Summary
I detta protokoll beskrivs en in vitro-odlings- och funktionell analysmetod för muskelstamceller, vilket bevarar de flesta av deras interaktioner med deras endogena nisch.
Abstract
Vuxen skelettmuskelvävnad hyser en stamcellspopulation som är oumbärlig för dess förmåga att regenerera. Vid muskelskada lämnar muskelstamceller sitt quiescent tillstånd och aktiverar det myogena programmet som i slutändan leder till reparation av skadad vävnad som samtidigt är samtidig med påfyllningen av muskelstamcellspoolen. Olika faktorer påverkar muskelstamcellsaktiviteten, bland annat inneboende stimuli men också signaler från den direkta muskelstamcellsmiljön, stamcellsnisch. Isoleringen och kulturen hos enskilda myofibrer med tillhörande muskelstamceller bevarar det mesta av stamcellens interaktion med dess nisch och är därför den närmaste möjligheten att studera muskelstamcellsfunktionalitet ex vivo. Här tillhandahålls ett protokoll för isolering, kultur, siRNA-transfektion och immunstaining av muskelstamceller på deras respektive myofibrer från musen EDL (extensor digitorum longus) muskler. De experimentella tillstånd som beskrivs här tillåter studier och manipulering av muskelstamceller ex vivo inklusive undersökning av myogen aktivitet utan det inneboende behovet av in vivo djurförsök.
Introduction
Skelettmuskulaturen hos vuxna är en postmitotisk vävnad som huvudsakligen består av multikärnorikas myofibrer, som är effektorcellerna för frivilliga rörelser. Den har en anmärkningsvärd förmåga att regenerera, en process som liknar embryonal myogenes och genomgår försämringar i ålder och sjukdom1. Denna slående regenerativa kapacitet hos skelettmuskulaturen beror på muskelstamceller (MuSCs), som också kallas satellitceller på grund av deras placering mellan sarcolemma och den basala laminan i myofibrer2,3. Under viloförhållanden är muscs quiescent och kännetecknas av uttrycket av transkriptionsfaktorn Pax7 och quiescence markörer som Sprouty14,5,6,7,8. Vid aktivering, t.ex. efter skada, lämnar MuSCs det quiescenta tillståndet och uppreglerar den myogena regleringsfaktorn MyoD9. Pax7/MyoD dubbelpositiva MuSCs förökar sig och differentierar därmed myogena prekursorceller, som också ofta kallas myoblaster. Dessa myoblaster skiljer sig sedan ytterligare i långsträckta myocyter, en process som sammanfaller med molekylära och morfologiska förändringar, t.ex. förlust av Pax7 och uppreglering av Myogenin uttryck10. Myocyter smälter sedan så småningom till varandra eller till befintliga myofibrer och reparerar därmed den skadade vävnaden. Viktigt är att en liten del av muskelstamcellerna återställer MyoD-uppregleringen och kan själv förnya11. Statusen för MuSC differentiering och myogen progression kan lätt observeras genom undersökning av myogena markörer såsom Pax7, MyoD och Myogenin10.
Kulturen hos enskilda myofibrer med sina intilliggande MuSCs är en utmärkt metod för att undersöka MuSC-funktionalitet i en ex vivo-miljö eftersom MuSCs finns kvar i sin endogena nisch12,13. Beteendet hos MuSCs regleras av inneboende signaler samt extrinsiska signaler som tillhandahålls av nischen, en specialiserad anatomisk plats som består av komponenter i den extracellulära matrisen (ECM) som omger MuSCs och myofibern själv. Till exempel är en av de extrinsiska regulatorerna för MuSC quiescence Notch-signalering. Här tas signalsignaler emot av MuSCs från både myofiber och ECM14,15,16. Dessutom är MuSC-nischen viktig för att kontrollera uppdelningsaxeln för MuSCs och därmed reglera cellernas öde för MuSC-dottercellerna17,18. Rimligen kan parametrar som asymmetriska MuSC-divisioner, myogen progression och självförnyelse bedömas unikt i denna experimentella installation. Till exempel kan ett multicellulärt kluster bildas från en MuSC efter en 72 h kulturperiod, som kan undersökas för förekomst och procentandel av distinkta myogena populationer som självförnyelse, prolifererande och ytterligare differentierade MuSCs8,19,20,21. Differentieringstillståndet för MuSCs kan bestämmas genom undersökning av uttrycket/meduttrycket av Pax7, MyoD och Myogenin. Efter 72 h av kulturen kan cellerna i ett kluster diskrimineras av följande parametrar: Pax7 endast celler är självförnyande MuSCs, medan Pax7/ MyoD dubbla positiva celler förökar sig / aktiverade MuSCs och ytterligare differentierade myogena celler är Myogenin positiva22. Vidare kan MuSC-nummer eller återinträde i cellcykeln/aktiveringen undersökas utöver myogen progression, t.ex. genom immunofluorescensbaserade analyser baserade på de parametrar som beskrivs ovan.
Här beskrivs de unika egenskaperna hos myofiberisolerings- och kulturprotokollet, t.ex. bevarandet av interaktionen mellan MuSC och dess nisch. Mus hela EDL (extensor digitorum longus) muskler är noggrant dissekerade, smälta av kollagenas, och fysiskt triturerade för att få enstaka myofibers med deras tillhörande MuSCs för ytterligare kultur. Dessutom beskriver protokollet stegen för att transfektera MuSCs med siRNA för funktionella analyser av kandidatgener och på varandra följande immunofluorescensbaserade analyser utan behov av transgena djur.
Protocol
Uppoffring av djur måste utföras i enlighet med de nationella bestämmelserna för djurförsök. Protokollet som beskrivs här utfördes i enlighet med riktlinjerna från Leibniz Institute on Aging - Fritz Lipmann Institute och Europeiska unionens (EU) direktiv 2010/63/EU (licensnummer för organavverkning: O_JvM_18-20). Viktiga steg i protokollet sammanfattas i figur 1.
1. Beredning av odlingsplattor, media och Pasteur pipetter
OBS: Alla material och all utrustning som behövs för att isolera och odla enstaka myofibrer måste vara så sterila som möjligt. Därför rekommenderas att isolera enstaka myofibrer under en halvsteril dissekeringshuv.
- Använd steril HS (hästserum) för att belägga vävnadsodlingsplattor. Beläggning förhindrar fastsättning av enskilda myofibrer på plastytan. För varje mus krävs 4 brunnar av en 12-brunnsplatta för isolering och ett dedikerat antal brunnar på en 24-brunnsplatta för odling. Inkubera brunnarna på en 12-brunnsplatta med 1 ml och brunnarna på en 24-välplatta med 0,5 ml HS i 5 minuter vid RT (rumstemperatur), ta sedan bort HS och låt plattorna torka i ytterligare 5 min.
OBS: HS kan samlas in och återanvändas för beläggningsändamål flera gånger, om det hålls sterilt. - Förbered myofiberisoleringsmediet genom att komplettera DMEM (Dulbeccos modifierade Eagles medium med 4,5 g/L glukos och natriumpyuvat) med 20% FBS (fetalt bovinserum), filtrera genom 0,22 μm filter. Tillsätt medium till de förbelagda isoleringsplattorna (12-brunnsplatta, 2-4 ml isoleringsmedium per brunn) cirka 30 min före isoleringen och jämvikten i en fuktad 37 °C inkubator med 5% CO2.
- Förbered myofiberodlingsmediet genom att komplettera DMEM (Dulbeccos modifierade Eagles medium med 4,5 g/L glukos och natriumpyuvat) med 20% FBS (fetalt bovinserum) och 1% kycklingembryonextrakt, filtrera genom 0,22 μm filter. Tillsätt 0,5 ml medium till varje brunn på de förbelagda odlingsplattorna (24-brunnsplattan) cirka 30 minuter före isoleringen och jämvikten i en fuktad 37 °C inkubator med 5% CO2.
- Förbered kollagenas matsmältningslösning genom att lösa upp 0,2% (w/v) kollagenas typ 1 (från Clostridium histolyticum)i DMEM (Dulbeccos modifierade Eagles medium med 4,5 g/L glukos och natriumpyuvat), filtrera genom 0,22 μm filter. För två EDL(extensor digitorum longus)muskler använd 2,5 ml kollagenaslösning i ett sterilt 15 ml reaktionsrör. Förvärm dessutom lösningen ~10 min i ett cirkulerande vattenbad vid 37 °C innan isoleringen påbörjas.
- Förbered sterila Pasteur pipetter för trituration av kollagenas-smälta muskler. Använd en diamantpenna för att skära Pasteur pipetter.
- För varje mus, använd en stor borrpipeett med en öppning på ca 0,3 cm och en längd av ca 10-12 cm och en andra glaspipett med en liten öppning på ca 0,1 cm och en längd av ca 22 cm (figur 2F).
- Jämna ut kanterna på båda pipetterna genom värmepolering med lågan från en Bunsenbrännare. Håll pipettens spets i 5-10 s i lågan med mild rörelse för att möjliggöra jämn värmefördelning tills de vassa glaskanterna jämnas ut.
- Omedelbart före användning, täck båda typerna av glaspipetter med steril HS genom att fylla hela pipetten med ~ 2 ml HS i 5 min, därefter mata ut HS och låt pipetten torka i 5 min på RT.
2. EDL muskelisolering och kollagenas matsmältning
- Spraya all utrustning med 70% etanol för att undvika förorening.
- Offra musen i enlighet med de nationella bestämmelserna för djurförsök.
- Spraya musens baklimbs med 70% etanol. Använd härdad fin böjd sax (24 mm skäregg) och fina tångar (Dumont 7, böjd eller rak) för att ta bort huden och exponera de underliggande musklerna. Undvik kontakt med de underliggande musklerna med päls (ökar risken för kontaminering).
- Ta bort den omgivande fascian med fina böjda tångar utan att skada de underliggande musklerna (figur 2A). Stäng tången för att undvika böjning.
- Använd böjda tångar för att exponera de distala senorna i TA (tibialis främre) och EDL-muskeln. För att ta bort TA, ta tag i den distala TA-senan med tång och skär med fina Vannas fjädersax (5 mm skäregg, 0,35 mm spetsdiameter). Medan du håller TA vid senan, dra den mot knäet och skär muskeln nära knäet (figur 2B), är EDL-muskeln nu exponerad.
OBS: Se till att endast TA-senan tas i detta steg, annars kan den underliggande EDL skadas. När du skär av TA-muskeln, se till att senorna vid knäet lätt kan ses efteråt. - Lyft den distala EDL-senan med fina böjda tångar och skär med fina Vannas vårsax (figur 2C). Exponera den proximala EDL-senan genom att försiktigt dra EDL mot knäet. Skär den proximala senan med fina Vannas vårsax. Överför EDL-muskeln till 37 °C förvärmd 2,5 ml kollagenas matsmältningslösning i 15 ml reaktionsröret från steg 1,4. (Figur 2D).
OBS: Gör ett litet snitt vid den yttre knä bindväven för att helt exponera proximal EDL sena. Se till att bara ta tag i senorna och inte sträcka EDL för mycket. - Upprepa steg 2.3. till 2,6. med den andra EDL. Tillsätt båda EDL-musklerna till samma 15 ml reaktionsrör fyllt med 2,5 ml kollagenas matsmältningslösning.
- Inkubera EDL-musklerna i reaktionsröret vid 37 °C i ett cirkulerande vattenbad.
OBS: Inkubationstiden beror på flera faktorer, såsom kollagenasaktivitet, musens ålder och mängden fibrotisk vävnad. Den typiska inkubationstiden för EDL-muskler hos vuxna möss (2-6 månaders ålder) är 1-1,5 h och för åldrade möss (18 månaders ålder) 1,5-2 h. - För att undvika överdriven matsmältning av musklerna, kontrollera musklerna under matsmältningstiden. Stoppa matsmältningen när musklerna lossnar och enstaka myofibrer är synliga (figur 2E). Överför musklerna försiktigt med den stora borrpipetten till den första brunnen på den förvarnade 12-brunnsplattan som innehåller myofiberisoleringsmedium (Figur 2G).
3. Myofiber dissociation och kultur
- För följande steg använd ett stereokulatmikroskop, företrädesvis utrustat med en värmeplatta (37 °C). Använd den stora borrpipetten för att spola musklerna med varmt isoleringsmedium tills enstaka myofibrer släpps. Dissociera musklerna med den stora borrpipetten tills önskat antal myofibrer flyter fritt i lösningen.
OBS: Undvik överdriven trituration för att minska risken för skadade myofibrer. Användning av en värmeplatta för myofiber dissociation rekommenderas starkt eftersom temperaturen sjunker under isoleringsprocessen, vilket kommer att leda till myofiberdöd. - Överför icke kontrakterade myofibrer(figur 2H) med HS-belagda små borrglasrör till den andra brunnen fylld med isoleringsmedium för att tvätta bort skräp och kontrakterade (skadade) myofibrer(figur 2I).
OBS: För att undvika överdriven rörelse av isolerade myofibrer kan de överföras till den andra brunnen och sedan kan triturationsprocessen fortsätta. - Överför icke-kontrakterade myofibers till nästa (3rd)väl fyllda med isoleringsmedium för att tvätta igen.
- Använd den småborrade glaspipetten, belagd med HS, för att överföra cirka 50-100 icke kontrakterade myofibrer till 24-brunnsplattan som innehåller myofiberkulturmedium.
- Inkubera myofibrer vid 37 °C, 5% CO2 för dedikerad tid (96 h maximalt rekommenderas).
OBS: MuSCs delar en gång antingen plana eller apikal-basal efter 42 h av kultur. Dessutom, efter 72 h av kultur MuSC bildar multicellulära kluster som består av självförnyande, prolifererande eller engagerade (differentierade) MuSC.
4. siRNA-transfektion
- 4 h efter myofiber isolering, transfect myofiber associerade MuSCs (50-100 icke-kontrakterade myofibrer i en brunn av 24-brunnsplattan fylld med 500 μL odlingsmedium) med lipidbaserad transfekt reagens, t.ex. RNAiMAX enligt tillverkarens protokoll med en slutlig koncentration av 5 pmol siRNA. Tillsätt därför 25 μL Opti-MEM med respektive volym siRNA till 25 μL Opti-MEM som innehåller 1,5 μL av transfektreagenset. Inkubera reaktionsblandningen i 5 minuter och tillsätt den sedan till 500 μL odlingsmedium.
OBS: En andra transfekt efter 24 timmar eller 48 timmar rekommenderas för längre kulturperioder, t.ex. mer än 48 timmar. En förändring av medium efter transfektion är inte nödvändig.
5. Fixering och OM färgning
- För immunstainering använd ett stereokulatmikroskop. Alla volymer i följande steg justeras till en brunn på en 24-brunnsplatta. Utför alla följande steg med en HS-belagd rörett med småborrar.
- Kassera försiktigt myofiberodlingsmediet samtidigt som du lämnar en lösning i brunnen (cirka 100 μL per 24-brunn). Gör detta för alla ytterligare steg om inget annat anges för att tillåta flytande myofibrer. Tillsätt 500 μL 2% PFA för att fixera myofibrerna med sina intilliggande MuSCs, inkubera i 5 min vid rumstemperatur (RT).
- Ta försiktigt bort supernatanten och tvätta myofibrerna tre gånger med PBS (pH 7,4, 500 μL i 5 min vid RT vardera).
- Tillsätt 500 μL permeabiliseringslösning (0,1% Triton X-100, 0,1 M Glycin i PBS, pH 7,4), inkubera i 10 min vid RT.
- Ta bort permeabiliseringslösningen och tillsätt 500 μL-blockeringslösning (5% HS i PBS, pH 7.4) i 1 timme vid RT.
OBS: Kontrollera den rekommenderade blockeringslösningen för primära antikroppar för att undvika ospecificerad bindning. - Ta bort blockeringslösningen och tillsätt 300 μL primär antikroppsutspädning (t.ex. anti-Pax7 (PAX7, DSHB, outspädd), anti-MyoD (klon G-1, Santa Cruz, 1:200)) per brunn. Inkubera vid 4 °C över natten.
- Tvätta tre gånger med 500 μL PBS per brunn (5 min vid RT).
- Ta bort PBS och tillsätt 300 μL sekundär antikroppsutspädning (t.ex. antimus-IgG1-546 och antimus-IgG2b-488 1:1000) per brunn. Inkubera 1 h på RT skyddad mot ljus. För följande steg rekommenderas ljusreducerade förhållanden.
- Tvätta två gånger med 500 μL PBS per brunn (5 min vid RT).
- Utför DAPI-färgning genom att använda 500 μL av lösningen per brunn (slutlig DAPI-koncentration 10 μg/ml) i 5 min vid RT.
- Tvätta två gånger med 500 μL PBS per brunn (5 min vid RT).
- Använd en hydrofobisk penna för att rita en cirkel på en mikroskopisk glasrutschbana för att skapa en vattenavstötande barriär som förhindrar spill av vätska som innehåller myofibrer. Överför myofibrerna i minsta möjliga volym till den mikroskopiska glasrutschbanan och sprid dem på glasrutschbanan.
OBS: Undvik fysisk dragning av myofibrerna över den mikroskopiska glasrutschbanan eftersom detta kan orsaka friktion som resulterar i avlossning av kluster från myofibrer. - Ta bort restvätskan med pasteurpipetten med småborrat eller en 200 μL-pipett.
- Använd två droppar vattenhaltigt monteringsmedium och täck myofibrerna med ett täckslip. Låt bilderna torka under den tid som rekommenderas av tillverkaren. Förvara bilderna vid 4 °C i mörker.
Representative Results
Detta protokoll ger instruktioner för framgångsrik härledning och kultur av enstaka myofibers med deras tillhörande MuSCs från murine EDL muskler. Viktiga steg i protokollet sammanfattas i figur 1. Noggrann sen-till-sen-dissekering av EDL-musklerna (figur 2A-C) är avgörande för ett högt utbyte av livskraftiga myofibrer. Muskelavsociation uppnås först genom kollagenas matsmältning (figur 2D) följt av fysisk trituration (figur 2G). Intakta myofibrer (figur 2H) odlas, medan hyperkontrakterade och döda myofibrer (figur 2I) bör uteslutas från kultur och analys.
MuSCs förblir myofiber-associerade under isoleringsprocessen. Immunofluorescensfärgning för transkriptionsfaktorn Pax7 identifierar och skiljer 7-9 MuSC-kärnor från mängden myonukledi per myofiber när den fixeras direkt efter slutförandet av isoleringsprocessen (figur 3A). Figur 3B visar ett förstorat område från figur 3A med den extra brightfield-kanalen, som exponerar myofibrillärstrukturen hos myotuben och visar Pax7 immunofluorescenssignal i kärnan av en MuSC.
Aktivering och myogen progression av myofiber associerade MuSCs kan analyseras av myogena markör uttryck. Associeras med nyisolerade myofibrer (0 h), mestadels quiescent MuSCs kan hittas, som kännetecknas av Pax7 uttryck och frånvaro av MyoD uttryck, därmed liknar en in vivo homeostatic villkor (figur 4, 0 h). På grund av dissekerings-/dissociationsförfarandet och myofiberkulturens mediesammansättning aktiverar och uppreglerar muscs snabbt transkriptionsfaktorn MyoD för att underlätta spridning som kan observeras vid 42 timmar, när muscs har genomgått sin första uppdelning(figur 4, 42 h). Efter 72 timmars kultur bildar MuSCs kluster av avkomprogener med olika myogena öden som är parallella med uttrycksmönstren för olika myogena markörer (figur 4, 72 h). Pax7+ endast celler motstår differentiering och blir självförnyande stamceller. Pax7+ och MyoD+ dubbelpositiva celler är proliferativa, medan MyoD+ endast celler har vidareutvecklats längs den myogena härstamningen och kommer att skilja.
Myofiber kultursystemet möjliggör effektiv interferens av MuSC aktivitet genom olika interventioner, som en av dem är siRNA transfection som beskrivs i detalj i detta protokoll. För att övervaka transfection effektivitet myofiber associerade MuSCs en fluorescerande märkt icke-inriktning siRNA var transfected. Pax7 positiva muscs ackumulerade cytoplasmisk siRNA på ett granulatliknande sätt, vilket indikerar effektivt upptag (figur 5A). Inga fluorescerande granulat observerades i cytoplasman av myofibers tyder på en naturlig upptag barriär i myofibrer vid 4 h efter isolering och att siRNA transfection specifikt riktar muscs. Kvantifiering av positivt transfected Pax7 + celler per myofiber visade att mer än hälften av alla MuSCs hade tagit upp synliga mängder fluorescerande märkt siRNA strax före slutförandet av den första omgången av uppdelningen vid 24 timmar. Antalet transfekterade Pax7+ celler ökade ytterligare upp till 74% efter 30 timmar (figur 5B). Dessutom fanns det ingen skillnad i antalet Pax7+ celler per myofiber av transfekterade eller icke-transfekterade tillstånd vid båda tidpunkterna, vilket inte visade några negativa effekter på stamcellsnumren på grund av transfekteringsförfarandet (figur 5C).
Sammanfattningsvis ger protokollet en detaljerad beskrivning av isoleringen och kulturen av EDL single myofibers med sina intilliggande muskelstamceller. Det möjliggör studier av myofiberassocierad muskelstamcellsaktivitet ex vivo, t.ex. genom immunofluorescensbaserade analyser. Manipulering av muskelstamceller genom siRNA-transfektion är effektiv och ger en metodologisk grund för funktionella analyser.
Bild 1: Schematisk sammanfattning av viktiga steg. De väsentliga stegen i isolering och immunstaining förfarandet sammanfattas i denna figur. Förkortningar: DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium; FBS, fetalt bovinserum; CEE, kycklingembryonextrakt; TA, tibialis främre; EDL, extensor digitorum longus Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mus EDL-dissekering och enkel myofiberisolering. (A) Huden på musens baklimb avlägsnas och muskeln som omger fascia dras bort för att exponera TA (tibialis främre)muskeln. (B) TA-muskeln avlägsnas för att exponera EDL -muskeln (extensor digitorum longus),märkt med den vita pilen. (C) EDL-muskeln dissekeras genom att skära av senorna. (D) Två EDL-muskler är kollagenas smälta. (E) Utseende av kollagenas smält muskel med synliga enda myofibrer som lossnar upp från vävnadskärnan. F) Stor och småborrade Pasteur pipett med skala. ( G) EDL-musklerna (märkta med svarta pilar) är fysiskt triturerade med hjälp av en stor bor Pasteur pipetter. (H) Enskilda intakta myofibrer är tunna och glänsande och kan samlas individuellt för kultur och analys. (I) Hyperkontrakterade och döda myofibrer är olämpliga för kultur och analys. De mikroskopiska bilderna av 2H och 2I fångades med ett mikroskop med hjälp av ett N-Achroplan 5x mål. Skalstänger är 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mikroskopisk bild av en hel myofiber med tillhörande muscs. Single myofibers från EDL av unga C57BL/6 möss förbereddes och PFA-fixeras efter isolering (0 h). (A) Pax7 och DAPI immunofluorescensfärgning identifierar myofiberassocierade muskelstamceller (MuSCs, markerade med pilar). Den mikroskopiska bilden togs med hjälp av plattor och z-stack funktion av ett mikroskop utrustat med en Plan-Apochromat 40x oljemål. Skalstången är 200 μm. (B) Förstoring från (A) som visar myonukledi, en Pax7-positiv kärna och det ljusmörmma mönstret från myofibrillära strukturer i brightfield. Skalningsfältet är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Immunofluorescensbilder av MuSC-aktivering och myogen progression under en enda myofiberkultur. Muskelstamceller (MuSCs) av nyisolerade myofibrer (0 h) representerar ett homeostatiskt tillstånd nära in vivo quiescence, kännetecknat av uttryck av Pax7 och brist på MyoD uttryck. Under en enda myofiber kultur de flesta MuSCs upregulate MyoD och gå in i cellcykeln för att dela och föröka sig (42 h). Efter 72 h av kultur kan MuSC öde diskrimineras baserat på myogena markör uttryck. Celler med endast Pax7-uttryck förnyar sig själva (röd pil) medan Pax7 och MyoD dubbla positiva celler (röd/grön pil) fortsätter att föröka sig. MyoD endast positiva celler (grön pil) har åtagit sig att myogen differentiering. Mikroskopiska bilder togs med hjälp av ett mikroskop med ett Plan-Apochromat 20x mål (0 h, 42 h) eller ett LD Plan-Neofluar 40x-mål (72 h). Skalstänger är 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fluorescerande siRNA-transfektion av muscs och upptagsanalys. EDL enda myofibers förbereddes och transfected med fluorescerande märkt siRNA (siGLO) enligt stegen i detta protokoll. (A) Cytoplasmatisk ackumulering av siGLO-granulat specifikt i en Pax7 positiv muskelstamcell (MuSC) på en enda myofiber vid 30 h odling. Den mikroskopiska bilden fångades med hjälp av z-stack och apotome funktion av ett mikroskop med en Plan-Apochromat 100x oljemål. Skalstänger är 5 μm. (B) Kvantifiering av siRNA-upptag av Pax7 positiva muskelstamceller vid 24 eller 30 h kultur. (C) Antal Pax7-positiva celler per enstaka myofiber som jämför icke-transfekterade och transfekterade tillstånd vid 24 eller 30 timmars odling. Data visas som medelvärde med standardavvikelse på n = 4 möss. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Här presenteras en metod för att funktionellt undersöka rollen av en specifik gen i MuSCs med hjälp av en in vitro-metod. Viktigt, i det system som beskrivs här odlas muscs under förhållanden, som liknar in vivo-situationen så mycket som möjligt och bevarar de flesta interaktionerna mellan muscs med deras nisch. Detta åstadkoms genom att odla isolerade myofibers med sina intilliggande MuSCs under flytande förhållanden och på varandra följande siRNA-transfection. Förfarandena för myofiber isolering, siRNA transfection och undersökning av MuSC populationer under 72 h av kultur genom immunofluorescens analyser beskrivs. Dessutom visades det att cirka 74% av alla MuSCs transfected med en fluorescerande märkt kontroll siRNA efter 30 h av kultur.
Särskild uppmärksamhet bör fokuseras på noggrann dissekering av EDL muskeln eftersom omfattande stretching, klämning eller klämning kommer att leda till sammandragning och på varandra följande död av myofibers. Dessutom är det viktigt att undersöka kluster av MuSCs från minst 20 olika myofiber per replikat per villkor. Detta är nödvändigt eftersom MuSC-nummer och egenskaper varierar på grund av förekomsten av MuSC-subpopulationer. När man undersöker effekten av ett specifikt siRNA på MuSCs med hjälp av den flytande myofiber kulturmetoden en jämförelse av villkoret med inriktning siRNA till den icke-riktade kontrollen bör utföras inom samma mus och muskel. Detta rekommenderas för att undvika musspecifika skillnader som kan täcka eller förstärka effekterna av siRNA. Knockdown-effektiviteten kan bestämmas av immunofluorescensanalyser med antikroppar riktade mot målgenen med hjälp av enstaka myofibrer med deras intilliggande MuSCs. Om detta inte är ett alternativ kan man testa siRNA knockdown effektivitet i primära myoblaster följt av kvantitativa RT-PCR eller immunoblot analyser. Effektiviteten av siRNA bör bestämmas innan du analyserar effekten av siRNA på MuSCs på enstaka myofibrer. Användningen av en smart pool bestående av 4 olika siRNAs kontra en enda ökar knockdown-effektiviteten men ökar också risken för ospecificerad inriktning. En siRNA som inte är riktad ska användas som en kontroll. För att direkt övervaka transfekteringseffektiviteten kan man använda en fluorescerande märkt icke-mål siRNA som utförs här. Tidspunkten för transfection med siRNA är cirka 4 timmar efter isolering, en tidpunkt då den basala laminan som omger MuSCs redan är genomsläpplig för siRNA. Om effekten av ett specifikt siRNA på MuSCs efter 72 eller 96 h bör undersökas, rekommenderas att utföra en andra siRNA-transfektion efter 24 h eller 48 h för att upprätthålla en hög knockdown effektivitet.
Myofiberkulturens analys visar olika fördelar jämfört med undersökningen av MuSCs med konventionella cellodlingsmetoder. MuSCs förblir knutna till myofibrerna under hela isoleringsprocessen och bevarar därmed den avgörande interaktionen mellan MuSC med sin nisch19,23,24,25. Den bevarade interaktionen mellan MuSCs med myofiber är en förutsättning för att studera nischberoende effekter på MuSC-funktionalitet, som inte kan sammanfattas i konventionella 2D myoblast kulturer. Till exempel, under åldrande MuSCs display nedsatt myogen kapacitet vilket resulterar i en minskad effektivitet för att regenerera muskelvävnad efter skada20,26. Denna nedskrivning är åtminstone delvis hänförlig till förändringar i MuSC-nischen, särskilt förändringar iECM-sammansättningen 27,28. Myofiberkulturprotokollet tillåter studier och interferens med dessa avvikande nischförändringar.
I motsats till den metod som beskrivs här innebär rening av MuSCs genom immunolabeling och -sorteringstekniker som FACS (fluorescensaktiverad cellsortering) eller MACS (magnetisk cellsortering) avlägsnandet av MuSCs från deras nisch. Intressant nog förlorar 2D-kulturer av isolerade MuSCs från åldrade muskler sina extrinsiska signaler och beter sig som MuSCs isolerade från unga muskler och därmed inte rekapitulerar in vivo-situationen på lämpligt sätt29. Dessutom resulterar den fullständiga dissociationen av muskelvävnaden och märkning av muscs med ytmarkörer i transkriptomiska förändringar och aktivering av cellerna30,31,32. En annan fördel med myofiberkultursystemet är möjligheten att störa MuSC-funktionaliteten på olika nivåer. Manipulering av MuSCs på odlade myofibers kan effektivt uppnås genom siRNA-medierad gen knockdown som beskrivs här i detalj. På samma sätt är appliceringen av kemiska föreningar eller leverans av rekombinanta proteiner mycket effektiv för att störa stamcellsvägar20,28. Dessutom tillåter retro- eller lentivirala uttrycksvektorer införandet av exogena gener, dvs. konstituerande aktiva mutanter33. Dessutom kan påverkan av extrinsiska faktorer på MuSC-funktionalitet utforskas i det system som beskrivs här, t.ex. kan odlingsförhållandena kompletteras med supernatant från olika fysiologiska eller patologiska källor för att modellera olika tillstånd som cancercakexi34,35.
En begränsning av metoden som beskrivs här är det faktum att det enda myofiberkultursystemet inte helt kan rekapitulera effekten av alla systemiska faktorer eller påverkan av andra celltyper på MuSCs. Dessutom är den tid då myofibers kan hållas livskraftiga i kultur begränsad och därför fokuserar studien av MuSC-relaterade processer på tidiga händelser som aktivering och myogent engagemang. Dessutom är undersökningen av MuSC-interaktionen med andra nischceller såsom immunceller eller fibroadipogenic stamceller inte möjlig. För att undersöka systemiska effekter på MuSC-funktionalitet kan man antingen utföra muskelskada experiment följt av analys av muskelregenerering in vivo eller utföra transplantationsexperiment36,37.
Sammantaget ger myofiberisolerings- och kulturprotokollet stora möjligheter till genetiska eller mekanistiska studier på vuxna muscs utan krav på transgena musmodeller och kan potentiellt minska djurförsök.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Christine Poser och Christina Picker för utmärkt teknisk hjälp och kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft till JvM (MA-3975/2-1), Carl Zeiss-stiftelsen och Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
| chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
| collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
| horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
| MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
| siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |
References
- Henze, H., Jung, M. J., Ahrens, H. E., Steiner, S., von Maltzahn, J. Skeletal muscle aging - Stem cells in the spotlight. Mechanisms of Ageing and Development. 189, 111283 (2020).
- Chang, N. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells: the architects of skeletal muscle. Current Topics in Developmental Biology. 107, 161-181 (2014).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysics and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (13), 2559-2570 (2019).
- Motohashi, N., Asakura, A. Muscle satellite cell heterogeneity and self-renewal. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2, 1 (2014).
- Huttner, S. S., et al. Isolation and culture of individual myofibers and their adjacent muscle stem cells from aged and adult skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 2045, 25-36 (2019).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- Mourikis, P., et al. A critical requirement for notch signaling in maintenance of the quiescent skeletal muscle stem cell state. Stem Cells. 30 (2), 243-252 (2012).
- Pisconti, A., Cornelison, D. D., Olguin, H. C., Antwine, T. L., Olwin, B. B. Syndecan-3 and Notch cooperate in regulating adult myogenesis. Journal of Cell Biology. 190 (3), 427-441 (2010).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).
- Troy, A., et al. Coordination of satellite cell activation and self-renewal by Par-complex-dependent asymmetric activation of p38alpha/beta MAPK. Cell Stem Cell. 11 (4), 541-553 (2012).
- Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A., Brack, A. S. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
- Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127, Pt 21 4543-4548 (2014).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Eliazer, S., et al. Wnt4 from the Niche Controls the Mechano-Properties and Quiescent State of Muscle Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 654-665 (2019).
- Goel, A. J., Rieder, M. K., Arnold, H. H., Radice, G. L., Krauss, R. S. Niche cadherins control the quiescence-to-activation transition in muscle stem cells. Cell Reports. 21 (8), 2236-2250 (2017).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
- Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular wisp1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12 (3), 333-344 (2013).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24 (2), 213-225 (2019).
- Judson, R. N., et al. The Hippo pathway member Yap plays a key role in influencing fate decisions in muscle satellite cells. Journal of Cell Science. 125, Pt 24 6009-6019 (2012).
- He, W. A., et al. NF-kappaB-mediated Pax7 dysregulation in the muscle microenvironment promotes cancer cachexia. Journal of Clinical Investigation. 123 (11), 4821-4835 (2013).
- Schmidt, M., Poser, C., von Maltzahn, J. Wnt7a counteracts cancer cachexia. Molecular Therapy Oncolytics. 16, 134-146 (2020).
- Feige, P., Rudnicki, M. A. Isolation of satellite cells and transplantation into mice for lineage tracing in muscle. Nature Protocols. 15 (3), 1082-1097 (2020).
- Garry, G. A., Antony, M. L., Garry, D. J. Cardiotoxin induced injury and skeletal muscle regeneration. Methods in Molecular Biology. 1460, 61-71 (2016).
