Summary
En este protocolo se describe un método de cultivo y análisis funcional in vitro para células madre musculares, que conserva la mayoría de sus interacciones con su nicho endógeno.
Abstract
El tejido muscular esquelético adulto alberga una población de células madre que es indispensable para su capacidad de regenerarse. Tras el daño muscular, las células madre musculares abandonan su estado de reposo y activan el programa miogénico que finalmente conduce a la reparación del tejido dañado concomitante con la reposición del grupo de células madre musculares. Varios factores influyen en la actividad de las células madre musculares, entre ellos los estímulos intrínsecos, pero también las señales del entorno directo de las células madre musculares, el nicho de las células madre. El aislamiento y cultivo de miofibras individuales con sus células madre musculares asociadas preserva la mayor parte de la interacción de la célula madre con su nicho y, por lo tanto, es la posibilidad más cercana para estudiar la funcionalidad de las células madre musculares ex vivo. Aquí, se proporciona un protocolo para el aislamiento, cultivo, transfección de siRNA e inmunotinción de células madre musculares en sus respectivas miofiberes de los músculos EDL(extensor digitorum longus)de ratón. Las condiciones experimentales descritas aquí permiten el estudio y la manipulación de las células madre musculares ex vivo, incluida la investigación de la actividad miogénica sin la necesidad inherente de experimentos in vivo con animales.
Introduction
El músculo esquelético en el adulto es un tejido postmitótico compuesto principalmente por miofibras multinucleadas, que son las células efectoras de los movimientos voluntarios. Tiene una notable capacidad de regeneración, un proceso que se asemeja a la miogénesis embrionaria y sufre deficiencias en la edad y la enfermedad1. Esta sorprendente capacidad regenerativa del músculo esquelético depende de las células madre musculares (MuSC), que también se denominan células satélite debido a su ubicación entre el sarcolema y la lámina basal de las miofiberes2,3. En condiciones de reposo, los MuSC son quiescentes y se caracterizan por la expresión del factor de transcripción Pax7 y marcadores de inactividad como Sprouty14,5,6,7,8. Tras la activación, por ejemplo, después de una lesión, las MuSC abandonan el estado de reposo y regulan al alza el factor regulador miogénico MyoD9. Las MuSCs doblemente positivas Pax7/MyoD proliferan y se diferencian generando así células precursoras miogénicas, que a menudo también se denominan mioblastos. Esos mioblastos luego se diferencian aún más en miocitos alargados, un proceso que coincide con cambios moleculares y morfológicos, por ejemplo, pérdida de Pax7 y regulación ascendente de la expresión de miogenina10. Los miocitos eventualmente se fusionan entre sí o con las miofibras existentes, reparando así el tejido dañado. Es importante destacar que una pequeña fracción de células madre musculares revierte la regulación ascendente de MyoD y es capaz de autorrenovarse11. El estado de la diferenciación de MuSC y la progresión miogénica se pueden observar fácilmente mediante la investigación de marcadores miogénicos como Pax7, MyoD y Myogenin10.
El cultivo de miofibras individuales con sus MuSCs adyacentes es un excelente método para investigar la funcionalidad de MuSC en un entorno ex vivo, ya que las MuSC permanecen en su nicho endógeno12,13. El comportamiento de las MuSC está regulado por señales intrínsecas, así como por señales extrínsecas proporcionadas por el nicho, una ubicación anatómica especializada que comprende componentes de la matriz extracelular (ECM) que rodea las MuSC y la propia miofibra. Por ejemplo, uno de los reguladores extrínsecos de la inactividad MuSC es la señalización Notch. Aquí, las señales de señalización son recibidas por muSC tanto del myofiber como del ECM14,15,16. Además, el nicho MuSC es importante para controlar el eje de división de muSCs regulando así el destino celular de las células hijas MuSC17,18. Razonablemente, parámetros como las divisiones asimétricas de MuSC, la progresión miogénica y la autorrenovación se pueden evaluar de manera única en esta configuración experimental. Por ejemplo, se puede formar un grupo multicelular que surge de un MuSC después de un período de cultivo de 72 h, que puede investigarse para la aparición y el porcentaje de poblaciones miogénicas distintas, como las MuSC auto-renovadoras, proliferantes y diferenciadas8,19,20,21. El estado de diferenciación de las MuSCs puede determinarse mediante la investigación de la expresión/coexpresión de Pax7, MyoD y Myogenin. Después de 72 h de cultivo, las células de un grupo pueden ser discriminadas por los siguientes parámetros: Pax7 solo las células son MuSC autorrenovadoras, mientras que las células dobles positivas Pax7 / MyoD están proliferando / activadas MuSC y las células miogénicas diferenciadas son Myogeninpositivas 22. Además, los números de MuSC o la reentrada en el ciclo/activación celular pueden investigarse además de la progresión miogénica, por ejemplo, a través de análisis basados en inmunofluorescencia basados en los parámetros descritos anteriormente.
Aquí, se describen las características únicas del protocolo de aislamiento y cultivo de myofiber, por ejemplo, la preservación de la interacción del MuSC con su nicho. Los músculos enteros de EDL(extensor digitorum longus)del ratón se diseccionan cuidadosamente, se digieren mediante colagenasa y se trituran físicamente para obtener miofibras individuales con sus MuSC asociadas para un mayor cultivo. Además, el protocolo delinea los pasos para transfectar MuSCs con siRNA para análisis funcionales de genes candidatos y análisis consecutivos basados en inmunofluorescencia sin la necesidad de animales transgénicos.
Protocol
El sacrificio de animales debe realizarse de conformidad con la normativa nacional para la experimentación con animales. El protocolo descrito aquí se realizó de acuerdo con las directrices del Instituto Leibniz sobre el Envejecimiento - Instituto Fritz Lipmann y la directiva 2010/63/UE de la Unión Europea (UE) (número de licencia para la sustracción de órganos: O_JvM_18-20). Los pasos esenciales del protocolo se resumen en la Figura 1.
1. Preparación de placas de cultivo, medios y pipetas Pasteur
NOTA: Todos los materiales y equipos necesarios para aislar y cultivar miofibras individuales deben ser lo más estériles posible. Por lo tanto, se recomienda aislar miofibras individuales bajo una capucha de disección semiestéril.
- Use HS (suero de caballo) estéril para recubrir las placas de cultivo de tejidos. El recubrimiento evita la fijación de miofibras individuales a la superficie plástica. Para cada ratón, se requieren 4 pocillos de una placa de 12 pocillos para el aislamiento y un número dedicado de pocillos de una placa de 24 pocillos para el cultivo. Incubar los pocillos de una placa de 12 pocillos con 1 mL y los pocillos de una placa de 24 pocillos con 0,5 mL de HS durante 5 min a RT (temperatura ambiente), luego retirar el HS y dejar secar las placas durante otros 5 min.
NOTA: El SA se puede recolectar y reutilizar para fines de recubrimiento varias veces, si se mantiene estéril. - Prepare el medio de aislamiento myofiber suplementando DMEM (el medio Eagle modificado de Dulbecco con 4,5 g / L de glucosa y piruvato de sodio) con 20% FBS (suero fetal bovino), filtre a través de un filtro de 0,22 μm. Añadir medio a las placas de aislamiento pre-recubiertas (placa de 12 pocillos, medio de aislamiento de 2-4 mL por pozo) aproximadamente 30 min antes del aislamiento y equilibrar en una incubadora humidificada de 37 °C con 5% de CO2.
- Preparar el medio de cultivo myofiber suplementando DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco con 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodio) con 20% de FBS (suero fetal bovino) y 1% de extracto de embrión de pollo, filtrar a través de un filtro de 0,22 μm. Añadir 0,5 ml de medio a cada pocillo de las placas de cultivo pre-recubiertas (placa de 24 pocillos) aproximadamente 30 min antes del aislamiento y equilibrar en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
- Preparar la solución de digestión de la colagenasa disolviendo 0,2% (p/v) de colagenasa tipo 1 (de Clostridium histolyticum)en DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco con 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodio), filtrar a través de un filtro de 0,22 μm. Para dos músculos EDL(extensor digitorum longus)se utilizan 2,5 ml de solución de colagenasa en un tubo de reacción estéril de 15 ml. Además, precaliente la solución ~ 10 min en un baño de agua circulante a 37 ° C antes de comenzar el aislamiento.
- Prepare pipetas Pasteur estériles para la trituración de los músculos digeridos por la colagenasa. Usa un bolígrafo de diamantes para cortar las pipetas Pasteur.
- Para cada ratón, use una pipeta de gran diámetro con una abertura de aproximadamente 0,3 cm y una longitud de aproximadamente 10-12 cm y una segunda pipeta de vidrio con una pequeña abertura de aproximadamente 0,1 cm y una longitud de aproximadamente 22 cm(Figura 2F).
- Alisar los bordes de ambas pipetas puliendo térmicamente con la llama de un quemador Bunsen. Sostenga la punta de la pipeta durante 5-10 s en la llama con un movimiento suave para permitir una distribución equitativa del calor hasta que los bordes de vidrio afilados se alisen.
- Inmediatamente antes de su uso, cubra ambos tipos de pipetas de vidrio con HS estéril llenando toda la pipeta con ~ 2 ml de HS durante 5 minutos, a partir de entonces, expulse el HS y deje que las pipetas se sequen durante 5 minutos en RT.
2. Aislamiento muscular EDL y digestión de la colagenasa
- Rocíe todos los equipos con etanol al 70% para evitar la contaminación.
- Sacrificar al ratón de acuerdo con las regulaciones nacionales para la experimentación animal.
- Rocíe las extremidades posteriores del ratón con 70% de etanol. Use tijeras curvas finas endurecidas (borde de corte de 24 mm) y pinzas finas (Dumont 7, curvas o rectas) para eliminar la piel y exponer los músculos subyacentes. Evite cualquier contacto de los músculos subyacentes con el pelaje (aumenta el riesgo de contaminación).
- Retire la fascia circundante con pinzas curvas finas sin dañar los músculos subyacentes(Figura 2A). Cierre las pinzas para evitar que se doblen.
- Use pinzas curvas para exponer los tendones distales del músculo TA(tibial anterior)y EDL. Para retirar la TA, agarre el tendón distal de la TA con fórceps y corte con tijeras finas de resorte Vannas (borde de corte de 5 mm, diámetro de punta de 0,35 mm). Mientras sostiene la AT en el tendón, tire de ella hacia la rodilla y corte el músculo cerca de la rodilla(Figura 2B),el músculo EDL ahora está expuesto.
NOTA: Asegúrese de que solo se agarre el tendón TA en este paso, de lo contrario el EDL subyacente podría dañarse. Al cortar el músculo TA, asegúrese de que los tendones de la rodilla se puedan ver fácilmente después. - Levante el tendón distal EDL con pinzas curvas finas y corte con tijeras finas de resorte Vannas (Figura 2C). Exponga el tendón EDL proximal tirando cuidadosamente del EDL hacia la rodilla. Corte el tendón proximal con tijeras finas de resorte Vannas. Transfiera el músculo EDL a los 37 °C precalentados 2,5 ml de solución de digestión de colagenasa en el tubo de reacción de 15 ml del paso 1,4. (Figura 2D).
NOTA: Haga una pequeña incisión en el tejido conectivo externo de la rodilla para exponer completamente el tendón EDL proximal. Asegúrese de agarrar solo los tendones y no estirar demasiado el EDL. - Repita los pasos 2.3. a 2.6. con el segundo EDL. Agregue ambos músculos EDL al mismo tubo de reacción de 15 ml lleno de solución de digestión de colagenasa de 2,5 ml.
- Incubar los músculos EDL en el tubo de reacción a 37 °C en un baño de agua circulante.
NOTA: El tiempo de incubación depende de varios factores, como la actividad de la colagenasa, la edad del ratón y la cantidad de tejido fibrótico. El tiempo de incubación típico para los músculos EDL de ratones adultos (2-6 meses de edad) es de 1-1.5 h y para ratones envejecidos (18 meses de edad) 1.5-2 h. - Para evitar la digestión excesiva de los músculos, revise los músculos durante el tiempo de digestión. Detener la digestión cuando los músculos se aflojan y se ven miofibras individuales(Figura 2E). Transfiera los músculos cuidadosamente con la pipeta de gran diámetro al primer pozo de la placa de 12 pocillos precalentada que contiene el medio de aislamiento de miofiber(Figura 2G).
3. Disociación y cultura de Myofiber
- Para los siguientes pasos utilice un microscopio binocular estéreo, preferentemente equipado con una placa calefactora (37 °C). Use la pipeta de orificio grande para enjuagar los músculos con un medio de aislamiento caliente hasta que se liberen miofibras individuales. Disociar los músculos con la pipeta de gran diámetro hasta que el número deseado de miofiberes flote libremente en la solución.
NOTA: Evite la trituración excesiva para reducir el riesgo de miofibras dañadas. Se recomienda encarecidamente el uso de una placa calefactora para la disociación de miofiber, ya que la temperatura desciende durante el proceso de aislamiento, lo que resultará en la muerte de myofiber. - Transfiera las miofibras no contraídas (Figura 2H) con la pipeta de vidrio de pequeño diámetro recubierta de HS al segundo pozo lleno de medio de aislamiento para lavar los desechos y las miofiberes contraídas (dañadas) (Figura 2I).
NOTA: Para evitar el movimiento excesivo de miofibras aisladas, se pueden transferir al segundo pozo y luego se puede continuar el proceso de trituración. - Transfiera las miofibers no contraídas al siguiente(3º)bien lleno de medio de aislamiento para lavar nuevamente.
- Utilice la pipeta de vidrio de pequeño diámetro, recubierta con HS, para transferir aproximadamente 50-100 miofibers no contraídas a la placa de 24 pocillos que contiene el medio de cultivo de miofiber.
- Incubar miofibers a 37 °C, 5% CO2 durante un tiempo dedicado (se recomienda un máximo de 96 h).
NOTA: Las MuSC se dividen una vez que son planas o apical-basales después de 42 h de cultivo. Además, después de 72 h de cultivo, las MuSC forman grupos multicelulares que consisten en MuSC auto-renovadoras, proliferantes o comprometidas (diferenciadas).
4. transfección de siRNA
- 4 h después del aislamiento de miofiber, transfectar MuSC asociadas a myofiber (50-100 miofibers no contraídas en un pozo de la placa de 24 pocillos llena con medio de cultivo de 500 μL) con reactivo de transfección a base de lípidos, por ejemplo, RNAiMAX según el protocolo del fabricante con una concentración final de 5 pmol siRNA. Por lo tanto, agregue 25 μL de Opti-MEM con el volumen respectivo de siRNA a 25 μL de Opti-MEM que contengan 1,5 μL del reactivo de transfección. Incubar la mezcla de reacción durante 5 min y añadirla luego a los 500 μL de medio de cultivo.
NOTA: Se recomienda una segunda transfección después de 24 h o 48 h para períodos de cultivo más largos, por ejemplo, más de 48 h. No es necesario un cambio de medio después de la transfección.
5. Fijación y tinción IF
- Para la inmunotinción use un microscopio binocular estéreo. Todos los volúmenes en los siguientes pasos se ajustan a un pozo de una placa de 24 pocillos. Realice todos los pasos siguientes con una pipeta de pequeño diámetro recubierta de HS.
- Deseche cuidadosamente el medio de cultivo de miofibra mientras deja alguna solución en el pozo (aproximadamente 100 μL por 24 pocillos). Haga esto para todos los pasos adicionales a menos que se indique lo contrario para permitir la flotación de los myofibers. Agregue 500 μL de PFA al 2% para fijar las miofibras con sus MuSC adyacentes, incube durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Retire el sobrenadante con cuidado y lave las miofiberes tres veces con PBS (pH 7.4, 500 μL durante 5 min a RT cada una).
- Añadir 500 μL de solución de permeabilización (0,1% Triton X-100, 0,1 M de glicina en PBS, pH 7,4), incubar durante 10 min a RT.
- Retire la solución de permeabilización y agregue una solución de bloqueo de 500 μL (5% HS en PBS, pH 7.4) durante 1 h a RT.
NOTA: Compruebe la solución de bloqueo recomendada para los anticuerpos primarios para evitar la unión inespecífica. - Retire la solución bloqueadora y agregue 300 μL de dilución primaria de anticuerpos (por ejemplo, anti-Pax7 (PAX7, DSHB, sin diluir), anti-MyoD (clon G-1, Santa Cruz, 1:200)) por pozo. Incubar a 4 °C durante la noche.
- Lavar tres veces con 500 μL de PBS por pocillo (5 min a RT).
- Elimine el PBS y agregue 300 μL de dilución secundaria de anticuerpos (por ejemplo, anti-ratón-IgG1-546 y anti-ratón-IgG2b-488 1:1000) por pozo. Incubar 1 h a RT protegido de la luz. Para los siguientes pasos, se recomiendan condiciones de luz reducida.
- Lavar dos veces con 500 μL de PBS por pocillo (5 min a RT).
- Realizar tinción DAPI utilizando 500 μL de la solución por pocillo (concentración final de DAPI 10 μg/mL) durante 5 min a RT.
- Lavar dos veces con 500 μL de PBS por pocillo (5 min a RT).
- Use una pluma hidrofóbica para dibujar un círculo en un portaobjetos de vidrio microscópico para crear una barrera repelente al agua que evite el derrame de líquido que contenga miofibras. Transfiera las miofibras en el menor volumen posible al portaobjetos de vidrio microscópico y disperse en el portaobjetos de vidrio.
NOTA: Evite el tirón físico de las miofiberes sobre el portaobjetos de vidrio microscópico, ya que esto podría causar fricción que resulte en el desprendimiento de grupos de miofiberes. - Retire el líquido residual con la pipeta Pasteur de diámetro pequeño o una pipeta de 200 μL.
- Utilice dos gotas de medio de montaje acuoso y cubra las miofibers con una funda. Deje que los portaobjetos se sequen durante el tiempo recomendado por el fabricante. Guarde los portaobjetos a 4 °C en la oscuridad.
Representative Results
Este protocolo proporciona instrucciones para la derivación y el cultivo exitosos de miofibras individuales con sus MuSC asociadas de los músculos murinos de EDL. Los pasos esenciales del protocolo se resumen en la Figura 1. La disección cuidadosa de tendón a tendón de los músculos EDL(Figura 2A-C)es fundamental para un alto rendimiento de miofiberes viables. La disociación muscular se logra primero por digestión de colagenasa (Figura 2D) seguida de trituración física (Figura 2G). Las miofibras intactas (Figura 2H) se cultivan, mientras que las miofibras hipercontraídas y muertas (Figura 2I) deben excluirse del cultivo y el análisis.
Las MuSC permanecen asociadas a miofibras durante el proceso de aislamiento. La tinción de inmunofluorescencia para el factor de transcripción Pax7 identifica y distingue 7-9 núcleos MuSC de la plétora de mionúcleos por miofibra cuando se fija directamente después de completar el proceso de aislamiento(Figura 3A). La Figura 3B muestra un área ampliada de la Figura 3A con el canal de campo brillante adicional, que expone la estructura miofibrilar subcelular del miotubo y demuestra la señal de inmunofluorescencia Pax7 en el núcleo de un MuSC.
La activación y la progresión miogénica de las MuSC asociadas a miofiber se pueden analizar mediante la expresión de marcadores miogénicos. Asociados con miofibras recién aisladas (0 h), se pueden encontrar MuSC en su mayoría inactivas, que se caracterizan por la expresión de Pax7 y la ausencia de expresión de MyoD, lo que se asemeja a una condición homeostática in vivo(Figura 4,0 h). Debido al procedimiento de disección/disociación y a la composición de los medios de cultivo de miofiber, las MuSCs activan y regulan rápidamente el factor de transcripción MyoD para facilitar la proliferación, como se puede observar a las 42 horas, cuando las MuSC han sufrido su primera división(Figura 4,42 h). Después de 72 horas de cultivo, las MuSC forman grupos de progenies con diferentes destinos miogénicos que es paralelo a los patrones de expresión de diferentes marcadores miogénicos(Figura 4,72 h). Solo las células Pax7+ resisten la diferenciación y se convierten en células madre autorrenovadoras. Las células doblemente positivas Pax7+ y MyoD+ son proliferativas, mientras que las células solo MyoD+ han progresado aún más a lo largo del linaje miogénico y se diferenciarán.
El sistema de cultivo myofiber permite una interferencia eficiente de la actividad de MuSC mediante diversas intervenciones, una de ellas es la transfección de siRNA como se describe en detalle en este protocolo. Para monitorear la eficiencia de transfección de las MuSC asociadas a myofiber, se transfectó un siRNA no dirigido marcado fluorescentemente. Las MuSC positivas Pax7 acumularon siRNA citoplasmático en forma de gránulo, lo que indica una absorción eficiente(Figura 5A). No se observaron gránulos fluorescentes en el citoplasma de las miofiberes, lo que sugiere una barrera de absorción natural en las miofiberes a las 4 h después del aislamiento y que la transfección de siRNA se dirige específicamente a las MuSC. La cuantificación de células Pax7+ transfectadas positivamente por miofiber reveló que más de la mitad de todas las MuSC habían absorbido cantidades visibles de siRNA marcado fluorescentemente justo antes de completar la primera ronda de división a las 24 horas. El número de células Pax7+ transfectadas aumentó aún más hasta un 74% después de 30 horas(Figura 5B). Además, no hubo diferencias en el número de células Pax7+ por miofiber de condiciones transfectadas o no transfectadas en ambos puntos temporales, demostrando que no hubo efectos adversos en el número de células madre debido al procedimiento de transfección(Figura 5C).
En resumen, el protocolo proporciona una descripción detallada del aislamiento y cultivo de miofibras individuales de EDL con sus células madre musculares adyacentes. Permite el estudio de la actividad de las células madre musculares asociadas a miofiber ex vivo, por ejemplo, mediante análisis basados en inmunofluorescencia. La manipulación de células madre musculares mediante transfección de siRNA es eficiente y proporciona una base metodológica para los análisis funcionales.
Figura 1: Resumen esquemático de los pasos esenciales. Los pasos esenciales del procedimiento de aislamiento e inmunotinción se resumen en esta figura. Abreviaturas: DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium; FBS: Suero Fetal Bovino; CEE, Extracto de embrión de pollo; TA: tibial anterior; EDL, extensor digitorum longus Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Disección de EDL de ratón y aislamiento de miofibra única. (A) Se elimina la piel de la extremidad posterior del ratón y se retira el músculo que rodea la fascia para exponer el músculo TA(tibial anterior). (B) El músculo TA se extrae para exponer el músculo EDL (extensor digitorum longus), marcado por la flecha blanca. (C) El músculo EDL se disecciona cortando sus tendones. (D) Dos músculos EDL son digeridos por colagenasa. (E) Aparición de músculo digerido por colagenasa con miofibras individuales visibles que se aflojan desde el núcleo del tejido. (F) Pipeta Pasteur grande y de pequeño diámetro con escala. (G) Los músculos EDL (marcados por flechas negras) se trituran físicamente utilizando una pipeta Pasteur de gran diámetro. (H) Las miofibras intactas individuales son delgadas y brillantes y se pueden recolectar individualmente para su cultivo y análisis. (I) Las miofiberes hipercontraídas y muertas no son adecuadas para la cultura y el análisis. Las imágenes microscópicas de 2H y 2I fueron capturadas con un microscopio utilizando un objetivo N-Achroplan 5x. Las barras de escala son de 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen microscópica de un solo miofibio entero con sus MuSCs asociados. Se prepararon miofibras individuales de EDL de ratones jóvenes C57BL/6 y se fijaron con PFA después del aislamiento (0 h). (A) La tinción de inmunofluorescencia Pax7 y DAPI identifica las células madre musculares asociadas a miofiber (MuSC, marcadas por flechas). La imagen microscópica se capturó utilizando las baldosas y la función z-stack de un microscopio equipado con un objetivo de aceite Plan-Apochromat 40x. La barra de escala es de 200 μm. (B) Aumento de (A) que muestra el mionúcleo, un núcleo positivo Pax7 y el patrón brillante-oscuro de las estructuras miofibrilares en campo brillante. La barra de escala es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes de inmunofluorescencia de la activación de MuSC y la progresión miogénica durante el cultivo de miofibra única. Las células madre musculares (MuSCs) de miofiberes recién aisladas (0 h) representan un estado homeostático cercano a la inactividad in vivo, caracterizado por la expresión de Pax7 y la falta de expresión de MyoD. Durante el cultivo de miofibra única, la mayoría de las MuSC regulan al alza MyoD y vuelven a entrar en el ciclo celular para dividirse y proliferar (42 h). Después de 72 h de cultivo, el destino de MuSC puede ser discriminado en función de la expresión del marcador miogénico. Las células con expresión solo pax7 se autorrenovarán (flecha roja), mientras que las celdas positivas dobles Pax7 y MyoD (flecha roja / verde) continuarán proliferando. MyoD solo las células positivas (flecha verde) se han comprometido con la diferenciación miogénica. Las imágenes microscópicas se capturaron utilizando un microscopio con un objetivo Plan-Apochromat 20x (0 h, 42 h) o un objetivo LD Plan-Neofluar 40x (72 h). Las barras de escala son de 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Transfección fluorescente de siRNA de MuSCs y análisis de captación. Las miofibras individuales EDL se prepararon y transfectaron con siRNA marcado fluorescentemente (siGLO) siguiendo los pasos proporcionados por este protocolo. (A) Acumulación citoplasmática de gránulos de siGLO específicamente en una célula madre muscular positiva Pax7 (MuSC) en una sola miofibra a las 30 h de cultivo. La imagen microscópica se capturó utilizando la función z-stack y apotoma de un microscopio con un objetivo de aceite Plan-Apochromat 100x. Las barras de escala son de 5 μm. (B) Cuantificación de la absorción de siRNA por las células madre musculares pax7 positivas a las 24 o 30 h de cultivo. (C) Número de células Pax7 positivas por miofibra individual que comparan condiciones no transfectadas y transfectadas a las 24 o 30 horas de cultivo. Los datos se muestran como media con desviación estándar de n = 4 ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Aquí, se presenta un método para investigar funcionalmente el papel de un gen específico en las MuSC utilizando un enfoque in vitro. Es importante destacar que en el sistema descrito aquí, los MuSC se cultivan en condiciones, que se asemejan a la situación in vivo tanto como sea posible, preservando la mayoría de las interacciones de los MuSC con su nicho. Esto se logra cultivando miofibras aisladas con sus MuSC adyacentes en condiciones de flotación y transfección consecutiva de siRNA. Se describen los procedimientos de aislamiento de miofibra, transfección de siRNA e investigación de poblaciones de MuSC durante 72 h de cultivo mediante análisis de inmunofluorescencia. Además, se demostró que alrededor del 74% de todas las MuSC fueron transfectadas con un siRNA de control marcado fluorescentemente después de 30 h de cultivo.
Se debe prestar especial atención a la disección cuidadosa del músculo EDL, ya que el estiramiento extenso, el pellizco o la compresión conducirán a la contracción y la muerte consecutiva de las miofiberes. Además, es importante investigar grupos de MuSC de al menos 20 miofiberes diferentes por réplica por condición. Esto es necesario ya que los números y propiedades de MuSC varían debido a la existencia de subpoblaciones de MuSC. Al investigar el efecto de un siRNA específico en muSC utilizando el método de cultivo flotante de miofibra, se debe realizar una comparación de la condición con el siRNA objetivo con el control no objetivo dentro del mismo ratón y músculo. Esto se recomienda para evitar diferencias específicas del ratón que podrían cubrir o amplificar los efectos del siRNA. La eficiencia de derribo se puede determinar mediante análisis de inmunofluorescencia con anticuerpos dirigidos contra el gen objetivo utilizando miofiberes individuales con sus MuSC adyacentes. Si esto no es una opción, se puede probar la eficiencia de eliminación de siRNA en mioblastos primarios seguido de RT-PCR cuantitativa o análisis de inmunoblot. La eficiencia del siRNA debe determinarse antes de analizar el efecto del siRNA en muSCs en miofiberes individuales. El uso de un grupo inteligente que consta de 4 siRNAs diferentes frente a uno solo aumenta la eficiencia de derribo, pero también aumenta el riesgo de una orientación inespecífica. Se debe utilizar un siRNA no dirigido como control. Para monitorear directamente la eficiencia de la transfección, se puede usar un siRNA no dirigido marcado fluorescentemente como se realiza aquí. El punto de tiempo para la transfección con el siRNA es de alrededor de 4 horas después del aislamiento, un punto de tiempo en el que la lámina basal que rodea las MuSC ya es permeable para el siRNA. Si se debe investigar el efecto de un siRNA específico sobre muSCs después de 72 o 96 h, se recomienda realizar una segunda transfección de siRNA después de 24 h o 48 h para mantener una alta eficiencia de derribo.
El ensayo de cultivo de myofiber muestra diversas ventajas en comparación con la investigación de MuSCs con métodos convencionales de cultivo celular. Los MuSC permanecen unidos a los miofiberes durante todo el proceso de aislamiento, preservando así la interacción crucial del MuSC con su nicho19,23,24,25. La interacción preservada de muSC con el myofiber es un requisito previo para estudiar los efectos dependientes de nicho en la funcionalidad de MuSC, que no se pueden recapitular en cultivos de mioblastos 2D convencionales. Por ejemplo, durante el envejecimiento, las MuSC muestran una capacidad miogénica deteriorada, lo que resulta en una eficiencia reducida para regenerar el tejido muscular después del daño20,26. Este deterioro es al menos parcialmente atribuible a cambios en el nicho muSC, en particular cambios en la composición ecm27,28. El protocolo de cultivo myofiber permite el estudio y la interferencia con estos cambios aberrantes de nicho.
En contraste con el método descrito aquí, la purificación de MuSCs por técnicas de inmunoetiquetado y clasificación como FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia) o MACS (clasificación de células magnéticas) implica la eliminación de las MuSC de su nicho. Curiosamente, los cultivos 2D de MuSCs aislados de músculos envejecidos pierden sus señales extrínsecas y se comportan de manera similar a muSCs aislados de músculos jóvenes, por lo que no recapitulan la situación in vivo de manera adecuada29. Además, la disociación completa del tejido muscular y el etiquetado de MuSCs con marcadores de superficie da como resultado cambios transcriptómicos y activación de las células30,31,32. Otra ventaja del sistema de cultivo myofiber es la posibilidad de interferir con la funcionalidad muSC en varios niveles. La manipulación de MuSCs en miofibras cultivadas se puede lograr de manera efectiva mediante la eliminación de genes mediada por siRNA como se describe aquí en detalle. Asimismo, la aplicación de compuestos químicos o la entrega de proteínas recombinantes es muy eficaz para interferir con las vías de las células madre20,28. Además, los vectores de expresión retro o lentiviral permiten la introducción de genes exógenos, es decir, mutantes activos constitutivos33. Además, la influencia de los factores extrínsecos en la funcionalidad de MuSC se puede explorar en el sistema descrito aquí, por ejemplo, las condiciones de cultivo se pueden complementar con sobrenadante de diferentes fuentes fisiológicas o patológicas para modelar diferentes estados como la caquexia del cáncer34,35.
Una limitación del método descrito aquí es el hecho de que el sistema de cultivo único de miofiber no puede recapitular completamente el impacto de todos los factores sistémicos o la influencia de otros tipos de células en las MuSC. Además, el tiempo en el que las miofibras pueden mantenerse viables en cultivo es limitado y, por lo tanto, el estudio de los procesos relacionados con MuSC se centra en eventos tempranos como la activación y el compromiso miogénico. Además, la investigación de la interacción muSC con otras células de nicho como las células inmunes o las células progenitoras fibro-adipogénicas no es posible. Para investigar los efectos sistémicos sobre la funcionalidad del MuSC se pueden realizar experimentos de lesión muscular seguidos del análisis de la regeneración muscular in vivo o realizar experimentos de trasplante36,37.
En conjunto, el protocolo de aislamiento y cultivo de myofiber ofrece una gran oportunidad para estudios genéticos o mecanicistas en MuSC adultos sin el requisito de modelos de ratones transgénicos y puede reducir potencialmente la experimentación con animales.
Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos a Christine Poser y Christina Picker por su excelente asistencia técnica y lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Deutsche Forschungsgemeinschaft a JvM (MA-3975/2-1), la fundación Carl Zeiss y la Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
| chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
| collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
| horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
| MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
| siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |
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