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Biology

वायरस जैसे कणों ("नैनोब्लेड्स") के माध्यम से अमर और प्राथमिक कोशिकाओं में Cas9 / sgRNA राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स का वितरण

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/62245
Automatic Translation
2, 1, 1, 1
1LBMC, Laboratoire de Biologie et Modélisation de la Cellule Univ Lyon, ENS de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, CNRS, UMR 5239, INSERM, U1210, Lyon, 69007, France, 2CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie Univ Lyon, Inserm, U1111, Université Claude Bernard Lyon 1, CNRS, UMR5308, ENS de Lyon, F-69007, Lyon, France

Summary

हमने वायरस जैसे कणों के भीतर Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स को लोड करने के लिए एक सरल और सस्ती प्रोटोकॉल विकसित किया है। ये कण, जिन्हें "नैनोब्लेड्स" कहा जाता है, अमर और प्राथमिक कोशिकाओं के साथ-साथ विवो में Cas9 / sgRNA परिसर के कुशल वितरण की अनुमति देते हैं।

Abstract

Clustered नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता है (CRISPR) -कैस प्रणाली यूकेरियोटिक कोशिकाओं में जीनोम-संपादन democratized है और कई अभिनव अनुप्रयोगों के विकास के लिए नेतृत्व किया है। हालांकि, Cas9 प्रोटीन और एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) का लक्ष्य कोशिकाओं में वितरण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है। शास्त्रीय वायरल वैक्टर, जैसे कि लेंटिवायरस (एलवी) या एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) से व्युत्पन्न, कैस 9 प्रोटीन और कई प्राथमिक कोशिकाओं और विवो में इसके संबंधित एसजीआरएनए के लिए ट्रांसजीन कोडिंग के कुशल वितरण की अनुमति देते हैं। फिर भी, ये वैक्टर लक्ष्य सेल जीनोम में ट्रांसजीन के एकीकरण, एक सीमित कार्गो क्षमता, और कैस 9 प्रोटीन की दीर्घकालिक अभिव्यक्ति और लक्ष्य कोशिकाओं में आरएनए का मार्गदर्शन करने जैसी कमियों से पीड़ित हो सकते हैं।

इनमें से कुछ समस्याओं को दूर करने के लिए, किसी भी कोडिंग ट्रांसजीन की अनुपस्थिति में कैस 9 प्रोटीन और इससे जुड़े गाइड आरएनए को पैकेज करने के लिए मुरीन ल्यूकेमिया वायरस (एमएलवी) पर आधारित एक डिलीवरी वेक्टर विकसित किया गया था। MLV से संरचनात्मक प्रोटीन गैग के सी-टर्मिनस के लिए Cas9 प्रोटीन को फ्यूज करके, Cas9 प्रोटीन और sgRNA ("Nanoblades" नामक) के साथ लोड किए गए वायरस जैसे कणों (VLPs) का गठन किया गया था। नैनोब्लेड्स को उत्पादक कोशिकाओं के संस्कृति माध्यम से एकत्र किया जा सकता है, शुद्ध, मात्राबद्ध किया जा सकता है, और लक्ष्य कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने और सक्रिय कैस 9 / एसजीआरएनए कॉम्प्लेक्स को वितरित करने के लिए उपयोग किया जाता है। Nanoblades अपने राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (RNP) कार्गो को प्राथमिक और अमर कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में क्षणिक और तेजी से वितरित करते हैं और संशोधित Cas9 प्रोटीन का उपयोग करके लक्षित जीन के क्षणिक ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण जैसे अन्य अनुप्रयोगों के लिए प्रोग्राम किए जा सकते हैं। Nanoblades इंजेक्टेड वयस्क चूहों के जिगर में और ट्रांसजेनिक जानवरों को उत्पन्न करने के लिए ocytes में विवो जीनोम-संपादन में सक्षम हैं। अंत में, उन्हें "अभिकर्मक-मुक्त" होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत के लिए दाता डीएनए के साथ जटिल किया जा सकता है। नैनोब्लेड तैयारी सरल, अपेक्षाकृत कम लागत वाली है, और इसे किसी भी सेल जीव विज्ञान प्रयोगशाला में आसानी से किया जा सकता है।

Introduction

अन्य प्रोग्राम योग्य न्यूक्लिएज की तुलना में, CRISPR-Cas प्रणाली ने यूकेरियोटिक कोशिकाओं में अनुक्रम-विशिष्ट जीनोम लक्ष्यीकरण और दरार की प्रक्रिया को नाटकीय रूप से सरल और लोकतांत्रिक बनाया। एक sgRNA की सरल अभिव्यक्ति के माध्यम से, उपयोगकर्ता लगभग किसी भी सेलुलर लोकस 1 के लिए Cas9 प्रोटीन (या अनुकूलित वेरिएंट) को प्रोग्राम कर सकते हैं। इस परिदृश्य में, Cas9 प्रोटीन और sgRNA का वितरण साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस करते समय मुख्य सीमा बन जाता है। अमर कोशिकाओं में, एसजीआरएनए और कैस प्रोटीन को अधिकांश कोशिकाओं में कुशल जीनोम लक्ष्यीकरण प्राप्त करने के लिए ट्रांसफेक्टेड प्लास्मिड से आसानी से व्यक्त किया जा सकता है। हालांकि, Cas9 / sgRNA कॉम्प्लेक्स की संवैधानिक अभिव्यक्ति Cas9 प्रोटीन की ऑफ-टारगेट गतिविधि को बढ़ा सकती है और गैर-विशिष्ट लोकी 2 में अवांछित परिवर्तन पेश कर सकती है। प्राथमिक कोशिकाओं में, डीएनए अभिकर्मक को प्राप्त करना तकनीकी रूप से मुश्किल हो सकता है और खराब अभिव्यक्ति या संक्रमित कोशिकाओं का एक छोटा प्रतिशत हो सकता है। क्लासिक डीएनए अभिकर्मक के विकल्पों में वायरल वैक्टर का उपयोग शामिल है जो कैस 9 और एसजीआरएनए के लिए एक ट्रांसजीन कोडिंग या एक सिंथेटिक एसजीआरएनए के साथ युग्मित पुनः संयोजक कैस 9 प्रोटीन के इलेक्ट्रोपोरेशन को वितरित करता है। हालांकि, ये दृष्टिकोण सेल होस्ट जीनोम के भीतर ट्रांसजीन एकीकरण का कारण बन सकते हैं (जैसा कि शास्त्रीय रेट्रोवायरल और लेंटिवायरल अभिव्यक्ति वैक्टर के मामले में है), सेलुलर कारकों द्वारा प्रतिबंध, और कैस 9 प्रोटीन और एसजीआरएनए की संवैधानिक अभिव्यक्ति का कारण बन सकता है।

Cas9 / sgRNA RNP कॉम्प्लेक्स का इलेक्ट्रोपोरेशन इन समस्याओं में से अधिकांश को दूर कर सकता है और प्राथमिक कोशिकाओं में और विवो में कुशल और क्षणिक वितरण का कारण बन सकता है और साथ ही साथ खुराक-निर्भर प्रतिक्रिया की अनुमति देता है। फिर भी, यह आमतौर पर महंगे उपकरणों और अभिकर्मकों पर निर्भर करता है और यदि बड़ी संख्या में कोशिकाओं का इलाज किया जाना है तो इसे बढ़ाना भी मुश्किल है। उपर्युक्त तकनीकों के विकल्प के रूप में, इन लेखकों ने "नैनोब्लेड्स" विकसित किया है - कैस 9 प्रोटीन और एसजीआरएनए 3 के लिए एक रेट्रोवायरल डिलीवरी वेक्टर जो अवधारणात्मक रूप से अन्य वायरल-व्युत्पन्न कैप्सिड प्रोटीन डिलीवरी सिस्टम 4,5,6,7,8 के समान है। Nanoblades रेट्रोवायरस से गैग पॉलीप्रोटीन की प्राकृतिक क्षमता का उपयोग करने के लिए उत्पादन करते हैं, जब अकेले सुसंस्कृत कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, तो वीएलपी जो बाह्य कोशिकीय माध्यम 9 में जारी किए जाते हैं। कैस 9 प्रोटीन को मुरीन ल्यूकेमिया वायरस (एमएलवी) गैग पॉलीप्रोटीन के सी-टर्मिनल छोर पर फ्यूज करके और एसजीआरएनए और वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन को सह-व्यक्त करके, कैस 9 प्रोटीन को जारी वीएलपी या नैनोब्लेड्स के भीतर एनकैप्सिडेट किया जा सकता है। शुद्धिकरण पर, Nanoblades लक्ष्य कोशिकाओं के साथ incubated किया जा सकता है या Vivo में इंजेक्ट किया जा सकता है तेजी से मध्यस्थता करने के लिए, क्षणिक, और Cas9 / sgRNA RNP complex3 की खुराक निर्भर वितरण.

Nanoblades को विभिन्न लोकी पर एक साथ संपादन के लिए कई sgRNAs के साथ प्रोग्राम किया जा सकता है या Cas9 वेरिएंट के साथ लक्ष्य-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण या दमन 3 जैसे अन्य अनुप्रयोगों को निष्पादित करने के लिए। प्रोटीन इलेक्ट्रोपोरेशन के विपरीत, जो पुनः संयोजक अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है, साहित्य से नए वर्णित कैस वेरिएंट को आसानी से गैग संलयन अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किया जा सकता है, जिससे यह एक बहुमुखी मंच बन जाता है। नैनोब्लेड्स को होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत करने के लिए एकल-फंसे हुए और डबल-फंसे हुए ओलिगोडॉक्सीन्यूक्लियोटाइड्स (एसएसओडीएन) के साथ आगे जटिल या लोड किया जा सकता है। नैनोब्लेड उत्पादन अपेक्षाकृत सरल और सस्ता है। इसके अलावा, नैनोब्लेड्स को कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। आमतौर पर, Nanoblades सबसे अमर और प्राथमिक सुसंस्कृत कोशिकाओं में कुशल, ट्रांसजीन मुक्त जीनोम-संपादन की मध्यस्थता करते हैं। हालांकि, कुछ प्राथमिक कोशिकाएं वायरल कणों की उपस्थिति के प्रति संवेदनशील हो सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप मृत्यु दर में वृद्धि होती है। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाएं नैनोब्लेड्स की उपस्थिति पर भी प्रतिक्रिया कर सकती हैं (उनके वायरल मूल के कारण) और सक्रिय हो जाती हैं। इन मामलों में, Transduction प्रोटोकॉल Nanoblades के लिए जोखिम समय को सीमित करने और nonspecific प्रभाव को कम करने के लिए अनुकूलित किया जाना है। Nanoblades अन्य उपलब्ध CRISPR वितरण विधियों के लिए एक व्यवहार्य और आसान करने के लिए लागू विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Protocol

1. sgRNA डिजाइन और क्लोनिंग

नोट: SgRNas के डिजाइन के लिए दिशानिर्देश कई स्रोतों जैसे https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing या हन्ना और Doench10 से प्राप्त किया जा सकता है।

  1. एक बार 20 न्यूक्लियोटाइड एसजीआरएनए अनुक्रमों को डिजाइन किए जाने के बाद, निम्नलिखित एकल-फंसे हुए डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का आदेश दें:
    1. आगे: 5 'caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (एन प्रोटोस्पेसर-आसन्न आकृति (पीएएम) अनुक्रम के बिना लक्षित लोकस से मेल खाती है)
    2. रिवर्स: 5 'aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3' (एन पीएएम अनुक्रम के बिना लक्षित लोकस के रिवर्स-पूरक के अनुरूप है)
      नोट: ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (5 'फॉस्फेट के लिए कोई आवश्यकता नहीं) का आदेश देते समय कोई विशेष संशोधन ों की आवश्यकता नहीं होती है।
  2. एनीलिंग बफर (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; pH 7.9 25 °C पर), प्रत्येक डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (पानी में 100 μM स्टॉक समाधान) के 1 μL, और पानी के 42 μL के 5 μL को मिलाकर एक 0.2 mL पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) ट्यूब में दो डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को हाइब्रिडाइज़ करें।
  3. एक पीसीआर ब्लॉक पर, 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें और फिर 0.5 डिग्री सेल्सियस / सेकंड के रैंप के साथ तापमान को 20 डिग्री सेल्सियस तक कम करें। कमरे के तापमान पर रखें या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  4. 50 μL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा में 55 °C पर 3 ज के लिए BsmBI-v2 प्रतिबंध एंजाइम की 10 इकाइयों के साथ ब्लेड या SUPERBLADE sgRNA अभिव्यक्ति plasmids के 10 μg को पचाने।
    नोट: पचा हुआ वेक्टर ~ 1.9 KB का एक डीएनए सम्मिलित करें और ~ 3.3 KB का दूसरा डीएनए टुकड़ा जारी करना चाहिए।
  5. एथिडियम ब्रोमाइड (या एक सुरक्षित वैकल्पिक डीएनए जेल दाग) के 5 μg / mL के साथ दाग वाले 1% agarose जेल पर प्रतिबंध प्रतिक्रिया लोड करें।
    नोट: एथिडियम ब्रोमाइड में हेरफेर करते समय उचित सुरक्षा गियर पहनें, जो आनुवंशिक दोषों के कारण होने का संदेह है।
    1. 312 एनएम (डीएनए को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए) की तरंग दैर्ध्य पर सेट एक पराबैंगनी (यूवी) टेबल पर, जेल से 3.3 केबी डीएनए टुकड़े को काट लें, और इसे 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
      नोट: एथिडियम ब्रोमाइड में हेरफेर करते समय और यूवी टेबल पर काम करते समय उपयुक्त सुरक्षा गियर (दस्ताने और यूवी सुरक्षा चश्मे) पहनें।
    2. एक समर्पित डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके 3.3 केबी डीएनए टुकड़ा युक्त कटा हुआ जेल से डीएनए निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके शुद्ध डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  6. चरण 1.2 से BsmB1-पचा, जेल-शुद्ध ब्लेड या सुपरब्लेड वेक्टर को चरण 1.5.2 से हाइब्रिड किए गए आगे और रिवर्स डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को लिगेट करें। इसके लिए, T4 डीएनए लिगेज़ बफर के 2 μL, जेल-शुद्ध वेक्टर के 50 ng (चरण 1.5.2 से), संकरित डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के 1 μL (चरण 1.2 से), 19 μL तक आयतन बनाने के लिए पानी, और T4 डीएनए लिगेज़ के 1 μL जोड़ें। 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
    1. बंधाव उत्पाद को सक्षम बैक्टीरिया में बदलें ( सामग्री की तालिका देखें) जैसा कि 11 में वर्णित है। एक एम्पिसिलिन लूरिया Bertani आगर प्लेट पर परिवर्तित बैक्टीरिया प्लेट और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
    2. डीएनए minipreparation11 प्रदर्शन करने के लिए आगर प्लेट पर कई अलग-अलग कॉलोनियों का चयन करें ( सामग्री की तालिका देखें), और SgRNA चर अनुक्रम के सही बंधाव के लिए जाँच करने के लिए एक U6 फॉरवर्ड प्राइमर (5'GACTATCATATGCTTACCGT 3') का उपयोग करके सेंगर अनुक्रमण करें।
      नोट: अन्य sgRNA अभिव्यक्ति plasmids का उपयोग किया जा सकता है यदि वे Cas9 प्रोटीन के लिए कोड नहीं करते हैं, जो Nanoblade उत्पादन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है।

2. प्लास्मिड तैयारी

  1. सभी आवश्यक प्लास्मिडों की maxipreparation ( सामग्री की तालिका देखें) का प्रदर्शन करें, और -20 °C पर स्टोर करने के लिए 1 μg / mL पर 10 μg एलीकोट तैयार करें। प्लास्मिड के बार-बार फ्रीज / पिघलने वाले चक्रों से बचें; उन्हें छोड़ने से पहले दो बार एलीकोट का उपयोग करें।

3. Nanoblade तैयारी

  1. दिन 1 पर, 3.5 और 4 के बीच बीज × 106 HEK293T कोशिकाओं ( सामग्री की तालिका देखें) Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के 10 मिलीलीटर में उच्च ग्लूकोज, सोडियम पाइरूवेट, एल-ग्लूटामाइन, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 10 सेमी सेल संस्कृति पकवान में। 10 सेमी प्लेट को धीरे से पीछे और आगे की ओर ले जाएं, फिर दाएं से बाएं (इस अनुक्रम को 5x दोहराएं) कोशिकाओं को संस्कृति पकवान पर सजातीय रूप से वितरित करने के लिए। 5% CO2 के साथ एक सेल इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: सुसंस्कृत कोशिकाओं और Nanoblades की हैंडलिंग से संबंधित सभी प्रक्रियाओं को उनके संदूषण से बचने के लिए एक सेल संस्कृति लैमिनर प्रवाह हुड के तहत किया जाना चाहिए।
  2. दिन 2: प्लास्मिड अभिकर्मक
    1. कोशिकाओं को चढ़ाना के बाद 70-80% confluent 24 घंटे होना चाहिए (चित्रा 1A)। उच्च ग्लूकोज, सोडियम पाइरूवेट, एल-ग्लूटामाइन, 10% एफबीएस (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन को छोड़ा जा सकता है हालांकि यह अनिवार्य नहीं है) युक्त ताजा डीएमईएम के 10 मिलीलीटर के साथ माध्यम को बदलें।
      नोट:: इस चरण में, यह महत्वपूर्ण है कि कक्ष confluent नहीं हैं। अन्यथा, अभिकर्मक दक्षता के साथ-साथ कण उत्पादन को कम किया जा सकता है।
    2. प्रत्येक 10 सेमी प्लेट के लिए, 1.5 mL ट्यूब में प्लास्मिड की निम्नलिखित मात्रा तैयार करें: 0.3 μg pCMV-VSV-G, 0.7 μg pBaEVRless, 2.7 μg MLV Gag/ Pol, 1.7 μg BIC-Gag-Cas9, 4.4 μg BLADES या SUPERBLADES प्लास्मिड क्लोन sgRNA (या 2.2 μg प्रत्येक का उपयोग करके यदि दो sgRNAs का उपयोग करके)।
    3. अभिकर्मक बफर के 500 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), 10 s के लिए भंवर, और फिर 1 s के लिए centrifuge। अभिकर्मक अभिकर्मक के 20 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), 1 s के लिए ट्यूब भंवर, और फिर 1 s के लिए centrifuge।
    4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और P1000 पिपेटर का उपयोग करके DMEM माध्यम में कोशिकाओं के लिए पूरे समाधान को ड्रॉपवाइज जोड़ें। 10 सेमी प्लेट को धीरे से पीछे और आगे की ओर ले जाएं, फिर दाएं से बाएं (इस अनुक्रम 5x को दोहराएं) कोशिकाओं पर समान रूप से अभिकर्मक अभिकर्मक वितरित करने के लिए। 5% CO2 के साथ एक सेल इनक्यूबेटर में कम से कम 40 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि वांछित है, तो माध्यम को अभिकर्मक के बाद 4 घंटे बदला जा सकता है।
  3. दिन 3 पर, माइक्रोस्कोप के तहत transfected कोशिकाओं की आकृति विज्ञान की जांच करें।
    नोट: निर्माता कक्षों को फ्यूज करने के लिए शुरू हो जाएगा। यह fusogenic वायरल लिफाफे की अभिव्यक्ति के कारण एक सामान्य घटना है (चित्रा 1B, C)।
  4. दिन 4: कटाई Nanoblades
    नोट: अभिकर्मक के बाद कम से कम 40 घंटे, कोशिकाओं ने फ्यूसोजेनिक वायरल लिफाफों की अभिव्यक्ति के कारण एक साथ फ्यूज किया होगा, और कभी-कभी, कोशिकाओं को प्लेट समर्थन (चित्रा 1 डी) से पूरी तरह से अलग कर दिया जाता है।
    1. एक 10 mL पिपेट का उपयोग कर संस्कृति माध्यम supernatant के 9 mL ले लीजिए.
      नोट: Nanoblades VLPs Cas9 प्रोटीन और इसके संबंधित sgRNA को प्राथमिक कोशिकाओं में और विवो में वितरित करने में सक्षम हैं। हालांकि उन्हें आनुवंशिक रूप से संशोधित जीव नहीं माना जाता है क्योंकि वे आनुवंशिक सामग्री से रहित हैं, वे आनुवंशिक परिवर्तनों को प्रेरित कर सकते हैं। इसलिए, उपयोगकर्ताओं के साथ किसी भी संपर्क से बचने के लिए उन्हें सावधानी के साथ हेरफेर किया जाना चाहिए (खासकर यदि वे ट्यूमर दबाने वाले जीन को लक्षित करने के लिए क्रमादेशित हैं)। उपयोगकर्ताओं को सलाह दी जाती है कि वे रेट्रोवायरल वैक्टर के हेरफेर के लिए अपने स्थानीय सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें और वीएलपी तैयार करते समय और ट्रांसडक्शन प्रयोग करते समय बीएसएल -2 स्तर की प्रयोगशाला में काम करें। नैनोब्लेड्स को 70% इथेनॉल या सोडियम हाइपोक्लोराइट के 0.5% के साथ निष्क्रिय किया जा सकता है। नैनोब्लेड्स को निष्क्रिय करने के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए 0.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ सभी प्लास्टिक अपशिष्ट (पिपेट टिप्स, ऊतक संस्कृति प्लेटों, सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब) का इलाज करने की भी सलाह दी जाती है।
    2. सेलुलर मलबे को हटाने और सेल गोली को परेशान किए बिना supernatant को पुनर्प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 500 × जी पर एकत्र supernatant centrifuge।
      नोट: यदि Nanoblades प्राथमिक कोशिकाओं पर उपयोग किया जा करने के लिए हैं, तो एक 0.45 μm या 0.8 μm फ़िल्टर का उपयोग करके supernatant फ़िल्टर। ध्यान रखें कि यह कदम नैनोब्लेड टिटर को काफी कम कर देता है क्योंकि एक महत्वपूर्ण अंश फ़िल्टर झिल्ली में अवरुद्ध हो जाएगा।
    3. 4,300 × ग्राम पर एक झूलते बाल्टी रोटर में रात भर (12-16 घंटे) या 4 डिग्री सेल्सियस पर 75 मिनट के लिए एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में 209,490 × जी पर नैनोब्लेड्स को गोली मारें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: यदि लक्ष्य कोशिकाएं DMEM में बढ़ सकती हैं, तो उन्हें Nanoblades को केंद्रित किए बिना चरण 3.4.2 के बाद प्राप्त supernatant के साथ सीधे इनक्यूबेट करना संभव है।
  5. दिन 5: Nanoblades के Resuspension और भंडारण
    1. centrifugation के बाद, धीरे-धीरे माध्यम aspirate और ठंडे 1x फॉस्फेट-buffered खारा (PBS) के 100 μL के साथ सफेद गोली resuspend. पैराफिल्म के साथ ट्यूब को कवर करें, और ऊपर और नीचे पिपेटिंग द्वारा गोली को फिर से निलंबित करने से पहले कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट:: एक सफेद चिपचिपा सामग्री resuspension पर प्रकट हो सकता है; यह सामान्य है और ट्रांसडक्शन की दक्षता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करता है।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर Nanoblades स्टोर अगर चार सप्ताह के भीतर उन्हें उपयोग करने पर योजना बना रहे हैं. अन्यथा, तरल नाइट्रोजन में नैनोब्लेड्स को स्नैप-फ्रीज करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: तरल नाइट्रोजन में हेरफेर करते समय सुरक्षा चश्मे और क्रायोजेनिक दस्ताने पहनें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्नैप-फ्रीजिंग और स्टोरेज नैनोब्लेड दक्षता में महत्वपूर्ण कमी की ओर जाता है। इसके अलावा, पिघले हुए नैनोब्लेड्स को फिर से जमे हुए नहीं किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।

4. एक सुक्रोज-तकिया पर Nanoblades की एकाग्रता

नोट: रातोंरात centrifugation या ultracentrifugation (चरण 3.4.3) के विकल्प के रूप में, Nanoblades एक सुक्रोज कुशन पर केंद्रित किया जा सकता है। यह Nanoblades का एक शुद्ध अंश उपज, हालांकि कुल बरामद राशि कम हो जाएगा.

  1. 1x PBS में एक 10% सुक्रोज समाधान (मात्रा के लिए वजन) तैयार करें, और इसे 0.2 μm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. सुक्रोज कुशन पर Nanoblades ध्यान केंद्रित करने की प्रक्रिया शुरू करें।
    1. एक ultracentrifuge ट्यूब में VLP युक्त नमूने (चरण 3.4.3 से) के 9 मिलीलीटर रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक 3 एमएल सिरिंज और कैनुला का उपयोग करके, धीरे-धीरे नमूने के तहत 10% सुक्रोज के 2.5 मिलीलीटर परत, वीएलपी युक्त नमूने और सुक्रोज समाधान को मिश्रण नहीं करने की कोशिश कर रहा है।
    2. वैकल्पिक रूप से, एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10% सुक्रोज के 2.5 मिलीलीटर रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। ट्यूब को झुकाएं और धीरे-धीरे कम गति वाले पिपेटर के साथ वीएलपी युक्त नमूने (चरण 3.4.3 से) के 9 एमएल जोड़ें। इस ऑपरेशन के दौरान, धीरे-धीरे ट्यूब को ऊर्ध्वाधर स्थिति में उठाएं।
  3. 209,490 पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज × जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए एक अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: इस तकनीक को कम गति सेंट्रीफ्यूजेशन (4,300 × जी) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसा कि 12 में वर्णित है।
  4. centrifugation के बाद, supernatant ध्यान से निकालें और किसी भी शेष तरल को हटाने के लिए ट्यूब को टिशू पेपर पर उल्टा रखें। 1 मिनट के बाद, 1x PBS के 100 μL जोड़ें और 1 घंटे के लिए एक आंदोलन मेज पर एक ट्यूब धारक में एक पैराफिल्म कवर के साथ 4 °C पर ट्यूब रखें ( सामग्री की तालिका देखें) ऊपर और नीचे pipetting द्वारा गोली को फिर से निलंबित करने से पहले।
    नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।

5. निगरानी Cas9 डॉट धब्बा द्वारा Nanoblades के भीतर लोड हो रहा है

  1. 1x PBS के 4 संस्करणों में एक गैर-आयनिक surfactant युक्त lysis बफर की 1 मात्रा को जोड़कर कमजोर पड़ने बफर तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। तनुकरण बफर, भंवर के 50 μL में केंद्रित Nanoblades के 2 μL पतला, संक्षेप में, और इस मिश्रण के 25 μL को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 25 μL कमजोर पड़ने वाले बफर शामिल हैं। Nanoblade dilutions (2 गुना कमजोर पड़ने के कदम) के 4 ट्यूबों के लिए इस ऑपरेशन को दोहराएं।
  2. मानक नियंत्रण के लिए, पुनः संयोजक Cas9 न्यूक्लिएज के 2 μL पतला (सामग्री की तालिका देखें) को तनुकरण बफर के 50 μL में पतला करें, भंवर संक्षेप में, और आठ सीरियल dilutions (प्रत्येक चरण के लिए 2 गुना कमजोर पड़ने) बनाने के लिए आगे बढ़ें।
  3. प्रत्येक वीएलपी कमजोर पड़ने के 2.5 μL और प्रत्येक मानक के 2.5 μL को एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर ध्यान से स्पॉट करें (एक बड़ी मात्रा के परिणामस्वरूप ओवरलैपिंग स्पॉट हो सकते हैं)।
    नोट: एक मेथनॉल-उपचारित पॉलीविनाइलडिफ्लूराइड झिल्ली का भी उपयोग किया जा सकता है।
  4. एक बार कणों को झिल्ली पर अवशोषित कर लिया जाता है, तो कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए गैर-वसा शुष्क-दूध (5% डब्ल्यू / वी) के साथ पूरक गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट (टीबीएस-टी) युक्त 1x ट्रिस-बफ़र्ड खारा के साथ झिल्ली को अवरुद्ध करें।
    नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है, और झिल्ली 1x TBS-T में 4 °C पर संग्रहीत की जा सकती है।
  5. गैर वसा वाले सूखे-दूध के साथ पूरक 1x TBST को त्याग दें, और Cas9-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज एंटीबॉडी (1x TBST, 5% दूध में 1/1000 कमजोर पड़ने) के साथ 4 °C पर झिल्ली को रातभर इनक्यूबेट करें। टीबीएस-टी के साथ झिल्ली 3x को धोएं, और एक बढ़ी हुई केमिल्यूमिनेसेंट सब्सट्रेट किट का उपयोग करके सिग्नल की कल्पना करें।
  6. जेल इमेजिंग स्टेशन या imageJ13 के साथ प्रदान किए गए मालिकाना सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके Nanoblades और पुनः संयोजक Cas9 मानक dilutions के लिए डॉट तीव्रता को मापें। कैस 9 एकाग्रता के लिए डॉट तीव्रता को जोड़ने वाले एक रैखिक वक्र को परिभाषित करें। प्राप्त वक्र के कार्य का उपयोग करते हुए, प्रत्येक तैयारी में Cas9 सामग्री extrapolate।
    नोट:: पुनः संयोजक Cas9 प्रोटीन नियंत्रण की मात्रा मानक कमजोर पड़ने सेट (चित्रा 2) के सबसे केंद्रित नमूनों के लिए पढ़ने संतृप्त कर सकते हैं। इसलिए यह सलाह दी जाती है, जब रैखिक वक्र को परिभाषित किया जाता है, तो अप्रकाशित नमूनों (और कभी-कभी पहले कमजोर पड़ने वाले चरणों) से पढ़ने को हटाने के लिए यदि वे कैस 9 की ज्ञात एकाग्रता के संबंध में रैखिक सीमा में नहीं हैं जो देखा गया था। इसी तरह, जब Nanoblade नमूनों के भीतर Cas9 की मात्रा extrapolating, केवल रीडिंग है कि मानक वक्र की रैखिक सीमा के भीतर कर रहे हैं का उपयोग करें।

6. Nanoblades के साथ लक्ष्य कोशिकाओं के transduction (एक 12 अच्छी तरह से प्लेट में transduction के लिए प्रक्रिया)

  1. एक 12-अच्छी तरह से प्लेट में, बीज 100,000-200,000 कोशिकाओं (या तो प्राथमिक या अमर अनुयायी कोशिकाओं) प्रति अच्छी तरह से उपयुक्त सेल संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर में प्रति अच्छी तरह से। कोशिकाओं को ट्रांसडक्शन से पहले प्लेट की सतह का पालन करने की अनुमति दें।
  2. एक 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में, केंद्रित नैनोब्लेड्स के 5-20 μL जोड़ें (चरण 3.5.1 या 4.4 से) सेल संस्कृति माध्यम के 500 μL तक, और P1000 पिपेटर के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण। कोशिकाओं से माध्यम को निकालें, और इसे इस नैनोब्लेड मिश्रण के 500 μL के साथ बदलें।
    नोट:: ट्रांसडक्शन प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए। मध्यम की सबसे छोटी संभव मात्रा का उपयोग करना महत्वपूर्ण है (लक्ष्य कोशिकाओं के सूखने से बचने के दौरान) ताकि नैनोब्लेड्स अत्यधिक केंद्रित रहें। अनुयायी कोशिकाओं को प्लेट से जुड़े होने पर सीधे ट्रांसड्यूस किया जाना चाहिए (निलंबन में ट्रांसड्यूस न करें क्योंकि यह ट्रांसडक्शन दक्षता को काफी कम कर देगा)। कुछ कोशिकाएं नैनोब्लेड्स (24-48 एच) के लंबे समय तक संपर्क को सहन करती हैं, जबकि अन्य बहुत संवेदनशील होती हैं और छोटी सिंकीटिया बना सकती हैं। इस मामले में, नैनोब्लेड्स को माध्यम को बदलने से पहले केवल 4-6 घंटे के लिए कोशिकाओं के साथ ऊष्मायन किया जाना चाहिए। Spinoculation14 भी निलंबन में उगाई गई कोशिकाओं के लिए ट्रांसडक्शन में सुधार कर सकता है। सहायक जैसे कि कैटिओनिक पॉलिमर ( सामग्री की तालिका देखें) भी कुछ सेल प्रकारों में ट्रांसडक्शन दक्षता में सुधार कर सकते हैं।
  3. नैनोब्लेड्स युक्त माध्यम की कम मात्रा में सेल इनक्यूबेशन के 4-6 घंटे के बाद, माध्यम की मात्रा को सामान्य मात्रा में बढ़ाएं (1 एमएल यदि 12-अच्छी तरह से प्लेट के साथ काम कर रहा है), या इसे ताजा माध्यम के साथ बदलें यदि कोशिकाएं वीएलपी के प्रति संवेदनशील हैं।
    नोट: Nanoblades युक्त सेल माध्यम को इसे त्यागने से पहले 10 मिनट के लिए 0.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ निष्क्रिय किया जाना चाहिए। सोडियम हाइपोक्लोराइट में हेरफेर करते समय दस्ताने और सुरक्षात्मक चश्मे का उपयोग करें। यदि नैनोब्लेड्स सेल मृत्यु को प्रेरित करते हैं, तो सेल मृत्यु दर को कम करने के लिए जोखिम की मात्रा और कुल समय को अनुकूलित करें।

7. T7 एंडोन्यूक्लिएज परख द्वारा लक्षित लोकस पर CRISPR दक्षता को मापने

  1. CRISPR-दरार साइट को शामिल करने वाले 400-700 बेस-पेयर (BP) क्षेत्र को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन पीसीआर प्राइमर।
    नोट: दरार साइट को कम से कम 200 बीपी द्वारा एम्प्लिकॉन किनारे से दूर होना चाहिए और इसे एम्प्लिकॉन के केंद्र से थोड़ा स्थानांतरित किया जाना चाहिए ताकि T7 एंडोन्यूक्लिएज दरार पर, विभिन्न आकारों के 2 टुकड़े जारी किए जाएंगे।
  2. Nanoblades के साथ इलाज की गई कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए निकालें जो ब्याज के जीन को लक्षित करते हैं और नियंत्रण कोशिकाओं से एक नियंत्रण sgRNA के साथ क्रमादेशित Nanoblades के साथ इलाज किया जाता है (सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  3. एक टेम्पलेट के रूप में जीनोमिक डीएनए के 150 एनजी का उपयोग करते हुए, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करके 30 μL वॉल्यूम (अंतिम मात्रा) की पीसीआर प्रतिक्रिया को प्रोग्राम करें। जांचें कि पीसीआर प्रवर्धन एथिडियम ब्रोमाइड (या एक सुरक्षित वैकल्पिक डीएनए जेल दाग) के 5 μg / mL के साथ दाग वाले 2% agarose जेल चलाकर अपेक्षित आकार का एक एकल एम्प्लिकॉन उत्पन्न करता है।
    नोट: एथिडियम ब्रोमाइड में हेरफेर करते समय उचित सुरक्षा गियर पहनें, जो आनुवंशिक दोषों के कारण होने का संदेह है। प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।
  4. हेटरोडप्लेक्स पीढ़ी और पाचन
    1. एक 0.2 mL PCR ट्यूब में, एंजाइम बफर के 5 μL जोड़ें (T7 एंडोन्यूक्लिएज I के साथ प्रदान किया गया), पानी का 20 μL, और चरण 7.3 से PCR उत्पाद का 24 μL। 3 मिनट में 94 डिग्री सेल्सियस तक नमूनों को गर्म करके हेटरोडुप्लेक्स गठन की अनुमति दें और फिर 40 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए तापमान (2 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट) को कम करके।
    2. नियंत्रण सहित प्रत्येक हेटरोडुप्लेक्स ट्यूब में कमरे के तापमान पर T7-endonuclease I के 0.5 μL जोड़ें। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक 2.5% (वजन / मात्रा) agarose जेल एथिडियम ब्रोमाइड द्वारा सना हुआ में परिणामी प्रतिक्रिया लोड करें। माइग्रेशन के बाद, एक यूवी ट्रांसिल्युमिनेटर पर जेल की छवि।
      नोट: एथिडियम ब्रोमाइड में हेरफेर करते समय उचित सुरक्षा गियर पहनें, जो आनुवंशिक दोषों के कारण होने का संदेह है। यूवी ट्रांसिल्युमिनेटर का उपयोग करते समय यूवी-सुरक्षा चश्मे का उपयोग करें।
    3. उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ प्रत्येक बैंड की तीव्रता को मापने के लिए पाचन प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप छवि का विश्लेषण करके दरार क्षमता को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।

8. Sanger अनुक्रमण और ज्वार विश्लेषण द्वारा लक्षित लोकस पर CRISPR दक्षता को मापने

नोट: T7 endonuclease परख के लिए एक विकल्प के रूप में, CRISPR दक्षता विश्लेषण और TIDE प्रोटोकॉल 15 के आधार पर Sanger अनुक्रमण निशान के deconvolution द्वारा निगरानी की जा सकती है.

  1. आगे या रिवर्स पीसीआर प्राइमर का उपयोग करके चरण 7.3 से पीसीआर एम्प्लिकॉन का सेंगर अनुक्रमण करें (अनुपचारित कोशिकाओं के अनुरूप एक नियंत्रण स्थिति शामिल करें)।
  2. TIDE सर्वर (https://tide.nki.nl) का उपयोग करके और उनके विश्लेषण दिशानिर्देशों का पालन करते हुए नियंत्रण स्थिति (अनुपचारित कोशिकाओं) और Nanoblade-उपचारित नमूनों के Sanger अनुक्रमण निशान का विश्लेषण करें।

9. Homology के लिए ssODN दाताओं के साथ Nanoblade जटिल गठन-निर्देशित मरम्मत (एक 12-अच्छी तरह से प्लेट में transduction के लिए प्रक्रिया)

नोट:: कुशल होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत मध्यस्थता संपादन के लिए ssODN के डिजाइन के लिए दिशानिर्देश पहले 16 वर्णित किया गया है।

  1. एक 12-अच्छी तरह से प्लेट में, बीज 100,000-200,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से उपयुक्त सेल संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर में। कोशिकाओं को ट्रांसडक्शन से पहले प्लेट की सतह का पालन करने की अनुमति दें।
  2. 1x PBS में 8 μg / mL पर कैटिओनिक बहुलक ( सामग्री की तालिका देखें) के एक समाधान का 100 μL तैयार करें।
    1. ssODN टेम्पलेट के 100 pmol के साथ catyonic बहुलक समाधान के 19 μL मिश्रण. केंद्रित Nanoblades के 20 μL जोड़ें (चरण 3.5.1 या 4.4 से), और बर्फ पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    2. बर्फ से जटिल Nanoblades / ssODN निकालें, और सेल संस्कृति माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस पर) के 500 μL जोड़ें। लक्ष्य कोशिकाओं (चरण 9.1 से) से माध्यम को निकालें, और जटिल Nanoblades / ssODN युक्त माध्यम के 500 μL जोड़ें। जीनोटाइपिंग से पहले कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए फैलने की अनुमति दें।
  3. एक समर्पित निष्कर्षण किट का उपयोग करके सेल आबादी के एक अंश से जीनोमिक डीएनए निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. एक 400-700 बीपी क्षेत्र को बढ़ाने के लिए पीसीआर प्राइमरों को डिजाइन करें जिसमें नॉक-इन साइट शामिल है।
      नोट: पीसीआर प्राइमरों को लक्ष्य कोशिकाओं के भीतर अभी भी मौजूद किसी भी अवशिष्ट एसएसओडीएन के पीसीआर प्रवर्धन के परिणामस्वरूप झूठे-सकारात्मक परिणामों से बचने के लिए एसएसओडीएन के होमोलॉजी हथियारों के साथ ओवरलैप नहीं करना चाहिए।
    2. एक टेम्पलेट के रूप में नियंत्रण कोशिकाओं (अनुपचारित) या नैनोब्लेड-उपचारित कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए के 150 एनजी का उपयोग करते हुए, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए 30 μL पीसीआर प्रतिक्रिया को प्रोग्राम करें।
      नोट:: ssODN निशान कक्ष माध्यम में कई दिनों के बाद परिसर के साथ transduction के बाद मौजूद हो सकता है। यह ssODN सही एकीकरण के लिए स्क्रीन करने का प्रयास करने वाले पीसीआर assays के लिए एक आंशिक टेम्पलेट के रूप में काम कर सकता है। इसलिए, अंतिम झूठी-सकारात्मक assays से बचने के लिए ट्रांसडक्शन के बाद कम से कम दो बार कोशिकाओं को पारित करने की सलाह दी जाती है।
    3. नियंत्रण के 5 μL लोड और एक 1% (वजन / मात्रा) agarose जेल एथिडियम ब्रोमाइड द्वारा सना हुआ में Nanoblade-इलाज पीसीआर प्रतिक्रियाओं. माइग्रेशन के बाद, एक यूवी-ट्रांसिल्युमिनेटर पर जेल की छवि बनाएं।
      नोट: यदि होमोलॉजी पुनर्संयोजन सफल है और आनुवंशिक सामग्री के 1 बीपी से अधिक के सम्मिलन से मेल खाता है, तो नियंत्रण और नैनोब्लेड-उपचारित नमूने के बीच पीसीआर एम्प्लिकॉन के आणविक वजन में अंतर होना चाहिए। चूंकि एचडीआर की दक्षता 100% तक नहीं पहुंचती है, इसलिए दो बैंड नैनोब्लेड-उपचारित नमूने में दिखाई देने चाहिए (नियंत्रण पीसीआर एम्प्लिकॉन के समान आकार में से एक जो असंपादित एलील के अनुरूप है और नॉक-इन एलील के अनुरूप उच्च आणविक वजन में से एक है, चित्रा 3 बी मध्य पैनल देखें)।
  4. नियंत्रण और Nanoblade-इलाज पीसीआर amplicons के Sanger अनुक्रमण प्रदर्शन.
  5. TIDER प्रोटोकॉल 17 का उपयोग कर नॉक-इन दक्षता निर्धारित करें।

10. Vivo में Nanoblade वितरण

  1. रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन के माध्यम से चरण 3.5.1 से केंद्रित नैनोब्लेड्स के 25 μL तक वितरित करें या पूंछ शिरा इंजेक्शन के माध्यम से 100 μL तक, जैसा कि 18 में वर्णित है, यदि चूहों के साथ काम कर रहे हैं।
    नोट: पशु प्रयोग (जीनोम संपादन उद्देश्यों के लिए Nanoblade इंजेक्शन सहित) से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को स्थानीय नैतिकता समिति से एक अनुमोदित प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।
  2. ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी के लिए, एक माइक्रो-इंजेक्टर का उपयोग करें ताकि चरण 4.4 से केंद्रित नैनोब्लेड्स के 1 पीएल से 10 पीएल तक माउस ओसाइट्स के पेरिविटेलिन स्पेस में वितरित किया जा सके जैसा कि पहले वर्णित है18।
    नोट: perivitelline इंजेक्शन के लिए, यह शुद्ध करने के लिए और माइक्रो इंजेक्टर के clogging से बचने के लिए एक सुक्रोज कुशन पर Nanoblades ध्यान केंद्रित करने के लिए आवश्यक है।

Representative Results

Nanoblade तैयारी के लिए प्रोटोकॉल काफी सीधा है और एक ऊतक संस्कृति हुड, एक CO2 इनक्यूबेटर, और एक झूलते बाल्टी सेंट्रीफ्यूज या एक ultracentrifuge के लिए उपयोग के अलावा सरल प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता है। हालांकि, कुछ चरणों में विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है जैसे कि स्रोत और निर्माता कोशिकाओं को संभालना, साथ ही साथ ट्रांसडक्शन की स्थिति। जैसा कि चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, बीज कोशिकाओं के लिए यह महत्वपूर्ण है ताकि वे प्लेट में सजातीय रूप से वितरित किए जा सकें और अभिकर्मक के दिन ~ 70-80% संगम तक पहुंच सकें (कोशिकाओं के झुरमुट होने से बचें)। अभिकर्मक (चित्रा 1 बी, सी) के चौबीस घंटे बाद, निर्माता कोशिकाएं कई नाभिक के साथ बड़े आकार की कोशिकाओं के लिए अग्रणी सिंक्टिया बनाएंगी। अभिकर्मक (चित्रा 1 डी) के चालीस घंटे बाद, प्लेट में अधिकांश कोशिकाओं ने सिंकिटिया का गठन किया होगा और प्लेट से अलग होना शुरू कर दिया होगा।

यह पूरी तरह से सामान्य है और लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन की अभिव्यक्ति के कारण होता है, जो पड़ोसी कोशिकाओं के बीच संलयन को प्रेरित करता है। centrifugation द्वारा एकाग्रता पर (या यहां तक कि सीधे निर्माता कोशिकाओं के supernatant से), Nanoblades के भीतर लोड Cas9 की मात्रा एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर डॉट-धब्बा द्वारा संदर्भ के रूप में पुनः संयोजक Cas9 का उपयोग करके एक निरपेक्ष तरीके से परिमाणित किया जा सकता है (चित्रा 2). लक्ष्य कोशिकाओं के ट्रांसडक्शन के लिए उपयोग करने के लिए Nanoblades की सही मात्रा निर्धारित करने के लिए यह चरण महत्वपूर्ण है। डॉट-धब्बा परख करते समय, यह केवल रीडिंग पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है जो मानक वक्र की रैखिक सीमा के भीतर आते हैं। हालांकि, Nanoblades के भीतर मौजूद Cas9 की मात्रा से स्वतंत्र रूप से, यह T7 एंडोन्यूक्लिएज परख (चित्रा 3) या Sanger अनुक्रमण का उपयोग कर लक्ष्य कोशिकाओं पर सीधे जीनोम संपादन की दक्षता का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है।

जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, नैनोब्लेड्स की दक्षता बैच से बैच में भिन्न हो सकती है, हालांकि यह आमतौर पर कैस 9 की मात्रा से संबंधित होती है। चित्र 3 में दिखाए गए उदाहरण में, लेन 1 से बैच 20% समग्र संपादन दक्षता की ओर जाता है जबकि लेन 3 से बैच 60% दक्षता की ओर जाता है। इस मामले में, बैच 1 से उपयोग किए जाने वाले नैनोब्लेड्स की मात्रा को बढ़ाना संभव है ताकि बैच 3 के समान संपादन दक्षता प्राप्त की जा सके। चित्रा 4 विभिन्न प्रकार की प्राथमिक कोशिकाओं में नैनोब्लेड्स का उपयोग करके प्राप्त अधिकतम संपादन दक्षता को दर्शाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि दक्षता उपयोग किए गए एसजीआरएनए के अनुक्रम और लक्ष्य पहुंच के आधार पर भिन्न हो सकती है।

Figure 1
चित्र 1: नैनोब्लेड उत्पादन के दौरान उत्पादक कोशिकाओं की आकृति विज्ञान। (A) चढ़ाना के बाद 70-80% संगम पर HEK293T कोशिकाएं। (बी और सी) HEK293T सेल आकृति विज्ञान 24 घंटे के बाद अभिकर्मक। (डी) HEK293T सेल आकृति विज्ञान 40 h अभिकर्मक के बाद। स्केल बार = 400 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: डॉट-ब्लॉट द्वारा नैनोब्लेड्स के भीतर Cas9 लोडिंग का परिमाणीकरण। (A) पुनः संयोजक Cas9 या 100x केंद्रित (अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा) नैनोब्लेड नमूने (# 1, # 2, और # 3) को 2-गुना क्रमिक रूप से पतला किया जाता है और एंटी-कैस 9 एचआरपी-युग्मित एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करने से पहले नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर देखा जाता है। संकेत बढ़ाया chemiluminescence द्वारा पता चला है. (बी) Chemiluminescence संकेत का अधिग्रहण किया है और पुनः संयोजक Cas9 dilutions और संकेत तीव्रता नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर देखा Cas9 की ज्ञात राशि के खिलाफ प्लॉट के लिए परिमाणित. एक प्रतिगमन वक्र की गणना उन dilutions के लिए की जाती है जो रैखिक सीमा के भीतर होते हैं (नीले क्रॉस देखें), उन सभी सांद्रताओं को छोड़कर जो रैखिक सीमा के बाहर हैं (लाल क्रॉस देखें)। (सी) प्रत्येक नैनोब्लेड तैयारी में कैस 9 एकाग्रता (एनएम) को (बी) में प्राप्त रैखिक प्रतिगमन से समीकरण का उपयोग करके एक्सट्रपलेटेड किया गया था। इसके लिए, केवल नैनोब्लेड dilutions से मात्रात्मक संकेत का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो प्रतिगमन वक्र की रैखिक सीमा के भीतर आते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ट्रांसडक्शन पर संपादन दक्षता की निगरानी. (ए) T7 एंडोन्यूक्लिएज परख Nanoblade-उपचारित कोशिकाओं में दरार दक्षता को मापने. EMX1 जीन को लक्षित करने वाले Nanoblades के साथ transduced कोशिकाओं T7 endonuclease परख द्वारा विश्लेषण किया गया था. लेन 1: Nanoblade तैयारी बैच # 1 (20% दरार दक्षता); लेन 2: नियंत्रण कोशिकाओं; लेन 3: नैनोब्लेड तैयारी बैच # 2 (60% दरार दक्षता)। (बी) DDX3 ओपन रीडिंग फ्रेम के भीतर फ्लैग-टैग अनुक्रम का नॉक-इन। DDX3 लोकस को लक्षित करने वाले एक sgRNA के साथ क्रमादेशित केंद्रित Nanoblades विभिन्न HEK293T क्लोन (# 1, # 2) से उत्पादित किए गए थे और एक फ्लैग-DDX3 ssODN टेम्पलेट की बढ़ती खुराक और HEK293T लक्ष्य कोशिकाओं के ट्रांसडक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राप्त परिसरों के साथ जटिल थे। ट्रांसडक्शन पर, जीनोमिक डीएनए और कुल प्रोटीन निकालने के लिए उन्हें इकट्ठा करने से पहले कोशिकाओं को तीन दिनों के लिए उगाया गया था। फ्लैग-डीडीएक्स 3 प्रोटीन को एंटी-फ्लैग एगारोज़ मोतियों का उपयोग करके immunoprecipitated किया गया था, जिसके बाद एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी (शीर्ष पैनल) का उपयोग करके बरामद प्रोटीन के पश्चिमी-धब्बा विश्लेषण के बाद। Ddx3 लोकस में फ्लैग-टैग की साइट-निर्देशित सम्मिलन को भी पीसीआर द्वारा या तो सम्मिलन साइट (मध्य पैनल) को फ्लैंक करने वाले प्राइमरों का उपयोग करके परखा गया था, या एक फॉरवर्ड प्राइमर का उपयोग करके जो फ्लैग-टैग अनुक्रम को पहचानता है और फ्लैग सम्मिलन साइट (नीचे पैनल) के डाउनस्ट्रीम के Ddx3 लोकस के लिए विशिष्ट एक रिवर्स प्राइमर का उपयोग करता है। संक्षिप्त रूप: EMX1 = खाली Spiracles होमोबॉक्स 1; DDX3 = मृत बॉक्स आरएनए हेलीकेस 3; PCR = पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया; ODN = oligodeoxynucleotide; ssODN = सिंग-फंसे ODN; sgRNA = एकल-गाइड आरएनए; IP = immunoprecipitation। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: नैनोब्लेड्स का उपयोग करके विभिन्न प्राथमिक सेल प्रकारों में प्राप्त दक्षता संपादित करना। संक्षेप: PBL = परिधीय रक्त लिम्फोसाइट; आईएल = इंटरल्यूकिन; CD = विभेदन का समूह; iPSC = प्रेरित pluripotent स्टेम सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

Nanoblades सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं में Cas9 / sgRNA RNP परिसर के तेजी से और खुराक-निर्भर वितरण के लिए अनुमति देते हैं। शास्त्रीय अभिकर्मक और अन्य वायरल डिलीवरी वैक्टर के विपरीत, लेकिन प्रोटीन इलेक्ट्रोपोरेशन की तरह, नैनोब्लेड्स में ट्रांसजीन-मुक्त तरीके से कैस 9 / एसजीआरएनए आरएनपी के क्षणिक वितरण का लाभ होता है। Nanoblades प्रोटीन वितरण के लिए एक अत्यधिक बहुमुखी, सरल और सस्ती मंच प्रदान करते हैं जिसे आसानी से और तेजी से CRISPR वेरिएंट के कभी-विस्तारित परिवार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। Nanoblades HEK293T सेल लाइन या इसके डेरिवेटिव में उत्पादित किया जा सकता है। यहां उपयोग की जाने वाली HEK293T सेल लाइनों को रेट्रोवायरल और लेंटिवायरल कण उत्पादन को अधिकतम करने के लिए विकसित किया गया है (सामग्री की तालिका देखें)। हालांकि, हालांकि HEK293T कोशिकाओं के अन्य स्रोत उपयुक्त हो सकते हैं, उपयोगकर्ताओं को विभिन्न स्रोतों से HEK293T कोशिकाओं का परीक्षण और तुलना करनी चाहिए क्योंकि HEK293T सेल-स्रोत के आधार पर कण उत्पादन में प्रमुख अंतर देखे गए हैं। कोशिकाओं को माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए भी अक्सर जांचा जाना चाहिए और ओवरकॉन्फ्लेंस से बचने के लिए हर तीन दिनों (शास्त्रीय रूप से 1/8 कमजोर पड़ने) में पारित किया जाता है, जिसका कण उत्पादन पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है।

कोशिकाओं को 20 से अधिक मार्गों के लिए बनाए नहीं रखा जाना चाहिए। ग्लूकोज, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, ग्लूटामाइन, और 10% विघटित भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक डीएमईएम का उपयोग सेल संस्कृति के लिए किया गया था। चूंकि सीरम मूल नैनोब्लेड तैयारी की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है, इसलिए बड़े पैमाने पर उत्पादन से पहले सीरम के विभिन्न बैचों का परीक्षण किया जाना चाहिए। Nanoblades को अन्य मीडिया जैसे RPMI या न्यूनतम आवश्यक माध्यम के सीरम-मुक्त संशोधनों में कुशलतापूर्वक उत्पादित किया जा सकता है जो अभिकर्मक के बाद के दिन में DMEM को प्रतिस्थापित कर सकते हैं। जैसा कि नीचे इंगित किया गया है, हालांकि कुछ डीएनए-अभिकर्मक अभिकर्मकों के साथ अभिकर्मक के बाद मध्यम प्रतिस्थापन वैकल्पिक है, यह उस माध्यम को संशोधित करने के लिए फायदेमंद हो सकता है जिसमें वीएलपी जारी किए जाते हैं, विशेष रूप से कण तैयारी में सीरम के निशान को सीमित करने के लिए। हालांकि, अभिकर्मक से पहले के दिन कम-सीरम न्यूनतम आवश्यक माध्यम में कोशिकाओं की खेती का अभी तक प्रयास नहीं किया गया है।

जैसा कि उल्लेख किया गया है, नैनोब्लेड्स निर्माता कोशिकाओं में प्लास्मिड के मिश्रण के ओवरएक्सप्रेशन पर उत्पादित होते हैं। Overexpression इष्टतम उत्पादन के लिए आवश्यक प्रतीत होता है। दरअसल, इस प्रयोगशाला ने एक निर्माता सेल लाइन विकसित की जहां गैग-पोल-व्यक्त करने वाले निर्माण को एंटीबायोटिक चयन द्वारा स्थिर किया गया था; हालांकि, यह प्रणाली Nanoblades की महत्वपूर्ण मात्रा का उत्पादन करने में विफल रही। इसी तरह का अवलोकन तब किया गया था जब एसजीआरएनए-कोडिंग निर्माण को उत्पादक कोशिकाओं के जीनोम में स्थिर रूप से एकीकृत किया गया था। जैसा कि अन्य कण उत्पादन प्रणालियों के लिए वर्णित है, एक स्थिर सेल लाइन जो नैनोब्लेड्स उत्पादन में शामिल कम से कम कुछ निर्माणों को व्यक्त करती है, उपयोगी हो सकती है; हालांकि, यह निश्चित रूप से supernatant की बड़ी मात्रा के प्रसंस्करण और कणों को शुद्ध करने के लिए एक उपयुक्त तकनीक की आवश्यकता होगी। उपर्युक्त प्रोटोकॉल नैनोब्लेड्स का उत्पादन करने के लिए पसंदीदा प्रक्रिया को रेखांकित करता है जो विशिष्ट अभिकर्मक अभिकर्मकों का शोषण करता है ( सामग्री की तालिका देखें)।

यद्यपि अन्य निर्माताओं से अभिकर्मक अभिकर्मकों को भी सफलता के साथ परीक्षण किया गया है, नैनोब्लेड्स के साथ इस समूह के परिणामों का विशाल बहुमत यहां वर्णित प्रक्रिया का पालन करता है। कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मकों का उपयोग करके कम लागत वाले अभिकर्मक प्राप्त किए जा सकते हैं और अच्छी उत्पादन दक्षता प्राप्त कर सकते हैं; हालांकि, इस विधि को पूरी तरह से अभिकर्मक के बाद के दिन अभिकर्मक माध्यम के प्रतिस्थापन की आवश्यकता होती है और तलछट कण तैयारी में कैल्शियम फॉस्फेट अवशेषों को छोड़ सकता है। निर्माता कोशिकाओं के भीतर Nanoblade घटकों के लिए उच्च अभिव्यक्ति के स्तर की आवश्यकता के अनुरूप यह अवलोकन है कि Cas9 प्रोटीन से जुड़े sgRNas की मात्रा कुशल जीनोम-संपादन के लिए एक सीमित कारक हो सकती है। एसजीआरएनए लोडिंग में सुधार करने के लिए, दो तकनीकी दृष्टिकोण हाल ही में नैनोब्लेड्स के समान प्रोटीन वितरण वैक्टर का उपयोग करके स्वतंत्र समूहों द्वारा विकसित किए गए हैं। ये SGRNA6 के T7 पोलीमरेज़-निर्भर साइटोप्लाज्मिक अभिव्यक्ति के उपयोग पर निर्भर करते हैं या Gag polyprotein6 के लिए बाध्यकारी मध्यस्थता करने के लिए sgRNA अनुक्रम में एक retroviral encapsidation संकेत के अलावा के माध्यम से। ये दृष्टिकोण वास्तव में Nanoblades के भीतर sgRNA लोडिंग में सुधार कर सकते हैं, हालांकि उनका अभी तक परीक्षण नहीं किया गया है।

लक्ष्य कोशिकाओं का ट्रांसडक्शन प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। अधिकांश अमर सेल लाइनों में, नैनोब्लेड्स के साथ ट्रांसडक्शन का बहुत कम या कोई साइटोपैथिक प्रभाव नहीं होता है। हालांकि, प्राथमिक कोशिकाओं में, विषाक्तता एक मुद्दा हो सकता है। इसलिए ट्रांसडक्शन को प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना है। विशेष रूप से, नैनोब्लेड्स के लिए एक्सपोज़र समय ट्रांसडक्शन प्रोटोकॉल को अनुकूलित करते समय संशोधित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। संवेदनशील कोशिकाओं जैसे प्राथमिक न्यूरॉन्स या अस्थि मज्जा कोशिकाओं के लिए, माध्यम को बदलने से पहले नैनोब्लेड्स के साथ इनक्यूबेशन के 4-6 घंटे सेल विषाक्तता को कम करते हुए कैस 9 प्रोटीन के कुशल वितरण के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, दूसरों के बीच, कैटिओनिक पॉलिमर जैसे सहायक, कुछ कोशिकाओं में ट्रांसडक्शन की दक्षता में काफी सुधार कर सकते हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि नैनोब्लेड्स वीएलपी हैं और एक इम्युनोजेनिक प्रतिक्रिया को प्रेरित कर सकते हैं। यह एक सीमा हो सकती है यदि कुछ प्रकार की प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम करना, जैसे मैक्रोफेज या डेंड्राइटिक कोशिकाएं, जिसमें नैनोब्लेड्स के साथ इनक्यूबेशन जीन अभिव्यक्ति और कोशिकाओं के फेनोटाइप में महत्वपूर्ण परिवर्तन को प्रेरित कर सकती है। यदि मैक्रोफेज और डेंड्राइटिक कोशिकाएं हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल अग्रदूतों (जैसे माउस अस्थि मज्जा कोशिकाओं) से प्राप्त की जाती हैं, तो नैनोब्लेड्स के खिलाफ सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रेरित करने से बचने के लिए पूरी तरह से विभेदित होने से पहले नैनोब्लेड्स के साथ कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करना बेहतर होता है। अन्यथा, कैस 9 प्रोटीन इलेक्ट्रोपोरेशन विभेदित प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ काम करते समय एक व्यवहार्य विकल्प का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

नैनोब्लेड्स का उपयोग ट्रांसजेनिक जानवरों को उत्पन्न करने के लिए माउस युग्मनज या भ्रूण को ट्रांसड्यूस करने के लिए विवो में किया जा सकता है। शास्त्रीय रेट्रोवायरल या लेंटिवायरल वैक्टर के समान, उन्हें वयस्क जानवरों से ऊतकों में सीधे इंजेक्ट किया जा सकता है। हालांकि, नैनोब्लेड्स (रेट्रोवायरल और लेंटिवायरल वैक्टर के समान) को मेजबान जानवर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया द्वारा निष्क्रिय किया जा सकता है; इसलिए, इंजेक्शन की जाने वाली खुराक को प्रत्येक आवेदन के लिए अनुकूलित किया जाना है। यह प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया इंजेक्शन साइट के करीब ऊतकों के लिए कार्यात्मक वीएलपी के वितरण को भी सीमित कर सकती है। अंत में, लेंटिवायरल वैक्टर के विपरीत, नैनोब्लेड्स ट्रांसजीन-मुक्त होते हैं और एक प्रतिबंधित समय सीमा में कैस 9 वितरित करते हैं। इसलिए, उनका उपयोग जीनोम-वाइड कार्यात्मक स्क्रीनिंग करने के लिए नहीं किया जा सकता है, जिसके लिए कोशिकाओं के चयन पर एसजीआरएनए के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण की आवश्यकता होती है। Nanoblades उपयोगी होते हैं जब तेजी से, खुराक-निर्भर, और ट्रांसजीन-मुक्त जीनोम-संपादन की आवश्यकता होती है20। इसके अलावा, प्रोटीन इलेक्ट्रोपोरेशन के समान, नैनोब्लेड्स डीएनए अभिकर्मक या शास्त्रीय वायरल वैक्टर 3 के माध्यम से कैस 9 / एसजीआरएनए की लंबे समय तक अभिव्यक्ति की तुलना में कम ऑफ-टारगेट प्रभाव का कारण बनते हैं। Nanoblades के भविष्य के विकास इस तरह के आधार संपादन और आरएनए लक्ष्यीकरण के रूप में विभिन्न तकनीकी अनुप्रयोगों के लिए Cas9 वेरिएंट को शामिल करने पर केंद्रित है।

Disclosures

फिलिप ई Mangeot और Emiliano पी Ricci Nanoblades प्रौद्योगिकी से संबंधित एक पेटेंट पर आविष्कारकों के रूप में नामित कर रहे हैं (पेटेंट आवेदकों: Institute National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), सेंटर नेशनल डे ला Recherche Scientifique (CNRS), Ecole Normale Superieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne Cedex; आवेदन संख्या: WO 2017/068077 Al; पेटेंट स्थिति: प्रकाशित, 27 अप्रैल 2017; पांडुलिपि के सभी पहलुओं पेटेंट आवेदन द्वारा कवर कर रहे हैं. शेष लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को Université de Lyon के Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, कार्यक्रम Investissements d'Avenir (ANR-11-IDEX-0007) के भीतर फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERC-ERC0000) द्वारा संचालित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm - 50Pk Beckman Coulter Life Sciences 331372 Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose Merck GE10600004 Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades
BIC-Gag-CAS9 Addgene 119942 Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes
BICstim-Gag-dCAS9-VPR Addgene 120922 Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation
BLADE Addgene 134912 Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system
BsmBI-v2 New England Biolabs R0739S Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 Cell Signaling Technology 97982S Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot
Cas9 Nuclease, S. pyogenes New England Biolabs M0386T Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) Sigma-Aldrich E1510-10ML For staining agarose gels and visualize DNA
Fisherbrand Wave Motion Shakers Fisher Scientific 88-861-028 Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation
gelAnalyzer http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion
Gesicle Producer 293T Takara 632617 Nanoblades producer cell line
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate ThermoFisher Scientific 41966052 Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells
GoTaq G2 DNA Polymerase Promega M7848 Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA Polyplus POL114-15 Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter Millipore SLAA033SS Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter Millipore SLGS033SS Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter Millipore SLHP033RS Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration
Monarch DNA Gel Extraction Kit New England Biolabs T1020L DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs C3040I Competent bacteria for plasmid transformation and amplification
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA Macherey-Nagel 740410.50 Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria
Nucleospin gDNA extraction kit Macherey-Nagel 740952.50 Extraction of genomic DNA from transduced cells
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA Macherey-Nagel 740588.50 Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue Macherey-Nagel 740952.5 Genomic DNA extraction kit
Optima XE-90 Beckman Coulter Life Sciences A94471 Ultracentrifuge
pBaEVRless Els Verhoeyen (Inserm U1111) Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-gagpol Addgene 35614 Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes
pCMV-VSV-G Addgene 8454 Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
Phosphate-Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 14200091 10X PBS to dilute in millipore water
Polybrene Transfection Reagent Millipore Sigma TR-1003-G Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S0389-5KG Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation
SUPERBLADE5 Addgene 134913 Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013)
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ThermoFisher Scientific 34076 Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362 Rotor for ultracentrifugation
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher Scientific S33102 Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA
T7 Endonuclease I New England Biolabs M0302S T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus
Triton-containing lysis buffer Promega E291A Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416 For the preparation of TBST

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References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome-editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33, 73-80 (2015).
  3. Mangeot, P. E., et al. Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Nature Communications. 10 (1), 45 (2019).
  4. Cai, Y., Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Targeted genome editing by lentiviral protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases. eLife. 3, 01911 (2014).
  5. Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Therapy. 23 (7), 627-633 (2016).
  6. Gee, P., et al. Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nature Communications. 11, 1334 (2020).
  7. Indikova, I., Indik, S. Highly efficient 'hit-and-run' genome editing with unconcentrated lentivectors carrying Vpr.Prot.Cas9 protein produced from RRE-containing transcripts. Nucleic Acids Research. 48 (14), 8178-8187 (2020).
  8. Lyu, P., Javidi-Parsijani, P., Atala, A., Lu, B. Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (17), 99 (2019).
  9. Gheysen, D., Jacobs, E., de Foresta, F., Thiriart, C. Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells. Cell. 59 (1), 103-112 (1989).
  10. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
  11. Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. Third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
  12. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
  13. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  14. O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).
  15. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  16. Bollen, Y., Post, J., Koo, B. -K., Snippert, H. J. G. How to create state-of-the-art genetic model systems: strategies for optimal CRISPR-mediated genome editing. Nucleic Acids Research. 46 (13), 6435-6454 (2018).
  17. Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
  18. Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders. Journal of Visualized Experiments. (140), e57609 (2018).
  19. Montagna, C., et al. VSV-G-enveloped vesicles for traceless delivery of CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 12, 453-462 (2018).
  20. Marnef, A., et al. A cohesin/HUSH- and LINC-dependent pathway controls ribosomal DNA double-strand break repair. Genes & Development. 33 (17-18), 1175-1190 (2019).

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जीव विज्ञान अंक 169 CRISPR Cas9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन आरएनपी मुरीन ल्यूकेमिया वायरस वायरस की तरह कणों वीएलपी वायरल वेक्टर प्रोटीन वितरण
वायरस जैसे कणों ("नैनोब्लेड्स") के माध्यम से अमर और प्राथमिक कोशिकाओं में Cas9 / sgRNA राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स का वितरण
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Mangeot, P. E., Guiguettaz, L.,… More

Mangeot, P. E., Guiguettaz, L., Sohier, T. J. M., Ricci, E. P. Delivery of the Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complex in Immortalized and Primary Cells via Virus-like Particles ("Nanoblades"). J. Vis. Exp. (169), e62245, doi:10.3791/62245 (2021).

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