Summary
Dans ce protocole, une méthode de culture in vitro et d’analyse fonctionnelle des cellules souches musculaires est décrite, qui préserve la plupart de leurs interactions avec leur niche endogène.
Abstract
Le tissu musculaire squelettique adulte abrite une population de cellules souches indispensable à sa capacité de régénération. En cas de lésions musculaires, les cellules souches musculaires quittent leur état de repos et activent le programme myogénique conduisant finalement à la réparation des tissus endommagés en même temps que la reconstitution du pool de cellules souches musculaires. Divers facteurs influencent l’activité des cellules souches musculaires, parmi lesquels les stimuli intrinsèques mais aussi les signaux de l’environnement direct des cellules souches musculaires, la niche des cellules souches. L’isolement et la culture de myofibres simples avec leurs cellules souches musculaires associées préservent la majeure partie de l’interaction de la cellule souche avec sa niche et constituent donc la possibilité la plus proche d’étudier la fonctionnalité des cellules souches musculaires ex vivo. Ici, un protocole pour l’isolement, la culture, la transfection de siRNA et l’immunocoloration des cellules souches musculaires sur leurs myofibres respectifs des muscles EDL(extensor digitorum longus)de souris est fourni. Les conditions expérimentales décrites ici permettent l’étude et la manipulation des cellules souches musculaires ex vivo, y compris l’étude de l’activité myogénique sans le besoin inhérent d’expériences in vivo sur les animaux.
Introduction
Le muscle squelettique chez l’adulte est un tissu postmitotique principalement composé de myofibres multinucléés, qui sont les cellules effectrices des mouvements volontaires. Il a une capacité remarquable à se régénérer, un processus qui ressemble à la myogenèse embryonnaire et subit des déficiences de l’âge et de la maladie1. Cette capacité de régénération frappante du muscle squelettique dépend des cellules souches musculaires (MuSC), également appelées cellules satellites en raison de leur emplacement entre le sarcolemme et la lame basale des myofibres2,3. Dans des conditions de repos, les MuSC sont quiescents et caractérisés par l’expression du facteur de transcription Pax7 et des marqueurs de quiescence tels que Sprouty14,5,6,7,8. Lors de l’activation, par exemple après une blessure, les MuSC quittent l’état de repos et régulent à la hausse le facteur régulateur myogénique MyoD9. Les MuSC double positifs Pax7/MyoD prolifèrent et se différencient, générant ainsi des cellules précurseurs myogéniques, également souvent appelées myoblastes. Ces myoblastes se différencient ensuite en myocytes allongés, un processus coïncidant avec des changements moléculaires et morphologiques, par exemple la perte de Pax7 et la régulation à la hausse de l’expression de la myogénine10. Les myocytes finissent ensuite par fusionner les uns avec les autres ou avec les myofibres existants, réparant ainsi le tissu endommagé. Il est important de noter qu’une petite fraction de cellules souches musculaires inverse la régulation à la hausse de MyoD et est capable de s’auto-renouveler11. L’état de la différenciation muSC et de la progression myogénique peut être facilement observé par l’étude de marqueurs myogéniques tels que Pax7, MyoD et Myogénine10.
La culture de myofibers simples avec leurs MuSC adjacents est une excellente méthode pour étudier la fonctionnalité MuSC dans un contexte ex vivo puisque les MuSC restent dans leur niche endogène12,13. Le comportement des MuSC est régulé par des signaux intrinsèques ainsi que par des signaux extrinsèques fournis par la niche, un emplacement anatomique spécialisé comprenant des composants de la matrice extracellulaire (ECM) entourant les MuSC et le myofiber lui-même. Par exemple, l’un des régulateurs extrinsèques de la quiescence MuSC est la signalisation Notch. Ici, les signaux de signalisation sont reçus par les MuSC à la fois du myofiber et de l’ECM14,15,16. De plus, la niche MuSC est importante pour contrôler l’axe de division des MuSC régulant ainsi le devenir cellulaire des cellules filles MuSC17,18. Raisonnablement, des paramètres tels que les divisions asymétriques de MuSC, la progression myogénique et l’auto-renouvellement peuvent être évalués de manière unique dans cette configuration expérimentale. Par exemple, un amas multicellulaire peut se former à partir d’un MuSC après une période de culture de 72 heures, ce qui peut être étudié pour l’apparition et le pourcentage de populations myogéniques distinctes telles que les MuSC auto-renouvelés, proliférants et différenciés8,19,20,21. L’état de différenciation des MuSC peut être déterminé par l’étude de l’expression/co-expression de Pax7, MyoD et Myogenin. Après 72 h de culture, les cellules d’un cluster peuvent être discriminées par les paramètres suivants : les cellules Pax7 seules sont des MuSC auto-renouvelées, tandis que les cellules Pax7/MyoD double positives prolifèrent/activent les MuSC et les cellules myogéniques différenciées sont Myogénine positive22. En outre, les nombres de MuSC ou la réintégration dans le cycle cellulaire / activation peuvent être étudiés en plus de la progression myogénique, par exemple, par le biais d’analyses basées sur l’immunofluorescence basées sur les paramètres décrits ci-dessus.
Ici, les caractéristiques uniques du protocole d’isolement et de culture du myofiber, par exemple la préservation de l’interaction du MuSC avec sa niche, sont décrites. Les muscles EDLentiers (extenseur digitorum longus)de souris sont soigneusement disséqués, digérés par la collagénase et triés physiquement pour obtenir des myofibres uniques avec leurs MuSC associés pour une culture ultérieure. De plus, le protocole délimite les étapes de transfecter les MuSC avec de l’ARNsi pour des analyses fonctionnelles de gènes candidats et des analyses consécutives basées sur l’immunofluorescence sans avoir besoin d’animaux transgéniques.
Protocol
Le sacrifice d’animaux doit être effectué conformément à la réglementation nationale en matière d’expérimentation animale. Le protocole décrit ici a été réalisé conformément aux directives de l’Institut Leibniz sur le vieillissement - Institut Fritz Lipmann et à la directive de l’Union européenne (UE) 2010/63/UE (numéro de licence pour le prélèvement d’organes: O_JvM_18-20). Les étapes essentielles du protocole sont résumées à la figure 1.
1. Préparation des plaques de culture, des milieux et des pipettes Pasteur
REMARQUE: Tous les matériaux et équipements nécessaires pour isoler et cultiver des myofibres uniques doivent être aussi stériles que possible. Par conséquent, il est recommandé d’isoler les myofibres simples sous une hotte de dissection semi-stérile.
- Utilisez du HS stérile (sérum de cheval) pour enduire les plaques de culture tissulaire. Le revêtement empêche la fixation de myofibres simples à la surface en plastique. Pour chaque souris, 4 puits d’une plaque de 12 puits pour l’isolement et un nombre dédié de puits d’une plaque de 24 puits pour la culture sont nécessaires. Incuber les puits d’une plaque de 12 puits avec 1 mL et les puits d’une plaque de 24 puits avec 0,5 mL de SH pendant 5 min à RT (température ambiante), puis retirer le SH et laisser sécher les plaques pendant encore 5 min.
REMARQUE: Le SH peut être collecté et réutilisé à des fins de revêtement plusieurs fois, s’il est maintenu stérile. - Préparer le milieu d’isolement des myofibères en complétant le DMEM (milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 4,5 g/L de glucose et de pyruvate de sodium) avec 20% de FBS (sérum bovin fœtal), filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Ajouter du milieu aux plaques d’isolement pré-revêtues (plaque de 12 puits, milieu d’isolement de 2-4 mL par puits) environ 30 min avant l’isolement et équilibrer dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2.
- Préparer le milieu de culture de myofibère en complétant le DMEM (milieu d’Eagle modifié de Dulbecco avec 4,5 g/L de glucose et de pyruvate de sodium) avec 20% de FBS (sérum bovin fœtal) et 1% d’extrait d’embryon de poulet, filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Ajouter 0,5 mL de milieu à chaque puits des plaques de culture pré-enduites (plaque de 24 puits) environ 30 min avant l’isolement et équilibrer dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2.
- Préparer la solution de digestion de la collagénase en dissolvant 0,2% (p / v) de collagénase de type 1 (de Clostridium histolyticum)dans du DMEM (milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 4,5 g / L de glucose et de pyruvate de sodium), filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Pour deux muscles EDL(extenseur digitorum longus),utilisez une solution de collagénase de 2,5 mL dans un tube de réaction stérile de 15 mL. De plus, préchauffez la solution ~10 min dans un bain-marie circulant à 37 °C avant de commencer l’isolement.
- Préparez des pipettes Pasteur stériles pour la trituration des muscles digérés par la collagénase. Utilisez un stylo diamant pour couper les pipettes Pasteur.
- Pour chaque souris, utilisez une pipette à grand alésage avec une ouverture d’environ 0,3 cm et une longueur d’environ 10-12 cm et une deuxième pipette en verre avec une petite ouverture d’environ 0,1 cm et une longueur d’environ 22 cm (Figure 2F).
- Lisser les bords des deux pipettes en polissant à la chaleur avec la flamme d’un brûleur Bunsen. Maintenez la pointe de la pipette pendant 5 à 10 s dans la flamme avec un mouvement doux pour permettre une répartition égale de la chaleur jusqu’à ce que les bords tranchants du verre se lissent.
- Immédiatement avant utilisation, enduisez les deux types de pipettes en verre de HS stérile en remplissant toute la pipette avec ~ 2 mL de HS pendant 5 min, puis éjectez le HS et laissez les pipettes sécher pendant 5 min à RT.
2. Isolement musculaire EDL et digestion de la collagénase
- Vaporisez tout l’équipement avec 70% d’éthanol pour éviter toute contamination.
- Sacrifier la souris conformément aux réglementations nationales en matière d’expérimentation animale.
- Vaporisez les membres postérieurs de la souris avec 70% d’éthanol. Utilisez des ciseaux incurvés fins durcis (tranchant de 24 mm) et des pinces fines (Dumont 7, incurvées ou droites) pour enlever la peau et exposer les muscles sous-jacents. Évitez tout contact des muscles sous-jacents avec la fourrure (augmente le risque de contamination).
- Retirez le fascia environnant avec de fines pinces incurvées sans endommager les muscles sous-jacents (Figure 2A). Fermez les pinces pour éviter de vous pencher.
- Utilisez une pince incurvée pour exposer les tendons distaux du muscle TA(tibialis antérieur)et de l’EDL. Pour retirer l’AT, saisissez le tendon TA distal avec une pince et coupez avec de fins ciseaux à ressort Vannas (tranchant de 5 mm, diamètre de la pointe de 0,35 mm). Tout en maintenant l’AT au niveau du tendon, tirez-le vers le genou et coupez le muscle près du genou(Figure 2B),le muscle EDL est maintenant exposé.
REMARQUE: Assurez-vous que seul le tendon TA est saisi à cette étape, sinon l’EDL sous-jacent pourrait être endommagé. Lorsque vous coupez le muscle TA, assurez-vous que les tendons du genou peuvent être vus facilement par la suite. - Soulevez le tendon distal EDL avec de fines pinces incurvées et coupez avec de fins ciseaux à ressort Vannas (Figure 2C). Exposez le tendon proximal de l’EDL en tirant soigneusement l’EDL vers le genou. Coupez le tendon proximal avec de fins ciseaux à ressort Vannas. Transférer le muscle EDL dans la solution de digestion de la collagénase préchauffée à 37 °C 2,5 mL dans le tube de réaction de 15 mL de l’étape 1.4. (Figure 2D).
REMARQUE: Faites une petite incision au niveau du tissu conjonctif externe du genou pour exposer complètement le tendon proximal EDL. Assurez-vous de ne saisir que les tendons et de ne pas trop étirer l’EDL. - Répétez les étapes 2.3. à 2.6. avec le deuxième EDL. Ajouter les deux muscles EDL dans le même tube de réaction de 15 mL rempli de solution de digestion de 2,5 mL de collagénase.
- Incuber les muscles EDL dans le tube de réaction à 37 °C dans un bain-marie circulant.
REMARQUE: Le temps d’incubation dépend de plusieurs facteurs, tels que l’activité de la collagénase, l’âge de la souris et la quantité de tissu fibrotique. Le temps d’incubation typique pour les muscles EDL des souris adultes (2-6 mois) est de 1-1,5 h et pour les souris âgées (18 mois) de 1,5-2 h. - Pour éviter une digestion excessive des muscles, vérifiez les muscles pendant le temps de digestion. Arrêtez la digestion lorsque les muscles se relâchent et que des myofibres simples sont visibles (Figure 2E). Transférer soigneusement les muscles avec la pipette à gros alésage vers le premier puits de la plaque préavertissée de 12 puits contenant un milieu d’isolement de myofibre (Figure 2G).
3. Dissociation et culture des myofibères
- Pour les étapes suivantes, utilisez un microscope binoculaire stéréo, équipé de préférence d’une plaque chauffante (37 °C). Utilisez la pipette à grand alésage pour rincer les muscles avec un milieu d’isolement chaud jusqu’à ce que des myofibers simples soient libérés. Dissocier les muscles avec la pipette à grand alésage jusqu’à ce que le nombre souhaité de myofibres flotte librement dans la solution.
REMARQUE: Évitez la trituration excessive pour réduire le risque d’endommagement des myofibres. L’utilisation d’une plaque chauffante pour la dissociation des myofibres est fortement conseillée car la température baisse pendant le processus d’isolement, ce qui entraînera la mort du myofiber. - Transférer les myofibres non contractés (Figure 2H) avec la pipette en verre de petit alésage revêtue de SH vers le deuxième puits rempli de milieu isolant pour éliminer les débris et les myofibres contractés (endommagés) (Figure 2I).
REMARQUE: Pour éviter un mouvement excessif des myofibres isolés, ils peuvent être transférés au deuxième puits, puis le processus de trituration peut être poursuivi. - Transférer les myofibres non contractés au prochain (3e)bien rempli de milieu isolant pour les laver à nouveau.
- Utilisez la pipette en verre de petit calibre, recouverte de SH, pour transférer environ 50 à 100 myofibres non contractés dans la plaque de 24 puits contenant le milieu de culture du myofibre.
- Incuber des myofibres à 37 °C, 5% de CO2 pendant un temps dédié (96 h maximum recommandés).
REMARQUE: Les MuSC se divisent une fois planaire ou apical-basal après 42 h de culture. De plus, après 72 h de culture, les MuSC forment des amas multicellulaires constitués de MuSC auto-renouvelés, proliférants ou engagés (différenciés).
4. Transfection de siRNA
- 4 h après l’isolement du myofiber, transfecter les MuSC associés au myofiber (50 à 100 myofibers non contractés dans un puits de la plaque de 24 puits remplie d’un milieu de culture de 500 μL) avec un réactif de transfection à base de lipides, par exemple RNAiMAX selon le protocole du fabricant avec une concentration finale de 5 pmol siRNA. Par conséquent, ajouter 25 μL d’Opti-MEM avec le volume respectif de siRNA à 25 μL d’Opti-MEM contenant 1,5 μL du réactif de transfection. Incuber le mélange réactionnel pendant 5 min et l’ajouter ensuite aux 500 μL de milieu de culture.
REMARQUE: Une deuxième transfection après 24 h ou 48 h est recommandée pour des périodes de culture plus longues, par exemple plus de 48 h. Un changement de milieu après la transfection n’est pas nécessaire.
5. Fixation et coloration IF
- Pour l’immunocoloration, utilisez un microscope binoculaire stéréo. Tous les volumes dans les étapes suivantes sont ajustés à un puits d’une plaque de 24 puits. Effectuez toutes les étapes suivantes à l’aide d’une pipette de petit calibre revêtue de HS.
- Jeter soigneusement le milieu de culture du myofiber tout en laissant une solution dans le puits (environ 100 μL par 24 puits). Faites-le pour toutes les étapes ultérieures, sauf indication contraire pour permettre le flottement des myofibres. Ajouter 500 μL de PFA à 2% pour fixer les myofibers avec leurs MuSC adjacents, incuber pendant 5 min à température ambiante (RT).
- Retirez soigneusement le surnageant et lavez les myofibers trois fois avec du PBS (pH 7,4, 500 μL pendant 5 min à RT chacun).
- Ajouter 500 μL de solution de perméabilisation (0,1% de Triton X-100, 0,1 M de glycine dans le PBS, pH 7,4), incuber pendant 10 min à TA.
- Retirer la solution de perméabilisation et ajouter 500 μL de solution bloquante (5% HS dans PBS, pH 7,4) pendant 1 h à RT.
REMARQUE: Vérifiez la solution de blocage recommandée pour les anticorps primaires afin d’éviter toute liaison non spécifique. - Retirer la solution bloquante et ajouter 300 μL de dilution d’anticorps primaires (p. ex. anti-Pax7 (PAX7, DSHB, non dilué), anti-MyoD (clone G-1, Santa Cruz, 1:200)) par puits. Incuber à 4 °C pendant la nuit.
- Laver trois fois avec 500 μL de PBS par puits (5 min à TA).
- Retirer le PBS et ajouter 300 μL de dilution d’anticorps secondaires (p. ex., IgG1-546 anti-souris et IgG2b-488 anti-souris 1:1000) par puits. Incuber 1 h à RT à l’abri de la lumière. Pour les étapes suivantes, des conditions de réduction de la lumière sont recommandées.
- Laver deux fois avec 500 μL de PBS par puits (5 min à TA).
- Effectuer la coloration DAPI en utilisant 500 μL de la solution par puits (concentration finale de DAPI 10 μg/mL) pendant 5 min à RT.
- Laver deux fois avec 500 μL de PBS par puits (5 min à TA).
- Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle sur une lame de verre microscopique afin de créer une barrière hydrofuge qui empêchera le déversement de liquide contenant des myofibres. Transférez les myofibres dans le plus petit volume possible sur la lame de verre microscopique et dispersez-les sur la lame de verre.
REMARQUE: Évitez de tirer physiquement les myofibres sur la lame de verre microscopique, car cela pourrait provoquer des frottements entraînant le détachement des grappes des myofibres. - Retirez le liquide résiduel avec la pipette Pasteur de petit calibre ou une pipette de 200 μL.
- Utilisez deux gouttes de support de montage aqueux et couvrez les myofibres avec un couvercle. Laissez sécher les lames pendant le temps recommandé par le fabricant. Conservez les diapositives à 4 °C dans l’obscurité.
Representative Results
Ce protocole fournit des instructions pour une dérivation et une culture réussies de myofibres uniques avec leurs MuSC associés à partir de muscles murins EDL. Les étapes essentielles du protocole sont résumées à la figure 1. Une dissection minutieuse des muscles EDL(Figure 2A-C)est essentielle pour un rendement élevé de myofibres viables. La dissociation musculaire est obtenue d’abord par digestion de la collagénase (Figure 2D) suivie d’une trituration physique (Figure 2G). Les myofibres intacts (Figure 2H) sont cultivés, tandis que les myofibres hypercontractés et morts (Figure 2I) doivent être exclus de la culture et de l’analyse.
Les CSM restent associés aux myofibres pendant le processus d’isolement. La coloration par immunofluorescence du facteur de transcription Pax7 identifie et distingue les noyaux 7-9 MuSC de la pléthore de myonoyaux par myofiber lorsqu’ils sont fixés directement après la fin du processus d’isolement (Figure 3A). La figure 3B montre une zone agrandie de la figure 3A avec le canal de champ lumineux supplémentaire, qui expose la structure myofibrillaire subcellulaire du myotube et démontre le signal d’immunofluorescence Pax7 dans le noyau d’un MuSC.
L’activation et la progression myogénique des MuSC associés aux myofibères peuvent être analysées par l’expression de marqueurs myogéniques. Associés à des myofibres fraîchement isolés (0 h), on peut trouver principalement des MuSC quiescents, caractérisés par l’expression de Pax7 et l’absence d’expression de MyoD, ressemblant ainsi à une condition homéostatique in vivo(Figure 4, 0 h). En raison de la procédure de dissection/dissociation et de la composition du milieu de culture myofiber, les MuSC activent et régulent rapidement le facteur de transcription MyoD pour faciliter la prolifération comme on peut l’observer à 42 heures, lorsque les MuSC ont subi leur première division (Figure 4, 42 h). Après 72 heures de culture, les MuSC forment des grappes de progénitures avec des destins myogéniques différents qui sont mis en parallèle avec les modèles d’expression de différents marqueurs myogéniques (Figure 4, 72 h). Seules les cellules Pax7+ résistent à la différenciation et deviennent des cellules souches auto-renouvelées. Les cellules double positives Pax7+ et MyoD+ sont prolifératives, tandis que les cellules MyoD+ seules ont progressé le long de la lignée myogénique et se différencient.
Le système de culture de myofiber permet une interférence efficace de l’activité MuSC par diverses interventions, dont l’une est la transfection de siRNA comme décrit en détail dans ce protocole. Pour surveiller l’efficacité de transfection des MuSC associés aux myofibères, un siRNA non ciblé marqué par fluorescence a été transfecté. Les MuSC Pax7 positifs ont accumulé de l’ARNsi cytoplasmique de manière granuleuse, ce qui indique une absorption efficace(Figure 5A). Aucun granule fluorescent n’a été observé dans le cytoplasme des myofibres suggérant une barrière d’absorption naturelle dans les myofibres 4 h après l’isolement et que la transfection de siRNA cible spécifiquement les MuSC. La quantification des cellules Pax7+ positivement transfectées par myofiber a révélé que plus de la moitié de tous les MuSC avaient absorbé des quantités visibles d’ARNsi marqué par fluorescence juste avant la fin du premier cycle de division à 24 heures. Le nombre de cellules Pax7+ transfectées a encore augmenté jusqu’à 74 % après 30 heures(Figure 5B). De plus, il n’y avait aucune différence dans le nombre de cellules Pax7+ par myofiber de conditions transfectées ou non transfectées aux deux moments, ne démontrant aucun effet indésirable sur le nombre de cellules souches en raison de la procédure de transfection (Figure 5C).
En résumé, le protocole fournit une description détaillée de l’isolement et de la culture des myofibres simples EDL avec leurs cellules souches musculaires adjacentes. Il permet d’étudier ex vivo l’activité des cellules souches musculaires associées aux myofibères, par exemple par des analyses basées sur l’immunofluorescence. La manipulation des cellules souches musculaires par transfection de siRNA est efficace et fournit une base méthodologique pour les analyses fonctionnelles.
Figure 1: Résumé schématique des étapes essentielles. Les étapes essentielles de la procédure d’isolement et d’immunocoloration sont résumées dans cette figure. Abréviations : DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; FBS, Sérum bovin fœtal; CEE, Extrait d’embryon de poulet; TA, tibialis antérieur; EDL, extensor digitorum longus Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Dissection de l’EDL de la souris et isolement du myofibre unique. (A) La peau du membre postérieur de la souris est enlevée et le muscle entourant le fascia est retiré pour exposer le muscle TA(tibialis antérieur). (B) Le muscle TA est retiré pour exposer le muscle EDL(extensor digitorum longus),marqué par la flèche blanche. (C) Le muscle EDL est disséqué en coupant ses tendons. (D) Deux muscles EDL sont digérés par la collagénase. (E) Apparition d’un muscle digéré par la collagénase avec des myofibres simples visibles se desserrant du noyau tissulaire. (F) Pipette Pasteur de grand et petit calibre avec échelle. (G) Les muscles EDL (marqués par des flèches noires) sont physiquement triturés à l’aide d’une pipette Pasteur de gros calibre. (H) Les myofibres intacts simples sont minces et brillants et peuvent être collectés individuellement pour la culture et l’analyse. (I) Les myofibres hypercontractés et morts ne conviennent pas à la culture et à l’analyse. Les images microscopiques de 2H et 2I ont été capturées au microscope à l’aide d’un objectif N-Achroplan 5x. Les barres d’échelle sont de 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Image microscopique d’un seul myofiber entier avec ses MuSC associés. Des myofibres simples provenant d’EDL de jeunes souris C57BL/6 ont été préparés et fixés au PFA après isolement (0 h). (A) La coloration par immunofluorescence Pax7 et DAPI identifie les cellules souches musculaires associées au myofibère (MuSC, marquées par des flèches). L’image microscopique a été capturée à l’aide des tuiles et de la fonction z-stack d’un microscope équipé d’un objectif d’huile Plan-Apochromat 40x. La barre d’échelle est de 200 μm. (B) Grossissement de (A) montrant le myonuclée, un noyau positif Pax7 et le motif clair-sombre des structures myofibrillaires en champ clair. La barre d’échelle est de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Images d’immunofluorescence de l’activation du MuSC et de la progression myogénique au cours d’une culture de myofibère unique. Les cellules souches musculaires (CSM) de myofibres fraîchement isolés (0 h) représentent un état homéostatique proche de la quiescence in vivo, caractérisé par l’expression de Pax7 et l’absence d’expression de MyoD. Au cours de la culture d’un seul myofibère, la plupart des MuSC régulent à la hausse myoD et réintègrent le cycle cellulaire pour se diviser et proliférer (42 h). Après 72 h de culture, le sort du MuSC peut être discriminé en fonction de l’expression des marqueurs myogéniques. Les cellules avec une expression Pax7 uniquement s’auto-renouvelleront (flèche rouge) tandis que pax7 et MyoD doubleront les cellules positives (flèche rouge/verte) continueront de proliférer. Seules les cellules positives (flèche verte) se sont engagées dans la différenciation myogénique. Des images microscopiques ont été capturées à l’aide d’un microscope avec un objectif Plan-Apochromat 20x (0 h, 42 h) ou un objectif LD Plan-Neofluar 40x (72 h). Les barres d’échelle sont de 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Transfection de siRNA fluorescent des CS MuSC et analyse de l’absorption. Les myofibres simples EDL ont été préparés et transfectés avec du siRNA marqué par fluorescence (siGLO) en suivant les étapes prévues par ce protocole. (A) Accumulation cytoplasmique de granules de siGLO spécifiquement dans une cellule souche musculaire Pax7 positive (MuSC) sur un seul myofibère à 30 h de culture. L’image microscopique a été capturée à l’aide de la fonction z-stack et apotome d’un microscope avec un objectif d’huile Plan-Apochromat 100x. Les barres d’échelle sont de 5 μm. (B) Quantification de l’absorption de siRNA par les cellules souches musculaires positives Pax7 à 24 ou 30 h de culture. (C) Nombre de cellules Pax7 positives par myofiber unique comparant les conditions non transfectées et transfectées à 24 ou 30 heures de culture. Les données sont présentées comme moyennes avec un écart-type de n = 4 souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Ici, une méthode pour étudier fonctionnellement le rôle d’un gène spécifique dans les MuSC en utilisant une approche in vitro est présentée. Il est important de noter que dans le système décrit ici, les MuSC sont cultivés dans des conditions qui ressemblent autant que possible à la situation in vivo, préservant autant que possible la plupart des interactions des MuSC avec leur niche. Ceci est accompli en cultivant des myofibers isolés avec leurs MuSC adjacents dans des conditions flottantes et une transfection consécutive de siRNA. Les procédures d’isolement des myofibres, de transfection de siRNA et d’étude des populations de MuSC pendant 72 h de culture par des analyses d’immunofluorescence sont décrites. En outre, il a été démontré qu’environ 74% de tous les MuSC ont été transfectés avec un siRNA témoin marqué par fluorescence après 30 h de culture.
Une attention particulière doit être accordée à la dissection minutieuse du muscle EDL, car un étirement, un pincement ou une compression étendus entraîneront une contraction et la mort consécutive des myofibres. En outre, il est important d’étudier les grappes de MuSC d’au moins 20 myofibres différents par réplique et par condition. Ceci est nécessaire car les nombres et les propriétés muSC varient en raison de l’existence de sous-populations MuSC. Lors de l’étude de l’effet d’un siRNA spécifique sur les MuSC à l’aide de la méthode de culture de myofibre flottant, une comparaison de la condition avec le siRNA cible au contrôle non ciblé doit être effectuée au sein de la même souris et du même muscle. Ceci est recommandé pour éviter les différences spécifiques à la souris qui pourraient couvrir ou amplifier les effets du siRNA. L’efficacité de l’élimination peut être déterminée par des analyses d’immunofluorescence avec des anticorps dirigés contre le gène cible à l’aide de myofibers simples avec leurs MuSC adjacents. Si ce n’est pas une option, on peut tester l’efficacité de l’élimination du siRNA dans les myoblastes primaires, suivie d’analyses quantitatives RT-PCR ou immunoblot. L’efficacité du siRNA doit être déterminée avant d’analyser l’effet du siRNA sur les MuSC sur les myofibres simples. L’utilisation d’un pool intelligent composé de 4 siRNA différents contre un seul augmente l’efficacité de l’élimination mais augmente également le risque de ciblage non spécifique. Un siRNA non ciblé doit être utilisé comme témoin. Pour surveiller directement l’efficacité de la transfection, on peut utiliser un siRNA non ciblé marqué par fluorescence comme effectué ici. Le point de temps pour la transfection avec le siRNA est d’environ 4 heures après l’isolement, un point de temps où la lame basale entourant les MuSC est déjà perméable pour le siRNA. Si l’effet d’un siRNA spécifique sur les MuSC après 72 ou 96 h doit être étudié, il est recommandé d’effectuer une deuxième transfection de siRNA après 24 h ou 48 h pour maintenir une efficacité de knockdown élevée.
Le test de culture de myofiber présente divers avantages par rapport à l’étude des MuSC avec des méthodes de culture cellulaire conventionnelles. Les MuSC restent attachés aux myofibers pendant tout le processus d’isolement, préservant ainsi l’interaction cruciale du MuSC avec sa niche19,23,24,25. L’interaction préservée des MuSC avec le myofiber est une condition préalable à l’étude des effets dépendants de niche sur la fonctionnalité MuSC, qui ne peuvent pas être récapitulés dans les cultures de myoblastes 2D conventionnelles. Par exemple, pendant le vieillissement, les MuSC présentent une capacité myogénique altérée entraînant une efficacité réduite pour régénérer le tissu musculaire après des dommages20,26. Cette dépréciation est au moins partiellement attribuable aux changements dans le créneau MuSC, en particulier aux changements dans la composition del’ECM27,28. Le protocole de culture myofiber permet l’étude et l’interférence avec ces changements de niche aberrants.
Contrairement à la méthode décrite ici, la purification des MuSC par immunomarquage et tri de techniques telles que FACS (fluorescence activated cell sorting) ou MACS (magnetic cell sorting) implique le retrait des MuSC de leur niche. Fait intéressant, les cultures 2D de MuSC isolés de muscles âgés perdent leurs signaux extrinsèques et se comportent de manière similaire aux MuSC isolés de jeunes muscles, ne récapitulant ainsi pas la situation in vivo de manière appropriée29. De plus, la dissociation complète du tissu musculaire et le marquage des MuSC avec des marqueurs de surface entraînent des changements transcriptomiques et l’activation des cellules30,31,32. Un autre avantage du système de culture myofiber est la possibilité d’interférer avec la fonctionnalité MuSC à différents niveaux. La manipulation des MuSC sur les myofibers cultivés peut être réalisée efficacement par l’élimination des gènes médiée par le siRNA, comme décrit ici en détail. De même, l’application de composés chimiques ou l’administration de protéines recombinantes est très efficace pour interférer avec les voies des cellules souches20,28. De plus, les vecteurs d’expression rétro- ou lentiviraux permettent l’introduction de gènes exogènes, c’est-à-dire de mutants actifs constitutifs33. En outre, l’influence des facteurs extrinsèques sur la fonctionnalité MuSC peut être explorée dans le système décrit ici, par exemple, les conditions de culture peuvent être complétées par un surnageant provenant de différentes sources physiologiques ou pathologiques pour modéliser différents états comme la cachexie cancéreuse34,35.
Une limitation de la méthode décrite ici est le fait que le système de culture de myofibre unique ne peut pas récapituler complètement l’impact de tous les facteurs systémiques ou de l’influence d’autres types de cellules sur les MuSC. En outre, le temps pendant lequel les myoibères peuvent être maintenus viables en culture est limité et, par conséquent, l’étude des processus liés au MuSC se concentre sur les événements précoces tels que l’activation et l’engagement myogénique. En outre, l’étude de l’interaction MuSC avec d’autres cellules de niche telles que les cellules immunitaires ou les cellules progénitrices fibro-adipogènes n’est pas possible. Pour étudier les effets systémiques sur la fonctionnalité MuSC, on peut soit effectuer des expériences de lésions musculaires suivies d’une analyse de la régénération musculaire in vivo, soit effectuer des expériences de transplantation36,37.
Pris ensemble, le protocole d’isolement et de culture des myofibres offre une excellente opportunité pour des études génétiques ou mécanistes sur des MuSC adultes sans l’exigence de modèles murins transgéniques et peut potentiellement réduire l’expérimentation animale.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions Christine Poser et Christina Picker pour leur excellente assistance technique et leur lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft à JvM (MA-3975/2-1), à la fondation Carl Zeiss et à la Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
| chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
| collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
| horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
| MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
| siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |
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