Summary
이 프로토콜에서 근육 줄기 세포에 대한 체외 배양 및 기능 분석 방법이 설명되어 있어 내인성 틈새 시장을 통해 대부분의 상호 작용을 보존합니다.
Abstract
성인 골격 근육 조직은 재생 능력에 대 한 필수 불가결 한 줄기 세포 인구를 항구. 근육 손상시, 근육 줄기 세포는 그들의 정지 상태를 떠나 궁극적으로 근육 줄기 세포 풀의 보충과 함께 손상된 조직의 복구로 이어지는 근생 프로그램을 활성화. 다양한 요인이 근육 줄기 세포 활동에 영향을 미치며, 그 중 본질적인 자극뿐만 아니라 직접 근육 줄기 세포 환경, 줄기 세포 틈새 에서 신호. 그들의 관련 된 근육 줄기 세포와 단일 심근 섬유의 격리 및 배양 틈새 와 줄기 세포의 상호 작용의 대부분을 보존 하 고, 따라서, 근육 줄기 세포 기능을 공부 하는 가장 가까운 가능성 ex vivo. 여기서, 마우스EDL(엑스텐소디소룸 롱러스)근육으로부터 각각의 근섬유에 대한 근육 줄기세포의 격리, 배양, siRNA 형질 및 면역염색을 위한 프로토콜이 제공된다. 여기에 설명된 실험 조건은 생체 내동물 실험에서 내재된 필요 없이 근생 활성의 조사를 포함하여 근육 줄기 세포 ex vivo의 연구 그리고 조작을 허용합니다.
Introduction
성인의 골격 근은 주로 다중 핵근섬유로 구성된 후미토조직으로, 이는 자발적인 움직임을 위한 이펙터 세포이다. 그것은 배아 근신생을 닮고 나이와 질병1에있는 손상을 겪는 프로세스, 재생하는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 골격 근육의 이 눈에 띄는 재생 능력은 근육 줄기 세포에 따라 달라집니다 (MuSCs), 이는 또한 사콜렘과 근섬유의 기저 라미나 사이의 위치로 인해 위성 세포라고2,3. 휴식 조건에서 MuSC는 정지및 전사 인자 Pax7및 Sprouty14,5,6,7,8과같은 정지 마커의 발현을 특징으로한다. 활성화 시, 예를 들어, 부상 후, MuSC는 정지 상태를 떠나 근생 조절 요인 MyoD9을강화한다. Pax7/MyoD 이중 양성 MuSCs는 증식및 분화하여 근생세포세포를 생성하며, 이는 종종 근막세포라고도 한다. 그 myoblasts는 그 때 더 길쭉한 근구로 분화합니다, 분자및 형태학적 변화와 일치하는 프로세스, 예를 들면, Pax7의 손실 및 Myogenin 발현의 강화 조절(10). 심근세포는 결국 서로 또는 기존 근섬유에 융합하여 손상된 조직을 복구합니다. 중요 한 것은, 근육 줄기 세포의 작은 분수는 MyoD 업 조절을 되돌리고 자가 갱신 할 수 있습니다11. MuSC 분화 및 근생학적 진행의 상태는 Pax7, MyoD 및 Myogenin10과같은 근생 마커의 조사에 의해 쉽게 관찰될 수 있다.
인접한 MuSC를 이용한 단일 근섬유의 문화는 MuSC가 내인성 틈새시장 12,13에남아 있기 때문에 전 생체 설정에서 MuSC 기능을 조사하는 훌륭한 방법입니다. MuSCs의 동작은 내재신호뿐만 아니라 틈새 시장에서 제공하는 외신 신호, MuSC 및 근섬유 자체를 둘러싼 세포외 매트릭스(ECM)의 구성 요소를 포함하는 특수 해부학적 위치에 의해 조절된다. 예를 들어, MuSC 퀴싱의 외신 조절제 중 하나는 노치 시그널링입니다. 여기서, 시그널링큐는 근섬유와 ECM14,15,16모두에서 MuSC에 의해 수신된다. 더욱이, MuSC 틈새는 MuSC의 분할 축을 제어하는 것이 중요하다 따라서 MuSC 딸 세포의 세포 운명을 조절17,18. 합리적으로, 비대칭 MuSC 분열과 같은 매개 변수, 근생 진행 및 자기 갱신은 이 실험적인 설정에서 고유하게 평가될 수 있습니다. 예를 들어, 다세포 클러스터는 72h 배양 기간 이후에 하나의 MuSC로부터 발생하는 형태를 형성할 수 있으며, 이는 자가 갱신, 증식 및 추가분화된 MuSC8,19,20,21과같은 뚜렷한 근생 집단의 발생 및백분율을조사할 수 있다. MuSC의 분화 상태는 Pax7, MyoD 및 묘게닌의 발현/공동 표현에 대한 조사에 의해 결정될 수 있다. 배양의 72h 후 클러스터내의 세포는 다음 매개변수에 의해 구별될 수 있다: Pax7 만 세포는 자체 갱신 MuSC이고, Pax7/MyoD 이중 양성 세포는 확산/활성화된 MuSC및 더욱 분화된 근생 세포는 묘게닌 양성22이다. 더욱이, 상기에 기술된 파라미터에 기초한 면역형광기반 분석을 통해, 예를 들어, 근생적 진행 이외에, 예를 들어, 세포 주기/활성화에 대한 MuSC 수치 또는 재진입을 조사할 수 있다.
여기서, 근섬유 절연 및 배양 프로토콜의 독특한 특징, 예를 들어, 그 틈새 와 MuSC의 상호 작용의 보존, 설명된다. 마우스 전체 EDL(엑스텐소 디지토리룸 롱투스)근육은 조심스럽게 해부, 콜라게나아제에 의해 소화, 그리고 물리적으로 더 많은 문화를 위해 자신의 관련 MuSCs와 단일 심섬유를 얻기 위해 세트리술. 더욱이, 이 프로토콜은 유전자의 기능적 분석을 위해 siRNA를 사용하여 MuSC를 횡단하는 단계와 형질전환 동물의 필요 없이 연속적인 면역형광계 분석을 묘사한다.
Protocol
동물의 희생은 동물 실험에 대한 국가 규정에 따라 수행되어야한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 노화에 라이프 니츠 연구소의 지침에 따라 수행되었다 - 프리츠 리만 연구소와 유럽 연합 (EU) 지침 2010/63 / EU (장기 수확라이센스 번호: O_JvM_18-20). 프로토콜의 필수 단계는 그림 1로요약됩니다.
1. 문화 판, 미디어 및 파스퇴르 파이펫 준비
참고: 단일 근섬유를 분리하고 배양하는 데 필요한 모든 재료와 장비는 가능한 한 멸균되어야 합니다. 따라서, 반멸 해부 후드 에서 단일 심섬유를 분리하는 것이 좋습니다.
- 멸균 HS(말 세럼)를 사용하여 조직 배양 판을 코팅하십시오. 코팅은 플라스틱 표면에 단일 심섬유의 부착을 방지합니다. 각 마우스에 대해, 격리를 위한 12웰 플레이트의 4웰과 배양을 위한 24웰 플레이트의 전용 수의 우물이 필요합니다. 1mL로 12웰 플레이트의 우물과 RT(실온)에서 5분 동안 HS0.5mL의 24웰 플레이트의 우물을 배양한 다음 HS를 제거하고 접시를 5분 더 건조하게 합니다.
참고: HS는 멸균을 보관하는 경우 코팅 목적으로 여러 번 수집 및 재사용할 수 있습니다. - DMEM(덜벡코의 수정독수리 배지 4.5g/L 포도당 및 피루바테 나트륨)을 20%의 FBS(태아소 혈청)로 보충하여 근섬유 절연 매체를 준비, 0.22 μm 필터를 통해 필터. 미리 코팅된 절연 플레이트(12웰 플레이트, 웰당 2-4mL 절연 배지)에 배지를 넣고 5%CO2를가진 가습된 37°C 인큐베이터에서 격리 및 평형화하기 전에 약 30분 동안 분리한다.
- DMEM(덜벡코의 수정독수리 배지 4.5g/L 포도당 및 피루바테 나트륨)을 20%의 FBS(태아소 혈청)와 1%의 닭배아 추출물로 보충하여 근섬유 배양 배지를 준비하여 0.22 μm 필터를 통해 필터를 준비한다. 전코팅된 배양판(24웰 플레이트)의 각 웰에 0.5mL 배지를 넣고 5%CO2로가습된 37°C 인큐베이터에서 격리및 평형화하기 전에 약 30분 동안 분리한다.
- DMEM(4.5g/L 포도당 및 피루바테 나트륨)의 DMEM(Dulbecco의 수정된 독수리 매체)에서 0.2% (w/v) 콜라게나아제 타입 1(클로스트리디움 히스토리티즘)을용해시켜 콜라게나아제 소화 용액을 준비하여 0.22m μ 필터를 통해 필터를 준비합니다. 두 EDL(엑스텐소 디포럼 롱투스)근육은 멸균 15 mL 반응 튜브에 2.5 mL 콜라게나제 용액을 사용합니다. 또한, 격리를 시작하기 전에 37°C에서 순환 수조에서 용액 ~10분 미리 가열한다.
- 콜라게나아제 소화 근육의 트리튜레이션을 위해 멸균 파스퇴 파이펫을 준비합니다. 다이아몬드 펜을 사용하여 파스퇴르 파이펫을 자른다.
- 각 마우스에 대해, 약 0.3cm의 개구부와 약 10-12cm의 길이와 약 0.1cm의 작은 개구부와 약 22cm(도 2F)의길이와 두 번째 유리 파이펫1개의 큰 보어 파이펫을 사용한다.
- 분젠 버너의 불꽃으로 열을 연마하여 두 파이펫의 가장자리를 부드럽게 합니다. 파이펫 팁을 5-10s로 고정하여 부드러운 움직임으로 불꽃에 넣고 날카로운 유리 가장자리가 부드러워질 때까지 동일한 열 분포를 허용합니다.
- 사용하기 직전에 두 종류의 유리 파이펫을 멸균 HS로 코팅하여 전체 파이펫을 ~ 2mL의 HS를 5분 동안 채우고 HS를 배출하고 RT에서 5분 동안 파이펫을 건조시키십시오.
2. EDL 근육 격리 및 콜라게나아제 소화
- 오염을 방지하기 위해 70 % 에탄올로 모든 장비를 분사하십시오.
- 동물 실험에 대한 국가 규정에 따라 마우스를 희생.
- 70%의 에탄올로 마우스의 뒷다리를 스프레이합니다. 경화 미세 곡선 가위 (24mm 절단 가장자리) 및 미세 한 집게 (Dumont 7, 곡선 또는 직선)를 사용하여 피부를 제거하고 기본 근육을 노출하십시오. 모피와 기본 근육의 접촉을 피하십시오 (오염의 위험을 증가시킵니다).
- 기본근육(그림 2A)을손상시키지 않고 미세 곡선 포셉으로 주변 근막을 제거합니다. 굽힘 방지를 위해 집게를 닫습니다.
- TA(티비알리스 전방)및 EDL 근육의 탈면 힘줄을 노출하기 위해 곡선 집게를 사용합니다. TA를 제거하려면, 집게와 탈면 TA 힘줄을 잡고 미세 반나스 스프링 가위로 잘라 (5mm 절단 가장자리, 0.35 mm 팁 직경). 힘줄에서 TA를 들고있는 동안, 무릎쪽으로 당겨 무릎에 가까운 근육을 잘라(그림 2B),EDL 근육이 지금 노출된다.
참고: 이 단계에서는 TA 힘줄만 잡히지 만 있는지 확인하면 기본 EDL이 손상될 수 있습니다. TA 근육을 절단 할 때 무릎의 힘줄은 나중에 쉽게 볼 수 있는지 확인합니다. - 미세 곡선 집게와 말단 EDL 힘줄을 들어 올리고 고급 반나스 스프링 가위로 잘라(그림 2C). 조심스럽게 무릎쪽으로 EDL을 당겨 근위 EDL 힘줄을 노출. 미세 반나스 스프링 가위로 근위근을 잘라냅니다. 15mL 반응튜브에서 콜라게나아제 소화용액의 37°C 예열된 2.5mL로 EDL 근육을 1.4단계에서 이송한다. (그림2D).
참고: 근위 EDL 힘줄을 완전히 노출시키기 위해 외부 무릎 결합 조직에서 작은 절개를 합니다. 힘줄을 잡고 EDL을 너무 많이 늘리지 않도록하십시오. - 2.3 단계를 반복합니다. 2.6. 두 번째 EDL. 2.5 mL 콜라게나아제 소화 용액으로 채워진 동일한 15 mL 반응 튜브에 EDL 근육을 모두 추가합니다.
- 순환 하는 수조에서 37°C에서 반응 관에서 EDL 근육을 배양.
참고: 잠복기는 콜라게나아제 활동, 마우스의 나이 및 섬유조직의 양과 같은 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 성인 마우스의 EDL 근육에 대한 전형적인 잠복기 (2-6 개월)는 1-1.5 h이며 숙성 마우스 (18 개월) 1.5-2 h입니다. - 근육의 과도한 소화를 피하려면 소화 시간 동안 근육을 확인하십시오. 근육이 느슨해지고 단일 심섬유가 보이면 소화를중지하십시오(그림 2E). 큰 보어 파이펫으로 근육을 신중하게 이송하여 심섬유 절연배지(도 2G)를함유한 예온된 12웰 플레이트의 첫 번째 웰로 근육을 옮긴다.
3. 심섬유 절단 및 문화
- 다음 단계에 는 스테레오 쌍안경 현미경을 사용하여 가열 판(37°C)을 우선적으로 장착한다. 큰 보어 파이펫을 사용하여 단일 심섬유가 방출될 때까지 따뜻한 절연 매체로 근육을 플러시합니다. 원하는 수의 근섬유제가 용액에 자유롭게 떠오를 때까지 큰 보어 파이펫으로 근육을 분리합니다.
참고: 심근섬유가 손상될 위험을 줄이기 위해 과도한 트리튜레이션을 피하십시오. 근섬유질 단화를 위해 가열판을 사용하는 것은 격리 과정에서 온도가 떨어지기 때문에 근섬유성 사망을 초래할 수 있습니다. - 비계약근섬유(도2H)를HS 코팅된 소형 보어 유리 파이펫으로 이송하여 격리 매체로 잘 채워진 이물질을 씻어내고 수축(손상된) 심오섬유(도2I).
참고: 격리된 심근섬유의 과도한 이동을 피하기 위해, 두 번째 우물로 옮겨진 다음 트리튜레이션 과정을 계속할 수 있다. - 다음 (3rd)로비계약 심근섬유를 전송하여 격리 매체로 잘 채워져 다시 씻습니다.
- HS로 코팅된 소형 보어 유리 파이펫을 사용하여 약 50-100개의 비계약 근섬유를 근섬유 배양 배지를 함유한 24웰 플레이트로 이송한다.
- 37°C에서 심섬유를 배양하고, 전용 시간 동안 5% CO2(최대 96시간 권장).
참고: MuSC는 42h의 문화 후에 한 번 평면 또는 액면베이스를 나눕니다. 또한, 72h의 문화 MuSCs가 자체 갱신, 증식 또는 커밋(차별화된) MuSC로 구성된 다세포 클러스터를 형성한 후.
4. siRNA 트랜스페션
- 4h 심섬유 절연 후, 500 μL 배양 배지로 채워진 24웰 플레이트 중 1개 에서 50-100개의 비계약 심섬유(50-100 비계약 심섬유)와 지질계 성 형질 계열 시약, 예를 들어 RNAiMAX는 최종 농도가 5pmol sRNAii의 최종 농도를 가진 제조업체의 프로토콜에 따라. 따라서, 25 μL의 시RNA를 각각 25 μL에 25 μL 옵티-MEM을 추가하여 1.5 μL의 트랜스펙트 시약을 함유한다. 반응 혼합물을 5분 동안 배양한 다음 배양 배지의 500 μL에 추가합니다.
참고: 24h 또는 48h 이후의 두 번째 형체는 48h 이상인 긴 배양 기간에 권장됩니다. 대입 후 배지의 변경은 필요하지 않습니다.
5. 고정 및 IF 염색
- 면역 염색을 위해 스테레오 쌍안경 현미경을 사용합니다. 다음 단계의 모든 부피가 24웰 플레이트의 한 웰로 조정됩니다. HS 코팅된 작은 보어 파이펫을 사용하여 다음 단계를 모두 수행합니다.
- 골에 일부 용액을 남기면서 근섬유 배양 배지를 조심스럽게 폐기하십시오(24웰당 약 100μL). 근섬유섬유의 부동을 허용하기 위해 달리 명시되지 않는 한 모든 추가 단계에 대해이 작업을 수행합니다. 인접한 MuSC로 심섬유를 수정하기 위해 2% PFA의 500 μL을 추가하고 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
- 상체를 조심스럽게 제거하고 PBS (PH 7.4, 500 μL)로 심섬유를 세 번 씻으시면 RT에서 5 분 동안 하십시오.
- 500 μL permeabilization 솔루션(0.1% 트리톤 X-100, PBS0000, 0.1 M 글리신, pH 7.4)을 RT에서 10분 동안 배양합니다.
- 투과성 용액을 제거하고 RT에서 1h에 500 μL 차단 용액(PBS의 5% HS, pH 7.4)을 추가합니다.
참고: 특이하지 않은 결합을 피하기 위해 1차 항체에 권장되는 차단 솔루션을 확인하십시오. - 차단 용액을 제거하고 1차 항체 희석의 300 μL(예를 들어, 항팍스7(PAX7, DSHB, 희석), 항묘드(클론 G-1, 산타 크루즈, 1:200)를 잘 첨가한다. 하룻밤 동안 4 °C에서 배양하십시오.
- 우물 당 PBS500 μL로 세 번 세척하십시오 (RT에서 5 분).
- PBS를 제거하고 300 μL의 이차 항체 희석(예: 항 마우스-IgG1-546 및 항 마우스-IgG2b-488 1:1000)을 잘 추가한다. 빛으로부터 보호된 RT에서 1h를 배양합니다. 다음 단계의 경우 조명 을 줄이는 조건을 권장합니다.
- 우물 당 PBS500 μL로 두 번 세척하십시오 (RT에서 5 분).
- RT에서 5분 동안 우물당 500 μL의 용액(최종 DAPI 농도 10 μg/mL)을 사용하여 DAPI 염색을 수행합니다.
- 우물 당 PBS500 μL로 두 번 세척하십시오 (RT에서 5 분).
- 소수성 펜을 사용하여 현미경 유리 슬라이드에 원을 그리면 심섬유를 함유한 액체의 유출을 방지하는 물 방충제 장벽을 만듭니다. 현미경 유리 슬라이드에 가능한 가장 작은 부피의 근섬유를 옮기고 유리 슬라이드에 분산시십시오.
참고: 미세한 유리 슬라이드를 통해 근섬유를 물리적으로 당기는 것을 피하십시오. - 작은 지터 파스퇴르 파이펫 또는 200 μL 파이펫으로 잔류 액체를 제거합니다.
- 수성 장착 매체 2방울을 사용하고 근섬유를 커버슬립으로 덮습니다. 제조업체가 권장하는 시간 동안 슬라이드를 건조시키십시오. 슬라이드를 어둠 속에서 4°C로 저장합니다.
Representative Results
이 프로토콜은 뮤린 EDL 근육에서 연관된 MuSC와 함께 단일 근섬유의 성공적인 파생 및 배양에 대한 지침을 제공합니다. 프로토콜의 필수 단계는 그림 1로요약됩니다. EDL 근육의 신중한 힘줄-힘줄 해부(도2A-C)는가능한 근섬유의 높은 수율에 매우 중요합니다. 근육 해리는 콜라게나제소화(도 2D)에의해 먼저 달성되고 물리적 인 트리튜레이션(도 2G)이뒤따릅니다. 온전한 근섬유(그림2H)는배양되는 반면, 과다 수축및 죽은 심근섬유(그림2I)는배양 및 분석에서 제외되어야 한다.
MuSC는 격리 과정에서 근섬유와 연관된 상태로 남아 있습니다. 전사 인자에 대한 면역형염색체 인자 Pax7은 격리 과정의 완료 후 직접 고정할 때 근섬유당 미오뉴클레의 과다로부터 7-9 MuSC 핵을 식별하고 구별한다(도3A). 도 3B는 추가 적인 브라이트필드 채널로 도 3A로부터 확대된 영역을 나타내며, 이는 근소튜브의 세포외 근막 구조를 노출시키고 MuSC의 핵에서 Pax7 면역 형광 신호를 나타낸다.
근섬유 관련 MuSCs의 활성화 및 근생성 진행은 근생 마커 발현에 의해 분석될 수 있다. 갓 분리된 심근섬유(0h)와 연관된, 주로 정지된 MuSCs는 Pax7 발현 및 MyoD 발현의 부재를 특징으로 하며, 이를 통해 생체 내 동종성 상태를 닮은 것으로나타났다(도 4,0h). 해부/해리 절차 및 근섬유 배양 배지 조성으로 인해 MuSC는 42시간 동안 관찰될 수 있는 확산을 용이하게 하기 위해 전사 인자를 빠르게 활성화및 조절하여 첫 번째 분과(그림4,42h)를 거쳤습니다. 72시간의 배양 후, MuSC는 다른 근생 마커의 발현 패턴에 의해 평행한 다른 근생적 운명을 가진 자손의 클러스터를 형성한다(도4,72h). Pax7+ 세포만 분화에 저항하고 자가 갱신 줄기 세포가 됩니다. Pax7+와 MyoD+ 이중 양성 세포는 증식하는 반면, MyoD+ 세포만이 근생 계보를 따라 더 발전하고 분화할 것입니다.
근섬유 배양 시스템은 다양한 개입에 의해 MuSC 활동의 효율적인 간섭을 허용하며, 그 중 하나는 이 프로토콜에 자세히 설명된 바와 같이 siRNA 트랜스포션입니다. 근섬유 와 관련된 MuSCs의 트랜스페션 효율을 모니터링하기 위해 형광으로 표지된 비표적 시RNA가 형질감염되었다. Pax7 양성 MuSC는 과립과 같은 방식으로 세포질 siRNA를 축적하여 효율적인섭취(그림 5A)를나타냅니다. 심섬유의 세포질에서 분리 후 4시간 에서 근섬유의 자연식 섭취 장벽을 제안하는 형광 과립이 관찰되지 않았으며 siRNA 트랜스포팅은 특히 MuSC를 대상으로 합니다. 근섬유섬유당 양분형 Pax7+ 세포의 정량화는 모든 MuSCs의 절반 이상이 24시간 분할의 첫 번째 라운드가 완료되기 직전에 형광표 siRNA의 가시량을 차지했다는 것을 밝혔습니다. 30시간 후 전감염된 Pax7+ 세포의 수가 최대 74%까지 증가하였다(그림5B). 더욱이, 두 시점에서 전균 또는 비트랜스감염 조건의 근섬유당 Pax7+ 세포의 수에는 차이가 없었으며, 트랜스포션절차(도 5C)로인한 줄기세포 수에 악영향을 미치지 않았다.
요약하자면, 프로토콜은 인접한 근육 줄기 세포를 가진 EDL 단일 심근섬유의 격리 및 배양에 대한 상세한 설명을 제공한다. 그것은 면역 형광 계 분석에 의해 근섬유 관련 근육 줄기 세포 활성 ex vivo, 예를 들어, 연구를 가능하게한다. siRNA 경질에 의한 근육 줄기 세포의 조작은 효율적이며 기능적 분석을 위한 방법론적 근거를 제공한다.
그림 1: 필수 단계의 회로도 요약. 격리 및 면역 염색 절차의 필수 단계는 이 그림에서 요약됩니다. 약어: DMEM, 덜벡코의 수정된 독수리의 매체; FBS, 태아 소 혈청; CEE, 닭 배아 추출물; TA, 티비아리스 전방; EDL, extensor digitorum longus이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 마우스 EDL 해부 및 단일 심섬유 절연. (A)마우스 뒷다리의 피부가 제거되고 근막 을 둘러싼 근육이 TA(티비알리스 전방)근육을 노출하도록 당겨. (B)TA 근육은 백색 화살표로 표시된 EDL(셀소어디지토럼 롱클로스)근육을 노출시키기 위해 제거된다. (C)EDL 근육은 힘줄을 절단하여 해부됩니다. (D)두 개의 EDL 근육이 콜라게나아제 소화된다. (E)콜라게나아제의 출현은 조직 코어에서 느슨해지는 눈에 보이는 단일 심섬유와 함께 소화된 근육을 소화합니다. (F)크고 작은 지퍼 파스퇴르 파이펫스케일. (G)EDL 근육(검은 화살로 표시)은 큰 보어 파스퇴르 파이펫을 사용하여 물리적으로 삼각화됩니다. (H)단일 온전한 심근섬유는 얇고 반짝이며 문화 및 분석을 위해 개별적으로 수집할 수 있습니다. (I)과수축 및 죽은 심근섬유는 문화와 분석에 적합하지 않습니다. 2H 와 2I의 현미경 이미지는 N-Achroplan 5x 목표를 사용하여 현미경으로 캡처되었습니다. 스케일 바는 200 μm입니다.
그림 3: 연관된 MuSC를 가진 전체 단일 근섬유의 현미경 이미지. 젊은 C57BL/6 마우스의 EDL로부터의 단일 심섬유를 제조하고 분리 후 PFA 고정(0h)하였다. (A)Pax7 및 DAPI 면역형광 염색은 심섬유 관련 근육 줄기 세포(MuSC, 화살표로 표시)를 식별합니다. 현미경 이미지는 플랜-아포크로마트 40x 오일 목표를 갖춘 현미경의 타일 및 z 스택 기능을 사용하여 캡처되었습니다. 스케일 바는 200 μm.(B)배율 (A) 발화(A)발화는 밝은 필드에 있는 근위체 구조에서 근핵, 1개의 Pax7 양성 핵 및 밝은 어두운 패턴을 나타내는다. 스케일 바는 10 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 단일 근섬유 배양 시 MuSC 활성화 및 근생학적 진행의 면역 형광 이미지. 갓 분리된 심근섬유(0h)의 근육 줄기세포(MuSC)는 Pax7의 발현과 MyoD 발현의 부족을 특징으로 하는 생체 내 의 정충성 상태를 나타낸다. 단일 심섬유 배양 시 대부분의 MuSCs는 MyoD를 조절하고 세포 주기를 다시 입력하여 분할 및 증식(42h)한다. 문화의 72 h 후 MuSC 운명은 근생 마커 표현에 따라 차별 될 수있다. Pax7만 발현을 사용하는 세포는 자가 갱신(적색 화살표)이 되는 반면 Pax7 및 MyoD 이중 양성 셀(적색/녹색 화살표)은 계속 증식합니다. MyoD만 양성 세포(녹색 화살표)는 근생 분화에 전념하고 있습니다. 현미경 이미지는 플랜-아포크로마트 20x 목표(0h, 42h) 또는 LD 플랜-네오플루어 40x 목표(72h)를 가진 현미경을 사용하여 포착하였다. 스케일 바는 20 μm입니다.
그림 5: MuSC 및 섭취 분석의 형광 시RNA 트랜스퍼션. EDL 단일 심근섬유는 이 프로토콜에서 제공하는 단계에 따라 형광으로 표지된 siRNA(siGLO)로 제조및 전감염되었다. (A)30h 배양시 단일 심섬유에 대한 Pax7 양성 근육 줄기 세포(MuSC)에서 구체적으로 siGLO 과립의 세포 플라즈마 축적. 현미경 이미지는 플랜-아포크로마트 100x 오일 목표를 가진 현미경의 z 스택 및 종말 기능을 사용하여 포착되었다. 스케일 바는 배양의 24 또는 30 h에서 Pax7 양성 근육 줄기 세포에 의해 siRNA 섭취량의 5 μm.(b)정량화이다. (C)24 또는 30시간의 배양에서 비감염 및 트랜스감염 조건을 비교하는 단일 근섬유당 Pax7 양성 세포의 수. 데이터는 n = 4 마우스의 표준 편차와 평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기서, 시험관내 접근법을 이용하여 MuSCs에서 특정 유전자의 역할을 기능적으로 조사하는 방법이 제시된다. 중요한 것은, 여기에 설명 된 시스템에서 MuSCs는 조건에서 배양되어, 이는 가능한 한 생체 내 상황과 유사하여 MuSCs의 상호 작용의 대부분을 틈새 시장을 보존합니다. 이것은 부동 조건 및 연속siRNA transfection에서 그들의 인접한 MuSCs를 가진 고립된 근섬유를 배양하여 달성됩니다. 면역형광 분석을 통해 72h의 배양 중 MuSC 집단의 근섬유 분리, siRNA 경화 및 조사의 절차가 설명된다. 더욱이, 모든 MuSCs의 약 74%가 30h의 배양 후에 형광표 대조군 siRNA로 전염되었다는 것을 입증되었습니다.
특히 주의 는 광범위한 스트레칭, 꼬집기, 또는 압박이 근섬유의 수축과 연속 사망으로 이어질 것이기 때문에 EDL 근육의 주의 해부에 초점을 맞추어야합니다. 또한 조건당 복제당 최소 20개의 다른 근섬유에서 MuSCs 클러스터를 조사하는 것이 중요합니다. 이는 MuSC 숫자와 속성이 MuSC 하위 인구의 존재로 인해 달라지므로 필요합니다. 부동 근섬유 배양 방법을 이용하여 MuSCs에 대한 특정 siRNA의 효과를 조사할 때 표적 시RNA와 비표적 대조군과 조건의 비교는 동일한 마우스 및 근육 내에서 수행되어야 한다. 이 커버 하거나 siRNA의 효과 증폭 수 있습니다 마우스 특정 차이 방지 하는 것이 좋습니다. 녹다운 효율은 인접한 MuSC를 사용하여 단일 근섬유를 사용하여 표적 유전자에 대해 지시된 항체를 이용한 면역형광 분석에 의해 결정될 수 있다. 이것이 옵션이 아닌 경우, 정량적 RT-PCR 또는 면역블롯 분석 다음에 1차 근사에서 siRNA 녹다운 효율을 테스트할 수 있습니다. siRNA의 효율은 단일 심섬유에 대한 MuSCs에 대한 siRNA의 효과를 분석하기 전에 결정되어야 합니다. 4개의 서로 다른 siRNAs와 단일 로 구성된 스마트 풀을 사용하면 녹다운 효율이 향상되지만 특이하지 않은 타겟팅의 위험도 증가합니다. 비 타겟팅 siRNA는 대조군으로 사용되어야 합니다. 직접 트랜스퍼링 효율을 모니터링하기 위해, 여기서 수행되는 형광 라벨이 부착된 비타겟팅 siRNA를 사용할 수 있다. siRNA를 가진 transfection를 위한 시간 점은 격리 후에 약 4 시간, MuSCs를 둘러싼 기저 라미나가 이미 siRNA를 위해 투과할 때 시간 점입니다. 72 또는 96 h 후 MuSCs에 대한 특정 siRNA의 효과를 조사해야 하는 경우, 높은 녹다운 효율을 유지하기 위해 24h 또는 48h 후에 두 번째 siRNA 트랜스페션을 수행하는 것이 좋습니다.
근섬유 배양 분석법은 기존의 세포 배양 방법을 가진 MuSC의 조사에 비해 다양한 장점을 표시합니다. MuSC는 전체 격리 과정에서 근섬유에 부착되어 있어, 그 틈새시장19,23,24,25로MuSC의 중요한 상호 작용을 보존한다. 뮤SC와 근섬유유섬유의 보존된 상호 작용은 기존의 2D myoblast 문화에서 재현할 수 없는 MuSC 기능에 대한 틈새 의존성 효과를 연구하기 위한 전제 조건입니다. 예를 들어, 노화 중 MuSCs 디스플레이는 근생 능력이 손상되어손상(20,26)을손상한 후 근육 조직을 재생하는 효율이 저하되는 것을초래한다. 이러한 장애는 적어도 MuSC 틈새 시장, 특히 ECM조성27,28의변화에 기인한다. 근섬유 배양 프로토콜은 이러한 비정상적인 틈새 변화에 대한 연구와 간섭을 허용합니다.
여기에 설명된 방법과는 대조적으로, 면역 라벨링 및 -분류 기술에 의한 MuSCs의 정제는 FACS(형광 활성 세포 선별) 또는 MACS(자기 세포 분류)와 같은 그들의 틈새에서 MuSC를 제거하는 것을 포함한다. 흥미롭게도, 노화 된 근육에서 고립 된 MuSCs의 2D 배양은 외설적 인 단서를 풀고 젊은 근육으로부터 분리 된 MuSCs와 유사한 행동을하여 생체 내 상황을 적절하게 재현하지 않습니다29. 더욱이, 표면 마커를 가진 MuSC의 근육 조직의 완전한 해리 및 표시는 세포30,31,32의전사적 변화 및 활성화를 초래한다. 근섬유 배양 시스템의 또 다른 장점은 다양한 수준에서 MuSC 기능을 방해할 수 있다는 것입니다. 배양된 근섬유에 대한 MuSC의 조작은 여기에 상세히 설명된 바와 같이 siRNA 매개 유전자 녹다운에 의해 효과적으로 달성될 수 있다. 마찬가지로, 화학 화합물의 적용 또는 재조합 단백질의 전달은 줄기 세포통로(20,28)를방해하는 데 매우 효과적이다. 더욱이, 레트로 또는 렌티바이러스 발현 벡터는 외인성 유전자, 즉 구성 활성돌연변이체(33)의도입을 허용한다. 또한, MuSC 기능에 대한 외외적 인자의 영향은 여기에 설명된 시스템에서 탐구될 수 있으며, 예를 들어, 배양 조건은 암악액증(34,35)과같은 다른 상태를 모델링하기 위해 상이한 생리적 또는 병리학적 근원으로부터 초월제로 보충될 수 있다.
여기서 설명된 방법의 한 가지 제한은 단일 근섬유 배양 시스템이 MuSCs에 대한 다른 세포 유형의 모든 전신 요인 또는 영향의 영향을 완전히 회수할 수 없다는 사실이다. 또한, 문화에서 근섬유를 사용할 수 있는 시간이 제한되어 있으므로 MuSC 관련 프로세스의 연구는 활성화 및 근생 성 약정과 같은 초기 사건에 초점을 맞추고 있습니다. 더욱이, 면역 세포 또는 섬유-아디포겐성 전구 세포와 같은 다른 틈새 세포와의 MuSC 상호 작용의 조사는 불가능합니다. MuSC 기능에 대한 전신 효과를 조사하기 위해 생체 내에서 근육 재생의 분석 뒤에 근육 부상 실험을 수행하거나 이식 실험을 수행할 수있습니다(36,37).
함께 종합, 근섬유 격리 및 배양 프로토콜은 형질전환 마우스 모델의 요구 없이 성인 MuSCs에 유전 또는 기계학 연구 기회를 제공하고 잠재적으로 동물 실험을 줄일 수 있습니다.
Disclosures
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 우수한 기술 지원과 원고의 비판적 독서크리스틴 포서와 크리스티나 피커 감사합니다. 이 작품은 도이치 포르스충스게마인샤프트에서 JvM(MA-3975/2-1), 칼 자이스 재단, 도이치 크렙실페(DKH-JvM-861005)에 대한 보조금으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
| chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
| collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
| horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
| MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
| siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |
References
- Henze, H., Jung, M. J., Ahrens, H. E., Steiner, S., von Maltzahn, J. Skeletal muscle aging - Stem cells in the spotlight. Mechanisms of Ageing and Development. 189, 111283 (2020).
- Chang, N. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells: the architects of skeletal muscle. Current Topics in Developmental Biology. 107, 161-181 (2014).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysics and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (13), 2559-2570 (2019).
- Motohashi, N., Asakura, A. Muscle satellite cell heterogeneity and self-renewal. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2, 1 (2014).
- Huttner, S. S., et al. Isolation and culture of individual myofibers and their adjacent muscle stem cells from aged and adult skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 2045, 25-36 (2019).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- Mourikis, P., et al. A critical requirement for notch signaling in maintenance of the quiescent skeletal muscle stem cell state. Stem Cells. 30 (2), 243-252 (2012).
- Pisconti, A., Cornelison, D. D., Olguin, H. C., Antwine, T. L., Olwin, B. B. Syndecan-3 and Notch cooperate in regulating adult myogenesis. Journal of Cell Biology. 190 (3), 427-441 (2010).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).
- Troy, A., et al. Coordination of satellite cell activation and self-renewal by Par-complex-dependent asymmetric activation of p38alpha/beta MAPK. Cell Stem Cell. 11 (4), 541-553 (2012).
- Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A., Brack, A. S. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
- Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127, Pt 21 4543-4548 (2014).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Eliazer, S., et al. Wnt4 from the Niche Controls the Mechano-Properties and Quiescent State of Muscle Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 654-665 (2019).
- Goel, A. J., Rieder, M. K., Arnold, H. H., Radice, G. L., Krauss, R. S. Niche cadherins control the quiescence-to-activation transition in muscle stem cells. Cell Reports. 21 (8), 2236-2250 (2017).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
- Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular wisp1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12 (3), 333-344 (2013).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24 (2), 213-225 (2019).
- Judson, R. N., et al. The Hippo pathway member Yap plays a key role in influencing fate decisions in muscle satellite cells. Journal of Cell Science. 125, Pt 24 6009-6019 (2012).
- He, W. A., et al. NF-kappaB-mediated Pax7 dysregulation in the muscle microenvironment promotes cancer cachexia. Journal of Clinical Investigation. 123 (11), 4821-4835 (2013).
- Schmidt, M., Poser, C., von Maltzahn, J. Wnt7a counteracts cancer cachexia. Molecular Therapy Oncolytics. 16, 134-146 (2020).
- Feige, P., Rudnicki, M. A. Isolation of satellite cells and transplantation into mice for lineage tracing in muscle. Nature Protocols. 15 (3), 1082-1097 (2020).
- Garry, G. A., Antony, M. L., Garry, D. J. Cardiotoxin induced injury and skeletal muscle regeneration. Methods in Molecular Biology. 1460, 61-71 (2016).
