Summary
In dit protocol wordt een in vitro kweek- en functionele analysemethode voor spierstamcellen beschreven, die de meeste van hun interacties met hun endogene niche behoudt.
Abstract
Volwassen skeletspierweefsel herbergt een stamcelpopulatie die onmisbaar is voor zijn vermogen om te regenereren. Bij spierbeschadiging verlaten spierstamcellen hun rustige toestand en activeren het myogene programma dat uiteindelijk leidt tot het herstel van beschadigd weefsel dat gepaard gaat met de aanvulling van de spierstamcelpool. Verschillende factoren beïnvloeden de spierstamcelactiviteit, waaronder intrinsieke stimuli maar ook signalen van de directe spierstamcelomgeving, de stamcelniche. De isolatie en kweek van enkele myofiberen met hun bijbehorende spierstamcellen behoudt het grootste deel van de interactie van de stamcel met zijn niche en is daarom de dichtstbijzijnde mogelijkheid om spierstamcelfunctionaliteit ex vivo te bestuderen. Hier wordt een protocol verstrekt voor de isolatie, kweek, siRNA-transfectie en immunostaining van spierstamcellen op hun respectieve myofiberen van muis EDL (extensor digitorum longus) spieren. De hier geschetste experimentele omstandigheden maken de studie en manipulatie van spierstamcellen ex vivo mogelijk, inclusief onderzoek naar myogene activiteit zonder de inherente noodzaak van in vivo dierproeven.
Introduction
Skeletspieren in de volwassene is een postmitotisch weefsel dat voornamelijk bestaat uit multinucleated myofibers, die de effectorcellen zijn voor vrijwillige bewegingen. Het heeft een opmerkelijk vermogen om te regenereren, een proces dat lijkt op embryonale myogenese en beperkingen in leeftijd en ziekte ondergaat1. Dit opvallende regeneratieve vermogen van skeletspieren is afhankelijk van spierstamcellen (MuSC's), die ook satellietcellen worden genoemd vanwege hun locatie tussen het sarcolemma en de basale lamina van myofibers2,3. Onder rustomstandigheden zijn MuSC's rustig en worden gekenmerkt door de expressie van de transcriptiefactor Pax7 en rustmarkers zoals Sprouty14,5,6,7,8. Bij activering, bijvoorbeeld na letsel, verlaten MuSC's de rusttoestand en upreguleren de myogene regulerende factor MyoD9. De Pax7/MyoD dubbel positieve MuSC's prolifereren en differentiëren waardoor myogene voorlopercellen worden gegenereerd, die ook vaak myoblasten worden genoemd. Die myoblasten differentiëren vervolgens verder in langwerpige myocyten, een proces dat samenvalt met moleculaire en morfologische veranderingen, bijvoorbeeld verlies van Pax7 en upregulatie van Myogenine-expressie10. Myocyten smelten dan uiteindelijk met elkaar of met bestaande myofiberen en herstellen zo het beschadigde weefsel. Belangrijk is dat een klein deel van de spierstamcellen de MyoD-upregulatie terugdraait en in staat is om zichzelf te vernieuwen11. De status van MuSC-differentiatie en myogene progressie kan gemakkelijk worden waargenomen door onderzoek naar myogene markers zoals Pax7, MyoD en Myogenin10.
De cultuur van enkele myofibers met hun aangrenzende MuSC's is een uitstekende methode om MuSC-functionaliteit in een ex vivo-setting te onderzoeken, omdat MuSC's in hun endogene niche blijven12,13. Het gedrag van MuSC's wordt gereguleerd door intrinsieke signalen en extrinsieke signalen die worden geleverd door de niche, een gespecialiseerde anatomische locatie bestaande uit componenten van de extracellulaire matrix (ECM) rond de MuSC's en de myofiber zelf. Een van de extrinsieke regulatoren van MuSC-rust is bijvoorbeeld Notch-signalering. Hier worden signaleringssignalen ontvangen door MuSC's van zowel de myofiber als de ECM14,15,16. Bovendien is de MuSC-niche belangrijk om de delingsas van MuSC's te beheersen en zo het cellot van MuSC-dochtercellen te reguleren17,18. Redelijk kunnen parameters zoals asymmetrische MuSC-divisies, myogene progressie en zelfvernieuwing uniek worden beoordeeld in deze experimentele opstelling. Er kan zich bijvoorbeeld een meercellige cluster vormen die ontstaat uit één MuSC na een kweekperiode van 72 uur, die kan worden onderzocht op het voorkomen en percentage van verschillende myogene populaties zoals zelfvernieuwende, prolifererende en verder gedifferentieerde MuSC's8,19,20,21. De differentiatietoestand van MuSC's kan worden bepaald door onderzoek naar de expressie/co-expressie van Pax7, MyoD en Myogenine. Na 72 uur cultuur kunnen de cellen in een cluster worden onderscheiden door de volgende parameters: Pax7 alleen cellen zijn zelfvernieuwende MuSC's, terwijl Pax7 / MyoD dubbele positieve cellen prolifererende / geactiveerde MuSC's en verder gedifferentieerde myogene cellen zijn Myogenine positief22. Bovendien kunnen MuSC-nummers of terugkeer in de celcyclus/activering worden onderzocht naast myogene progressie, bijvoorbeeld door middel van immunofluorescentie-gebaseerde analyses op basis van de hierboven beschreven parameters.
Hier worden de unieke kenmerken van het myofiber isolatie- en cultuurprotocol, bijvoorbeeld het behoud van de interactie van het MuSC met zijn niche, beschreven. Muis hele EDL (extensor digitorum longus) spieren worden zorgvuldig ontleed, verteerd door collagenase, en fysiek getriatificeerd om enkele myofibers te verkrijgen met hun geassocieerde MuSC's voor verdere kweek. Bovendien beschrijft het protocol de stappen om MuSCs te transfecteren met siRNA voor functionele analyses van kandidaatgenen en opeenvolgende immunofluorescentie-gebaseerde analyses zonder de noodzaak van transgene dieren.
Protocol
Het offeren van dieren moet gebeuren in overeenstemming met de nationale voorschriften voor dierproeven. Het hier beschreven protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Leibniz Institute on Aging - Fritz Lipmann Institute en de Richtlijn 2010/63/EU van de Europese Unie (EU) (licentienummer voor orgaanoogst: O_JvM_18-20). Essentiële stappen van het protocol zijn samengevat in figuur 1.
1. Bereiding van kweekplaten, media en Pasteur pipetten
OPMERKING: Alle materialen en apparatuur die nodig zijn om afzonderlijke myofibers te isoleren en te kweken, moeten zo steriel mogelijk zijn. Daarom wordt aanbevolen om enkele myofiberen te isoleren onder een semi-steriele dissectiekap.
- Gebruik steriel HS (paardenserum) om weefselkweekplaten te coaten. Coating voorkomt de bevestiging van enkele myofibers aan het kunststof oppervlak. Voor elke muis zijn 4 putten van een 12-putplaat voor de isolatie en een speciaal aantal putten van een 24-putplaat voor het kweken vereist. Incubeer de putten van een 12-putplaat met 1 ml en de putten van een 24-putplaat met 0,5 ml HS gedurende 5 minuten bij RT (kamertemperatuur), verwijder vervolgens de HS en laat de platen nog eens 5 minuten drogen.
OPMERKING: HS kan meerdere keren worden verzameld en hergebruikt voor coatingdoeleinden, mits steriel gehouden. - Bereid myofiber isolatiemedium door DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium met 4,5 g/L glucose en natriumpyruvaat) aan te vullen met 20% FBS (foetaal runderserum), filter door het filter van 0,22 μm. Voeg medium toe aan de voorgecoate isolatieplaten (12-well plaat, 2-4 ml isolatiemedium per put) ongeveer 30 minuten voor de isolatie en equilibrate in een bevochtigde incubator van 37 °C met 5% CO2.
- Bereid myofiber kweekmedium door DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium met 4,5 g/L glucose en natriumpyruvaat) aan te vullen met 20% FBS (foetaal runderserum) en 1% kippenembryo-extract, filter door 0,22 μm filter. Voeg ongeveer 30 minuten voor de isolatie 0,5 ml medium toe aan elke put van de voorgecoate kweekplaten (24-well plate) en breng in evenwicht in een bevochtigde incubator van 37 °C met 5% CO2.
- Bereid collagenase-verteringsoplossing door 0,2% (w / v) collagenase type 1 (van Clostridium histolyticum) op te lossen in DMEM (Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium met 4,5 g / L glucose en natriumpyruvaat), filter door 0,22 μm filter. Voor twee EDL(extensor digitorum longus)spieren gebruiken 2,5 ml collagenase-oplossing in een steriele reactiebuis van 15 ml. Verwarm de oplossing bovendien ~ 10 minuten voor in een circulerend waterbad bij 37 °C voordat u met de isolatie begint.
- Bereid steriele Pasteur pipetten voor trituratie van de collagenase-verteerde spieren. Gebruik een diamantpen om de Pasteur pipetten te snijden.
- Gebruik voor elke muis een pipet met grote boring met een opening van ongeveer 0,3 cm en een lengte van ongeveer 10-12 cm en een tweede glazen pipet met een kleine opening van ongeveer 0,1 cm en een lengte van ongeveer 22 cm (figuur 2F).
- Maak de randen van beide pipetten glad door warmtepolijsten met de vlam van een Bunsen-brander. Houd de pipetpunt 5-10 s in de vlam met zachte beweging om een gelijke warmteverdeling mogelijk te maken totdat de scherpe glasranden glad worden.
- Bestrijk onmiddellijk voor gebruik beide soorten glazen pipetten met steriel HS door de hele pipet gedurende 5 minuten te vullen met ~ 2 ml HS, daarna de HS uit te werpen en de pipetten gedurende 5 minuten te laten drogen bij RT.
2. EDL spierisolatie en collagenase vertering
- Spuit alle apparatuur met 70% ethanol om vervuiling te voorkomen.
- Offer de muis op in overeenstemming met de nationale voorschriften voor dierproeven.
- Spuit de achterpoten van de muis in met 70% ethanol. Gebruik een geharde fijn gebogen schaar (24 mm snijkant) en een fijne tang (Dumont 7, gebogen of recht) om de huid te verwijderen en de onderliggende spieren bloot te leggen. Vermijd elk contact van de onderliggende spieren met de vacht (verhoogt het risico op besmetting).
- Verwijder de omliggende fascia met een fijn gebogen tang zonder de onderliggende spieren te beschadigen(figuur 2A). Sluit de tang om buigen te voorkomen.
- Gebruik een gebogen tang om de distale pezen van de TA(tibialis anterieure)en EDL-spier bloot te leggen. Om de TA te verwijderen, pak je de distale TA-pees met een tang en knip je met een fijne Vannas-veerschaar (5 mm snijkant, 0,35 mm tipdiameter). Terwijl u de TA bij de pees houdt, trekt u deze naar de knie en snijdt u de spier dicht bij de knie(figuur 2B),wordt de EDL-spier nu blootgesteld.
OPMERKING: Zorg ervoor dat alleen de TA-pees in deze stap wordt gepakt, anders kan de onderliggende EDL beschadigd raken. Let er bij het afsnijden van de TA-spier op dat de pezen bij de knie achteraf goed te zien zijn. - Til de distale EDL-pees op met een fijne gebogen tang en knip met een fijne Vannas-veerschaar (figuur 2C). Stel de proximale EDL-pees bloot door de EDL voorzichtig naar de knie te trekken. Knip de proximale pees door met een fijne Vannas veerschaar. Breng de EDL-spier over naar de voorverwarmde 2,5 ml collagenaseverteringsoplossing van 37 °C in de reactiebuis van 15 ml uit stap 1.4. (Figuur 2D).
OPMERKING: Maak een kleine incisie aan het bindweefsel van de buitenste knie om de proximale EDL-pees volledig bloot te leggen. Zorg ervoor dat je alleen de pezen vastpakt en de EDL niet te veel uitrekt. - Herhaal stap 2.3. tot 2.6. met de tweede EDL. Voeg beide EDL-spieren toe aan dezelfde reactiebuis van 15 ml gevuld met 2,5 ml collagenase-verteringsoplossing.
- Incubeer de EDL-spieren in de reactiebuis bij 37 °C in een circulerend waterbad.
OPMERKING: Incubatietijd is afhankelijk van verschillende factoren, zoals collagenase-activiteit, leeftijd van de muis en hoeveelheid fibrotisch weefsel. De typische incubatietijd voor EDL-spieren van volwassen muizen (2-6 maanden oud) is 1-1,5 uur en voor oudere muizen (18 maanden oud) 1,5-2 uur. - Om overmatige vertering van de spieren te voorkomen, controleert u de spieren tijdens de verteringstijd. Stop de spijsvertering wanneer spieren losser worden en enkele myofiberen zichtbaar zijn(figuur 2E). Breng de spieren voorzichtig over met de pipet met grote boring naar de eerste put van de voorgewarmde 12-putplaat met myofiber isolatiemedium(figuur 2G).
3. Myofiber dissociatie en cultuur
- Gebruik voor de volgende stappen een stereo verrekijkermicroscoop, bij voorkeur uitgerust met een verwarmingsplaat (37 °C). Gebruik de pipet met grote boring om de spieren te spoelen met warm isolatiemedium totdat enkele myofibers worden vrijgegeven. Dissociëer de spieren met de pipet met grote boring totdat het gewenste aantal myofibers vrij in de oplossing zweeft.
OPMERKING: Vermijd overmatige trituratie om het risico op beschadigde myofibers te verminderen. Het gebruik van een verwarmingsplaat voor myofiberdissociatie wordt sterk aanbevolen, omdat de temperatuur daalt tijdens het isolatieproces, wat zal resulteren in myofiber-dood. - Breng niet-gecontracteerde myofibers (figuur 2H) met de met GS gecoate glazen pipet met kleine boring over naar de tweede put gevuld met isolatiemedium om puin en samengetrokken (beschadigde) myofibers weg te spoelen (figuur 2I).
OPMERKING: Om overmatige beweging van geïsoleerde myofibers te voorkomen, kunnen ze worden overgebracht naar de tweede put en vervolgens kan het trituratieproces worden voortgezet. - Breng niet-gecontracteerde myofibers over naar de volgende(3e)goed gevuld met isolatiemedium om opnieuw te wassen.
- Gebruik de met HS beklede pipet met kleine boring om ongeveer 50-100 niet-samengetrokken myofibers over te brengen naar de 24-putplaat met myofibercultuurmedium.
- Incubeer myofibers bij 37 °C, 5% CO2 voor speciale tijd (maximaal 96 uur wordt aanbevolen).
OPMERKING: MuSC's delen eenmaal planair of apisch-basaal na 42 uur cultuur. Daarnaast vormen MuSC's na 72 uur cultuur meercellige clusters bestaande uit zelfvernieuwende, woekerende of toegewijde (gedifferentieerde) MuSC's.
4. siRNA-transfectie
- 4 uur na myofiber-isolatie transfecteren myofiber-geassocieerde MuSC's (50-100 niet-gecontracteerde myofibers in één put van de 24-putplaat gevuld met 500 μL kweekmedium) met op lipiden gebaseerd transfectiereagens, bijv. RNAiMAX volgens het protocol van de fabrikant met een eindconcentratie van 5 pmol siRNA. Voeg daarom 25 μL Opti-MEM met het respectieve volume siRNA toe aan 25 μL Opti-MEM met 1,5 μL transfectiereagens. Incubeer het reactiemengsel gedurende 5 minuten en voeg het vervolgens toe aan het 500 μL kweekmedium.
OPMERKING: Een tweede transfectie na 24 uur of 48 uur wordt aanbevolen voor langere kweekperioden, bijvoorbeeld meer dan 48 uur. Een verandering van medium na transfectie is niet nodig.
5. Fixatie en IF-kleuring
- Gebruik voor immunostaining een stereo binoculaire microscoop. Alle volumes in de volgende stappen worden aangepast aan één put van een 24-well plaat. Voer alle volgende stappen uit met een HS-gecoate pipet met kleine boring.
- Gooi het myofiber-kweekmedium voorzichtig weg terwijl u een oplossing in de put laat (ongeveer 100 μL per 24-put). Doe dit voor alle verdere stappen, tenzij anders vermeld om het drijven van de myofibers mogelijk te maken. Voeg 500 μL van 2% PFA toe om de myofibers te fixeren met hun aangrenzende MuSC's, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder het supernatant voorzichtig en was de myofibers driemaal met PBS (pH 7,4, 500 μL gedurende 5 minuten bij RT elk).
- Voeg 500 μL permeabilisatieoplossing toe (0,1% Triton X-100, 0,1 M Glycine in PBS, pH 7,4), incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
- Verwijder de permeabilisatieoplossing en voeg 500 μL blokkerende oplossing (5% HS in PBS, pH 7,4) toe gedurende 1 uur bij RT.
OPMERKING: Controleer de aanbevolen blokkerende oplossing voor primaire antilichamen om niet-specifieke binding te voorkomen. - Verwijder de blokkerende oplossing en voeg 300 μL primaire antilichaamverdunning (bijv. anti-Pax7 (PAX7, DSHB, onverdund), anti-MyoD (kloon G-1, Santa Cruz, 1:200)) per put toe. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Drie keer wassen met 500 μL PBS per putje (5 min bij RT).
- Verwijder PBS en voeg 300 μL secundaire antilichaamverdunning (bijv. anti-muis-IgG1-546 en anti-muis-IgG2b-488 1:1000) per put toe. Incubeer 1 uur bij RT beschermd tegen licht. Voor de volgende stappen worden lichte omstandigheden aanbevolen.
- Was twee keer met 500 μL PBS per put (5 min bij RT).
- Voer DAPI-kleuring uit door 500 μL van de oplossing per put te gebruiken (uiteindelijke DAPI-concentratie 10 μg / ml) gedurende 5 minuten bij RT.
- Was twee keer met 500 μL PBS per put (5 min bij RT).
- Gebruik een hydrofobe pen om een cirkel op een microscopische glazen dia te tekenen om een waterafstotende barrière te creëren die het morsen van vloeistof met myofibers voorkomt. Breng de myofibers in het kleinst mogelijke volume over op de microscopische glasplaat en verspreid ze over de glasplaat.
OPMERKING: Vermijd fysiek trekken van de myofibers over de microscopische glasplaat, omdat dit wrijving kan veroorzaken, wat kan leiden tot het loskoppelen van clusters van myofibers. - Verwijder de resterende vloeistof met de pasteurpipet met kleine boring of een pipet van 200 μL.
- Gebruik twee druppels waterig bevestigingsmedium en bedek de myofibers met een coverslip. Laat de dia's drogen voor de door de fabrikant aanbevolen tijd. Bewaar de dia's bij 4 °C in het donker.
Representative Results
Dit protocol geeft instructies voor succesvolle afleiding en kweek van enkele myofiberen met hun geassocieerde MuSC's uit murine EDL-spieren. Essentiële stappen van het protocol zijn samengevat in figuur 1. Zorgvuldige pees-tot-peesdissectie van de EDL-spieren (figuur 2A-C) is van cruciaal belang voor een hoge opbrengst van levensvatbare myofiberen. Spierdissociatie wordt eerst bereikt door collagenasevertering (figuur 2D) gevolgd door fysieke trituratie (figuur 2G). Intacte myofiberen (figuur 2H) worden gekweekt, terwijl hypercontracteerde en dode myofiberen (figuur 2I) moeten worden uitgesloten van cultuur en analyse.
MuSC's blijven myofiber-geassocieerd tijdens het isolatieproces. Immunofluorescentiekleuring voor de transcriptiefactor Pax7 identificeert en onderscheidt 7-9 MuSC-kernen van de overvloed aan myonuclei per myofiber wanneer deze direct na voltooiing van het isolatieproces worden gefixeerd(figuur 3A). Figuur 3B toont een vergroot gebied uit figuur 3A met het extra helderveldkanaal, dat de subcellulaire myofibrillaire structuur van de myotube blootlegt en pax7-immunofluorescentiesignaal in de kern van een MuSC laat zien.
Activering en myogene progressie van myofiber geassocieerde MuSC's kunnen worden geanalyseerd door myogene markerexpressie. Geassocieerd met vers geïsoleerde myofibers (0 h), kunnen meestal rustige MuSC's worden gevonden, die worden gekenmerkt door Pax7-expressie en afwezigheid van MyoD-expressie, waardoor ze lijken op een in vivo homeostatische toestand (Figuur 4, 0 h). Door de dissectie/dissociatieprocedure en de samenstelling van de myofibercultuurmedia activeren en upreguleren de MuSC's snel de transcriptiefactor MyoD om proliferatie te vergemakkelijken, zoals kan worden waargenomen na 42 uur, wanneer MuSC's hun eerste deling hebben ondergaan(figuur 4,42 uur). Na 72 uur cultuur vormen MuSC's clusters van nakomelingen met verschillende myogene lotgevallen die parallel lopen met de expressiepatronen van verschillende myogene markers(figuur 4,72 h). Pax7+ alleen cellen weerstaan differentiatie en worden zelfvernieuwende stamcellen. Pax7+ en MyoD+ dubbel positieve cellen zijn proliferatief, terwijl MyoD+ alleen cellen verder zijn gevorderd langs de myogene afstamming en zullen differentiëren.
Het myofiber-cultuursysteem zorgt voor een efficiënte interferentie van MuSC-activiteit door verschillende interventies, waaronder siRNA-transfectie zoals in detail beschreven in dit protocol. Om de transfectie-efficiëntie van myofiber-geassocieerde MuSC's te monitoren, werd een fluorescerend gelabeld niet-gericht siRNA getransfecteerd. Pax7-positieve MuSCs accumuleerden cytoplasmatisch siRNA op een korrelachtige manier, wat wijst op een efficiënte opname(figuur 5A). Er werden geen fluorescerende korrels waargenomen in het cytoplasma van myofibers, wat wijst op een natuurlijke opnamebarrière in myofiberen na 4 uur na isolatie en dat siRNA-transfectie specifiek gericht is op MuSC's. Kwantificering van positief getransfecteerde Pax7+ cellen per myofiber onthulde dat meer dan de helft van alle MuSC's zichtbare hoeveelheden fluorescerend gelabeld siRNA had opgenomen vlak voordat de eerste delingronde na 24 uur was voltooid. Het aantal getransfecteerde Pax7+ cellen nam na 30 uur verder toe tot 74%(figuur 5B). Bovendien was er geen verschil in het aantal Pax7+-cellen per myofiber van getransfecteerde of niet-getransfecteerde omstandigheden op beide tijdstippen, wat geen nadelige effecten op het stamcelaantal als gevolg van de transfectieprocedure aantoonde (figuur 5C).
Samenvattend geeft het protocol een gedetailleerde beschrijving van de isolatie en kweek van EDL single myofibers met hun aangrenzende spierstamcellen. Het maakt de studie van myofiber-geassocieerde spierstamcelactiviteit ex vivo mogelijk, bijvoorbeeld door immunofluorescentie-gebaseerde analyses. Manipulatie van spierstamcellen door siRNA-transfectie is efficiënt en biedt een methodologische basis voor functionele analyses.
Figuur 1: Schematische samenvatting van essentiële stappen. De essentiële stappen van de isolatie- en immunostainingprocedure zijn samengevat in deze figuur. Afkortingen: DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium; FBS, Foetaal Runderserum; CEE, kippenembryo-extract; TA, tibialis anterior; EDL, extensor digitorum longus Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Muis EDL dissectie en enkele myofiber isolatie. (A) De huid van de muis hindlimb wordt verwijderd en de spier rondom fascia wordt weggetrokken om de TA (tibialis anterieure) spier bloot te leggen. (B) De TA-spier wordt verwijderd om de EDL(extensor digitorum longus)spier bloot te leggen, gemarkeerd door de witte pijl. (C) De EDL-spier wordt ontleed door de pezen door te snijden. (D) Twee EDL-spieren worden collagenase verteerd. (E)Verschijning van collagenase verteerde spier met zichtbare enkele myofiberen die loskomen van de weefselkern. (F) Grote en kleinzijdige Pasteur pipet met schaal. (G) De EDL-spieren (gemarkeerd door zwarte pijlen) worden fysiek getriangeerd met behulp van een pasteurpipet met grote boring. (H) Enkele intacte myofiberen zijn dun en glanzend en kunnen individueel worden verzameld voor kweek en analyse. (I) Hypercontracted en dode myofibers zijn ongeschikt voor cultuur en analyse. De microscopische beelden van 2H en 2I zijn gemaakt met een microscoop met behulp van een N-Achroplan 5x objectief. Schaalbalken zijn 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Microscopisch beeld van een hele myofiber met de bijbehorende MuSC's. Enkele myofiberen van EDL van jonge C57BL/6 muizen werden bereid en PFA-gefixeerd na isolatie (0 uur). Pax7en DAPI immunofluorescentiekleuring identificeren myofiber geassocieerde spierstamcellen (MuSC's, gemarkeerd door pijlen). Het microscopische beeld werd vastgelegd met behulp van de tegels en z-stack-functie van een microscoop uitgerust met een Plan-Apochromat 40x olie objectief. Schaalbalk is 200 μm. (B) Vergroting van (A) met de myonuclei, één Pax7 positieve kern en het helder-donkere patroon van myofibrillaire structuren in helder veld. Schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunofluorescentiebeelden van MuSC-activering en myogene progressie tijdens enkelvoudige myofibercultuur. Spierstamcellen (MuSC's) van vers geïsoleerde myofiberen (0 h) vertegenwoordigen een homeostatische toestand dicht bij in vivo rust, gekenmerkt door expressie van Pax7 en gebrek aan MyoD-expressie. Tijdens de enkelvoudige myofibercultuur upreguleren de meeste MuSC's MyoD en komen ze opnieuw in de celcyclus om zich te delen en te prolifereren (42 uur). Na 72 uur cultuur kan het MuSC-lot worden gediscrimineerd op basis van myogene markerexpressie. Cellen met pax7 alleen expressie zullen zichzelf vernieuwen (rode pijl), terwijl Pax7 en MyoD dubbele positieve cellen (rode / groene pijl) blijven prolifereren. MyoD alleen positieve cellen (groene pijl) hebben zich gecommitteerd aan myogene differentiatie. Microscopische beelden werden gemaakt met een microscoop met een Plan-Apochromat 20x objectief (0 h, 42 h) of een LD Plan-Neofluar 40x objectief (72 h). Schaalbalken zijn 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Fluorescerende siRNA-transfectie van MuSC's en opnameanalyse. EDL single myofibers werden bereid en getransfecteerd met fluorescerend gelabeld siRNA (siGLO) volgens de stappen van dit protocol. (A) Cytoplasmatische accumulatie van siGLO-korrels specifiek in een Pax7 positieve spierstamcel (MuSC) op een enkele myofiber bij 30 uur cultuur. Het microscopische beeld werd vastgelegd met behulp van de z-stack en apotome-functie van een microscoop met een Plan-Apochromat 100x olieobjectief. Schaalstaven zijn 5 μm. (B) Kwantificering van siRNA-opname door Pax7-positieve spierstamcellen bij 24 of 30 uur cultuur. (C) Aantal Pax7-positieve cellen per enkele myofiber waarbij niet-getransfecteerde en getransfecteerde omstandigheden worden vergeleken bij 24 of 30 uur cultuur. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde met standaarddeviatie van n = 4 muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hier wordt een methode gepresenteerd om de rol van een specifiek gen in MuSCs functioneel te onderzoeken met behulp van een in vitro benadering. Belangrijk is dat in het hier beschreven systeem de MuSC's worden gekweekt in omstandigheden die zoveel mogelijk lijken op de in vivo situatie, waarbij de meeste interacties van de MuSC's met hun niche behouden blijven. Dit wordt bereikt door geïsoleerde myofiberen te kweken met hun aangrenzende MuSC's onder zwevende omstandigheden en opeenvolgende siRNA-transfectie. De procedures van myofiberisolatie, siRNA-transfectie en onderzoek van MuSC-populaties gedurende 72 uur cultuur door middel van immunofluorescentieanalyses worden beschreven. Bovendien werd aangetoond dat ongeveer 74% van alle MuSC's na 30 uur cultuur werden getransfecteerd met een fluorescerend gelabeld controlesiRNA.
Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de zorgvuldige dissectie van de EDL-spier, omdat uitgebreid strekken, knijpen of knijpen zal leiden tot samentrekking en opeenvolgende dood van myofibers. Verder is het belangrijk om clusters van MuSC's van ten minste 20 verschillende myofiberen per replicatie per aandoening te onderzoeken. Dit is nodig omdat MuSC-nummers en -eigenschappen variëren vanwege het bestaan van MuSC-subpopulaties. Bij het onderzoeken van het effect van een specifiek siRNA op MuSC's met behulp van de zwevende myofibercultuurmethode moet een vergelijking van de aandoening met het gerichte siRNA met de niet-gerichte controle worden uitgevoerd binnen dezelfde muis en spier. Dit wordt aanbevolen om muisspecifieke verschillen te vermijden die de effecten van het siRNA kunnen bedekken of versterken. De knockdown-efficiëntie kan worden bepaald door immunofluorescentieanalyses met antilichamen gericht tegen het doelgen met behulp van enkele myofiberen met hun aangrenzende MuSC's. Als dit geen optie is, kan men de siRNA knockdown-efficiëntie in primaire myoblasten testen, gevolgd door kwantitatieve RT-PCR- of immunoblotanalyses. De efficiëntie van het siRNA moet worden bepaald voordat het effect van het siRNA op MuSC's op enkele myofiberen wordt geanalyseerd. Het gebruik van een slimme pool bestaande uit 4 verschillende siRNA's versus een enkele verhoogt de knockdown-efficiëntie, maar verhoogt ook het risico op niet-specifieke targeting. Een niet-gericht siRNA moet als controle worden gebruikt. Om de transfectie-efficiëntie direct te monitoren, kan men een fluorescerend gelabeld niet-gericht siRNA gebruiken zoals hier wordt uitgevoerd. Het tijdstip voor transfectie met het siRNA is ongeveer 4 uur na isolatie, een tijdstip waarop de basale lamina rond de MuSC's al doorlaatbaar is voor het siRNA. Als het effect van een specifiek siRNA op MuSC's na 72 of 96 uur moet worden onderzocht, wordt aanbevolen om na 24 uur of 48 uur een tweede siRNA-transfectie uit te voeren om een hoge knockdown-efficiëntie te behouden.
De myofiber-cultuurtest vertoont diverse voordelen in vergelijking met het onderzoek van MuSC's met conventionele celkweekmethoden. MuSC's blijven tijdens het hele isolatieproces aan de myofiberen gehecht, waardoor de cruciale interactie van het MuSC met zijn niche19,23,24,25behoudenblijft. De bewaarde interactie van MuSC's met de myofiber is een voorwaarde voor het bestuderen van niche-afhankelijke effecten op MuSC-functionaliteit, die niet kunnen worden samengevat in conventionele 2D-myoblastculturen. Tijdens het ouder worden vertonen MuSC's bijvoorbeeld een verminderde myogene capaciteit, wat resulteert in een verminderde efficiëntie om spierweefsel te regenereren na schade20,26. Deze bijzondere waardevermindering is ten minste gedeeltelijk toe te schrijven aan veranderingen in de MuSC-niche, met name veranderingen in de samenstelling van de ECU27,28. Het myofiber-cultuurprotocol maakt het mogelijk om deze afwijkende nicheveranderingen te bestuderen en te verstoren.
In tegenstelling tot de hier beschreven methode, omvat zuivering van MuSC's door immunolabeling- en sorteertechnieken zoals FACS (fluorescentie geactiveerde celsortering) of MACS (magnetische celsortering) de verwijdering van de MuSC's uit hun niche. Interessant is dat 2D-culturen van geïsoleerde MuSC's uit verouderde spieren hun extrinsieke signalen verliezen en zich vergelijkbaar gedragen met MuSC's geïsoleerd uit jonge spieren, waardoor de in vivo situatie niet op de juiste manier wordt samengevat29. Bovendien resulteert de volledige dissociatie van het spierweefsel en het labelen van MuSC's met oppervlaktemarkers in transcriptomische veranderingen en activering van de cellen30,31,32. Een ander voordeel van het myofiber-cultuursysteem is de mogelijkheid om de MuSC-functionaliteit op verschillende niveaus te verstoren. Manipulatie van MuSC's op gekweekte myofibers kan effectief worden bereikt door siRNA-gemedieerde gen knockdown zoals hier in detail beschreven. Evenzo is de toepassing van chemische verbindingen of de afgifte van recombinante eiwitten zeer effectief om te interfereren met stamcelroutes20,28. Bovendien maken retro- of lentivirale expressievectoren de introductie van exogene genen mogelijk, d.w.z. constitutieve actieve mutanten33. Bovendien kan de invloed van extrinsieke factoren op musc-functionaliteit worden onderzocht in het hier beschreven systeem, bijvoorbeeld de kweekomstandigheden kunnen worden aangevuld met supernatant uit verschillende fysiologische of pathologische bronnen om verschillende toestanden zoals kankercachexie te modelleren34,35.
Een beperking van de hier beschreven methode is het feit dat het enkele myofibercultuursysteem de impact van alle systemische factoren of invloed van andere celtypen op MuSC's niet volledig kan samenvatten. Ook is de tijd waarin de myofiberen levensvatbaar kunnen worden gehouden in cultuur beperkt en daarom richt de studie van MuSC-gerelateerde processen zich op vroege gebeurtenissen zoals activering en myogene betrokkenheid. Bovendien is het onderzoek naar de MuSC-interactie met andere nichecellen zoals immuuncellen of fibro-adipogene voorlopercellen niet mogelijk. Om systemische effecten op MuSC-functionaliteit te onderzoeken, kan men spierletselexperimenten uitvoeren, gevolgd door de analyse van spierregeneratie in vivo of transplantatie-experimenten uitvoeren36,37.
Alles bij elkaar biedt het myofiber-isolatie- en kweekprotocol grote kansen voor genetische of mechanistische studies op volwassen MuSC's zonder de vereiste van transgene muismodellen en kan het mogelijk dierproeven verminderen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken Christine Poser en Christina Picker voor hun uitstekende technische assistentie en kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft aan JvM (MA-3975/2-1), de Carl Zeiss foundation en de Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
| chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
| collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
| horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
| MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
| siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |
References
- Henze, H., Jung, M. J., Ahrens, H. E., Steiner, S., von Maltzahn, J. Skeletal muscle aging - Stem cells in the spotlight. Mechanisms of Ageing and Development. 189, 111283 (2020).
- Chang, N. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells: the architects of skeletal muscle. Current Topics in Developmental Biology. 107, 161-181 (2014).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysics and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (13), 2559-2570 (2019).
- Motohashi, N., Asakura, A. Muscle satellite cell heterogeneity and self-renewal. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2, 1 (2014).
- Huttner, S. S., et al. Isolation and culture of individual myofibers and their adjacent muscle stem cells from aged and adult skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 2045, 25-36 (2019).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- Mourikis, P., et al. A critical requirement for notch signaling in maintenance of the quiescent skeletal muscle stem cell state. Stem Cells. 30 (2), 243-252 (2012).
- Pisconti, A., Cornelison, D. D., Olguin, H. C., Antwine, T. L., Olwin, B. B. Syndecan-3 and Notch cooperate in regulating adult myogenesis. Journal of Cell Biology. 190 (3), 427-441 (2010).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).
- Troy, A., et al. Coordination of satellite cell activation and self-renewal by Par-complex-dependent asymmetric activation of p38alpha/beta MAPK. Cell Stem Cell. 11 (4), 541-553 (2012).
- Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A., Brack, A. S. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
- Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127, Pt 21 4543-4548 (2014).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Eliazer, S., et al. Wnt4 from the Niche Controls the Mechano-Properties and Quiescent State of Muscle Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 654-665 (2019).
- Goel, A. J., Rieder, M. K., Arnold, H. H., Radice, G. L., Krauss, R. S. Niche cadherins control the quiescence-to-activation transition in muscle stem cells. Cell Reports. 21 (8), 2236-2250 (2017).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
- Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular wisp1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12 (3), 333-344 (2013).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24 (2), 213-225 (2019).
- Judson, R. N., et al. The Hippo pathway member Yap plays a key role in influencing fate decisions in muscle satellite cells. Journal of Cell Science. 125, Pt 24 6009-6019 (2012).
- He, W. A., et al. NF-kappaB-mediated Pax7 dysregulation in the muscle microenvironment promotes cancer cachexia. Journal of Clinical Investigation. 123 (11), 4821-4835 (2013).
- Schmidt, M., Poser, C., von Maltzahn, J. Wnt7a counteracts cancer cachexia. Molecular Therapy Oncolytics. 16, 134-146 (2020).
- Feige, P., Rudnicki, M. A. Isolation of satellite cells and transplantation into mice for lineage tracing in muscle. Nature Protocols. 15 (3), 1082-1097 (2020).
- Garry, G. A., Antony, M. L., Garry, D. J. Cardiotoxin induced injury and skeletal muscle regeneration. Methods in Molecular Biology. 1460, 61-71 (2016).
