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Biology

वयस्क मांसपेशी स्टेम सेल कार्यक्षमता पूर्व वीवो के मूल्यांकन के लिए एकल Myofiber संस्कृति परख

Published: February 15, 2021 doi: 10.3791/62257
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Leibniz Institute on Aging, Fritz-Lipmann-Institute

Summary

इस प्रोटोकॉल में मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं के लिए एक इन विट्रो संस्कृति और कार्यात्मक विश्लेषण विधि का वर्णन किया गया है, जो उनके अंतर्जात आला के साथ उनकी अधिकांश बातचीत को बरकरार रखता है।

Abstract

वयस्क कंकाल मांसपेशी ऊतक एक स्टेम सेल आबादी है कि अपनी को पुनर्जीवित करने की क्षमता के लिए अपरिहार्य है बंदरगाहों । मांसपेशियों की क्षति पर, मांसपेशी स्टेम सेल अपने शांत राज्य छोड़ दें और मायोजेनिक कार्यक्रम को सक्रिय करते हैं जिससे अंततः मांसपेशियों के स्टेम सेल पूल की भरपाई के साथ क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत होती है। विभिन्न कारक मांसपेशियों की स्टेम सेल गतिविधि को प्रभावित करते हैं, उनमें से आंतरिक उत्तेजनाएं लेकिन प्रत्यक्ष मांसपेशी स्टेम सेल वातावरण, स्टेम सेल आला से भी संकेत मिलता है। अलगाव और उनके जुड़े मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के साथ एकल myofibers की संस्कृति अपने आला के साथ स्टेम सेल की बातचीत के सबसे बरकरार रखता है और इसलिए, निकटतम संभावना मांसपेशी स्टेम सेल कार्यक्षमता पूर्व वीवो का अध्ययन करने के लिए है । यहां, माउस ईडीएल(एक्सटेंसर डिजॉरमल लॉन्गस)मांसपेशियों से अपने संबंधित मायोफिबर पर मांसपेशियों के स्टेम कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति, सिरना ट्रांसफैक्शन और इम्यूनोस्टेपिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। यहां उल्लिखित प्रायोगिक स्थितियां वीवो पशु प्रयोगों में अंतर्निहित आवश्यकता के बिना मायोजेनिक गतिविधि की जांच सहित मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं के अध्ययन और हेरफेर की अनुमति देती हैं।

Introduction

वयस्क में कंकाल की मांसपेशी मुख्य रूप से बहुनीय मायोफिबर से बना एक पोस्टमिटोटिक ऊतक है, जो स्वैच्छिक आंदोलनों के लिए प्रभावक कोशिकाएं हैं। इसमें पुनर्जीवित करने की एक उल्लेखनीय क्षमता है, एक प्रक्रिया जो भ्रूणीय मायोजेनेसिस जैसा दिखता है और उम्र और रोग में हानि से गुजरता है1। कंकाल की मांसपेशियों की यह हड़ताली पुनर्योजी क्षमता मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) पर निर्भर करती है, जिन्हें सारकोलम्मा और मायोफिबर2, 3के बेसल लैमिना के बीच उनके स्थान के कारण उपग्रह कोशिकाएं भी कहाजाताहै। विश्राम की स्थिति में एमयूएससी शांत होते हैं और इसकी विशेषता है कि ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर पैक्स 7 और क्विसेंस मार्कर जैसे स्प्राउट14,5 ,6,7,8की अभिव्यक्ति होती है । सक्रियण पर, उदाहरण के लिए, चोट के बाद, MuSCs शांत राज्य छोड़ दें और मायोजेनिक नियामक कारक मायोडी 9 को बढ़ादें। पैक्स7/मायोड डबल पॉजिटिव एमयूएससी पैदा होते हैं और अंतर करते हैं जिससे मायोजेनिक अग्रदूत कोशिकाएं पैदा होती हैं, जिन्हें अक्सर मायोब्लास्ट के रूप में भी जाना जाता है । वे मायोब्लास्ट तो आगे विस्तारित मायोसाइट्स में अंतर करते हैं, एक प्रक्रिया जो आणविक और रूपात्मक परिवर्तनों के साथ मेल खाता है, उदाहरण के लिए, पैक्स 7 का नुकसान और मायोजिनिन अभिव्यक्ति10का अपरेगुलेशन। Myocytes तो अंततः एक दूसरे को फ्यूज या मौजूदा myofibers जिससे क्षतिग्रस्त ऊतक की मरंमत । महत्वपूर्ण बात यह है कि मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश मायओडी अपरेगुलेशन को वापस करता है और11को आत्म-नवीनीकृत करने में सक्षम है। पैक्स 7, मायोडी और मायोजेनिन10जैसे मायोजेनिक मार्कर की जांच से म्यूएससी भेदभाव और मायोजेनिक प्रगति की स्थिति को आसानी से देखा जा सकता है।

अपने निकटवर्ती MuSCs के साथ एकल myofibers की संस्कृति एक पूर्व वीवो सेटिंग में MuSC कार्यक्षमता की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट तरीका है क्योंकि MuSCs अपने अंतर्जात आला12,13में शेष हैं । एमयूएससी के व्यवहार को आंतरिक संकेतों के साथ-साथ आला द्वारा प्रदान किए गए बाह्य संकेतों द्वारा विनियमित किया जाता है, एक विशेष शारीरिक स्थान जिसमें एमयूएससी और माइफइबर के आसपास के एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के घटक शामिल होते हैं। उदाहरण के लिए, MuSC quiescence के बाह्य नियामकों में से एक पायदान संकेत है । यहां, म्यूएससी द्वारा मायोफाइबर और ईसीएम14, 15, 16दोनों से सिग्नलिंग संकेत प्राप्तहोतेहैं। इसके अलावा, म्यूएससी आला एमयूएससी के विभाजन धुरी को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है इस प्रकार MuSC बेटी कोशिकाओं के सेल भाग्य को विनियमित17,18। यथोचित, असममित MuSC डिवीजनों, मायोजेनिक प्रगति और आत्म नवीकरण जैसे मापदंडों विशिष्ट इस प्रयोगात्मक सेटअप में मूल्यांकन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक बहुकोशिकीय क्लस्टर 72 घंटे की संस्कृति अवधि के बाद एक म्यूएससी से उत्पन्न हो सकता है, जिसकी जांच अलग-अलग मायोजेनिक आबादी जैसे स्वयं-नवीनीकरण, प्रसार और आगे विभेदित एमयूएससी8,19,20, 21के प्रतिशत के लिए की जा सकती है। एमयूएससी की विभेदन स्थिति पैक्स7, मायोड और मायोजिन की अभिव्यक्ति/सह-अभिव्यक्ति की जांच से निर्धारित की जा सकती है । संस्कृति के ७२ घंटे के बाद एक क्लस्टर में कोशिकाओं को निम्नलिखित मापदंडों द्वारा भेदभाव किया जा सकता है: पैक्स7 केवल कोशिकाओं को स्वयं MuSCs नवीनीकरण कर रहे हैं, जबकि Pax7/MyoD डबल सकारात्मक कोशिकाओं का प्रसार कर रहे है/सक्रिय MuSCs और आगे विभेदित मायोजेनिक कोशिकाओं Myogenin सकारात्मक22हैं । इसके अलावा, एमयूएससी संख्या या कोशिका चक्र/सक्रियण में पुनः प्रवेश की जांच मायोजेनिक प्रगति के अलावा की जा सकती है, उदाहरण के लिए, ऊपर वर्णित मापदंडों के आधार पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित विश्लेषणों के माध्यम से ।

यहां, मायोफिबर अलगाव और संस्कृति प्रोटोकॉल की अनूठी विशेषताएं, उदाहरण के लिए, अपने आला के साथ MuSC की बातचीत के संरक्षण का वर्णन किया गया है। माउस पूरे ईडीएल(एक्सटेंसर डिजोरम लांगस)मांसपेशियों को ध्यान से विच्छेदित किया जाता है, कोलेजनेस द्वारा पचाया जाता है, और आगे की संस्कृति के लिए अपने जुड़े म्यूएससी के साथ एकल माइफबरर्स प्राप्त करने के लिए शारीरिक रूप से त्रिसंरित होता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक जानवरों की आवश्यकता के बिना उम्मीदवार जीन और लगातार इम्यूनोफ्लोरेसेंस आधारित विश्लेषणों के कार्यात्मक विश्लेषणों के लिए सिरना के साथ MuSCs को ट्रांसफेक्ट करने के कदमों को चित्रित करता है ।

Protocol

पशुओं का त्याग पशु प्रयोग के लिए राष्ट्रीय विनियमों के अनुसार किया जाना चाहिए । यहां वर्णित प्रोटोकॉल उम्र बढ़ने पर Leibniz संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था-फ्रिट्ज Lipmann संस्थान और यूरोपीय संघ (ईयू) निर्देश 2010/63/EU (अंग संचयन के लिए लाइसेंस संख्या: O_JvM_18-20) । प्रोटोकॉल के आवश्यक चरणों को चित्र 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है ।

1. संस्कृति प्लेटों, मीडिया, और पाश्चर पिपेट की तैयारी

नोट: सभी सामग्री और उपकरणों को अलग करने और संस्कृति के लिए आवश्यक एकल myofibers के रूप में संभव के रूप में बाँझ होने की जरूरत है । इसलिए, अर्ध-बाँझ विच्छेदन हुड के तहत एकल माइफइबररों को अलग करने की सिफारिश की जाती है।

  1. ऊतक संस्कृति प्लेटों कोट करने के लिए बाँझ एचएस (घोड़ा सीरम) का उपयोग करें। कोटिंग प्लास्टिक की सतह के लिए एकल myofibers के लगाव को रोकता है। प्रत्येक माउस के लिए, अलगाव के लिए एक 12 अच्छी तरह से थाली के 4 कुओं और खेती के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं की एक समर्पित संख्या की आवश्यकता है । 1 मिलील के साथ 12-अच्छी प्लेट के कुओं को इनक्यूबेट करें और 24-अच्छी प्लेट के कुओं को आर टी (कमरे के तापमान) पर 5 मिनट के लिए एचएस के ०.५ एमएल के साथ, फिर एचएस को हटा दें और प्लेटों को एक और 5 मिनट के लिए सूखने दें ।
    नोट: एचएस एकत्र किया जा सकता है और फिर से कोटिंग प्रयोजनों के लिए कई बार इस्तेमाल किया, अगर बाँझ रखा ।
  2. डीएमईएम (दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम 4.5 ग्राम/एल ग्लूकोज और सोडियम पायरुवेट) के साथ 20% एफबीएस (भ्रूण गोजातीय सीरम), 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर के साथ पूरक द्वारा myofiber आइसोलेशन माध्यम तैयार करें। पूर्व-लेपित आइसोलेशन प्लेटों (12-वेल प्लेट, 2-4 एमएल आइसोलेशन माध्यम प्रति अच्छी तरह) में मध्यम जोड़ें, अलगाव से लगभग 30 मिनट पहले और 5% सीओ2के साथ एक आर्द्रीकृत 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संतुलन।
  3. डीएमईएम (दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम 4.5 ग्राम/एल ग्लूकोज और सोडियम पायरुवेट) के साथ 20% एफबीएस (भ्रूण सीरम) और 1% चिकन भ्रूण निकालने, 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर के साथ पूरक द्वारा myofiber संस्कृति माध्यम तैयार करें। पूर्व-लेपित संस्कृति प्लेटों (24-अच्छी प्लेट) के प्रत्येक कुएं में 0.5 एमएल माध्यम जोड़ें अलगाव से लगभग 30 मिनट पहले और 5% सीओ2के साथ एक आर्द्रीकृत 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संतुलन।
  4. डीएमईएम (दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम 4.5 ग्राम/एल ग्लूकोज और सोडियम पाइरुवेट के साथ) में 0.2% (w/v) कोलेजनेस टाइप 1 (क्लोस्ट्रीडियम हिस्टोलिटिकमसे) को भंग करके कोलेजनेस पाचन समाधान तैयार करें, 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। दो ईडीएल(एक्सटेंसर डिजोरम लॉन्गस)मांसपेशियों के लिए बाँझ 15 एमएल रिएक्शन ट्यूब में 2.5 एमएल कोलेजनेस समाधान का उपयोग करें। इसके अतिरिक्त, अलगाव शुरू करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर एक परिसंचारी पानी स्नान में समाधान ~ 10 मिनट को प्री-हीट करें।
  5. कोलेजन-पचाने वाली मांसपेशियों के ट्रिट्यूशन के लिए बाँझ पाश्चर पिपेट तैयार करें। पाश्चुर पिपेट को काटने के लिए डायमंड पेन का इस्तेमाल करें।
    1. प्रत्येक माउस के लिए, लगभग 0.3 सेमी के उद्घाटन और लगभग 10-12 सेमी की लंबाई और लगभग 0.1 सेमी के छोटे उद्घाटन और लगभग 22 सेमी(चित्रा 2F)की लंबाई के साथ एक बड़े बोर पिपेट का उपयोग करें।
    2. एक बुनसेन बर्नर की लौ के साथ गर्मी चमकाने द्वारा दोनों पिपेट के किनारों को चिकना करें। तेज कांच के किनारों को चिकना होने तक समान गर्मी वितरण की अनुमति देने के लिए कोमल आंदोलन के साथ लौ में 5-10 एस के लिए पिपेट टिप पकड़ो।
    3. उपयोग से तुरंत पहले, बाँझ एचएस के साथ दोनों प्रकार के ग्लास पिपेट को 5 मिनट के लिए एचएस के ~ 2 एमएल के साथ भरकर कोट करें, इसके बाद, एचएस को बाहर निकालें और पिपेट को आरटी में 5 मिनट के लिए सूखने दें।

2. ईडीएल मांसपेशियों में अलगाव और कोलेजनेस पाचन

  1. संदूषण से बचने के लिए 70% इथेनॉल के साथ सभी उपकरणों का छिड़काव करें।
  2. पशु प्रयोग के लिए राष्ट्रीय नियमों के अनुसार माउस का बलिदान।
  3. माउस के हिंडलिंब्स को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। त्वचा को हटाने और अंतर्निहित मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए कठोर ठीक घुमावदार कैंची (24 मिमी अत्याधुनिक) और ठीक संदंश (ड्यूमोंट 7, घुमावदार या सीधे) का उपयोग करें। फर के साथ अंतर्निहित मांसपेशियों के किसी भी संपर्क से बचें (संदूषण का खतरा बढ़ जाता है)।
  4. अंतर्निहित मांसपेशियों(चित्रा 2A)को नुकसान पहुंचाए बिना ठीक घुमावदार संदंश के साथ आसपास के प्रावरणी को हटा दें। झुकने से बचने के लिए संदंश बंद करें।
  5. टीए(टिबिलिस पूर्ववर्ती)और ईडीएल मांसपेशी के डिस्टल टेंडन को बेनकाब करने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें। टीए को हटाने के लिए, डिस्टल टीए टेंडन को संदंश के साथ पकड़ें और ठीक वेनस स्प्रिंग कैंची (5 मिमी अत्याधुनिक, 0.35 मिमी टिप व्यास) के साथ काट लें। टेंडन पर टीए को पकड़ते समय, इसे घुटने की ओर खींचें और मांसपेशियों को घुटने(चित्रा 2B)के करीब काट दें, ईडीएल मांसपेशी अब उजागर हो गई है।
    नोट: सुनिश्चित करें कि इस चरण में केवल टीए टेंडन को पकड़ा गया है, अन्यथा अंतर्निहित ईडीएल क्षतिग्रस्त हो सकता है। टीए मांसपेशी को काटते समय सुनिश्चित करें कि घुटने पर टेंडन को बाद में आसानी से देखा जा सकता है।
  6. ठीक घुमावदार संदंश के साथ डिस्टल ईडीएल टेंडन उठाएं और ठीक वेनस स्प्रिंग कैंची(चित्रा 2C) केसाथ काट लें। ईडीएल को ध्यान से घुटने की ओर खींचकर समीपस्थ ईडीएल टेंडन का पर्दाफाश करें। बारीक वन्नास स्प्रिंग कैंची के साथ समीपस्थ कण्डरा काटें। ईडीएल मांसपेशी को 15 एमएल रिएक्शन ट्यूब में कोलेजनेस पाचन समाधान के 37 डिग्री सेल्सियस पूर्व गरम 2.5 एमएल में स्थानांतरित करें। (चित्रा 2D)।
    नोट: बाहरी घुटने संयोजी ऊतक पर एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए पूरी तरह से समीपस्थ EDL कण्डरा का पर्दाफाश । केवल टेंडन को पकड़ना सुनिश्चित करें और ईडीएल को बहुत अधिक फैलाना न दें।
  7. चरण 2.3 दोहराएं। 2.6 करने के लिए। दूसरे ईडीएल के साथ। 2.5 एमएल कोलेजनस पाचन समाधान से भरे एक ही 15 एमएल रिएक्शन ट्यूब में दोनों ईडीएल मांसपेशियों को जोड़ें।
  8. एक परिसंचारी पानी स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया ट्यूब में ईडीएल मांसपेशियों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: इनक्यूबेशन समय कई कारकों पर निर्भर करता है, जैसे कोलेजनेस गतिविधि, माउस की उम्र और फाइब्रोटिक ऊतक की मात्रा। वयस्क चूहों (2-6 महीने की उम्र) की ईडीएल मांसपेशियों के लिए विशिष्ट इनक्यूबेशन समय 1-1.5 घंटे और वृद्ध चूहों (18 महीने की उम्र) 1.5-2 घंटे के लिए है।
  9. मांसपेशियों के अत्यधिक पाचन से बचने के लिए, पाचन समय के दौरान मांसपेशियों की जांच करें। जब मांसपेशियां ढीली हो जाती हैं और सिंगल माइफइबर दिखाई देते हैं तो पाचन बंद करदें (चित्रा 2E)। मांसपेशियों को बड़े बोर पिपेट के साथ ध्यान से स्थानांतरित करें प्रीवार्मेड 12-वेल प्लेट के पहले कुएं में माइओफाइबर आइसोलेशन मीडियम(चित्रा 2G)युक्त।

3. Myofiber वियोजन और संस्कृति

  1. निम्नलिखित चरणों के लिए स्टीरियो दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, अधिमानतः एक हीटिंग प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस) से लैस है। एक myofibers जारी कर रहे हैं जब तक गर्म अलगाव माध्यम के साथ मांसपेशियों फ्लश करने के लिए बड़े बोर पिपेट का प्रयोग करें। बड़े बोर पिपेट के साथ मांसपेशियों को अलग करें जब तक कि माइफबर की वांछित संख्या समाधान में स्वतंत्र रूप से तैर न जाए।
    नोट: क्षतिग्रस्त मायोफाइबर के जोखिम को कम करने के लिए अत्यधिक त्रयोदश से बचें। मायोफिबर वियोजन के लिए एक हीटिंग प्लेट का उपयोग दृढ़ता से सलाह दी जाती है क्योंकि अलगाव प्रक्रिया के दौरान तापमान गिरता है, जिसके परिणामस्वरूप मायोफिबर की मौत होगी।
  2. एचएस लेपित छोटे बोर ग्लास पिपेट के साथ गैर-अनुबंधित मायोफिबरर्स(चित्रा 2H)को स्थानांतरित करने के लिए दूसरे कुएं में मलबे को धोने के लिए और अनुबंधित (क्षतिग्रस्त) myofibers(चित्रा 2I)।
    नोट: अलग myofibers के अत्यधिक आंदोलन से बचने के लिए, वे दूसरे कुएं में स्थानांतरित किया जा सकता है और फिर त्रयोत प्रक्रिया जारी रखा जा सकता है ।
  3. गैर अनुबंधित myofibers अगले(3)अच्छी तरह से अलगाव माध्यम से भरा करने के लिए फिर से धोने के लिए स्थानांतरण ।
  4. छोटे बोर ग्लास पिपेट का उपयोग करें, एचएस के साथ लेपित, लगभग 50-100 गैर अनुबंधित myofibers को 24-अच्छी तरह से माईोफिबर संस्कृति माध्यम युक्त प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर myofibers इनक्यूबेट, समर्पित समय के लिए 5% सीओ2 (96 घंटे अधिकतम सिफारिश कर रहे हैं) ।
    नोट: MuSCs संस्कृति के ४२ घंटे के बाद या तो प्लैनर या apical-बेसल विभाजित । इसके अतिरिक्त, 72 घंटे की संस्कृति के बाद एमयूएससी बहुकोशिकीय समूह बनाते हैं जिसमें स्व-नवीनीकरण, प्रसार या प्रतिबद्ध (विभेदित) एमयूसी शामिल होते हैं।

4. सिरना ट्रांसफैक्शन

  1. 4 घंटे myofiber अलगाव के बाद, 50-100 गैर-अनुबंधित myofibers 24-अच्छी तरह से 500 μL संस्कृति माध्यम से भरा थाली के एक कुएं में myofibers) लिपिड आधारित ट्रांसेक्शन रिएजेंट के साथ, जैसे RNAiMAX निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 5 pmol siRNA की अंतिम एकाग्रता के साथ। इसलिए, सिरना के संबंधित वॉल्यूम के साथ ऑप्टी-एमईएम के 25 माइक्रोन जोड़ें, जिसमें ट्रांसफैक्शन रिएजेंट का 1.5 माइक्रोन होता है। 5 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें और इसे संस्कृति माध्यम के 500 माइक्रोन में जोड़ें।
    नोट: 24 घंटे या 48 घंटे के बाद एक दूसरे ट्रांसफैक्शन की सिफारिश लंबी संस्कृति अवधि के लिए की जाती है, उदाहरण के लिए, 48 घंटे से अधिक। ट्रांसफेक्शन के बाद मीडियम का बदलाव जरूरी नहीं है।

5. फिक्सेशन और अगर धुंधला

  1. इम्यूनोस्टेटिंग के लिए स्टीरियो दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। निम्नलिखित चरणों में सभी संस्करणों को 24-अच्छी प्लेट के एक कुएं में समायोजित किया जाता है। एचएस-लेपित छोटे बोर पिपेट का उपयोग करके सभी निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें।
  2. कुएं में कुछ समाधान छोड़ते समय माइोफिबर संस्कृति माध्यम को सावधानीपूर्वक त्याग दें (लगभग 100 माइक्रोन प्रति 24-वेल)। ऐसा सभी आगे के चरणों के लिए करें जब तक कि अन्यथा कहा न जाए कि मायोफिबरर्स के फ्लोटिंग की अनुमति दी जाए। अपने आसन्न MuSCs के साथ myofibers को ठीक करने के लिए 2% पीएफए के 500 μL जोड़ें, कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  3. सुपरनेटेंट को ध्यान से निकालें और पीबीएस (पीएच 7.4, 500 माइक्रोल के साथ प्रत्येक आरटी में 5 मिनट के लिए myofibers को तीन बार धोएं)।
  4. 500 माइक्रोन परमील का समाधान (0.1% ट्राइटन एक्स-100, पीबीएस में 0.1 एम ग्लाइसिन, पीएच 7.4), आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट जोड़ें।
  5. परमीलाइजेशन समाधान निकालें और आरटी में 1 एच के लिए 500 माइक्रोन ब्लॉकिंग समाधान (पीबीएस में 5% एचएस, पीएच 7.4) जोड़ें।
    नोट: अविशिष्ट बाध्यकारी से बचने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए अनुशंसित अवरुद्ध समाधान की जांच करें।
  6. अवरुद्ध समाधान निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 300 माइक्रोन जोड़ें (उदाहरण के लिए, एंटी-पैक्स 7 (पैक्स 7, डीएसबी, अन पतला), एंटी-मायोड (क्लोन जी-1, सांता क्रूज़, 1:200)) प्रति अच्छी तरह से। रात 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  7. पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ तीन बार धोएं (आरटी में 5 मिनट)।
  8. पीबीएस निकालें और माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 300 माइक्रोन जोड़ें (उदाहरण के लिए, विरोधी माउस-IgG1-546 और विरोधी माउस-IgG2b-488 1:1000) प्रति अच्छी तरह से। प्रकाश से संरक्षित आरटी में 1 घंटे इनक्यूबेट। निम्नलिखित चरणों के लिए, प्रकाश कम स्थितियों की सिफारिश की जाती है।
  9. पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं (आरटी में 5 मिनट)।
  10. आरटी में 5 मिनट के लिए समाधान के 500 माइक्रोन (अंतिम डीएपीआई एकाग्रता 10 माइक्रोग्राम/एमएल) का उपयोग करके डीएपीआई धुंधला करें।
  11. पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं (आरटी में 5 मिनट)।
  12. एक हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग एक सूक्ष्म ग्लास स्लाइड पर एक सर्कल आकर्षित करने के लिए एक पानी से बचाने वाली बाधा है कि myofibers युक्त तरल के रिसाव को रोकने जाएगा बनाने के लिए । सूक्ष्म ग्लास स्लाइड के लिए संभव सबसे छोटी मात्रा में myofibers हस्तांतरण और उन्हें ग्लास स्लाइड पर तितर-बितर।
    नोट: सूक्ष्म ग्लास स्लाइड पर मायोफीबर के भौतिक पुलिंग से बचें क्योंकि इससे घर्षण हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप मायोफिबर से समूहों की टुकड़ी हो सकती है।
  13. छोटे बोर पाश्चर पिपेट या 200 माइक्रोल पिपेट के साथ अवशिष्ट तरल निकालें।
  14. जलीय बढ़ते माध्यम की दो बूंदों का उपयोग करें और एक कवरस्लिप के साथ myofibers को कवर। स्लाइड निर्माता द्वारा अनुशंसित समय के लिए सूखी चलो। स्लाइड्स को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल मुरीन ईडीएल मांसपेशियों से जुड़े म्यूएससी के साथ एकल माइफिबर्स के सफल व्युत्पन्न और संस्कृति के लिए निर्देश प्रदान करता है। प्रोटोकॉल के आवश्यक चरणों को चित्र 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है । ईडीएल मांसपेशियों का सावधानीपूर्वक टेंडन-टू-टेंडन विच्छेदन(चित्रा 2ए-सी)व्यवहार्य मायोफिबर की उच्च उपज के लिए महत्वपूर्ण है। मांसपेशियों का वियोजन पहले कोलेजन पाचन(चित्रा 2D)द्वारा प्राप्त किया जाता है और उसके बाद शारीरिक त्रयोदश(चित्रा 2G)होता है। अक्षुण्ण myofibers(चित्रा 2H)सुसंस्कृत हैं, जबकि हाइपरअनुबंधित और मृत myofibers(चित्रा 2I)संस्कृति और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए ।

MuSCs अलगाव की प्रक्रिया के दौरान myofiber-जुड़े रहते हैं । ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर पैक्स 7 के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला पहचानता है और अलगाव प्रक्रिया (चित्रा 3 ए) के पूरा होने के बाद सीधे तय होने पर मायोन्यूक्लियी प्रति मायोफाइबर की अधिकता से7-9 एमयूएससीनाभिक को अलग करता है। चित्रा 3B अतिरिक्त ब्राइटफील्ड चैनल के साथ चित्रा 3 ए से एक बढ़ाया क्षेत्र दिखाता है, जो मायोट्यूब की उपकोशिकीय मायोफिब्रिलरी संरचना को उजागर करता है और एक MuSC के नाभिक में पैक्स7 इम्यूनोफ्लोरेसेंस सिग्नल को दर्शाता है।

मायोजेनिक मार्कर अभिव्यक्ति द्वारा मायोफ़िबर संबद्ध म्यूएससी की सक्रियण और मायोजेनिक प्रगति का विश्लेषण किया जा सकता है। हौसले से अलग myofibers (0 एच) के साथ जुड़े, ज्यादातर शांत MuSCs पाया जा सकता है, जो Pax7 अभिव्यक्ति और MyoD अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति की विशेषता है, जिससे वीवो होमोस्टैटिक स्थिति(चित्रा 4, 0एच) में एक जैसी । विच्छेदन/वियोजन प्रक्रिया और माइफइबर कल्चर मीडिया कंपोजीशन के कारण, एमयूएससी तेजी से सक्रिय होता है और प्रसार को सुगम बनाने के लिए ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर मायोडी को बढ़ाता है, जैसा कि ४२ घंटे में देखा जा सकता है, जब एमयूएससी अपने पहले डिवीजन(चित्रा 4, ४२एच) से गुजरा है । संस्कृति के 72 घंटों के बाद, एमयूएससी विभिन्न मायोजेनिक फैट्स के साथ संततिओं के समूह बनाते हैं जो विभिन्न मायोजेनिक मार्कर(चित्रा 4, 72एच) के अभिव्यक्ति पैटर्न द्वारा समानांतर होते हैं। Pax7 + केवल कोशिकाओं भेदभाव का विरोध और आत्म नवीनीकरण स्टेम सेल बन जाते हैं । पैक्स7 + और मायोड + डबल पॉजिटिव कोशिकाएं प्रसारित होती हैं, जबकि मायोड + केवल कोशिकाओं ने मायोजेनिक वंश के साथ आगे प्रगति की है और अंतर करेंगे।

मायोफिबर संस्कृति प्रणाली विभिन्न हस्तक्षेपों द्वारा म्यूएससी गतिविधि के कुशल हस्तक्षेप की अनुमति देती है, जिनमें से एक सिरर्ना ट्रांसफैक्शन है जैसा कि इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित है। मायोफिबर से जुड़े MuSCs की ट्रांसफेक्शन दक्षता की निगरानी करने के लिए एक फ्लोरोसेंटी लेबल गैर-लक्षित सिरना संक्रमित था। पैक्स7 सकारात्मक MuSCs एक कणिका की तरह फैशन में साइटोप्लाज्मिक सिरना संचित, कुशल तेज(चित्रा 5A) कासंकेत है । आइसोलेशन के बाद 4 घंटे में मायोफिबर्स में प्राकृतिक तेज बाधा का सुझाव देने वाले मायोफिबर के साइटोप्लाज्म में फ्लोरोसेंट कणिकाएं नहीं देखी गईं और सिरना ट्रांसफैक्शन विशेष रूप से MuSCs को लक्षित करता है। मायोफिबर प्रति सकारात्मक रूप से संक्रमित पैक्स7 + कोशिकाओं के परिमाणीकरण से पता चला है कि सभी MuSCs के आधे से अधिक फ्लोरोसेंटली लेबल सिरना की दृश्य मात्रा में ले लिया था बस 24 घंटे में विभाजन के पहले दौर के पूरा होने से पहले । 30 घंटे(चित्रा 5B)के बाद संक्रमित पैक्स 7 + कोशिकाओं की संख्या 74% तक बढ़ गई। इसके अलावा, दोनों टाइमपॉइंट्स पर ट्रांस संक्रमित या गैर-संक्रमित स्थितियों के मायोफाइबर के अनुसार Pax7 + कोशिकाओं की संख्या में कोई अंतर नहीं था, जो ट्रांसफेक्शन प्रक्रिया(चित्रा 5C)के कारण स्टेम सेल नंबरों पर कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं डालता था।

संक्षेप में, प्रोटोकॉल उनके आसन्न मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के साथ ईडीएल सिंगल माइफिबर्स के अलगाव और संस्कृति का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित विश्लेषणों द्वारा मायोफिबर से जुड़े मांसपेशी स्टेम सेल गतिविधि पूर्व वीवो, उदाहरण के लिए के अध्ययन को सक्षम बनाता है। सिरना ट्रांसफैक्शन द्वारा मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं में हेरफेर कुशल है और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक पद्धतिगत आधार प्रदान करता है।

Figure 1
चित्रा 1:आवश्यक चरणों का योजनाबद्ध सारांश। इस आंकड़े में अलगाव और इम्यूनोस्टेपिंग प्रक्रिया के आवश्यक कदम संक्षेप में दिए गए हैं । संक्षिप्त: DMEM, Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम; एफबीएस, भ्रूण गोजातीय सीरम; सीईई, चिकन भ्रूण निकालें; टीए, टिबिलिस पूर्वकाल; ईडीएल, ईएक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:माउस ईडीएल विच्छेदन और एकल माइफइबर अलगाव। (ए)माउस हिंडलिम्ब की त्वचा को हटा दिया जाता है और प्रावरणी के आसपास की मांसपेशी को टीए(टिबिलियाज पूर्ववर्ती)मांसपेशी का पर्दाफाश करने के लिए खींच लिया जाता है। (ख)टीए मांसपेशी को सफेद तीर द्वारा चिह्नित ईडीएल(एक्सटेंसर डिजोरम लांगस)मांसपेशी को बेनकाब करने के लिए हटा दिया जाता है। (ग)ईडीएल की मांसपेशी को उसके टेंडन काटकर विच्छेदन किया जाता है। (घ)दो ईडीएल मांसपेशियां कोलेजनेस पचा रही हैं। (ई)कोलेजनेज़ पचाने वाली मांसपेशियों की उपस्थिति ऊतक कोर से ढीला होने वाले दृश्यमान एकल माइफइबरर के साथ। (एफ)बड़े और छोटे बोर पाश्चुर पिपेट स्केल के साथ । (जी)ईडीएल की मांसपेशियों (काले तीरों द्वारा चिह्नित) को एक बड़े बोर पाश्चर पिपेट का उपयोग करके शारीरिक रूप से त्रिसंतेट किया जाता है। (ज)एकल अक्षुण्ण माइफबर पतले और चमकदार होते हैं और संस्कृति और विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत रूप से एकत्र किए जा सकते हैं। (I)हाइपरअनुबंधित और मृत माइफबर संस्कृति और विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त हैं । 2H और 2I की सूक्ष्म छवियों को एन-एक्रोप्लान 5x उद्देश्य का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के साथ कैप्चर किया गया था। स्केल बार 200 माइक्रोन हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3:अपने संबद्ध MuSCs के साथ एक पूरे एकल myofiber की सूक्ष्म छवि। युवा C57BL/6 चूहों के EDL से एकल myofibers तैयार किया गया और पीएफए-अलगाव (0 एच) के बाद तय किया गया । (A)पैक्स7 और डीएपीआई इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग मायोफिबर से जुड़ी मांसपेशी स्टेम सेल (म्यूएससी, तीर द्वारा चिह्नित) की पहचान करता है। माइक्रोस्कोपिक छवि को प्लान-एपोक्रोमैट 40x तेल उद्देश्य से लैस माइक्रोस्कोप के टाइल्स और जेड-स्टैक फ़ंक्शन का उपयोग करके कैप्चर किया गया था। स्केल बार 200 माइक्रोन है।(B)से आवर्धन(ए)मायोन्यूक्लियी, एक पैक्स7 सकारात्मक नाभिक और ब्राइटफील्ड में मायोफिब्रिलरी संरचनाओं से उज्ज्वल-अंधेरे पैटर्न को दिखाता है। स्केल बार 10 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:सिंगल माइफइबर संस्कृति के दौरान म्यूएससी सक्रियण और मायोजेनिक प्रगति की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। मांसपेशियों स्टेम सेल (MuSCs) हौसले से अलग myofibers (0 एच) के एक होमोस्टिटिक राज्य का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो पैक्स 7 की अभिव्यक्ति और मायोड अभिव्यक्ति की कमी के करीब है। एकल myofiber संस्कृति के दौरान सबसे MuSCs MyoD अपरिनियमित और फिर से सेल चक्र में प्रवेश करने के लिए विभाजित और पैदा (४२ एच) । संस्कृति के 72 घंटे के बाद MuSC भाग्य मायोजेनिक मार्कर अभिव्यक्ति के आधार पर भेदभाव किया जा सकता है। Pax7 केवल अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं को आत्म नवीनीकृत (लाल तीर) जबकि Pax7 और MyoD डबल सकारात्मक कोशिकाओं (लाल/हरे तीर) के लिए पैदा करना जारी रहेगा । मायोड केवल सकारात्मक कोशिकाओं (हरे तीर) ने मायोजेनिक भेदभाव के लिए प्रतिबद्धता की है। एक योजना-अपोक्रोमेट 20x उद्देश्य (0 घंटे, 42 एच) या एलडी प्लान-नेफलुर 40x उद्देश्य (72 एच) के साथ माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सूक्ष्म छवियों को कैप्चर किया गया था। स्केल बार 20 माइक्रोन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:MuSCs के फ्लोरोसेंट सिरना ट्रांसफेक्शन और तेज विश्लेषण। ईडीएल सिंगल माइफइबरर्स को इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रदान किए गए कदमों के बाद फ्लोरोसेंटी लेबल वाले सिरना (एसआईजीएलओ) से तैयार और संक्रमित किया गया था। (क)सीग्लो कणिकाओं का साइटोप्लाजेटिक संचय विशेष रूप से एक पैक्स7 पॉजिटिव मांसपेशी स्टेम सेल (MuSC) में संस्कृति के 30 घंटे में एक ही मायोफाइबर पर । माइक्रोस्कोपिक छवि को प्लान-एपोक्रोमैट 100x तेल उद्देश्य के साथ माइक्रोस्कोप के जेड-स्टैक और एपोटोम फ़ंक्शन का उपयोग करके कैप्चर किया गया था। स्केल बार 5 माइक्रोन हैं।(बी)संस्कृति के 24 या 30 घंटे में पैक्स7 सकारात्मक मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं द्वारा सिरना तेज का मात्राकरण । (ग)संस्कृति के 24 या 30 घंटे में गैर-संक्रमित और संक्रमित स्थितियों की तुलना करते हुए प्रति एकल मायोफिबर के लिए पैक्स7 सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या । डेटा एन = 4 चूहों के मानक विचलन के साथ मतलब के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां, इन विट्रो दृष्टिकोण का उपयोग करके एमयूएससी में एक विशिष्ट जीन की भूमिका की कार्यात्मक रूप से जांच करने की एक विधि प्रस्तुत की गई है। महत्वपूर्ण बात, यहां वर्णित प्रणाली में MuSCs स्थितियों में सुसंस्कृत हैं, जो वीवो स्थिति में जितना संभव हो उतना समान है जो अपने आला के साथ MuSCs की अधिकांश बातचीत को संरक्षित करता है। यह अस्थायी परिस्थितियों और लगातार सिराना ट्रांसफैक्शन के तहत अपने आसन्न MuSCs के साथ अलग myofibers खेती द्वारा पूरा किया जाता है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के माध्यम से संस्कृति के ७२ घंटे के दौरान मायोफाइबर अलगाव, सिरर्ना ट्रांसफैक्शन और म्यूएससी आबादी की जांच की प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है । इसके अलावा, यह प्रदर्शित किया गया था कि सभी MuSCs के लगभग ७४% संस्कृति के 30 घंटे के बाद एक फ्लोरोसेंटी लेबल नियंत्रण सिरना से संक्रमित थे ।

ईडीएल मांसपेशियों के सावधानीपूर्वक विच्छेदन पर विशेष ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए क्योंकि व्यापक खींचना, चुटकी लेना या फैलाएंगे जिससे मिओफिबर की संकुचन और लगातार मृत्यु हो जाएगी। इसके अलावा, प्रति शर्त प्रति दोहराने के लिए कम से कम 20 विभिन्न मायोफिबर से MuSCs के समूहों की जांच करना महत्वपूर्ण है। यह आवश्यक है क्योंकि म्यूएससी की संख्या और गुण म्यूएससी उपआबादी के अस्तित्व के कारण भिन्न होते हैं। फ्लोटिंग माइफइबर कल्चर विधि का उपयोग करके म्यूएससी पर एक विशिष्ट सिरना के प्रभाव की जांच करते समय गैर-लक्षित नियंत्रण के लिए लक्षित सिरना के साथ स्थिति की तुलना एक ही माउस और मांसपेशियों के भीतर की जानी चाहिए। यह माउस-विशिष्ट मतभेदों से बचने के लिए अनुशंसित है जो सिरएनए के प्रभावों को कवर या बढ़ा सकता है। नॉकडाउन दक्षता को उनके आसन्न MuSCs के साथ एकल myofibers का उपयोग कर लक्ष्य जीन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। यदि यह एक विकल्प नहीं है, तो कोई भी प्राथमिक मायोब्लास्ट में सिरना नॉकडाउन दक्षता का परीक्षण कर सकता है जिसके बाद मात्रात्मक आरटी-पीसीआर या इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण होते हैं। सिंगल माइफबर्स पर म्यूएससी पर सिरना के प्रभाव का विश्लेषण करने से पहले सिरना की दक्षता निर्धारित की जानी चाहिए। एक स्मार्ट पूल का उपयोग जिसमें 4 अलग-अलग सीआरएएनए बनाम एक एकल शामिल है, नॉकडाउन दक्षता को बढ़ाता है लेकिन अविशिष्ट लक्ष्यीकरण का खतरा भी बढ़ाता है। एक गैर-लक्षित सिराना को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। ट्रांसफेक्शन दक्षता की सीधे निगरानी करने के लिए, कोई भी फ्लोरोसेंटी लेबल वाले गैर-लक्षित सिरना का उपयोग कर सकता है जैसा कि यहां किया जाता है। सिरना के साथ ट्रांसफैक्शन के लिए समय बिंदु अलगाव के बाद लगभग 4 घंटे है, एक समय बिंदु जब MuSCs के आसपास बेसल लैमिना पहले से ही सिरना के लिए पारगम्य है । यदि 72 या 96 घंटे के बाद एमयूएससी पर एक विशिष्ट सिराना के प्रभाव की जांच की जानी चाहिए, तो उच्च नॉकडाउन दक्षता बनाए रखने के लिए 24 एच या 48 एच के बाद दूसरा सिरना ट्रांसफैक्शन करने की सिफारिश की जाती है।

myofiber संस्कृति परख पारंपरिक सेल संस्कृति तरीकों के साथ MuSCs की जांच की तुलना में विविध लाभ प्रदर्शित करता है । MuSCs पूरी अलगाव प्रक्रिया के दौरान myofibers से जुड़ा रहता है, जिससे अपने आला19,23, 24,25के साथ MuSC की महत्वपूर्ण बातचीत को संरक्षित करता है। मायोफिबर के साथ MuSCs की संरक्षित बातचीत MuSC कार्यक्षमता पर आला निर्भर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक शर्त है, जिसे पारंपरिक 2डी मायोब्लास्ट संस्कृतियों में पुन: स्थापित नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, उम्र बढ़ने के दौरान एमयूएससी प्रदर्शित करने से मायोजेनिक क्षमता बिगड़ी जिसके परिणामस्वरूप20,26को नुकसान पहुंचाने के बाद मांसपेशियों के ऊतकों को पुनर्जीवित करने की दक्षता कम हो जाती है । यह हानि कम से कम आंशिक रूप से एमयूएससी आला में परिवर्तन के कारण होती है, ईसीएम संरचना27,28में विशेष परिवर्तन। माइोफिबर संस्कृति प्रोटोकॉल इन गुमराह आला परिवर्तनों के साथ अध्ययन और हस्तक्षेप की अनुमति देता है।

यहां वर्णित विधि के विपरीत, इम्यूनोलेबेलिंग द्वारा एमयूएससी की शुद्धि और FACS (फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई) या एमएसीएस (चुंबकीय सेल छंटाई) जैसी तकनीकों को छांटने में एमयूएससी को उनके आला से हटाना शामिल है। दिलचस्प बात यह है कि वृद्ध मांसपेशियों से अलग-थलग पड़े म्यूएससी की 2डी संस्कृतियां अपने बाह्य संकेतों को ढीला कर देती हैं और युवा मांसपेशियों से अलग किए गए MuSCs के समान व्यवहार करती हैं जिससे वीवो स्थिति में उचित रूप से29का पुनर्मूल्यांकन नहीं होता है। इसके अलावा , मांसपेशियों के ऊतकों का पूर्ण विघटन और सतह के मार्कर के साथ म्यूएससी की लेबलिंग के परिणामस्वरूप 30 ,31,32कोशिकाओं में प्रतिलिपि परिवर्तन और सक्रियता होती है। माइफइबर संस्कृति प्रणाली का एक और लाभ विभिन्न स्तरों पर MuSC कार्यक्षमता के साथ हस्तक्षेप करने की संभावना है। सुसंस्कृत myofibers पर MuSCs के हेरफेर प्रभावी ढंग से सिरना मध्यस्थता जीन नॉकडाउन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है के रूप में यहां विस्तार से वर्णित है । इसी तरह, रासायनिक यौगिकों का उपयोग या पुनः संयोजन प्रोटीन की डिलीवरी स्टेम सेलपाथवे 20,28के साथ हस्तक्षेप करने के लिए बहुत प्रभावी है। इसके अलावा, रेट्रो या लेंटिवल अभिव्यक्ति वैक्टर एक्सोजेनस जीन, यानी संविलियन सक्रिय म्यूटेंट33की शुरूआत की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित प्रणाली में म्यूएससी कार्यक्षमता पर बाह्य कारकों के प्रभाव का पता लगाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, संस्कृति की स्थिति को विभिन्न शारीरिक या रोग स्रोतों से कैंसर कैशेक्सिया34, 35जैसे मॉडल विभिन्न राज्यों में सुपरनेट के साथ पूरक किया जा सकता है।

यहां वर्णित विधि की एक सीमा तथ्य यह है कि एकल माइोफिबर संस्कृति प्रणाली सभी प्रणालीगत कारकों या म्यूएससी पर अन्य सेल प्रकारों के प्रभाव के प्रभाव को पूरी तरह से पुन: कृत नहीं कर सकती है। इसके अलावा, जिस समय में मायोफिबरर्स को संस्कृति में व्यवहार्य रखा जा सकता है, वह सीमित है और इसलिए म्यूएससी से संबंधित प्रक्रियाओं का अध्ययन सक्रियण और मायोजेनिक प्रतिबद्धता जैसी शुरुआती घटनाओं पर केंद्रित है । इसके अलावा, प्रतिरक्षा कोशिकाओं या फाइब्रो-एडिपोजेनिक प्रोजेनिटर कोशिकाओं जैसी अन्य आला कोशिकाओं के साथ म्यूएससी इंटरैक्शन की जांच संभव नहीं है। एमयूएससी कार्यक्षमता पर प्रणालीगत प्रभावों की जांच करने के लिए कोई भी व्यक्ति मांसपेशियों की चोट के प्रयोगों को अंजाम दे सकता है जिसके बाद वीवो में मांसपेशियों के उत्थान का विश्लेषण किया जा सकता है या प्रत्यारोपण प्रयोग36,37कर सकते हैं ।

एक साथ लिया, myofiber अलगाव और संस्कृति प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की आवश्यकता के बिना वयस्क MuSCs पर आनुवंशिक या मशीनी अध्ययन के लिए महान अवसर प्रदान करता है और संभवतः पशु प्रयोग को कम कर सकते हैं ।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए क्रिस्टीन Poser और क्रिस्टीना बीनने का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को ड्यूश फोर्चुंग्स्जेमीस्चफ्ट से जेवीएम (एमए-3975/2-1), कार्ल ज़ीस फाउंडेशन और ड्यूश क्रेशहिल्फे (डीकेएच-जेवीएम-861005) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b ThermoScientific A-21141 use 1:1000 for IF
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 ThermoScientific A-21123 use 1:1000 for IF
chicken embryo extract Seralab CE-650-J chicken embryo extract containing growth factors etc.
collagenase type 1 Sigma C0130
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) GibCo 41966029 cell culture medium
fetal bovine serum Gibco 10270-106 fetal bovine serum
horse serum Gibco 26050-088
Lipofectamine RNAiMax ThermoScientific 13778150 transfection reagent
MyoD antibody clone G-1 Santa Cruz sc-377460 dilute 1:200 for IF
Pax7 antibody DSHB PAX7 use undiluted
siGLO Red Transfection Indicator horizon discovery D-001630-02-05 non targeting siRNA

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References

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Hüttner, S. S., Hayn, C.,… More

Hüttner, S. S., Hayn, C., Ahrens, H. E., Schmidt, M., Henze, H., von Maltzahn, J. Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo. J. Vis. Exp. (168), e62257, doi:10.3791/62257 (2021).

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