Summary
Neste protocolo é descrito um método de cultivo in vitro e análise funcional para células-tronco musculares, que preserva a maioria de suas interações com seu nicho endógeno.
Abstract
O tecido muscular esquelético adulto abriga uma população de células-tronco indispensáveis para sua capacidade de regeneração. Após danos musculares, as células-tronco musculares deixam seu estado quiescente e ativam o programa miogênico, levando ao reparo de concomitante de tecido danificado com a reposição da piscina de células-tronco musculares. Vários fatores influenciam a atividade de células-tronco musculares, entre eles estímulos intrínsecos, mas também sinais do ambiente de células-tronco musculares diretas, o nicho de células-tronco. O isolamento e a cultura dos miofibers únicos com suas células-tronco musculares associadas preserva a maior parte da interação da célula-tronco com seu nicho e é, portanto, a possibilidade mais próxima de estudar a funcionalidade de células-tronco musculares ex vivo. Aqui, é fornecido um protocolo para o isolamento, cultura, transfecção do siRNA e imunossuagem de células-tronco musculares em seus respectivos myofibers de músculos EDL(extensor digitorum longus). As condições experimentais aqui descritas permitem o estudo e manipulação de células-tronco musculares ex vivo, incluindo a investigação da atividade miogênica sem a necessidade inerente de experimentos in vivo em animais.
Introduction
O músculo esquelético no adulto é um tecido pós-meiótico composto principalmente de miofibers multinucleados, que são as células efeitosoras para movimentos voluntários. Tem uma notável capacidade de regeneração, um processo que se assemelha à miogênese embrionária e sofre prejuízos na idade e na doença1. Esta capacidade regenerativa marcante do músculo esquelético depende de células-tronco musculares (MuSCs), que também são denominadas células satélites devido à sua localização entre o sarcolemma e a lamina basal dos miofibers2,3. Em condições de repouso, os MuSCs são quiescentes e caracterizados pela expressão do fator de transcrição Pax7 e marcadores de quiescência como Sprouty14,5,6,7,8. Após a ativação, por exemplo, após lesão, os MuSCs deixam o estado quiescente e regulam o fator regulatório miogênico MyoD9. Os MuSCs duplo positivos Pax7/MyoD proliferam e diferenciam assim as células precursoras miogênicas, que também são frequentemente referidas como myoblasts. Esses mióblaos então se diferenciam ainda mais em miócitos alongados, um processo coincidindo com alterações moleculares e morfológicas, por exemplo, perda de Pax7 e regulação da expressão miogenina10. Miócitos, então, eventualmente se fundem uns aos outros ou aos miofibers existentes, reparando assim o tecido danificado. É importante ressaltar que uma pequena fração de células-tronco musculares reverte a regulação do MyoD e é capaz de se auto-renovar11. O status da diferenciação do MuSC e da progressão miogênica pode ser facilmente observado pela investigação de marcadores miogênicos como Pax7, MyoD e Myogenin10.
A cultura de myofibers únicos com seus MuSCs adjacentes é um excelente método para investigar a funcionalidade do MuSC em um ambiente ex vivo, uma vez que os MuSCs permanecem em seu nicho endógeno12,13. O comportamento dos MuSCs é regulado por sinais intrínsecos, bem como sinais extrínsecos fornecidos pelo nicho, local anatômico especializado composto por componentes da matriz extracelular (ECM) em torno dos MuSCs e da própria miofibra. Por exemplo, um dos reguladores extrínsecos da quiescência musc é a sinalização notch. Aqui, as sinalizações são recebidas pelos MuSCs tanto da miofibra quanto do ECM14,15,16. Além disso, o nicho musc é importante para controlar o eixo de divisão dos MuSCs, regulando assim o destino celular das células filhas musc17,18. Razoavelmente, parâmetros como divisões assimétricas de MuSC, progressão miogênica e auto-renovação podem ser avaliados exclusivamente nesta configuração experimental. Por exemplo, um aglomerado multicelular pode se formar decorrente de um MuSC após um período de cultura de 72 h, que pode ser investigado para a ocorrência e percentual de populações miogênicas distintas, como muSCs autoconexantes, proliferantes e ainda mais diferenciados8,19,20,21. O estado de diferenciação dos MuSCs pode ser determinado pela investigação da expressão/co-expressão de Pax7, MyoD e Myogenin. Após 72 h de cultura, as células em um cluster podem ser discriminadas pelos seguintes parâmetros: apenas as células Pax7 são MuSCs auto-renovador, enquanto as células duplas positivas Pax7/MyoD estão proliferando/ativadas MuSCs e células miogênicas ainda mais diferenciadas são Myogenina positiva22. Além disso, os números de MuSC ou a reentrada no ciclo/ativação celular podem ser investigados, além da progressão miogênica, por exemplo, através de análises baseadas em imunofluorescência com base nos parâmetros descritos acima.
Aqui, são descritas as características únicas do protocolo de isolamento e cultura miofibra, por exemplo, a preservação da interação do MuSC com seu nicho. Os músculos EDL inteiros do rato (extensor digitorum longus) são cuidadosamente dissecados, digeridos por colagenase, e fisicamente triturados para obter miofibers únicos com seus MuSCs associados para mais cultura. Além disso, o protocolo delineia as etapas para transfetar MuSCs com siRNA para análises funcionais de genes candidatos e análises consecutivas baseadas em imunofluorescência sem a necessidade de animais transgênicos.
Protocol
O sacrifício de animais deve ser realizado de acordo com as normas nacionais para experimentação animal. O protocolo aqui descrito foi realizado de acordo com as diretrizes do Instituto Leibniz sobre Envelhecimento - Instituto Fritz Lipmann e da Diretiva da União Europeia (UE) 2010/63/UE (número de licença para colheita de órgãos: O_JvM_18-20). As etapas essenciais do protocolo são resumidas na Figura 1.
1. Preparação de placas de cultura, mídia e pipetas Pasteur
NOTA: Todos os materiais e equipamentos necessários para isolar e cultivar myofibers únicos precisam ser o mais estéreis possível. Portanto, recomenda-se isolar miofibers únicos sob uma ensecada de dissecção semi-estéril.
- Use HS estéril (soro de cavalo) para revestir placas de cultura tecidual. O revestimento impede a fixação de miofibers únicos à superfície plástica. Para cada mouse, são necessários 4 poços de uma placa de 12 poços para o isolamento e um número dedicado de poços de uma placa de 24 poços para cultivo. Incubar os poços de uma placa de 12 poços com 1 mL e os poços de uma placa de 24 poços com 0,5 mL de HS por 5 min em RT (temperatura ambiente), depois retire o HS e deixe as placas secarem por mais 5 minutos.
NOTA: O HS pode ser coletado e reutilizado para fins de revestimento várias vezes, se mantido estéril. - Prepare o meio de isolamento da miofibra suplementando o DMEM (meio modificado da Águia de Dulbecco com 4,5 g/L de glicose e piruvato de sódio) com 20% de FBS (soro bovino fetal), filtro através de filtro de 0,22 μm. Adicione meio às placas de isolamento pré-revestidas (placa de 12 poços, meio de isolamento de 2-4 mL por poço) aproximadamente 30 minutos antes do isolamento e equilibre em uma incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2.
- Prepare o meio de cultura miofibra suplementando o DMEM (meio modificado da Águia de Dulbecco com 4,5 g/L de glicose e piruvato de sódio) com 20% de FBS (soro bovino fetal) e 1% extrato de embrião de frango, filtrar através de filtro de 0,22 μm. Adicione 0,5 mL médio a cada poço das placas de cultura pré-revestidas (placa de 24 poços) aproximadamente 30 minutos antes do isolamento e equilibre em uma incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2.
- Prepare a solução de digestão de colagenase dissolvendo 0,2% (w/v) colagenase tipo 1 (de Clostridium histolyticum) em DMEM (médio modificado da Águia de Dulbecco com 4,5 g/L de glicose e piruvato de sódio), filtrar através de 0,22 μm filtro. Para dois EDL(extensor digitorum longus) os músculos usam solução de colagenase de 2,5 mL em um tubo de reação estéril de 15 mL. Além disso, pré-aqueça a solução ~10 min em um banho de água circulante a 37 °C antes de iniciar o isolamento.
- Prepare pipetas pasteur estéreis para trituração dos músculos digeridos pela colagem. Use uma caneta de diamante para cortar as pipetas pasteur.
- Para cada rato, use uma pipeta grande com abertura de cerca de 0,3 cm e um comprimento de cerca de 10-12 cm e uma segunda pipeta de vidro com uma pequena abertura de cerca de 0,1 cm e um comprimento de aproximadamente 22 cm(Figura 2F).
- Suavize as bordas de ambas as pipetas pelo polimento térmico com a chama de um queimador de Bunsen. Segure a ponta da pipeta por 5-10 s na chama com movimento suave para permitir a distribuição de calor igual até que as bordas afiadas do vidro suavizem.
- Imediatamente antes do uso, cubra ambos os tipos de pipetas de vidro com HS estéril, preenchendo toda a pipeta com ~ 2 mL de HS por 5 min, depois disso, ejete o HS e deixe as pipetas secarem por 5 minutos na RT.
2. Isolamento muscular edl e digestão de colagemnase
- Pulverizar todos os equipamentos com 70% de etanol para evitar contaminação.
- Sacrifique o rato de acordo com as normas nacionais para experimentação animal.
- Pulverize as mesas traseiras do mouse com 70% de etanol. Use tesouras curvadas finas endurecidas (24 mm de ponta) e fórceps finos (Dumont 7, curva ou reta) para remover a pele e expor os músculos subjacentes. Evite qualquer contato dos músculos subjacentes com peles (aumenta o risco de contaminação).
- Remova a fáscia circundante com fórceps curvados finos sem danificar os músculos subjacentes(Figura 2A). Feche os fórceps para evitar dobrar.
- Use fórceps curvos para expor os tendões distais do músculo TA(tibialis anterior)e EDL. Para remover o TA, pegue o tendão distal ta com fórceps e corte com uma tesoura fina de mola Vannas (5 mm de ponta, 0,35 mm de diâmetro de ponta). Enquanto segura o TA no tendão, puxe-o em direção ao joelho e corte o músculo perto do joelho(Figura 2B), o músculo EDL está agora exposto.
NOTA: Certifique-se de que apenas o tendão do TA seja agarrado nesta etapa, caso contrário, o EDL subjacente pode ficar danificado. Ao cortar o músculo TA certifique-se de que os tendões do joelho podem ser vistos facilmente depois. - Levante o tendão dismotal EDL com fórceps curvos finos e corte com uma tesoura fina de mola Vannas(Figura 2C). Exponha o tendão proximal de EDL puxando cuidadosamente o EDL em direção ao joelho. Corte o tendão proximal com uma bela tesoura de mola Vannas. Transfira o músculo EDL para o 37 °C pré-aquecido 2,5 mL de solução de digestão de colagenase no tubo de reação de 15 mL a partir do passo 1.4. (Figura 2D).
NOTA: Faça uma pequena incisão no tecido conjuntivo externo do joelho para expor totalmente o tendão proximal do EDL. Certifique-se de apenas pegar os tendões e não esticar muito o EDL. - Repita os passos 2.3. para 2,6. com o segundo EDL. Adicione ambos os músculos EDL ao mesmo tubo de reação de 15 mL preenchido com solução de digestão de colagenase de 2,5 mL.
- Incubar os músculos EDL no tubo de reação a 37 °C em um banho de água circulante.
NOTA: O tempo de incubação depende de vários fatores, como atividade de colagem, idade do camundongo e quantidade de tecido fibroso. O tempo típico de incubação para músculos EDL de camundongos adultos (2-6 meses de idade) é de 1-1,5 h e para camundongos idosos (18 meses de idade) 1,5-2 h. - Para evitar a digestão excessiva dos músculos, verifique os músculos durante o tempo de digestão. Pare a digestão quando os músculos se soltarem e os miofibers solteiros estiverem visíveis(Figura 2E). Transfira os músculos cuidadosamente com a pipeta de furo grande para o primeiro poço da placa pré-enlasada de 12 poços contendo meio de isolamento de miofibra(Figura 2G).
3. Dissociação e cultura de miofibra
- Para as etapas a seguir use um microscópio binóculo estéreo, preferencialmente equipado com uma placa de aquecimento (37 °C). Use a pipeta de furo grande para lavar os músculos com meio de isolamento quente até que os miofibers solteiros sejam liberados. Dissociar os músculos com a pipeta de furo grande até que o número desejado de miofibers esteja flutuando livremente na solução.
NOTA: Evite trituração excessiva para reduzir o risco de myofibers danificados. O uso de uma placa de aquecimento para dissociação de miofibra é fortemente aconselhado, uma vez que a temperatura cai durante o processo de isolamento, o que resultará na morte da miofibra. - Transfira myofibers não contratados(Figura 2H)com a pipeta de vidro de pequeno furo revestido de HS para o segundo poço cheio de meio de isolamento para lavar detritos e myofibers (danificados)(Figura 2I).
NOTA: Para evitar o movimento excessivo de miofibers isolados, eles podem ser transferidos para o segundo poço e, em seguida, o processo de trituração pode ser continuado. - Transfira myofibers não contratados parao próximo (3º ) bem preenchido com meio de isolamento para lavar novamente.
- Use a pipeta de vidro de furo pequeno, revestida com HS, para transferir aproximadamente 50-100 miofibers não contratados para a placa de 24 poços contendo meio de cultura miofibra.
- Incubar myofibers a 37 °C, 5% de CO2 para tempo dedicado (recomenda-se 96h máxima).
NOTA: Os MuSCs dividem-se uma vez planar ou apical-basal após 42 h de cultura. Além disso, após 72 h de cultura, os MuSCs formam aglomerados multicelulares que consistem em MuSCs autoconstruidores, proliferantes ou comprometidos (diferenciados).
4. transfecção do siRNA
- 4 h após o isolamento da miofibra, transfeito miofibra associada MuSCs (50-100 myofibers não contraídos em um poço da placa de 24 poços preenchido com 500 μL cultura média) com reagente de transfecção à base de lipídio, por exemplo, RNAiMAX de acordo com o protocolo do fabricante com uma concentração final de 5 pmol siRNA. Portanto, adicione 25 μL de Opti-MEM com o respectivo volume de siRNA a 25 μL Opti-MEM contendo 1,5 μL do reagente de transfecção. Incubar a mistura de reação por 5 min e adicioná-la depois aos 500 μL do meio de cultura.
NOTA: Recomenda-se uma segunda transfecção após 24h ou 48h para períodos de cultura mais longos, por exemplo, mais de 48h. Não é necessária uma mudança de meio após a transfecção.
5. Fixação e coloração IF
- Para imunostaining use um microscópio binóculo estéreo. Todos os volumes nas etapas seguintes são ajustados a um poço de uma placa de 24 poços. Execute todas as etapas seguintes usando uma pipeta de furo pequeno revestida de HS.
- Descarte cuidadosamente o meio de cultura miofibra, deixando alguma solução no poço (aproximadamente 100 μL por 24-well). Faça isso por todas as outras etapas, a menos que seja declarado o contrário para permitir a flutuação dos miofibers. Adicione 500 μL de 2% pfa para fixar os miofibers com seus MuSCs adjacentes, incubar por 5 minutos à temperatura ambiente (RT).
- Retire o supernatante cuidadosamente e lave os miofibers três vezes com PBS (pH 7.4, 500 μL por 5 min em RT cada).
- Adicionar 500 μL solução de permeabilização (0,1% Triton X-100, 0,1 M Glycine em PBS, pH 7.4), incubar por 10 min na RT.
- Remova a solução de permeabilização e adicione a solução de bloqueio de 500 μL (5% HS em PBS, pH 7.4) por 1h na RT.
NOTA: Verifique a solução de bloqueio recomendada para anticorpos primários para evitar a ligação inespecífica. - Remova a solução de bloqueio e adicione 300 μL de diluição de anticorpos primários (por exemplo, anti-Pax7 (PAX7, DSHB, não diluído), anti-MyoD (clone G-1, Santa Cruz, 1:200)por poço. Incubar a 4 °C durante a noite.
- Lave três vezes com 500 μL de PBS por poço (5 min em RT).
- Remova o PBS e adicione 300 μL de diluição de anticorpos secundários (por exemplo, anti-mouse-IgG1-546 e anti-mouse-IgG2b-488 1:1000) por poço. Incubar 1 h em RT protegido contra a luz. Para as etapas seguintes, recomenda-se condições reduzidas à luz.
- Lave duas vezes com 500 μL de PBS por poço (5 min em RT).
- Realize a coloração da DAPI utilizando 500 μL da solução por poço (concentração final de DAPI 10 μg/mL) por 5 min no RT.
- Lave duas vezes com 500 μL de PBS por poço (5 min em RT).
- Use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo em um escorregador de vidro microscópico para criar uma barreira repelente de água que evitará derramamento de líquido contendo miofibers. Transfira os miofibers no menor volume possível para o deslizamento de vidro microscópico e disperse-os no escorregador de vidro.
NOTA: Evite o puxão físico dos miofibers sobre o escorregador de vidro microscópico, pois isso pode causar atrito resultando em descolamento de aglomerados de miofibers. - Remova o líquido residual com a pipeta Pasteur de pequeno porte ou uma pipeta de 200 μL.
- Use duas gotas de meio de montagem aquoso e cubra os miofibers com um deslizamento de tampa. Deixe os slides secarem pelo tempo recomendado pelo fabricante. Armazene os slides a 4 °C no escuro.
Representative Results
Este protocolo fornece instruções para derivação bem-sucedida e cultura de miofibers únicos com seus MuSCs associados de músculos murine EDL. As etapas essenciais do protocolo são resumidas na Figura 1. A dissecação cuidadosa do tendão dos músculos EDL (Figura 2A-C) é fundamental para um alto rendimento de miofibers viáveis. A dissociação muscular é alcançada primeiro pela digestão de colagenase(Figura 2D),seguida pela trituração física(Figura 2G). Myofibers intactos (Figura 2H) são cultivados, enquanto os miofibers hipercontratados e mortos(Figura 2I) devem ser excluídos da cultura e análise.
Os MuSCs permanecem associados à miofibra durante o processo de isolamento. Mancha de imunofluorescência para o fator de transcrição Pax7 identifica e distingue núcleos musc 7-9 da infinidade de míonucleos por miofibra quando fixados logo após a conclusão do processo de isolamento(Figura 3A). A Figura 3B mostra uma área ampliada da Figura 3A com o canal de campo brilhante adicional, que expõe a estrutura miofibrillar subcelular do miotube e demonstra o sinal de imunofluorescência Pax7 no núcleo de um MuSC.
Ativação e progressão miogênica de MuSCs associados à miofibra podem ser analisados pela expressão do marcador miogênico. Associado a miofibers recém-isolados (0h), podem ser encontrados muSCs quiescentes, que são caracterizados pela expressão Pax7 e ausência de expressão myoD, assemelhando-se assim a uma condição homeostática in vivo(Figura 4, 0 h). Devido ao procedimento de dissecção/dissociação e à composição da mídia de cultura miofibra, os MuSCs ativam e regulam rapidamente o fator de transcrição MyoD para facilitar a proliferação, como pode ser observado às 42 horas, quando os MuSCs passaram por sua primeira divisão(Figura 4, 42 h). Após 72 horas de cultura, os MuSCs formam aglomerados de progênies com diferentes destinos miogênicos que são paralelos pelos padrões de expressão de diferentes marcadores miogênicos(Figura 4, 72 h). Apenas as células Pax7+ resistem à diferenciação e se tornam células-tronco auto-renovadores. As células duplas positivas Pax7+ e MyoD+ são proliferativas, enquanto as células myoD+ progrediram ainda mais ao longo da linhagem miogênica e se diferenciarão.
O sistema de cultura miofibra permite uma interferência eficiente da atividade musc por várias intervenções, que uma delas é a transfecção do siRNA, conforme descrito detalhadamente neste protocolo. Para monitorar a eficiência de transfecção dos MuSCs associados à miofibra, foi transfecido um siRNA fluorescentemente rotulado como não-alvo. MuSCs positivos Pax7 acumularam siRNA citoplasmático de forma semelhante a um grânulo, indicando uma absorção eficiente (Figura 5A). Não foram observados grânulos fluorescentes no citoplasma dos miofibers sugerindo uma barreira natural de absorção em miofibers a 4h após o isolamento e que a transfecção do siRNA tem como alvo especificamente os MuSCs. A quantificação de células Pax7+ transfectadas positivamente por miofibra revelou que mais da metade de todos os MuSCs haviam tomado quantidades visíveis de siRNA fluorescentemente rotulado pouco antes da conclusão da primeira rodada de divisão em 24 horas. O número de células Pax7+ transfeinadas aumentou ainda mais até 74% após 30 horas(Figura 5B). Além disso, não houve diferença no número de células Pax7+ por miofibra de condições transfectadas ou não transfectadas em ambos os pontos de tempo, não demonstrando efeitos adversos nos números de células-tronco devido ao procedimento de transfecção(Figura 5C).
Em resumo, o protocolo fornece uma descrição detalhada do isolamento e cultura de myofibers únicos EDL com suas células-tronco musculares adjacentes. Permite o estudo da atividade de células-tronco ligadas à miofibra ex vivo, por exemplo, por meio de análises baseadas em imunofluorescência. A manipulação de células-tronco musculares pela transfecção do siRNA é eficiente e fornece uma base metodológica para análises funcionais.
Figura 1: Resumo esquemático de etapas essenciais. As etapas essenciais do procedimento de isolamento e imunossuagem são resumidas nesta figura. Abreviaturas: DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium; FBS, Soro Bovino Fetal; CEE, Extrato de Embrião de Frango; TA, tibialis anterior; EDL, extensor digitorum longus Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dissecção do EDL do rato e isolamento único da miofibra. (A) A pele do camundongo é removida e o músculo circundante da fáscia é puxado para expor o músculo TA (tibialis anterior). (B) O músculo TA é removido para expor o músculo EDL(extensor digitorum longus),marcado pela seta branca. (C) O músculo EDL é dissecado cortando seus tendões. (D) Dois músculos EDL são colagenase digeridos. (E) Aparecimento de músculo digerido de colagenase com miofibers únicos visíveis soltando-se do núcleo tecidual. (F) Pipeta pasteur grande e pequena com escala. (G) Os músculos EDL (marcados por setas negras) são fisicamente triturados usando uma pipeta pasteur grande furo. (H) Myofibers intactos únicos são finos e brilhantes e podem ser coletados individualmente para cultura e análise. (I) Myofibers hipercontratados e mortos são inadequados para cultura e análise. As imagens microscópicas de 2H e 2I foram capturadas com um microscópio usando um objetivo N-Achroplan 5x. As barras de escala são de 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem microscópica de uma única miofibra com seus MuSCs associados. Myofibers únicos de EDL de camundongos jovens C57BL/6 foram preparados e corrigidos por PFA após isolamento (0h). (A) A mancha de imunofluorescência Pax7 e DAPI identifica células-tronco musculares associadas à miofibra (MuSCs, marcadas por setas). A imagem microscópica foi capturada usando as telhas e a função z-stack de um microscópio equipado com um objetivo de óleo Plan-Apochromat 40x. A barra de escala é de 200 μm. (B) Ampliação de (A) mostrando os mionucleos, um núcleo positivo Pax7 e o padrão escuro-brilhante de estruturas miofibrillares em brightfield. A barra de escala é de 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens de imunofluorescência da ativação do MuSC e progressão miogênica durante a cultura única da miofibra. As células-tronco musculares (MuSCs) de miofibers recém-isolados (0 h) representam um estado homeostático próximo à quiescência in vivo, caracterizado pela expressão pax7 e falta de expressão myoD. Durante a cultura miofibra única, a maioria dos MuSCs reregulam o MyoD e reentram no ciclo celular para dividir e proliferar (42 h). Após 72 h de cultura, o destino MuSC pode ser discriminado com base na expressão do marcador miogênico. As células com expressão Pax7 só se auto-renovarão (seta vermelha), enquanto as células duplas positivas Pax7 e MyoD (vermelho/arqueiro verde) continuam a proliferar. MyoD apenas células positivas (arqueiro verde) se comprometeram com a diferenciação miogênica. Imagens microscópicas foram capturadas utilizando um microscópio com um objetivo Plan-Apochromat 20x (0 h, 42 h) ou um LD Plan-Neofluar 40x objetivo (72 h). As barras de escala são de 20 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Transfecção fluorescente siRNA de MuSCs e análise de absorção. Os myofibers únicos EDL foram preparados e transfectados com siRNA fluorescentemente rotulado (siGLO) seguindo as etapas fornecidas por este protocolo. (A) Acumulação citoplasmática de grânulos siGLO especificamente em uma célula-tronco muscular positiva Pax7 (MuSC) em uma única miofibra a 30 h de cultura. A imagem microscópica foi capturada usando a função z-stack e apotome de um microscópio com um objetivo de óleo Plan-Apochromat 100x. Barras de escala são 5 μm. (B) Quantificação da absorção de siRNA por células-tronco musculares positivas Pax7 a 24 ou 30 h de cultura. (C) Número de células positivas Pax7 por miofibra única comparando condições não transfecidas e transfectadas em 24 ou 30 horas de cultura. Os dados são mostrados como médias com desvio padrão de n = 4 camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Aqui, é apresentado um método para investigar funcionalmente o papel de um gene específico em MuSCs usando uma abordagem in vitro. É importante ressaltar que no sistema aqui descrito os MuSCs são cultivados em condições, que se assemelham tanto à situação in vivo quanto possível preservando a maioria das interações dos MuSCs com seu nicho. Isso é feito por meio de mirins isolados com seus MuSCs adjacentes em condições flutuantes e transfecção consecutiva de siRNA. Os procedimentos de isolamento de miofibra, transfecção do siRNA e investigação das populações musc durante 72 h de cultura através de análises de imunofluorescência são descritos. Além disso, foi demonstrado que cerca de 74% de todos os MuSCs foram transfectados com um siRNA de controle fluorescentemente rotulado após 30 horas de cultura.
Atenção especial deve ser focada na dissecação cuidadosa do músculo EDL, uma vez que alongamentos extensos, beliscar ou espremer levarão à contração e morte consecutiva de miofibers. Além disso, é importante investigar aglomerados de MuSCs de pelo menos 20 myofibers diferentes por réplica por condição. Isso é necessário, uma vez que os números e propriedades do MuSC estão variando devido à existência de subpopulações musc. Ao investigar o efeito de um siRNA específico em MuSCs usando o método de cultura miofibra flutuante, uma comparação da condição com o siRNA de alvo ao controle não direcionado deve ser realizada dentro do mesmo rato e músculo. Isso é recomendado para evitar diferenças específicas do mouse que possam cobrir ou amplificar efeitos do siRNA. A eficiência do knockdown pode ser determinada por análises de imunofluorescência com anticorpos direcionados contra o gene alvo usando miofibers únicos com seus MuSCs adjacentes. Se isso não for uma opção, pode-se testar a eficiência de knockdown do siRNA em myoblasts primários seguidos de análises quantitativas de RT-PCR ou imunoblot. A eficiência do siRNA deve ser determinada antes de analisar o efeito do siRNA em MuSCs em miofibers únicos. O uso de um pool inteligente composto por 4 siRNAs diferentes versus um único aumenta a eficiência do knockdown, mas também aumenta o risco de segmentação inespecífica. Um siRNA não direcionado deve ser usado como controle. Para monitorar diretamente a eficiência da transfecção, pode-se usar um siRNA fluorescente rotulado não direcionado como realizado aqui. O ponto de tempo para transfecção com o siRNA é cerca de 4 horas após o isolamento, um ponto de tempo em que a lamina basal em torno dos MuSCs já é permeável para o siRNA. Se o efeito de um siRNA específico em MuSCs após 72 ou 96 h deve ser investigado, recomenda-se realizar uma segunda transfecção de siRNA após 24 h ou 48 h para manter uma alta eficiência de knockdown.
O ensaio de cultura miofibra exibe diversas vantagens em comparação com a investigação de MuSCs com métodos convencionais de cultura celular. Os MuSCs permanecem ligados aos miofibers durante todo o processo de isolamento, preservando assim a interação crucial do MuSC com seu nicho19,23,24,25. A interação preservada dos MuSCs com a miofibra é um pré-requisito para estudar efeitos dependentes de nicho na funcionalidade musc, que não pode ser recapitulado em culturas míferas convencionais 2D. Por exemplo, durante o envelhecimento os MuSCs apresentam capacidade miogênica prejudicada, resultando em uma eficiência reduzida para regenerar tecido muscular após danos20,26. Esse prejuízo é, pelo menos, parcialmente atribuível a alterações no nicho musc, em especial mudanças na composição do ECM27,28. O protocolo de cultura miofibra permite o estudo e a interferência com essas mudanças de nicho aberrantes.
Em contraste com o método descrito aqui, a purificação dos MuSCs por técnicas de imunolabelação e classificação como FACS (fluorescência ativada de classificação celular) ou MACS (classificação celular magnética) envolve a remoção dos MuSCs de seu nicho. Curiosamente, culturas 2D de MuSCs isolados de músculos idosos perdem suas pistas extrínsecas e se comportam semelhantes aos MuSCs isolados de músculos jovens, não recapitulando a situação in vivo apropriadamente29. Além disso, a dissociação completa do tecido muscular e rotulagem de MuSCs com marcadores superficiais resulta em alterações transcriômicas e ativação das células30,31,32. Outra vantagem do sistema de cultura miofibra é a possibilidade de interferir com a funcionalidade do MuSC em vários níveis. A manipulação de MuSCs em miofibers cultivados pode ser efetivamente alcançada pelo knockdown genético mediado pelo siRNA, como descrito aqui em detalhes. Da mesma forma, a aplicação de compostos químicos ou a entrega de proteínas recombinantes é muito eficaz para interferir nas vias das células-tronco20,28. Além disso, vetores de expressão retro ou lentiviral permitem a introdução de genes exógenos, ou seja, mutantes ativos constitutivos33. Além disso, a influência de fatores extrínsecos na funcionalidade do MuSC pode ser explorada no sistema aqui descrito, por exemplo, as condições de cultura podem ser complementadas com supernasces de diferentes fontes fisiológicas ou patológicas para modelar diferentes estados como o câncer cachexia34,35.
Uma limitação do método descrito aqui é o fato de que o sistema único de cultura miofibra não pode recapitular completamente o impacto de todos os fatores sistêmicos ou influência de outros tipos de células nos MuSCs. Além disso, o tempo em que os miofibers podem ser mantidos viáveis na cultura é limitado e, portanto, o estudo de processos relacionados ao MuSC se concentra em eventos precoces como ativação e compromisso miogênico. Além disso, a investigação da interação musc com outras células de nicho, como células imunes ou células progenitoras fibro-adipogênicas, não é possível. Para investigar efeitos sistêmicos na funcionalidade do MuSC pode-se realizar experimentos de lesão muscular seguidos da análise da regeneração muscular in vivo ou realizar experimentos de transplante36,37.
Em conjunto, o protocolo de isolamento e cultura de miofibras oferece uma grande oportunidade para estudos genéticos ou mecanicistas sobre MuSCs adultos sem a necessidade de modelos de camundongos transgênicos e pode potencialmente reduzir a experimentação animal.
Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Christine Poser e Christina Picker pela excelente assistência técnica e leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção da Deutsche Forschungsgemeinschaft à JvM (MA-3975/2-1), à Fundação Carl Zeiss e à Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
| chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
| collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
| horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
| MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
| siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |
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