Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Single Myofiber Culture Assay for vurdering av voksen muskel stamcelle funksjonalitet Ex Vivo

Published: February 15, 2021 doi: 10.3791/62257
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Leibniz Institute on Aging, Fritz-Lipmann-Institute

Summary

I denne protokollen beskrives en in vitro culturing og funksjonell analysemetode for muskelstammeceller, som bevarer det meste av deres interaksjoner med deres endogene nisje.

Abstract

Voksen skjelettmuskulaturvev har en stamcellepopulasjon som er uunnværlig for sin evne til å regenerere. Ved muskelskader forlater muskelstammeceller sin passiv tilstand og aktiverer det myogene programmet som til slutt fører til reparasjon av skadet vev samtidig med etterfylling av muskelstammecellebassenget. Ulike faktorer påvirker muskel stamcelle aktivitet, blant dem iboende stimuli, men også signaler fra direkte muskel stamcelle miljø, stamcelle nisje. Isolasjonen og kulturen til enslige myofibers med deres tilknyttede muskelstammeceller bevarer det meste av samspillet mellom stamcellen med sin nisje og er derfor den nærmeste muligheten til å studere muskel stamcellefunksjonalitet ex vivo. Her er en protokoll for isolasjon, kultur, siRNA transfeksjon og immunstaining av muskel stamceller på sine respektive myofibers fra mus EDL (extensor digitorum longus) muskler gitt. De eksperimentelle forholdene som er skissert her tillater studie og manipulering av muskel stamceller ex vivo inkludert undersøkelse av myogen aktivitet uten det iboende behovet for in vivo dyreforsøk.

Introduction

Skjelettmuskulatur i voksen er et postmitotisk vev som hovedsakelig består av multinukleerte myofibers, som er effektorcellene for frivillige bevegelser. Den har en bemerkelsesverdig evne til å regenerere, en prosess som ligner embryonal myogenese og gjennomgår svekkelser i alder og sykdom1. Denne slående regenerative kapasiteten til skjelettmuskulaturen avhenger av muskelstammeceller (MuSCer), som også kalles satellittceller på grunn av deres plassering mellom sarcolemma og basal lamina av myofibers2,3. Under hvileforhold er MuSC-er passiviserte og preget av uttrykket av transkripsjonsfaktoren Pax7 og passiviseringsmarkører som Sprouty14,5,6,7,8. Ved aktivering, for eksempel etter skade, forlater MuSCs passiv tilstand og oppregulerer den myogene regulatoriske faktoren MyoD9. Pax7 /MyoD dobbeltpositive MuSC-er sprer seg og differensierer dermed myogene forløperceller, som også ofte kalles myoblaster. Disse myoblastene skiller seg deretter ytterligere ut i langstrakte myocytter, en prosess som sammenfaller med molekylære og morfologiske endringer, for eksempel tap av Pax7 og oppregulering av Myogenin-uttrykk10. Myocytter smelter deretter til slutt sammen eller til eksisterende myofibers og reparerer dermed det skadede vevet. Viktigst, en liten brøkdel av muskel stamceller tilbakestiller MyoD upregulering og er i stand til selvfornyelse11. Statusen til MuSC differensiering og myogen progresjon kan lett observeres ved undersøkelse av myogene markører som Pax7, MyoD og Myogenin10.

Kulturen til single myofibers med sine tilstøtende MuSCs er en utmerket metode for å undersøke MuSC-funksjonalitet i en ex vivo-setting siden MuSCs forblir i sin endogene nisje12,13. Oppførselen til MuSCs er regulert av iboende signaler samt ekstrinsiske signaler levert av nisjen, et spesialisert anatomisk sted som består av komponenter i den ekstracellulære matrisen (ECM) rundt MuSCene og myofiberen selv. For eksempel er en av de ekstrinsiske regulatorene til MuSC-passiviteten Notch-signalering. Her mottas signalsignaler av MuSCer fra både myofiber og ECM14,15,16. Videre er MuSC-nisjen viktig for å kontrollere divisjonsaksen til MuSCer og dermed regulere celle skjebnen til MuSC datterceller17,18. Rimelig, parametere som asymmetriske MuSC-divisjoner, myogen progresjon og selvfornyelse kan vurderes unikt i dette eksperimentelle oppsettet. For eksempel kan en multicellulær klynge dannes som følge av en MuSC etter en kulturperiode på 72 timer, som kan undersøkes for forekomsten og prosentandelen av distinkte myogene populasjoner som selvfornyelse, spredning og ytterligere differensierte MuSCer8,19,20,21. Differensieringstilstanden til MuSC-er kan bestemmes ved undersøkelse av uttrykket / meduttrykket til Pax7, MyoD og Myogenin. Etter 72 timers kultur kan cellene i en klynge diskrimineres av følgende parametere: Pax7 bare celler er selvfornyende MuSCer, mens Pax7 / MyoD doble positive celler sprer / aktiverte MuSCer og ytterligere differensierte myogene celler er Myogenin positive22. Videre kan MuSC-tall eller gjeninnføring i cellesyklusen/aktiveringen undersøkes i tillegg til myogen progresjon, for eksempel gjennom immunfluorescensbaserte analyser basert på parametrene beskrevet ovenfor.

Her beskrives de unike egenskapene til myofiberisolasjons- og kulturprotokollen, for eksempel bevaringen av samspillet mellom MuSC og dens nisje. Mus hele EDL (extensor digitorum longus) muskler er nøye dissekert, fordøyd av kollagenose, og fysisk triturert for å oppnå enkelt myofibers med sine tilknyttede MuSCs for videre kultur. Videre avgrenser protokollen trinnene for å transfekte muSC-er med siRNA for funksjonelle analyser av kandidatgener og påfølgende immunfluorescensbaserte analyser uten nødvendigheten av transgene dyr.

Protocol

Ofring av dyr må utføres i samsvar med de nasjonale forskriftene for dyreforsøk. Protokollen beskrevet her ble utført i samsvar med retningslinjene fra Leibniz Institute on Aging - Fritz Lipmann Institute og EU-direktivet 2010/63/EU (lisensnummer for organhøsting: O_JvM_18-20). Viktige trinn i protokollen er oppsummert i figur 1.

1. Utarbeidelse av kulturplater, media og Pasteur pipetter

MERK: Alle materialer og utstyr som er nødvendige for å isolere og dyrke enslige myofibere, må være så sterile som mulig. Derfor anbefales det å isolere enkle myofibers under en semi-steril disseksjonshette.

  1. Bruk sterilT HS (hesteserum) til å belegge vevskulturplater. Belegg forhindrer festing av enkle myofibers til plastoverflaten. For hver mus kreves det 4 brønner med en 12-brønnsplate for isolasjonen og et dedikert antall brønner på en 24-brønnsplate for dyrking. Inkuber brønnene på en 12-brønns plate med 1 ml og brønnene på en 24-brønns plate med 0,5 ml HS i 5 min ved RT (romtemperatur), fjern deretter HS og la platene tørke i ytterligere 5 minutter.
    MERK: HS kan samles opp og brukes til belegg flere ganger, hvis det holdes sterilt.
  2. Forbered myofiber isolasjonsmedium ved å supplere DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagle medium med 4,5 g/L glukose og natriumpyuvatt) med 20% FBS (fetal bovin serum), filtrer gjennom 0,22 μm filter. Tilsett medium til de forhåndsbelagte isolasjonsplatene (12-brønnsplate, 2-4 ml isolasjonsmedium per brønn) ca. 30 min før isolasjon og likevekt i en fuktet 37 °C inkubator med 5 % CO2.
  3. Forbered myofiberkulturmediet ved å supplere DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagle medium med 4,5 g/L glukose og natriumpyuvatt) med 20% FBS (foster bovint serum) og 1% kyllingembryoekstrakt, filtrer gjennom 0,22 μm filter. Tilsett 0,5 ml medium til hver brønn av de forhåndsbelagte kulturplatene (24-brønnsplate) ca. 30 min før isolasjonen og likevekten i en fuktet 37 °C inkubator med 5 % CO2.
  4. Forbered kollagenase fordøyelsesløsning ved å oppløse 0,2% (w / v) kollagenase type 1 (fra Clostridium histolyticum) i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagle medium med 4,5 g / L glukose og natriumpyuvat), filtrer gjennom 0,22 μm filter. For to EDL -extensor digitorum longus) muskler bruk 2,5 ml kollagenaliserende oppløsning i et sterilt 15 ml reaksjonsrør. I tillegg, forvarm løsningen ~ 10 min i et sirkulerende vannbad ved 37 °C før du starter isolasjonen.
  5. Forbered sterile Pasteur pipetter for triturering av kollagenalse-fordøyde muskler. Bruk en diamantpenn til å kutte Pasteur pipettene.
    1. For hver mus bruker du en stor borepipette med en åpning på ca. 0,3 cm og en lengde på ca. 10-12 cm og en ekstra glasspipette med en liten åpning på ca. 0,1 cm og en lengde på ca. 22 cm (figur 2F).
    2. Glatt ut kantene på begge pipettene ved å varme polere med flammen til en Bunsen-brenner. Hold pipettespissen i 5-10 s inn i flammen med forsiktig bevegelse for å tillate lik varmefordeling til de skarpe glasskantene glattes ut.
    3. Umiddelbart før bruk, belegge begge typer glasspipetter med steril HS ved å fylle hele pipetten med ~ 2 ml HS i 5 min, deretter kaste ut HS og la pipettene tørke i 5 min ved RT.

2. EDL muskelisolasjon og kollagenal fordøyelse

  1. Spray alt utstyr med 70% etanol for å unngå forurensning.
  2. Ofre musen i samsvar med de nasjonale forskriftene for dyreforsøk.
  3. Spray bakbenene på musen med 70% etanol. Bruk herdet fin buet saks (24 mm skjærekant) og fine tang (Dumont 7, buet eller rett) for å fjerne huden og for å eksponere de underliggende musklene. Unngå kontakt med underliggende muskler med pels (øker risikoen for forurensning).
  4. Fjern den omkringliggende fasciaen med fine buede tang uten å skade de underliggende musklene (Figur 2A). Lukk tangene for å unngå bøyning.
  5. Bruk buede tang for å eksponere de distale sener av TA (tibialis fremre) og EDL muskel. For å fjerne TA, ta tak i den distale TA-senen med tang og kutt med fin Vannas vårsaks (5 mm skjærekant, 0,35 mm spissdiameter). Mens du holder TA ved senen, trekk den mot kneet og kutt muskelen nær kneet (Figur 2B), EDL-muskelen er nå utsatt.
    MERK: Pass på at bare TA-senen er grepet i dette trinnet, ellers kan den underliggende EDL bli skadet. Når du kutter av TA-muskelen, må du sørge for at senene i kneet lett kan ses etterpå.
  6. Løft den distale EDL-senen med fine buede tang og kutt med fin Vannas vårsaks (Figur 2C). Utsett den proksimale EDL-senen ved å trekke EDL forsiktig mot kneet. Klipp den proksimale senen med fin Vannas vårsaks. Overfør EDL-muskelen til 37 °C forvarmet 2,5 ml kollagenalisse fordøyelsesoppløsning i 15 ml reaksjonsrøret fra trinn 1,4. (Figur 2D).
    MERK: Lag et lite snitt på det ytre kne bindevevet for å eksponere den proksimale EDL-senen fullt ut. Pass på at du bare tar tak i senene og ikke strekker EDL for mye.
  7. Gjenta trinn 2.3. til 2,6. med den andre EDLen. Tilsett begge EDL-musklene i samme 15 ml reaksjonsrør fylt med 2,5 ml kollagenalisse fordøyelsesoppløsning.
  8. Inkuber EDL-musklene i reaksjonsrøret ved 37 °C i et sirkulerende vannbad.
    MERK: Inkubasjonstiden avhenger av flere faktorer, for eksempel kollagenalisseaktivitet, musens alder og mengde fibrotisk vev. Den typiske inkubasjonstiden for EDL-muskler hos voksne mus (2-6 måneder) er 1-1,5 timer og for eldre mus (18 måneder) 1,5-2 t.
  9. For å unngå overdreven fordøyelse av musklene, sjekk musklene i fordøyelsestiden. Stopp fordøyelsen når musklene løsner og enkelt myofibers er synlige (Figur 2E). Overfør musklene forsiktig med den store borepipetten til den første brønnen på den forhåndsvarslede 12-brønnsplaten som inneholder myofiberisolasjonsmedium (Figur 2G).

3. Myofiber dissosiasjon og kultur

  1. For følgende trinn, bruk et stereo kikkertmikroskop, fortrinnsvis utstyrt med en varmeplate (37 °C). Bruk den store borepipetten til å skylle musklene med varmt isolasjonsmedium til enslige myofibere slippes ut. Dissosier musklene med den store borepipetten til ønsket antall myofibers flyter fritt i løsningen.
    MERK: Unngå overdreven trianturasjon for å redusere risikoen for skadede myofibers. Bruk av en varmeplate for myofiber dissosiasjon anbefales sterkt siden temperaturfall under isolasjonsprosessen, noe som vil resultere i myofiberdød.
  2. Overfør ikke-kontraherte myofibers (Figur 2H) med HS-belagt liten boreglasspipette til den andre brønnen fylt med isolasjonsmedium for å vaske bort rusk og kontrahert (skadede) myofibers (Figur 2I).
    MERK: For å unngå overdreven bevegelse av isolerte myofibers, kan de overføres til den andre brønnen, og deretter kan triturasjonsprosessen fortsette.
  3. Overfør ikke-kontraherte myofibers til neste (3rd) godt fylt med isolasjonsmedium for å vaske igjen.
  4. Bruk den småborede glasspipetten, belagt med HS, til å overføre ca. 50-100 ikke-kontraherte myofibere til 24-brønnsplaten som inneholder myofiberkulturmediet.
  5. Inkuber myofibers ved 37 °C, 5 % CO2 for dedikert tid (maksimalt 96 timer anbefales).
    MERK: MuSCer deler seg en gang enten planarisk eller apikal-basal etter 42 timers kultur. I tillegg, etter 72 h kultur MuSCs danner multicellulære klynger bestående av selvfornyende, proliferating eller engasjerte (differensierte) MuSCer.

4. siRNA-transfeksjon

  1. 4 timer etter myofiberisolasjon, transfekt myofiber assosiert MuSCs (50-100 ikke-kontrahert myofibers i en brønn av 24-brønnsplaten fylt med 500 μL kulturmedium) med lipidbasert transfeksjonsreagens, for eksempel RNAiMAX i henhold til produsentens protokoll med en endelig konsentrasjon på 5 pmol siRNA. Tilsett derfor 25 μL Opti-MEM med det respektive volumet av siRNA til 25 μL Opti-MEM som inneholder 1,5 μL av transfeksjonsreagenset. Inkuber reaksjonsblandingen i 5 min og legg den deretter til 500 μL kulturmedium.
    MERK: En ny transfeksjon etter 24 timer eller 48 timer anbefales for lengre kulturperioder, for eksempel mer enn 48 timer. En endring av medium etter transfeksjon er ikke nødvendig.

5. Fiksering og IF-farging

  1. For immunstaining bruk et stereo kikkertmikroskop. Alle volumer i de følgende trinnene er justert til en brønn på en 24-brønns plate. Utfør alle følgende trinn ved hjelp av en HS-belagt småboret pipette.
  2. Kast forsiktig myofiberkulturmediet mens du etterlater noen løsning i brønnen (ca. 100 μL per 24-brønn). Gjør dette for alle ytterligere trinn med mindre annet er oppgitt for å tillate flytende myofibers. Tilsett 500 μL 2% PFA for å fikse myofibers med sine tilstøtende MuSCs, inkubere i 5 min ved romtemperatur (RT).
  3. Fjern supernatanten forsiktig og vask myofibers tre ganger med PBS (pH 7,4, 500 μL i 5 min ved RT hver).
  4. Tilsett 500 μL permeabiliseringsløsning (0,1 % Triton X-100, 0,1 M Glycin i PBS, pH 7,4), inkuber i 10 minutter ved RT.
  5. Fjern permeabiliseringsløsningen og tilsett 500 μL blokkeringsløsning (5% HS i PBS, pH 7,4) i 1 time ved RT.
    MERK: Kontroller den anbefalte blokkeringsløsningen for primære antistoffer for å unngå uspesifisert binding.
  6. Fjern blokkeringsløsningen og tilsett 300 μL primær antistofffortynning (f.eks. anti-Pax7 (PAX7, DSHB, ufortynnet), anti-MyoD (klone G-1, Santa Cruz, 1:200)) per brønn. Inkuber ved 4 °C over natten.
  7. Vask tre ganger med 500 μL PBS per brønn (5 min ved RT).
  8. Fjern PBS og tilsett 300 μL sekundær antistofffortynning (f.eks. antimus-IgG1-546 og antimus-IgG2b-488 1:1000) per brønn. Inkuber 1 time ved RT beskyttet mot lys. For følgende trinn anbefales lysreduserende forhold.
  9. Vask to ganger med 500 μL PBS per brønn (5 min ved RT).
  10. Utfør DAPI-farging ved å bruke 500 μL av oppløsningen per brønn (endelig DAPI-konsentrasjon 10 μg/ml) i 5 min ved RT.
  11. Vask to ganger med 500 μL PBS per brønn (5 min ved RT).
  12. Bruk en hydrofob penn til å tegne en sirkel på en mikroskopisk glasssklie for å lage en vannavstøtende barriere som forhindrer søl av væske som inneholder myofibers. Overfør myofibers i det minste volumet som er mulig til den mikroskopiske glasssklie og spre dem på glasssklie.
    MERK: Unngå fysisk trekking av myofibers over mikroskopisk glass lysbilde siden dette kan føre til friksjon som resulterer i løsrivelse av klynger fra myofibers.
  13. Fjern restvæsken med den småborede Pasteur pipetten eller en 200 μL pipette.
  14. Bruk to dråper vandig monteringsmedium og dekk myofibers med en dekslelip. La lysbildene tørke i den tiden som anbefales av produsenten. Oppbevar skliene ved 4 °C i mørket.

Representative Results

Denne protokollen gir instruksjoner for vellykket avledning og kultur av enkelt myofibers med sine tilknyttede MuSCs fra murine EDL muskler. Viktige trinn i protokollen er oppsummert i figur 1. Forsiktig sene-til-sene disseksjon av EDL-musklene (Figur 2A-C) er avgjørende for et høyt utbytte av levedyktige myofibers. Muskeldissosiasjon oppnås først ved kollagenal fordøyelse (Figur 2D) etterfulgt av fysisk triturasjon (Figur 2G). Intakte myofibere (figur 2H) dyrkes, mens hyperkontraherte og døde myofibere (figur 2I) bør utelukkes fra kultur og analyse.

MuSCer forblir myofiber-assosiert under isolasjonsprosessen. Immunfluorescensfarging for transkripsjonsfaktoren Pax7 identifiserer og skiller 7-9 MuSC-kjerner fra mengden myonuclei per myofiber når den er løst direkte etter ferdigstillelse av isolasjonsprosessen (Figur 3A). Figur 3B viser et forstørret område fra figur 3A med den ekstra brightfield-kanalen, som eksponerer den subcellulære myofibrillære strukturen på myotuben og demonstrerer Pax7 immunfluorescenssignal i kjernen av en MuSC.

Aktivering og myogen progresjon av myofiber assosierte MuSCer kan analyseres av myogen markøruttrykk. Assosiert med nyisolerte myofibers (0 h), for det meste quiescent MuSCs kan bli funnet, som er preget av Pax7 uttrykk og fravær av MyoD uttrykk, og dermed ligner en in vivo homeostatisk tilstand (Figur 4, 0 h). På grunn av disseksjons-/dissosiasjonsprosedyren og den myofiberkulturelle mediesammensetningen, aktiverer og oppregulerer MuSC-ene raskt transkripsjonsfaktoren MyoD for å lette spredningen som kan observeres på 42 timer, når MuSCs har gjennomgått sin første divisjon (Figur 4, 42 h). Etter 72 timer med kultur danner MuSCs klynger av avkom med forskjellige myogene skjebner som er parallelt med uttrykksmønstrene til forskjellige myogene markører (Figur 4, 72 h). Pax7+ bare celler motstår differensiering og blir selvfornyende stamceller. Pax7+ og MyoD + doble positive celler er proliferative, mens MyoD + bare celler har videre utviklet seg langs den myogene avstamning og vil skille.

Myofiberkultursystemet muliggjør effektiv interferens av MuSC-aktivitet ved ulike intervensjoner, som en av dem er siRNA-transfeksjon som beskrevet i detalj i denne protokollen. For å overvåke transfeksjonseffektiviteten til myofiber assosiert MuSCs ble en fluorescerende merket ikke-målrettende siRNA transfektet. Pax7 positive MuSCer akkumulert cytoplasmic siRNA på en granulat-lignende måte, noe som indikerer effektivt opptak (Figur 5A). Ingen fluorescerende granulater ble observert i cytoplasma av myofibers som antyder en naturlig opptaksbarriere i myofibers ved 4 timer etter isolasjon, og at siRNA-transfeksjon spesifikt retter seg mot MuSCer. Kvantifisering av positivt transfekterte Pax7+ celler per myofiber avslørte at mer enn halvparten av alle muSC-er hadde tatt opp synlige mengder fluorescerende merket siRNA like før ferdigstillelse av første divisjonsrunde på 24 timer. Antall transfekterte Pax7+-celler økte ytterligere opptil 74 % etter 30 timer (figur 5B). Videre var det ingen forskjell i antall Pax7+ celler per myofiber av transfekterte eller ikke-transfektede forhold på begge tidspunktene, noe som ikke viste noen bivirkninger på stamcellenumrene på grunn av transfeksjonsprosedyren (Figur 5C).

Oppsummert gir protokollen en detaljert beskrivelse av isolasjonen og kulturen til EDL-single myofibers med sine tilstøtende muskelstammeceller. Det muliggjør studiet av myofiber-assosiert muskel stamcelle aktivitet ex vivo, f.eks, ved immunfluorescence-baserte analyser. Manipulering av muskelstammeceller ved siRNA-transfeksjon er effektiv og gir et metodisk grunnlag for funksjonelle analyser.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk sammendrag av viktige trinn. De viktigste trinnene i isolasjons- og immunstainingsprosedyren er oppsummert i denne figuren. Forkortelser: DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium; FBS, Fetal Bovine Serum; CEE, kylling embryo ekstrakt; TA, tibialis fremre; EDL, extensor digitorum longus Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Mus EDL-disseksjon og enkel myofiberisolasjon. (A) Huden på musens bakben fjernes og muskelen rundt fascia trekkes bort for å eksponere TA (tibialis fremre) muskel. (B) TA muskelen er fjernet for å eksponere EDL (extensor digitorum longus) muskel, merket med den hvite pilen. (C) EDL-muskelen dissekeres ved å kutte senene. (D) To EDL muskler er kollagenaliser fordøyd. (E) Utseende av kollagenose fordøyd muskel med synlige enkelt myofibers løsner opp fra vevskjernen. (F) Stor og småboret Pasteur pipette med skala. (G) EDL-musklene (merket med svarte piler) er fysisk triturert ved hjelp av en stor bore pasteurpipette. (H) Enkelt intakte myofibers er tynne og skinnende og kan samles individuelt for kultur og analyse. (I) Hyperkontracted og døde myofibers er uegnet for kultur og analyse. De mikroskopiske bildene av 2H og 2I ble tatt med et mikroskop ved hjelp av et N-Achroplan 5x-mål. Skalastenger er 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Mikroskopisk bilde av en hel enkelt myofiber med tilhørende musker. Enslige myofibers fra EDL av unge C57BL/6 mus ble tilberedt og PFA-fast etter isolasjon (0 h). (A) Pax7 og DAPI immunfluorescence farging identifiserer myofiber assosierte muskel stamceller (MuSCs, merket med piler). Det mikroskopiske bildet ble tatt ved hjelp av flisene og z-stack-funksjonen til et mikroskop utstyrt med et Plan-Apochromat 40x oljemål. Skalalinjen er 200 μm. (B) Forstørrelse fra (A) som viser myonuclei, en Pax7 positiv kjerne og det lyse mørke mønsteret fra myofibrillære strukturer i brightfield. Skalalinjen er 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Immunfluorescence bilder av MuSC aktivering og myogen progresjon under single myofiber kultur. Muskel stamceller (MuSCs) av nyisolerte myofibers (0 h) representerer en homeostatisk tilstand nær in vivo passiviteten, preget av uttrykk for Pax7 og mangel på MyoD uttrykk. Under enkelt myofiberkultur oppregulerer de fleste MuSCer MyoD og går inn i cellesyklusen igjen for å dele og spre seg (42 timer). Etter 72 timers kultur kan MuSC-skjebnen diskrimineres basert på myogent markøruttrykk. Celler med bare Pax7-uttrykk vil fornye seg selv (rød pil), mens Pax7 og MyoD doble positive celler (rød / grønn pil) fortsetter å spre seg. MyoD bare positive celler (grønn pil) har forpliktet seg til myogen differensiering. Mikroskopiske bilder ble tatt ved hjelp av et mikroskop med en Plan-Apochromat 20x mål (0 h, 42 h) eller en LD Plan-Neofluar 40x mål (72 h). Skalastenger er 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Fluorescerende siRNA-transfeksjon av muSC-er og opptaksanalyse. EDL single myofibers ble tilberedt og transfektert med fluorescerende merket siRNA (siGLO) ved å følge trinnene i denne protokollen. (A) Cytoplasmatisk akkumulering av siGLO granulater spesielt i en Pax7 positiv muskel stamcelle (MuSC) på en enkelt myofiber ved 30 h kultur. Det mikroskopiske bildet ble tatt ved hjelp av z-stack- og apotome-funksjonen til et mikroskop med et Plan-Apochromat 100x oljemål. Skalastenger er 5 μm. (B) Kvantifisering av siRNA-opptak av Pax7 positive muskelstammeceller ved 24 eller 30 timers kultur. (C) Antall Pax7 positive celler per enkelt myofiber som sammenligner ikke-transfekterte og transfected forhold ved 24 eller 30 timers kultur. Data vises som gjennomsnitt med standardavvik på n = 4 mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Her presenteres en metode for å undersøke rollen til et bestemt gen i MuSCer ved hjelp av en in vitro-tilnærming. Viktigst, i systemet som er beskrevet her, er muSCene dyrket under forhold, som ligner in vivo-situasjonen så mye som mulig og bevarer de fleste interaksjonene til muscene med deres nisje. Dette oppnås ved å dyrke isolerte myofibers med sine tilstøtende muSC-er under flytende forhold og påfølgende siRNA-transfeksjon. Prosedyrene for myofiberisolasjon, siRNA-transfeksjon og undersøkelse av MuSC-populasjoner i løpet av 72 timers kultur gjennom immunfluorescensanalyser beskrives. Videre ble det demonstrert at rundt 74% av alle muSC-er ble transfektert med en fluorescerende merket kontroll siRNA etter 30 timers kultur.

Spesiell oppmerksomhet bør fokuseres på forsiktig disseksjon av EDL muskelen siden omfattende strekk, klemming eller klemming vil føre til sammentrekning og påfølgende død av myofibers. Videre er det viktig å undersøke klynger av muSC-er fra minst 20 forskjellige myofibers per replikering per tilstand. Dette er nødvendig siden MuSC-tall og egenskaper varierer på grunn av eksistensen av MuSC-subpopulasjoner. Når du undersøker effekten av en bestemt siRNA på MuSCs ved hjelp av flytende myofiber kulturmetode, bør en sammenligning av tilstanden med målretting siRNA til ikke-målretting kontroll utføres innenfor samme mus og muskel. Dette anbefales for å unngå musespesifikke forskjeller som kan dekke eller forsterke effekten av siRNA. Nedslagseffektiviteten kan bestemmes av immunfluorescensanalyser med antistoffer rettet mot målgenet ved hjelp av enkelt myofibers med deres tilstøtende MuSCer. Hvis dette ikke er et alternativ, kan man teste siRNA knockdown-effektiviteten i primære myoblaster etterfulgt av kvantitative RT-PCR- eller immunoblotanalyser. Effektiviteten til siRNA bør bestemmes før du analyserer effekten av siRNA på muSCer på enkelt myofibers. Bruken av et smart basseng som består av 4 forskjellige siRNAer kontra en enkelt, øker knockdown-effektiviteten, men øker også risikoen for uspesifisert målretting. En siRNA som ikke er målrettet, bør brukes som en kontroll. For å overvåke transfeksjonseffektiviteten direkte, kan man bruke en fluorescerende merket ikke-målrettende siRNA som utført her. Tidspunktet for transfeksjon med siRNA er rundt 4 timer etter isolasjon, et tidspunkt da basal lamina rundt muSCene allerede er gjennomtrengelig for siRNA. Hvis effekten av en bestemt siRNA på MuSCs etter 72 eller 96 h skal undersøkes, anbefales det å utføre en annen siRNA-transfeksjon etter 24 timer eller 48 timer for å opprettholde en høy knockdown-effektivitet.

Myofiberkulturanalysen viser forskjellige fordeler sammenlignet med undersøkelsen av MuSC-er med konvensjonelle cellekulturmetoder. MuSCer forblir festet til myofibers under hele isolasjonsprosessen, og bevarer dermed det avgjørende samspillet mellom MuSC med sin nisje19,23,24,25. Den bevarte interaksjonen mellom MuSC-er med myofiberen er en forutsetning for å studere nisjeavhengige effekter på MuSC-funksjonalitet, som ikke kan rekapituleres i konvensjonelle 2D-myoblastkulturer. For eksempel, under aldring MuSCs skjerm svekket myogen kapasitet resulterer i redusert effektivitet for å regenerere muskelvev etter skade20,26. Denne svekkelsen skyldes i det minste delvis endringer i MuSC-nisjen, spesielt endringer i ECM-sammensetningen27,28. Myofiberkulturprotokollen tillater studie og forstyrrelser med disse avvikende nisjeendringene.

I motsetning til metoden som er beskrevet her, innebærer rensing av MuSC-er ved immunisolering og sorteringsteknikker som FACS (fluorescensaktivert cellesortering) eller MACS (magnetisk cellesortering) fjerning av MuSC-ene fra deres nisje. Interessant nok mister 2D-kulturer av isolerte muSC-er fra aldrende muskler sine ekstrinsiske signaler og oppfører seg som MuSCs isolert fra unge muskler og dermed ikke recapitulaterer in vivo-situasjonen riktig29. Videre resulterer fullstendig dissosiasjon av muskelvev og merking av MuSCer med overflatemarkører i transkripsjonsendringer og aktivering av cellene30,31,32. En annen fordel med myofiberkultursystemet er muligheten til å forstyrre MuSC-funksjonaliteten på ulike nivåer. Manipulering av MuSC-er på dyrkede myofibere kan effektivt oppnås ved siRNA-mediert gen-knockdown som beskrevet her i detalj. På samme måte er anvendelsen av kjemiske forbindelser eller levering av rekombinante proteiner svært effektiv for å forstyrre stamcellebanene20,28. Videre tillater retro- eller lentivirale uttrykksvektorer innføring av eksogene gener, det vil si konstitutive aktive mutanter33. I tillegg kan påvirkningen av ekstrinsiske faktorer på MuSC-funksjonalitet utforskes i systemet som er beskrevet her, for eksempel kan kulturforholdene suppleres med supernatant fra forskjellige fysiologiske eller patologiske kilder for å modellere forskjellige tilstander som kreftbufferxia34,35.

En begrensning av metoden som er beskrevet her er det faktum at det enkle myofiberkultursystemet ikke helt kan rekapitulere virkningen av alle systemiske faktorer eller påvirkning av andre celletyper på MuSCer. Også tiden da myofibers kan holdes levedyktig i kulturen er begrenset, og derfor fokuserer studiet av MuSC-relaterte prosesser på tidlige hendelser som aktivering og myogent engasjement. Videre er undersøkelsen av MuSC-interaksjonen med andre nisjeceller som immunceller eller fibro-adipogene stamceller ikke mulig. For å undersøke systemiske effekter på MuSC-funksjonalitet kan man enten utføre muskelskadeforsøk etterfulgt av analyse av muskelregenerering in vivo eller utføre transplantasjonsforsøk36,37.

Samlet gir myofiberisolasjons- og kulturprotokollen gode muligheter for genetiske eller mekanistiske studier på voksne muSC-er uten krav om transgene musemodeller og kan potensielt redusere dyreforsøk.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Christine Poser og Christina Picker for utmerket teknisk assistanse og kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft til JvM (MA-3975/2-1), Carl Zeiss foundation og Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b ThermoScientific A-21141 use 1:1000 for IF
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 ThermoScientific A-21123 use 1:1000 for IF
chicken embryo extract Seralab CE-650-J chicken embryo extract containing growth factors etc.
collagenase type 1 Sigma C0130
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) GibCo 41966029 cell culture medium
fetal bovine serum Gibco 10270-106 fetal bovine serum
horse serum Gibco 26050-088
Lipofectamine RNAiMax ThermoScientific 13778150 transfection reagent
MyoD antibody clone G-1 Santa Cruz sc-377460 dilute 1:200 for IF
Pax7 antibody DSHB PAX7 use undiluted
siGLO Red Transfection Indicator horizon discovery D-001630-02-05 non targeting siRNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henze, H., Jung, M. J., Ahrens, H. E., Steiner, S., von Maltzahn, J. Skeletal muscle aging - Stem cells in the spotlight. Mechanisms of Ageing and Development. 189, 111283 (2020).
  2. Chang, N. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells: the architects of skeletal muscle. Current Topics in Developmental Biology. 107, 161-181 (2014).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysics and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
  4. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
  5. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
  6. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
  7. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  8. Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
  9. Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
  10. Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (13), 2559-2570 (2019).
  11. Motohashi, N., Asakura, A. Muscle satellite cell heterogeneity and self-renewal. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2, 1 (2014).
  12. Huttner, S. S., et al. Isolation and culture of individual myofibers and their adjacent muscle stem cells from aged and adult skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 2045, 25-36 (2019).
  13. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
  14. Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
  15. Mourikis, P., et al. A critical requirement for notch signaling in maintenance of the quiescent skeletal muscle stem cell state. Stem Cells. 30 (2), 243-252 (2012).
  16. Pisconti, A., Cornelison, D. D., Olguin, H. C., Antwine, T. L., Olwin, B. B. Syndecan-3 and Notch cooperate in regulating adult myogenesis. Journal of Cell Biology. 190 (3), 427-441 (2010).
  17. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).
  18. Troy, A., et al. Coordination of satellite cell activation and self-renewal by Par-complex-dependent asymmetric activation of p38alpha/beta MAPK. Cell Stem Cell. 11 (4), 541-553 (2012).
  19. Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A., Brack, A. S. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
  20. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
  21. Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
  22. Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127, Pt 21 4543-4548 (2014).
  23. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
  24. Eliazer, S., et al. Wnt4 from the Niche Controls the Mechano-Properties and Quiescent State of Muscle Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 654-665 (2019).
  25. Goel, A. J., Rieder, M. K., Arnold, H. H., Radice, G. L., Krauss, R. S. Niche cadherins control the quiescence-to-activation transition in muscle stem cells. Cell Reports. 21 (8), 2236-2250 (2017).
  26. Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
  27. Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
  28. Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular wisp1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
  29. Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12 (3), 333-344 (2013).
  30. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  31. van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
  32. van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24 (2), 213-225 (2019).
  33. Judson, R. N., et al. The Hippo pathway member Yap plays a key role in influencing fate decisions in muscle satellite cells. Journal of Cell Science. 125, Pt 24 6009-6019 (2012).
  34. He, W. A., et al. NF-kappaB-mediated Pax7 dysregulation in the muscle microenvironment promotes cancer cachexia. Journal of Clinical Investigation. 123 (11), 4821-4835 (2013).
  35. Schmidt, M., Poser, C., von Maltzahn, J. Wnt7a counteracts cancer cachexia. Molecular Therapy Oncolytics. 16, 134-146 (2020).
  36. Feige, P., Rudnicki, M. A. Isolation of satellite cells and transplantation into mice for lineage tracing in muscle. Nature Protocols. 15 (3), 1082-1097 (2020).
  37. Garry, G. A., Antony, M. L., Garry, D. J. Cardiotoxin induced injury and skeletal muscle regeneration. Methods in Molecular Biology. 1460, 61-71 (2016).

Tags

Biologi Utgave 168 muskel stamcelle satellittcelle stamcelle skjelettmuskulatur myofiberkultur siRNA EDL extensor digitorum longus
Single Myofiber Culture Assay for vurdering av voksen muskel stamcelle funksjonalitet Ex Vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hüttner, S. S., Hayn, C.,… More

Hüttner, S. S., Hayn, C., Ahrens, H. E., Schmidt, M., Henze, H., von Maltzahn, J. Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo. J. Vis. Exp. (168), e62257, doi:10.3791/62257 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter