Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Enkelt Myofiber Kultur Assay til vurdering af voksne muskelstamcellefunktionalitet Ex Vivo

Published: February 15, 2021 doi: 10.3791/62257
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Leibniz Institute on Aging, Fritz-Lipmann-Institute

Summary

I denne protokol beskrives en in vitro-dyrkningsmetode og funktionel analysemetode for muskelstamceller, som bevarer de fleste af deres interaktioner med deres endogene niche.

Abstract

Voksen skeletmuskulaturvæv har en stamcellepopulation, der er uundværlig for sin evne til at regenerere. Ved muskelskader forlader muskelstamceller deres hvilende tilstand og aktiverer det myogene program, der i sidste ende fører til reparation af beskadiget væv samtidig med genopfyldning af muskelstamcellepuljen. Forskellige faktorer påvirker muskelstamcelleaktivitet, blandt dem iboende stimuli, men også signaler fra det direkte muskelstamcellemiljø, stamcelle nichen. Isolationen og kulturen af enkelte myofibre med deres tilknyttede muskelstamceller bevarer det meste af stamcellens interaktion med dens niche og er derfor den nærmeste mulighed for at studere muskelstamcellefunktionalitet ex vivo. Her er en protokol for isolation, kultur, siRNA transinfektion og immunstaining af muskelstamceller på deres respektive myofibre fra mus EDL (extensor digitorum longus)muskler leveres. De forsøgsbetingelser, der er skitseret her, gør det muligt at undersøge og manipulere muskelstamceller ex vivo, herunder undersøgelse af myogen aktivitet uden det iboende behov for in vivo dyreforsøg.

Introduction

Skeletmuskulatur hos den voksne er et postmitotisk væv, der hovedsageligt består af multinukleated myofibers, som er effektorcellerne til frivillige bevægelser. Det har en bemærkelsesværdig evne til at regenerere, en proces, der ligner embryonal myogenese og gennemgår funktionsnedsættelser i alder og sygdom1. Denne slående regenerative kapacitet af skeletmuskulatur afhænger af muskelstamceller (MuSC'er), som også kaldes satellitceller på grund af deres placering mellem sarcolemma og basal lamina af myofibers2,3. Under hvile betingelser MuSCs er quiescent og karakteriseret ved udtryk for transskription faktor Pax7 og quiescence markører såsom Sprouty14,5,6,7,8. Ved aktivering, f.eks efter skade, Forlader MuSCs den hvilende tilstand og opregulerer den myogene lovgivningsmæssige faktor MyoD9. Pax7/MyoD dobbelt positive MuSCs formerer sig og differentierer derved myogene prækursorer celler, som også ofte omtales som myoblasts. Disse myoblasts derefter yderligere differentiere sig til aflange myocytter, en proces sammenfaldende med molekylære og morfologiske ændringer, f.eks tab af Pax7 og upregulation af Myogenin udtryk10. Myocytter derefter til sidst smelte til hinanden eller til eksisterende myofibers derved reparere det beskadigede væv. Vigtigere, en lille brøkdel af muskel stamceller vender tilbage MyoD upregulation og er i stand til selv at forny11. Status for MuSC differentiering og myogen progression kan let observeres ved undersøgelse af myogene markører som Pax7, MyoD og Myogenin10.

Kulturen af enkelte myofibers med deres tilstødende MuSC'er er en glimrende metode til at undersøge MuSC-funktionalitet i en ex vivo-indstilling, da MuSCs forbliver i deres endogene niche12,13. MuSC'ernes adfærd reguleres af iboende signaler samt ydre signaler fra nichen, en specialiseret anatomisk placering bestående af komponenter i den ekstracellulære matrix (ECM) omkring MuSC'erne og myofiberen selv. For eksempel er en af de ydre tilsynsmyndigheder for MuSC quiescence Notch signalering. Her modtages signaleringssignaler af MuSCs fra både myofiber og ECM14,15,16. Desuden er MuSC-nichen vigtig for at kontrollere divisionaksen af MuSC'er og dermed regulere MuSC-dattercellernes celle skæbne17,18. Med rimelighed kan parametre som asymmetriske MuSC-divisioner, myogen progression og selvfornyelse vurderes entydigt i dette eksperimentelle setup. For eksempel kan en flercellet klynge dannes som følge af en MuSC efter en 72 timers kulturperiode, som kan undersøges for forekomsten og procentdelen af forskellige myogene populationer som selvfornyende, formerende og yderligere differentierede MuSCs8,19,20,21. MuSC'ernes differentieringstilstand kan bestemmes ved undersøgelse af pax7,myoD's og Myogenins udtryk/samudtryk. Efter 72 timers kultur cellerne i en klynge kan diskrimineres af følgende parametre: Pax7 kun celler er selvfornyende MuSCs, mens Pax7 / MyoD dobbelt positive celler breder / aktiveret MuSCs og yderligere differentierede myogene celler er Myogenin positive22. Desuden kan MuSC-numre eller genindtræden i cellecyklussen/aktiveringen undersøges ud over myogen progression, f.eks. gennem immunofluorescencebaserede analyser baseret på de parametre, der er beskrevet ovenfor.

Her beskrives de unikke træk ved myofiberisolations- og kulturprotokollen, f.eks. bevarelsen af MuSC's interaktion med dens niche. Mus hele EDL (extensor digitorum longus)muskler er omhyggeligt dissekeret, fordøjet af kollagen, og fysisk triturated at opnå enkelt myofibers med deres tilhørende MSC'er for yderligere kultur. Desuden afgrænses protokollen trinnene til transfect MuSCs med siRNA til funktionelle analyser af kandidatgener og på hinanden følgende immunofluorescencebaserede analyser uden nødvendigheden af transgene dyr.

Protocol

Ofring af dyr skal udføres i overensstemmelse med de nationale regler for dyreforsøg. Den protokol, der er beskrevet her, blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Leibniz Institute on Aging - Fritz Lipmann Institute og Eu-direktivet 2010/63/EU (licensnummer til organhøst: O_JvM_18-20). Vigtige trin i protokollen er sammenfattet i figur 1.

1. Forberedelse af kulturplader, medier og Pasteur pipetter

BEMÆRK: Alle materialer og udstyr, der er nødvendige for at isolere og kultur enkelte myofibers skal være så sterile som muligt. Derfor anbefales det at isolere enkelte myofibre under en semi-steril dissektionshætte.

  1. Brug steril HS (hesteserum) til at belægge vævskulturplader. Belægning forhindrer fastgørelse af enkelte myofibre til plastoverfladen. For hver mus kræves 4 brønde af en 12-brønds plade til isolering og et dedikeret antal brønde af en 24-brønds plade til dyrkning. Inkuber brøndene på en 12-brønds plade med 1 mL og brøndene på en 24-brønds plade med 0,5 mL HS i 5 minutter ved RT (stuetemperatur), fjern derefter HS og lad pladerne tørre i yderligere 5 minutter.
    BEMÆRK: HS kan indsamles og genbruges til belægningsformål flere gange, hvis det holdes sterilt.
  2. Lav myofiber isolation medium ved at supplere DMEM (Dulbeccos modificerede Eagles medium med 4,5 g/L glukose og natrium pyruvat) med 20% FBS (fosterkvægserum), filter gennem 0,22 μm filter. Tilsæt medium til de forbelagte isolationsplader (12-brønds plade, 2-4 mL isolationsmedium pr. brønd) ca. 30 min før isolering og ekvilibrere i en befugtet 37 °C inkubator med 5% CO2.
  3. Forbered myofiberkulturmediet ved at supplere DMEM (Dulbeccos modificerede Eagles medium med 4,5 g/L glukose og natrium pyruvat) med 20% FBS (fosterkvægsserum) og 1% kylling embryo ekstrakt, filter gennem 0,22 μm filter. Der tilsættes 0,5 mL medium til hver brønd af de forbelagte kulturplader (24 brøndplade) ca. 30 min før isoleringen og ekvilibraten i en befugtet 37 °C-inkubator med 5 % CO2.
  4. Tilberedelse af fordøjelsesopløsningen ved opløsning af 0,2% (w/v) kollagenasetype 1 (fra Clostridium histolyticum)i DMEM (Dulbeccos modificerede Ørnemedium med 4,5 g/L glukose og natrium pyruvat), filter gennem 0,22 μm filter. For to EDL (extensor digitorum longus)muskler bruger 2,5 mL kollagenaseopløsning i et sterilt 15 mL reaktionsrør. Derudover forvarmes opløsningen ~ 10 min i et cirkulerende vandbad ved 37 °C, før isolationen påbegyndes.
  5. Forbered sterile Pasteur pipetter til trituration af kollagenase-fordøjede muskler. Brug en diamantpen til at klippe Pasteur-pipetterne.
    1. For hver mus skal du bruge en stor borepipette med en åbning på ca. 0,3 cm og en længde på ca. 10-12 cm og en anden glaspipette med en lille åbning på ca. 0,1 cm og en længde på ca. 22 cm (Figur 2F).
    2. Udglat kanterne af begge pipetter ved at varme polering med flammen af en Bunsen brænder. Hold pipettespidsen i 5-10 s ind i flammen med blid bevægelse for at muliggøre lige varmefordeling, indtil de skarpe glaskanter glattes ud.
    3. Umiddelbart før brug, pels begge typer af glas pipetter med sterilE HS ved at fylde hele pipetten med ~ 2 mL HS i 5 min, derefter skubbe HS og lad pipetter tørre i 5 minutter på RT.

2. EDL muskelisolation og kollagenase fordøjelse

  1. Spray alt udstyr med 70% ethanol for at undgå forurening.
  2. Ofre musen i overensstemmelse med de nationale regler for dyreforsøg.
  3. Spray musens hindlimbs med 70% ethanol. Brug hærdet fin buet saks (24 mm skærkant) og fine sammenkråninger (Dumont 7, buet eller lige) til at fjerne huden og til at eksponere de underliggende muskler. Undgå enhver kontakt mellem de underliggende muskler med pels (øger risikoen for forurening).
  4. Fjern den omgivende fascia med fine buede sammenkøjninger uden at beskadige de underliggende muskler (Figur 2A). Luk sammentrækningerne for at undgå at bøje.
  5. Brug buede sammenkædninger til at eksponere de distale sener af TA (skinneben forreste) og EDL muskel. For at fjerne TA skal du gribe fat i den distale TA-sene med sammenkædning og skæres med fin Vannas fjedersaks (5 mm skærkant, 0,35 mm spidsdiameter). Mens du holder TA på senen, trække det mod knæet og skære musklen tæt på knæet (Figur 2B), EDL muskel er nu udsat.
    BEMÆRK: Sørg for, at kun TA-senen er grebet i dette trin, ellers kan den underliggende EDL blive beskadiget. Når du afskærer TA-musklen, skal du sørge for, at senerne i knæet let kan ses bagefter.
  6. Løft den distale EDL-sene med fine buede sammenkædninger og skær med fin Vannas fjedersaks (Figur 2C). Udsæt den proksimale EDL-sene ved forsigtigt at trække EDL mod knæet. Skær den proksimale sene med fine Vannas fjedersaks. EDL-musklen overføres til den 37 °C, der er forvarmet, og som er 2,5 mL collagenasefordøjelsesopløsning i 15 mL-reaktionsrøret fra trin 1.4. (Figur 2D).
    BEMÆRK: Lav et lille snit ved det ydre knæ bindevæv til fuldt ud at udsætte den proksimale EDL sene. Sørg for kun at gribe senerne og ikke strække EDL for meget.
  7. Gentag trin 2.3. til 2.6. med den anden EDL. Tilsæt begge EDL muskler til det samme 15 mL reaktionsrør fyldt med 2,5 mL kollagenase fordøjelsesopløsning.
  8. Inkuber EDL-musklerne i reaktionsrøret ved 37 °C i et cirkulerende vandbad.
    BEMÆRK: Inkubationstid afhænger af flere faktorer, såsom kollagenaseaktivitet, musens alder og mængden af fibrotisk væv. Den typiske inkubationstid for EDL-muskler hos voksne mus (2-6 måneder) er 1-1,5 timer og for ældre mus (18 måneder) 1,5-2 timer.
  9. For at undgå overdreven fordøjelse af musklerne skal du kontrollere musklerne i fordøjelsestiden. Stop fordøjelsen, når musklerne løsner op og enkelte myofibre er synlige (Figur 2E). Overfør musklerne forsigtigt med den store borepipette til den første brønd af den forvarmede 12-brønds plade, der indeholder myofiber isolationsmedium (Figur 2G).

3. Myofiber dissociation og kultur

  1. For følgende trin skal du bruge et stereokikkertmikroskop, der fortrinsvis er udstyret med en varmeplade (37 °C). Brug den store borepipette til at skylle musklerne med varmt isolationsmedium, indtil enkelte myofibre frigives. Afsocier musklerne med den store borepipette, indtil det ønskede antal myofibre flyder frit i opløsningen.
    BEMÆRK: Undgå overdreven trituration for at reducere risikoen for beskadigede myofibre. Brug af en varmeplade til myofiber dissociation anbefales kraftigt, da temperaturen falder under isolationsprocessen, hvilket vil resultere i myofiberdød.
  2. Overfør ikke-kontraherede myofibre(figur 2H)med HS-belagt lille boreglaspipette til den anden brønd fyldt med isolationsmedium for at vaske snavs væk og kontraheret (beskadiget) myofibers (Figur 2I).
    BEMÆRK: For at undgå overdreven bevægelse af isolerede myofibre kan de overføres til den anden brønd, og derefter kan triturationsprocessen fortsættes.
  3. Overfør ikke-kontraherede myofibers til den næste (3rd)godt fyldt med isolation medium til at vaske igen.
  4. Brug den lille boreglaspipette, belagt med HS, til at overføre ca. 50-100 ikke-kontraherede myofibers til den 24-brønds plade, der indeholder myofiberkulturmediet.
  5. Inkuber myofibre ved 37 °C, 5% CO2 for dedikeret tid (96 timer anbefales maksimalt).
    BEMÆRK: MuSCs opdele en gang enten planar eller apical-basal efter 42 timers kultur. Derudover danner MuSCs efter 72 timers kultur flercellede klynger bestående af selvfornyende, voksende eller engagerede (differentierede) MuSC'er.

4. siRNA transfection

  1. 4 timer efter myofiberisolation, transfect myofiber tilknyttede MuSC'er (50-100 ikke-kontraheret myofibers i en brønd af 24-brøndspladen fyldt med 500 μL kulturmedium) med lipidbaseret transfection reagens, f.eks. RNAiMAX i henhold til producentens protokol med en endelig koncentration på 5 pmol siRNA. Der tilsættes derfor 25 μL Opti-MEM med den respektive mængde siRNA til 25 μL Opti-MEM, der indeholder 1,5 μL af transfectionreagenset. Inkuber reaktionsmikset i 5 min og tilsæt det derefter til kulturmediets 500 μL.
    BEMÆRK: En anden transfektion efter 24 timer eller 48 timer anbefales i længere kulturperioder, f.eks. mere end 48 timer. En ændring af medium efter transfektion er ikke nødvendig.

5. Fiksering og HVIS farvning

  1. Til immunstainning skal du bruge et stereokikkertmikroskop. Alle volumener i de følgende trin justeres til en brønd af en 24-brønds plade. Udfør alle følgende trin ved hjælp af en HS-belagt pipette med små boringer.
  2. Kassér forsigtigt myofiberkulturmediet, mens du efterlader en opløsning i brønden (ca. 100 μL pr. 24 brønd). Gør dette for alle yderligere skridt, medmindre andet er angivet for at tillade flydende myofibers. Tilsæt 500 μL på 2% PFA for at fastgøre myofibererne med deres tilstødende MuSC'er, inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
  3. Supernatanten fjernes forsigtigt, og myofibererne vaskes tre gange med PBS (pH 7.4, 500 μL i 5 min. ved RT hver).
  4. Der tilsættes 500 μL permeabiliseringsopløsning (0,1% Triton X-100, 0,1 M Glycin i PBS, pH 7,4), inkubation i 10 min ved RT.
  5. Permeabiliseringsopløsningen fjernes, og der tilsættes 500 μL-blokerende opløsning (5 % HS i PBS, pH 7.4) i 1 time ved RT.
    BEMÆRK: Kontroller den anbefalede blokeringsopløsning for primære antistoffer for at undgå uspecifik binding.
  6. Fjern blokeringsopløsningen, og der tilsættes 300 μL primær antistoffortynding (f.eks. anti-Pax7 (PAX7, DSHB, ufortyndet), anti-MyoD (klon G-1, Santa Cruz, 1:200)) pr. Brønd. Inkuberes ved 4 °C natten over.
  7. Vask tre gange med 500 μL PBS pr. brønd (5 min ved RT).
  8. Fjern PBS og tilsæt 300 μL sekundær antistoffortynding (f.eks. anti-mus-IgG1-546 og anti-mus-IgG2b-488 1:1000) pr. Brønd. Inkuber 1 time ved RT beskyttet mod lys. For de følgende trin anbefales lette reducerede forhold.
  9. Vask to gange med 500 μL PBS pr. brønd (5 min ved RT).
  10. Udfør DAPI-farvning ved hjælp af 500 μL af opløsningen pr. brønd (endelig DAPI-koncentration 10 μg/mL) i 5 min ved RT.
  11. Vask to gange med 500 μL PBS pr. brønd (5 min ved RT).
  12. Brug en hydrofob pen til at tegne en cirkel på en mikroskopisk glasrutschebane for at skabe en vandafvisende barriere, der forhindrer spild af væske, der indeholder myofibre. Overfør myofibererne i det mindst mulige volumen til den mikroskopiske glasrutschebane og spred dem på glasrutschebanen.
    BEMÆRK: Undgå fysisk træk af myofibererne over den mikroskopiske glasrutschebane, da dette kan forårsage friktion, hvilket kan medføre løsrivelse af klynger fra myofibers.
  13. Fjern restvæsken med den lille Pasteur-pipette eller en 200 μL-pipette.
  14. Brug to dråber vandig montering medium og dække myofibers med en coverlip. Lad lysbillederne tørre i den tid, som producenten anbefaler. Opbevar rutsjebanerne ved 4 °C i mørke.

Representative Results

Denne protokol giver instruktioner til vellykket afledning og kultur af enkelte myofibers med deres tilknyttede MuSC'er fra murine EDL muskler. Vigtige trin i protokollen er sammenfattet i figur 1. Omhyggelig sene-til-sene dissektion af EDL muskler (Figur 2A-C) er afgørende for et højt udbytte af levedygtige myofibre. Muskel dissociation opnås først ved kollagenase fordøjelse (Figur 2D) efterfulgt af fysisk trituration (Figur 2G). Intakte myofibre (Figur 2H) dyrkes, mens hyperkontrakterede og døde myofibre (Figur 2I) bør udelukkes fra kultur og analyse.

MuSCs forbliver myofiber-associeret under isolationsprocessen. Immunofluorescence farvning for transskriptionsfaktoren Pax7 identificerer og skelner 7-9 MuSC-kerner fra overfloden af myonuklei pr. myofiber, når den er fastgjort umiddelbart efter afslutningen af isolationsprocessen (figur 3A). Figur 3B viser et forstørret område fra figur 3A med den ekstra brightfield kanal, som udsætter den subcellulære myofibrillary struktur myotube og demonstrerer Pax7 immunofluorescence signal i kernen af en MuSC.

Aktivering og myogen progression af myofiber associerede MuSC'er kan analyseres ved myogen markør udtryk. Forbundet med frisk isolerede myofibers (0 h), for det meste quiescent MuSCs kan findes, som er karakteriseret ved Pax7 udtryk og fravær af MyoD udtryk, og dermed ligner en in vivo homøostatisk tilstand (Figur 4, 0 h). På grund af dissektions-/dissociationsproceduren og myofiberkulturmediesammensætningen aktiverer og opregulerer muSC'erne hurtigt transskriptionsfaktoren MyoD for at lette spredningen, som det kan observeres på 42 timer, når MuSC'erne har gennemgået deres første division(figur 4, 42 h). Efter 72 timers kultur danner MuSCs klynger af afkom med forskellige myogene skæbner, der er parallel med udtryksmønstrene for forskellige myogene markører (Figur 4, 72 h). Pax7+ kun celler modstå differentiering og blive selvfornyende stamceller. Pax7+ og MyoD+ dobbelt positive celler er proliferative, mens MyoD+ kun celler har udviklet sig yderligere langs den myogene afstamning og vil differentiere.

Myofiberkultursystemet giver mulighed for effektiv interferens af MuSC-aktivitet ved forskellige interventioner, som en af dem er siRNA-transfection som beskrevet i detaljer i denne protokol. For at overvåge transfection effektiviteten af myofiber associerede MuSC'er en fluorescerende mærket ikke-målretning siRNA blev transfected. Pax7 positive MuSCs akkumuleret cytoplasmisk siRNA i en granulat-lignende måde, hvilket indikerer effektiv optagelse (Figur 5A). Der blev ikke observeret fluorescerende granulater i myofiberernes cytoplasma, hvilket tyder på en naturlig optagelsesbarriere i myofibre ved 4 timer efter isolation, og at siRNA-transfektion specifikt er rettet mod musc'er. Kvantificering af positivt transfected Pax7 + celler pr myofiber afslørede, at mere end halvdelen af alle MuSCs havde taget op synlige mængder af fluorescerende mærket siRNA lige før afslutningen af den første runde af division på 24 timer. Antallet af transfected Pax7+-celler steg yderligere op til 74 % efter 30 timer (figur 5B). Desuden var der ingen forskel i antallet af Pax7+-celler pr. myofiber af transfected eller ikke-overførte tilstande på begge tidspunkt, hvilket ikke viste nogen negative virkninger på stamcellenumrene på grund af transfektionsproceduren (Figur 5C).

Sammenfattende giver protokollen en detaljeret beskrivelse af isolationen og kulturen af EDL enkelt myofibers med deres tilstødende muskelstamceller. Det muliggør undersøgelse af myofiber-associeret muskelstamcelleaktivitet ex vivo, f.eks. ved immunfluorescencebaserede analyser. Manipulation af muskelstamceller ved siRNA transfection er effektiv og giver et metodisk grundlag for funktionelle analyser.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over væsentlige trin. De væsentlige trin i isolations- og immunstainingsproceduren er sammenfattet i dette tal. Forkortelser: DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium; FBS, Føtalt kvægserum; CEE, kylling embryo ekstrakt; TA, skinneben forreste; EDL, extensor digitorum longus Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Mus EDL dissektion og enkelt myofiber isolation. (A) Huden på musen hindlimb fjernes, og musklen omkring fascia trækkes væk for at eksponere TA (skinneben forreste)muskel. (B) TA-musklen fjernes for at eksponere EDL -extensor digitorum longus) musklen, markeret med den hvide pil. (C) EDL-musklen dissekeres ved at skære i senerne. (D) To EDL muskler er kollagenase fordøjet. (E) Udseendet af kollagen fordøjet muskel med synlige enkelt myofibre løsne op fra vævskernen. (F) Stor og lille borepastaent med skala. (G) EDL-musklerne (markeret med sorte pile) tritureres fysisk ved hjælp af en stor borepastaurpipette. (H) Enkelte intakte myofibre er tynde og skinnende og kan indsamles individuelt til kultur og analyse. (I) Hyperkontrerede og døde myofibre er uegnede til kultur og analyse. De mikroskopiske billeder af 2H og 2I blev taget med et mikroskop ved hjælp af et N-Achroplan 5x-mål. Skalalinjer er 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Mikroskopisk billede af en hel enkelt myofiber med tilhørende MuSC'er. Der blev fremstillet enkelte myofibre fra EDL af unge C57BL/6 mus og PFA-fikseret efter isolation (0 timer). (A) Pax7 og DAPI immunofluorescence farvning identificerer myofiber tilknyttede muskelstamceller (MuSC'er, præget af pile). Det mikroskopiske billede blev taget ved hjælp af fliser og z-stack funktion af et mikroskop udstyret med en Plan-Apochromat 40x olie mål. Skalastang er 200 μm. (B) Forstørrelse fra(A),der viser myonuclei, en Pax7 positiv kerne og det lyse mørke mønster fra myofibrillary strukturer i brightfield. Skalalinjen er 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Immunofluorescence billeder af MuSC aktivering og myogen progression under enkelt myofiber kultur. Muskelstamceller (MuSCs) af frisk isolerede myofibre (0 h) repræsenterer en homøostatisk tilstand tæt på in vivo quiescence, karakteriseret ved udtryk for Pax7 og mangel på MyoD udtryk. Under enkelt myofiber kultur de fleste MuSCs upregulate MyoD og genindtræde i cellecyklus for at opdele og formere sig (42 timer). Efter 72 timers kultur muSC skæbne kan diskrimineres baseret på myogen markør udtryk. Celler med Kun Pax7-udtryk fornyer sig selv (rød pil), mens Pax7 og MyoD dobbelt positive celler (rød/grøn pil) fortsætter med at formere sig. MyoD kun positive celler (grøn pil) har forpligtet sig til myogen differentiering. Mikroskopiske billeder blev taget ved hjælp af et mikroskop med et Plan-Apochromat 20x mål (0 h, 42 h) eller en LD Plan-Neofluar 40x mål (72 h). Skalastænger er 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Fluorescerende siRNA-transfekt af muSC'er og optagelsesanalyse. EDL enkelt myofibre blev udarbejdet og transfected med fluorescerende mærket siRNA (siGLO) efter de trin, der er fastsat i denne protokol. (A) Cytoplasmatisk ophobning af siGLO granulater specifikt i en Pax7 positiv muskelstamcelle (MuSC) på en enkelt myofiber ved 30 timers kultur. Det mikroskopiske billede blev taget ved hjælp af z-stack og apotom funktion af et mikroskop med en Plan-Apochromat 100x olie mål. Skalastænger er 5 μm. (B) Kvantificering af siRNA optagelse af Pax7 positive muskelstamceller ved 24 eller 30 timers kultur. (C) Antal Pax7 positive celler pr. enkelt myofiber, der sammenligner ikke-transfected og transfected betingelser ved 24 eller 30 timers kultur. Data vises som middelværdi med standardafvigelse på n = 4 mus. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her præsenteres en metode til funktionelt at undersøge et bestemt gens rolle i MuSC'er ved hjælp af en in vitro-tilgang. Det er vigtigt, at i det system, der er beskrevet her, dyrkes MuSC'erne under forhold, der ligner in vivo-situationen så meget som muligt og bevarer de fleste af muSCs interaktioner med deres niche. Dette opnås ved dyrkning isolerede myofibers med deres tilstødende MuSCs under flydende forhold og på hinanden følgende siRNA transfection. Procedurerne for myofiberisolation, siRNA-transinfektion og undersøgelse af MuSC-populationer i løbet af 72 timers kultur gennem immunofluorescenceanalyser er beskrevet. Desuden blev det påvist, at omkring 74% af alle muSC'er blev overført med en fluorescerende mærket kontrol siRNA efter 30 timers kultur.

Særlig opmærksomhed bør være fokuseret på omhyggelig dissektion af EDL muskel, da omfattende stretching, klemme, eller klemme vil føre til sammentrækning og på hinanden følgende død myofibers. Desuden er det vigtigt at undersøge klynger af MuSCs fra mindst 20 forskellige myofibers per replikere pr betingelse. Dette er nødvendigt, da MuSC-numre og egenskaber varierer på grund af eksistensen af MuSC-delpopulationer. Ved undersøgelse af effekten af en specifik siRNA på MuSC'er ved hjælp af flydende myofiber kultur metode en sammenligning af tilstanden med målretning siRNA til ikke-målretning kontrol bør udføres inden for samme mus og muskler. Dette anbefales for at undgå musespecifikke forskelle, som kan dække eller forstærke virkningerne af siRNA'et. Knockdown-effektiviteten kan bestemmes af immunofluorescenceanalyser med antistoffer rettet mod målgenet ved hjælp af enkelte myofibre med deres tilstødende MuSC'er. Hvis dette ikke er en mulighed, kan man teste siRNA knockdown effektivitet i primære myoblasts efterfulgt af kvantitative RT-PCR eller immunoblot analyser. Effektiviteten af siRNA skal bestemmes, før siRNA'en analyseres på muSC'er på enkelte myofibre. Brugen af en smart pool bestående af 4 forskellige siRNAs versus en enkelt øger knockdown effektivitet, men øger også risikoen for uspecifik målretning. Et ikke-målretnings siRNA bør anvendes som en kontrol. For direkte at overvåge transfection effektivitet, kan man bruge en fluorescerende mærket ikke-målretning siRNA som udført her. Tidspunktet for transfektion med siRNA er omkring 4 timer efter isolation, et tidspunkt, hvor den basale lamina omkring MuSCs allerede er gennemtrængelig for siRNA. Hvis virkningen af en specifik siRNA på MuSC'er efter 72 eller 96 timer undersøges, anbefales det at udføre en anden siRNA-transfektion efter 24 timer eller 48 timer for at opretholde en høj knockdown-effektivitet.

Myofiber kultur assay viser forskellige fordele i forhold til undersøgelsen af MuSCs med konventionelle celle kultur metoder. MuSCs forbliver knyttet til myofibers under hele isolationsprocessen og bevarer derved det afgørende samspil mellem MuSC med dets niche19,23,24,25. Den bevarede interaktion mellem MuSCs med myofiber er en forudsætning for at studere nicheafhængige effekter på MuSC-funktionalitet, som ikke kan rekapituleres i konventionelle 2D myoblast kulturer. For eksempel, under aldrende MuSCs display nedsat myogen kapacitet resulterer i en reduceret effektivitet til at regenerere muskelvæv efter skader20,26. Denne nedskrivning skyldes i det mindste delvis ændringer i MuSC-nichen , navnlig ændringer i ECM-sammensætningen27,28. Myofiber kultur protokol tillader undersøgelse og indblanding i disse afvigende niche ændringer.

I modsætning til den metode, der er beskrevet her, rensning af MuSC'er ved immunmærkning og -sortering teknikker som FACS (fluorescens aktiveret celle sortering) eller MACS (magnetisk celle sortering) indebærer fjernelse af MuSC'er fra deres niche. Interessant nok mister 2D-kulturer af isolerede muSCs fra alderen muskler deres ydre signaler og opfører sig svarende til MuSCs isoleret fra unge muskler og derved ikke recapitulating in vivo situationen passende29. Desuden resulterer den fuldstændige dissociation af muskelvævet og mærkningen af muSC'er med overflademarkører i transskriptomiske ændringer og aktivering af cellerne30,31,32. En anden fordel ved myofiberkultursystemet er muligheden for at forstyrre MuSC-funktionaliteten på forskellige niveauer. Manipulation af MuSCs på dyrkede myofibre kan effektivt opnås ved siRNA-medieret gen knockdown som beskrevet her i detaljer. Ligeledes er anvendelsen af kemiske forbindelser eller levering af rekombinante proteiner meget effektiv til at forstyrre stamcelleveje20,28. Desuden tillader retro- eller lentiviral ekspressionsvektorer indførelsen af udefrakommende gener,dvs. Derudover kan påvirkningen af ydre faktorer på MuSC-funktionalitet udforskes i det system, der er beskrevet her, f.eks. kan kulturforholdene suppleres med supernatant fra forskellige fysiologiske eller patologiske kilder for at modellere forskellige tilstande som kræftkaksi34,35.

En begrænsning af den metode, der er beskrevet her, er det faktum, at det enkelte myofiberkultursystem ikke helt kan generobre virkningen af alle systemiske faktorer eller indflydelse af andre celletyper på MuSCs. Også den tid, hvor myofibers kan holdes levedygtige i kulturen er begrænset, og derfor studiet af MuSC relaterede processer fokuserer på tidlige begivenheder som aktivering og myogen engagement. Desuden er undersøgelsen af MuSC interaktion med andre nicheceller såsom immunceller eller fibro-adipogenic stamfader celler ikke muligt. For at undersøge systemiske virkninger på MuSC funktionalitet kan man enten udføre muskelskade eksperimenter efterfulgt af analyse af muskel regenerering in vivo eller udføre transplantation eksperimenter36,37.

Samlet set giver myofiberisolations- og kulturprotokollen stor mulighed for genetiske eller mekanistiske undersøgelser af voksne MuSC'er uden krav om transgene musemodeller og kan potentielt reducere dyreforsøg.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Christine Poser og Christina Picker for fremragende teknisk assistance og kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft til JvM (MA-3975/2-1), Carl Zeiss-fonden og Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b ThermoScientific A-21141 use 1:1000 for IF
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 ThermoScientific A-21123 use 1:1000 for IF
chicken embryo extract Seralab CE-650-J chicken embryo extract containing growth factors etc.
collagenase type 1 Sigma C0130
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) GibCo 41966029 cell culture medium
fetal bovine serum Gibco 10270-106 fetal bovine serum
horse serum Gibco 26050-088
Lipofectamine RNAiMax ThermoScientific 13778150 transfection reagent
MyoD antibody clone G-1 Santa Cruz sc-377460 dilute 1:200 for IF
Pax7 antibody DSHB PAX7 use undiluted
siGLO Red Transfection Indicator horizon discovery D-001630-02-05 non targeting siRNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henze, H., Jung, M. J., Ahrens, H. E., Steiner, S., von Maltzahn, J. Skeletal muscle aging - Stem cells in the spotlight. Mechanisms of Ageing and Development. 189, 111283 (2020).
  2. Chang, N. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells: the architects of skeletal muscle. Current Topics in Developmental Biology. 107, 161-181 (2014).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysics and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
  4. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
  5. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
  6. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
  7. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  8. Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
  9. Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
  10. Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (13), 2559-2570 (2019).
  11. Motohashi, N., Asakura, A. Muscle satellite cell heterogeneity and self-renewal. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2, 1 (2014).
  12. Huttner, S. S., et al. Isolation and culture of individual myofibers and their adjacent muscle stem cells from aged and adult skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 2045, 25-36 (2019).
  13. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
  14. Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
  15. Mourikis, P., et al. A critical requirement for notch signaling in maintenance of the quiescent skeletal muscle stem cell state. Stem Cells. 30 (2), 243-252 (2012).
  16. Pisconti, A., Cornelison, D. D., Olguin, H. C., Antwine, T. L., Olwin, B. B. Syndecan-3 and Notch cooperate in regulating adult myogenesis. Journal of Cell Biology. 190 (3), 427-441 (2010).
  17. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).
  18. Troy, A., et al. Coordination of satellite cell activation and self-renewal by Par-complex-dependent asymmetric activation of p38alpha/beta MAPK. Cell Stem Cell. 11 (4), 541-553 (2012).
  19. Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A., Brack, A. S. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
  20. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
  21. Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
  22. Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127, Pt 21 4543-4548 (2014).
  23. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
  24. Eliazer, S., et al. Wnt4 from the Niche Controls the Mechano-Properties and Quiescent State of Muscle Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 654-665 (2019).
  25. Goel, A. J., Rieder, M. K., Arnold, H. H., Radice, G. L., Krauss, R. S. Niche cadherins control the quiescence-to-activation transition in muscle stem cells. Cell Reports. 21 (8), 2236-2250 (2017).
  26. Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
  27. Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
  28. Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular wisp1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
  29. Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12 (3), 333-344 (2013).
  30. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  31. van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
  32. van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24 (2), 213-225 (2019).
  33. Judson, R. N., et al. The Hippo pathway member Yap plays a key role in influencing fate decisions in muscle satellite cells. Journal of Cell Science. 125, Pt 24 6009-6019 (2012).
  34. He, W. A., et al. NF-kappaB-mediated Pax7 dysregulation in the muscle microenvironment promotes cancer cachexia. Journal of Clinical Investigation. 123 (11), 4821-4835 (2013).
  35. Schmidt, M., Poser, C., von Maltzahn, J. Wnt7a counteracts cancer cachexia. Molecular Therapy Oncolytics. 16, 134-146 (2020).
  36. Feige, P., Rudnicki, M. A. Isolation of satellite cells and transplantation into mice for lineage tracing in muscle. Nature Protocols. 15 (3), 1082-1097 (2020).
  37. Garry, G. A., Antony, M. L., Garry, D. J. Cardiotoxin induced injury and skeletal muscle regeneration. Methods in Molecular Biology. 1460, 61-71 (2016).

Tags

Biologi Udgave 168 muskelstamcelle satellitcelle stamcelle skeletmuskulatur myofiberkultur siRNA EDL extensor digitorum longus
Enkelt Myofiber Kultur Assay til vurdering af voksne muskelstamcellefunktionalitet Ex Vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hüttner, S. S., Hayn, C.,… More

Hüttner, S. S., Hayn, C., Ahrens, H. E., Schmidt, M., Henze, H., von Maltzahn, J. Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo. J. Vis. Exp. (168), e62257, doi:10.3791/62257 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter