Summary
Протокол, представленный здесь, описывает использование Spotiton, новой роботизированной системы, для доставки двух образцов, представляющих интерес, на самоваривающуюся нанопроволочную сетку, которая смешивается в течение как минимум 90 мс до витрификации в жидком криогене.
Abstract
Захват короткоживущих молекулярных состояний, вызванных ранним столкновением двух или более взаимодействующих частиц, продолжает оставаться экспериментальной задачей, представляющим большой интерес для области криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Было разработано несколько методологических стратегий, которые поддерживают эти исследования с «временным разрешением», одно из которых, Spotiton - новая роботизированная система - сочетает в себе дозирование капель образца размером с пиколитр с точным временным и пространственным контролем. Рабочий процесс Spotiton с временным разрешением предлагает уникально эффективный подход к опросу ранних структурных перестроек с минимальным объемом выборки. Выстреленные из независимо управляемых пьезоэлектрических диспенсеров, два образца приземляются и быстро смешиваются на нанопроволоке ЭМ-сетки, когда она погружается к криогену. Потенциально сотни решеток могут быть получены в быстрой последовательности всего из нескольких микролитров образца. Здесь представлен подробный пошаговый протокол работы системы Spotiton с акцентом на устранение конкретных проблем, возникающих при подготовке сетки.
Introduction
Потенциал крио-ЭМ для захвата и выявления переходных конформационных состояний белков на субсекундной временной шкале (крио-ЭМ с временным разрешением) был реализован несколькими группами, начиная с Берримана и Анвина1, чья техника построена на стандартном методе погружной заморозки, разработанном Дюбоше для подготовки крио-ЭМ-сеток2. Они добавили атомайзер чуть выше чашки криогена, который использовал сжатый газообразный азот для распыления мелкого тумана второго образца на погружающуюся ЭМ-сетку, содержащую первый образец, который был нанесен и смазан тонким водным слоем. Хотя эта система могла достичь времени смешивания всего 1 мс, она по-прежнему требовала ручного промокления первого образца пользователем - технически сложная задача - и относительно большого объема второго образца. Кроме того, на практике было трудно понять, где произошло смешивание двух образцов, что потребовало использования наночастиц ферритина в качестве фидуциального маркера в смешанном образце. Последующие усилия Говарда Уайта и его коллег улучшили контроль и воспроизводимость этого подхода к распылению-смешиванию, включив компьютерное управление этапами3,4пятнистости и распыления. Чтобы решить, насколько хорошо и где смешиваются образцы, та же группа5 и другие6,7,8,9,10 перешли на подход11 смешивания-распыления, при котором два образца смешиваются либо в узких капиллярных трубках под давлением шприцевых насосов, либо в микрофабрикатных микрофлюидных чипах, приводимых в действие газообразным азотом. Эти системы предварительного смешивания не только обеспечивают полное перемешивание, но и позволяют точно настраивать время смешивания для увеличения разрешения исследований с временным разрешением.
Внедрение пьезоэлектрических дозаторов в качестве альтернативного способа нанесения пробы на электромагнитные решетки в системе Spotiton позволило как точно определить осаждение образца, так и требование гораздо меньшего объема образца для создания сетки12. Позже использование нанопроволочных сеток и нанесение образцов в пути («на лету») устранило необходимость в этапе пятнистости и сократило время нанесения на витрификацию13,14. Для нового подхода к крио-ЭМ с временным разрешением, описанного здесь, второй дозатор вместе с необходимыми аппаратными и программными обновлениями управления были добавлены в систему Spotiton, чтобы обеспечить доставку второго образца на движущуюся нанопроволочную сетку почти сразу после осаждения первых15. Два перекрывающихся образца смешиваются на сетке, поскольку они превращаются нанопроволоками в тонкий водный слой перед витрификацией. Может быть достигнуто время перемешивания до 90 мс. Этот протокол предназначен для предоставления практической информации о том, как проводить эксперименты с временным разрешением с использованием пьезоэлектрического дозирования и нанопроволоконых сетей. Кроме того, поскольку аппаратное и программное обеспечение модифицируются для повышения простоты использования, согласованности и пропускной способности, этот протокол также служит в качестве актуального описания ранее сообщенного способа15.
Protocol
1. Настройка машины и программного обеспечения Spotiton
- Подготовьте систему к дозирования(рисунок 1).
- Откройте главный клапан на баке подачи азота. Убедитесь, что резервуар системы заполнен дегазированной, сверхчистой водой. Включите компьютер. Включите систему Spotiton на многофункционе Powertrip.
- Щелкните значок на рабочем столе (рисунок 2A),чтобы открыть пользовательский интерфейс (UI) программного обеспечения Spotiton(рисунок 2B). В меню Инструменты выберите Инициализировать этапы, чтобы инициализировать и размещать 3-осевых роботов (сетчатая ступень и ступень пипетки) и вращающуюся головку дозатора (тета-стадия). Убедитесь, что наконечники диспенсера направлены вниз перед инициализацией и самонаведением.
- В главном окне нажмите Нажмите На Go to SafePosition, чтобы отправить роботов в SafePosition(рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Переход на SafePosition может быть выполнен с роботами в любом положении без риска столкновения. - На вкладке Аспират выберите Прайм, чтобы несколько раз промыть головки диспенсера водой из резервуара. Продолжайте до тех пор, пока не будут видны непрерывные потоки воды, выходящие из двух кончиков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может потребоваться повторить, если значительный объем воздуха попал в жидкостные линии, когда наконечники были промыты метанолом при последнем отключении.
- Проверка работоспособности дозатора
- На вкладке Инспекция отправьте каждый наконечник на инспекционную камеру для проверки воды и соответствуйте схеме производства капель из двух дозаторов(рисунок S1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если наконечник не загорает из-за пузырька(рисунок S2A)или мусора, очистите наконечники на станции мойки(рисунок S2B)с помощью функции ультразвуковой мойки, доступной на вкладке Aspirate. - Отрегулируйте амплитуду обжига (без единиц) для каждого дозатора и образца, чтобы получить поток дискретных капель постоянного размера.
- Визуально подтвердите производство эквивалентных капель двумя дозаторами.
- Нажмите кнопку «Запись» на верхнем мониторе камеры, чтобы записать видео стрельбы Tip 1. Воспроизвести видео выстрела Tip 1 на правом боковом мониторе в то же время, когда Tip 2 выстреливает в верхнем мониторе камеры(рисунок S1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Видеозаписи каждого выстрела наконечника записываются и сохраняются.
- Нажмите кнопку «Запись» на верхнем мониторе камеры, чтобы записать видео стрельбы Tip 1. Воспроизвести видео выстрела Tip 1 на правом боковом мониторе в то же время, когда Tip 2 выстреливает в верхнем мониторе камеры(рисунок S1).
- Диспенсеры теперь готовы к испытательному стрельбе по сетке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предполагает, что было проверено правильное выравнивание ступеней сетки и пипетки в соответствующих положениях погружения. Неспособность подтвердить правильное выравнивание может привести к столкновению, повреждению наконечников или роботов.
- На вкладке Инспекция отправьте каждый наконечник на инспекционную камеру для проверки воды и соответствуйте схеме производства капель из двух дозаторов(рисунок S1).
- Испытать воду на сетке.
- Убедитесь, что роботы находятся в SafePosition.
- Снимите пинцет с крепления на сетке робота с помощью прилагаемого ключа Allen.
- На соседнем столе поместите тестовую сетку, нанопроволоку стороной вверх, на краю блока сетки. Осторожно захватите ободок сетки, правильно расположите пинцет(рисунок S3)и перемонтируйте пинцет.
- На вкладке Cryo нажмите «Подсказка к камере», чтобы переместить подсказки в поле зрения камеры верхнего погружения(верхней камеры). Убедитесь, что на верхнем мониторе камеры выбран Live, а верхний индикатор камеры включен (циферблат на передней панели корпуса устройства(рисунок 1).
- Установите пинцет на сетку робота. Положение Совет 1, видимый на верхнем мониторе камеры, щелкнув мышью внутри монитора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будет виден только совет 1, который будет перемещен в место клика. - Щелкните Сетка для камеры, чтобы расположить сетку перед верхней камерой. При необходимости отрегулируйте положение Tip 1, как и раньше.
- Выберите Tip1, Tip2или Tip1 и Tip2, чтобы выбрать один или оба дозатора для испытания.
ПРИМЕЧАНИЕ: При испытательной стрельбе наконечников по отдельности используйте мышь для размещения наконечника 1 в верхнем мониторе камеры в разных боковых местах сетки. Это будет наносить жидкие полосы из двух наконечников в неперекрывающемся шаблоне и позволит пользователю подтвердить, что каждый наконечник выстрелил. - На вкладке Cryo убедитесь, что Сетка Vitrify не выбрана, нажмите на Цель очереди,затем на Plunge.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ступень пипетки немного поднимется, за ней последует стадия сетки. Затем робот-сетка погружает сетку мимо дозаторов стрельбы и верхней и нижней камер, отдыхая прямо над палубой. Захват изображения с верхней камеры отображается над снимком с нижней камеры в левой части пользовательского интерфейса. - Оцените верхние и нижние изображения: каждый ли наконечник срабатывает при выборе? При совместном обжигах жидкость из двух кончиков полностью перекрывалась, создавая заметно более толстую полосу, чем при обжигах по отдельности?
- Если какой-либо наконечник не сработал, выполните один или несколько циклов ультразвуковой промывки до тех пор, пока не будет наблюдаться четкое обжиг.
- Если полосы образца не полностью перекрываются, отрегулируйте боковое выравнивание одного из дозаторов с помощью ключа Аллена, чтобы повернуть боковой регулировочный винт на одном из дозаторов на четверть оборота и выполнить пробное погружение. Повторяйте до тех пор, пока полосы полностью не перекрывутся.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если оба наконечника сдались успешно и как ожидалось, система готова подготовить сетки образцов.
2. Подготовьте смешанные сетки с двумя образцами
- Обновите значения ускорения, замедления и скорости в XML-файле параметров машины, чтобы достичь интересующего времени смешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Таблицы, коррелируя эти значения со временем смешивания, ранее сообщали15. - Подготовьте образец и сетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента в протоколе пройдет 20-30 минут, прежде чем будет подготовлена первая сетка, и образцы должны храниться при соответствующей температуре в течение этого интервала времени.- Разбавите два образца (т.е. белок и лиганд или другой взаимодействующий партнер) до желаемых концентраций с соответствующим буфером, в идеале одинаковым для обоих.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сетки Spotiton требуют в 1,5-2 раза более высоких концентраций белка, чем обычно используются для автоматических погружных морозильных камер. Это может быть связано с минимальным временем, которое белок проводит в тонком водном слое на поверхности сетки во время погружения, давая частицам меньше возможностей для концентрации на границе раздела воздух-вода. - Наполните криогеновую чашу жидким азотом.
- Плазменная очистка 3-4 нанопроволоволоконные сетки. Используйте 5 Вт, водород и кислород, 1,5 мин в качестве отправной точки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее эффективная продолжительность и рецепт плазменной очистки могут меняться изо дня в день в зависимости от температуры и влажности окружающей среды и партии используемых нанопроволочных сеток. Альтернативные газовые смеси или тлеющий разрядник также могут быть эффективными, но не были испытаны для этой цели. Поскольку вода и белок в буферном растворе часто с разной скоростью поглощаются нанопроволоками, лучше всего оценить впитывание решеток, которые будут использоваться в этот день на погружении, в котором дозируется фактический образец.
- Разбавите два образца (т.е. белок и лиганд или другой взаимодействующий партнер) до желаемых концентраций с соответствующим буфером, в идеале одинаковым для обоих.
- Установите уровень влажности в системе.
ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к условиям, используемым как для изготовления, так и для плазменной очистки сеток, влажность является еще одним основным фактором, который влияет на скорость впитывания нанопроволочных сеток. Хотя целевой процент влажности для конкретного сеанса определяется эмпирически для каждого дня и партии сеток, 90-95% является хорошей отправной точкой.- Убедитесь, что небулайзер достаточно заполнен сверхчистой водой. Подключите небулайзер и наблюдайте, как пар выходит из центрального порта на крышке небулайзера.
- Наблюдайте за монитором влажности в реальном времени в главном окне или откройте трекер влажности окружающей среды в разделе Отчеты | Окружающая среда (рисунок S4). Проверьте уровень влажности в двух зонах: Камерной и Плащанице.
ПРИМЕЧАНИЕ: Камера включает в себя все области в корпусе Spotiton. Плащаница - это область, непосредственно охватывающая положения решетки и наконечников диспенсера «на камеру». Кожух из черной смолы поддерживает заданный уровень влажности при открытии дверей корпуса для загрузки сетки. - После достижения целевых значений влажности поддерживайте эти значения автоматически или вручную на вкладке Влажность. Выберите Автоматическое управлениеи выберите заданное значение и пороговое значение, чтобы сохранить заданное значение в пределах выбранного порогового значения. Кроме того, выберите Ручное управлениеи отрегулируйте уровень влажности с помощью двух элементов управления вентилятором: камерного вентилятора и кожухового вентилятора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Включение камерного вентилятора вытягивает пар через фильтр в левом порту и предотвращает попадание в камеру более крупных капель воды, предотвращая дальнейшее повышение влажности окружающей среды. Пока двери камеры остаются закрытыми, уровень влажности стабилизируется на желаемом проценте. Включение вентилятора кожуха вытягивает пар через правый порт в кожух. Это уменьшает выделение пара в камеру и повышает уровень влажности в кожухе.
- Загрузите образец в дозаторы.
- Добавьте 5 мкл каждого образца в чашки для образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать введения пузырьков, очень осторожно распределите объем на внутреннюю боковую стенку чашки, затем встряхните, чтобы заставить образец перейти на дно чашки. - Загрузите чашки для образцов в лоток для хранения, образец для подсказки 1 слева, для подсказки 2 справа. Задвиньте лоток обратно в машину, пока она не сядёт.
- На вкладке Аспират выберите 3 мкл для объема, который будет аспирироваться каждым наконечником. Убедитесь, что лоток для образцов надежно установлен, затем нажмите на Аспират и посмотрите, как ступень пипетки перемещает головки дозатора в чашки для образцов.
- Проверьте успешное аспирирование обоих образцов, сняв чашки для образцов и наблюдая падение уровня жидкости.
- На вкладке Проверка отправьте каждый совет на инспекционную камеру, чтобы подтвердить беспрепятственную дозирование. Отрегулируйте амплитуду по мере необходимости, чтобы она соответствовала образованию капель с каждого наконечника (см. раздел 1.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Амплитуда, вероятно, должна быть увеличена для наконечника, который дозирует образец белка. - Теперь система готова подготовить сетку образцов.
- Добавьте 5 мкл каждого образца в чашки для образцов.
- Замораживание сеток для образцов
- Загрузите только что очищенную плазмой сетку в пинцет, но пока не монтируем пинцет. Убедитесь, что уровень влажности повышен, ~90-95%. Наполните чашку этана.
- Провести заключительный испытательный огонь обоих наконечников перед инспекционной камерой, подтвердив отсутствие препятствий. На вкладке Cryo нажмите «Подсказка к камере».
- Наполните этановой чашкой. Если образуется этановый лед, растапливаете по мере необходимости с дополнительным газообразным этаном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 2.5.4 и 2.5.5 должны быть выполнены относительно быстро (<20 с), чтобы свести к минимуму (i) насыщение нанопроволок в условиях высокой влажности камеры и (ii) вероятность того, что наконечник, обжигающий образец белка, засорится. - Установите пинцет с сеткой на сцену сетки. На вкладке Cryo нажмите сетку для камеры. Убедитесь, что совет 1 правильно расположен на верхнем мониторе камеры (см. шаги 1.3.4-1.3.5).
- Нажмите на Vitrify Grid, Queue Target, затем Plunge. Нажмите OK, когда появится запрос на команду робота сетки, чтобы перепрыгнуть сетку из этана в жидкий азот и выпустить ее на затопленную полку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Затем пинцет поднимается обратно в камеру. После перехода на жидкий азот появляется подсказка с вопросом, не упала ли сетка с пинцеса. Если он не упал, нажмите на No, и пинцет откроется и закроется несколько раз, чтобы отсоедить сетку. - Изучите изображения сетки(рисунок S5),чтобы решить, следует ли ее сохранить или выбросить.
- Если сетка сохраняется, перенесите ее в предварительно охлажденный блок сетки. В качестве альтернативы, обнаружите последующие сетки, а затем перенесите все сетки сразу в сетку, позаботившись о том, чтобы каждая сетка могла быть идентифицирована по ее положению в зоне отдыха.
- Чтобы перенести сетку в сетку, предварительно охладите щипцы с тонким наконечником, осторожно захватите сетку за край и поместите ее в слот для сетки, начиная с первого слота слева от выемки по часовой стрелке.
- Когда все сетки будут загружены, прикрепите крышку коробки сетки к инструменту крышки и предварительно охлаждите жидким азотом. Прикрутите крышку к коробке сетки и затяните крышкой-инструментом или предварительно охлажденной отверткой.
- Используйте большие щипцы, чтобы быстро перенести закрытую сетку коробки в небольшой дьюар для визуализации или длительного хранения.
- Оцените пригодность сети для последующей электромагнитной визуализации.
- Наблюдайте за изображениями с верхней и нижней камер погружения, которые отображаются в левой части пользовательского интерфейса сразу после погружения сетки. Используйте эти изображения для оценки скорости виляния, успешного обжига обоих наконечников и степени перекрытия двух полос образцов.
- Просмотрите и сравните изображения сетки с верхней и нижней камер, а также настройки машины и измерения влажности во время погружения с помощью средства просмотра экспериментов: Отчеты | Экспериментируйте.
- Выберите сетки для визуализации в электронном микроскопе, которые демонстрируют доказательства хорошего впитывания.
Representative Results
На фиг.4 показаны изображения сеток, полученных в течение одного сеанса Spotiton с временным разрешением путем смешивания РНК-полимеразы и олигомера ДНК 105 bp, несущего промоторную последовательность в течение 150 мс до витрификации15. На рисунке видны изображения, сделанные двумя высокоскоростными камерами из шести сеток в двух точках времени после примерного применения. Эти камеры, уникальные среди морозильных камер в стиле погружения, позволяют пользователю сразу же решить, сохранять или отбрасывать сетку, основываясь на наблюдаемой степени впитывания нанопроволоками и вероятности того, что жидкие образцы были втянуты в водный слой, достаточно тонкий для эм-визуализации. Хотя одна сетка может обеспечить достаточное количество льда для полного набора данных, после достижения оптимальных условий несколько сетей готовы держать под рукой в случае потери или загрязнения одной или нескольких. Из шести сеток, подготовленных в ходе этого сеанса, на снимках показана только одна с неоптимальным витие(рисунок 4F).
Показанные сетки были подготовлены (этапы 2.5.1-2.5.8) последовательно в течение 40 мин через час для подготовки образцов и машины, как описано в протоколе (этапы 1.1.1-2.4.6). Из шести сеток две использовались для сбора данных, а остальные были сохранены для последующего анализа, если это необходимо. Рисунок льда на остеклованной сетке(рисунок 5C)близко соответствует рисунку осажденной жидкости, видимой на верхнем изображении камеры(рисунок 5B). Эффективное впитывание смешанных образцов, что стало очевидным из-за отсутствия видимой жидкой полосы на нижнем изображении камеры(рисунок 5А),происходит вдоль покрытых нанопроволокой полос сетки, и образец редко перетекает в квадраты, прилегающие к тем, в которые он приземлился. В заполненных льдом квадратах лед обычно толще всего в отверстиях в центре квадрата и становится тоньше в отверстиях ближе к решетке сетки(рисунок 5E). Часто отверстия, непосредственно прилегающие к решетке сетки, пусты из-за близости к нанопроводам(рисунок 5F).
Рисунок 1:Система Spotiton с временным разрешением. 1. Рабочее место оператора; 2. Экологическая палата; 3. Подача азота; 4. Поставка этана 5. Управление подсветкой для камеры 6 с верхним контуром погружения. Пьезоэлектрические контроллеры дозаторов; 7. Шприцевые насосы; 8. Вакуумный насос; 9. Промыть бутылки с водой и отходами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Пользовательский интерфейс программного обеспечения Spotiton. (A) Значок рабочего стола и экран-заставка. (B) Основной пользовательский интерфейс состоит из шести областей: 1. область отображения для верхнего контура погружения («верхний») и камер контроля наконечников; 2. область отображения для камеры с более низким погружением («нижний») 3. Область воспроизведения для видео осмотра подсказок; 4. Многофункциональная область вкладок; 5. Живой монитор влажности; 6. Живой системный лог-файл. Аббревиатура: UI = пользовательский интерфейс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Внутренний вид камеры Spotiton (роботы в SafePosition). 1. Сетчатый робот (красный); 2. Робот-диспенсер (желтый); 3. Камера верхнего погружения (розовый); 4. Нижняя камера погружения (светло-синий); 5. Наконечник инспекционной камеры (оранжевый); 6. Кожух влажности (зеленый); 7. лоток для образцов; 8. Небулайзер в сборе (темно-синий); 9. Система водохранилища и водопровода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Репрезентативные изображения системной камеры из сеанса создания сетки Spotiton с временным разрешением. (А -F) Изображения камеры верхнего (слева) и нижнего (справа) пути погружения шести решеток, на которые с помощью Spotiton были нанесены РНК-полимераза и промоторная последовательность ДНК. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Схема осаждения льда на сетке, подготовленной Spotiton. Части(A)нижних и(B)верхних изображений камеры и(C)атласа сетки, показанного на рисунке 4F. Приблизительные места льда, образующиеся в результате осаждения и смешивания проб, - окрашенная лаванда. Области внутри квадрата, отмеченные желтой стрелкой, изображены в (E-G). Область, показанная в (E), обшита желтым цветом(D). Репрезентативный квадрат(E),отверстие(F)и(G)экспозиция изображений, собранных из сетки, показанной в (A-D). Коробочка на квадратном и отверстии изображениях соответствует изображениям отверстий и экспозиции соответственно. Шкала стержней = 100 мкм (A-D), 5 мкм (E), 2 мкм (F), 100 нм (G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок S1: Проверка обжига наконечника. Живой вид стрельбы Tip 2 виден на верхнем мониторе камеры в левой части пользовательского интерфейса, в то время как запись, сделанная ранее с помощью Tip 1, воспроизводится на петле для сравнения в области воспроизведения видео справа. Пожалуйста, нажмите здесь, загрузите этот файл.
Рисунок S2: Ультразвуковая очистка наконечников дозаторов. Пузырь воздуха в наконечнике(A)нарушит образование капель и предотвратит выстрел наконечника. (B) Наконечники погружают в воду на станции ультразвуковой очистки для удаления пузырька воздуха или прозрачного сухого белка, блокирующего отверстие наконечника. Пожалуйста, нажмите здесь, загрузите этот файл.
Рисунок S3: Загрузка сетки пинцетем. (A) Сетка, размещенная нанопроволокой стороной вверх по краю блока сетки. (B) Сетка, правильно расположенная в самозакрывающихся пинцетах. Пожалуйста, нажмите здесь, загрузите этот файл.
Рисунок S4: Трекер влажности. Процент относительной влажности в камере (темно-синий) и саване (светло-синий), зарегистрированный во время типичного сеанса создания сетки. Время погружений сетки (зеленых квадратов) отображается на графике. Пожалуйста, нажмите здесь, загрузите этот файл.
Рисунок S5: Виляние на нанопроволопроводных сетках во время погружения. Репрезентативные верхние(A, C, E)и нижние(B, D, F)погружают в траекторию камеры изображения впитывания на нанопроволочные сетки, которые слишком медленны(A, B),идеальны(C, D)и слишком быстры(E, F). Небольшое утолщение (белые наконечники стрелок) указывает на полосы сетки с нанопроволоками, которые были насыщены образцом. Квадраты в этих областях обычно содержат лед соответствующей толщины для электронно-микроскопической визуализации. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, загрузите этот файл.
Discussion
Этот протокол описывает использование роботизированной системы Spotiton для подготовки сеток для крио-ЭМ-визуализации, которые несут два образца, обычно представляющий интерес белок и активирующий лиганд, которые были смешаны в течение 90-500 мс. Хотя рабочий процесс прост, есть несколько соображений, которые пользователь должен иметь в виду, чтобы обеспечить продуктивный сеанс создания сетки. Во-первых, нередко один из наконечников пьезоэлектрического дозатора засоряется или блокируется, предотвращая его срабатывание. Такой сбой приведет к жидкой полосе, видимой на снимках с верхней или нижней камеры, которая заметно уже, чем та, что видна после выстрела обоих наконечников. Закупорка может возникнуть в результате пузырька воздуха, попадающего в наконечник, нарушая образование капель, или из образца белка, который высох и запечатал узкое отверстие кончика. Хотя аспирированный образец теряется в процессе, обе проблемы могут быть решены путем ультразвуковой промывки наконечников и повторной аспирации образца. Чтобы предотвратить последующее засорение и отходы проб, крайне важно тщательно загрунтовать (промыть) линии жидкости перед аспиражаемым образцом и поддерживать высокий и постоянный уровень влажности в камере и кожухе. Кроме того, образец белка с особенно высокой концентрацией может повлиять на обжиг наконечника, несмотря на хорошо поддерживаемую влажность. Хотя увеличение амплитуды обжига на вкладке Inspect может частично компенсировать слабое обжиг из-за высокой концентрации белка, разбавление образца по крайней мере 1: 2 улучшит обжиг наконечника и позволит избежать засорения.
Во-вторых, может быть трудно достичь идеальной скорости впитывания, необходимой для получения льда оптимальной толщины для целевой продолжительности смешивания. Как правило, более быстрое время смешивания потребует более быстрого впитывания, более медленное время смешивания требует более медленного впитывания. Для идеально злой сетки жидкая полоса четко различима на верхнем изображении камеры, в то время как в нижней камере остается видимым только очень небольшое утолщение полос сетки в месте расположения полосы. Медленное впитывание, обозначенное темной полосой на нижнем изображении камеры, обычно оставляет лед, который слишком толстый для изображения. Отсутствие полосы на любом изображении указывает на быстрое впитывание, которое, возможно, не оставило воды в отверстиях(рисунок S5). Несколько факторов, таких как плотность нанопроволоки, настройки и продолжительность плазменной очистки, а также время воздействия и заданный уровень влажности камеры, могут влиять на скорость впитывания. Плохое (медленное) впитывание может быть результатом разреженного покрытия нанопроволок на сетке. За счет незначительного разбавления и увеличения времени воздействия нанопроволокираствора 16,плотность и покрытие нанопроволок на сетчатых стержнях будет увеличиваться, способствуя более быстрому впитываниям. Если плотность нанопроволоки достаточна, увеличение настройки мощности или продолжительности плазменной очистки также улучшит впитывание. Рекомендуемые здесь настройки относительно малой мощности и длительности, но при необходимости могут быть изменены.
Однако, если как конкретная партия сеток, так и настройки плазменной очистки хорошо работали в предыдущем сеансе, медленная производительность впитывания может возникнуть из-за чрезмерного воздействия высокой влажности нанопроволок в камере, что приводит к их насыщению влагой и снижению емкости удержания жидкости. Насыщенный сеткой эффект влажности камеры может быть уменьшен либо путем минимизации времени, прошедшего между установкой пинцеста и погружением сетки, либо за счет снижения уровня влажности системы перед погружением. Следует, однако, отметить, что последнее несет связанный с этим риск того, что наконечник, загруженный образцом белка, засорится. Чтобы компенсировать этот риск, удержание наконечников в савате, где поддерживается высокий уровень влажности, может увеличить допустимое количество времени для монтажа пинцетом, держащим новую сетку. Наконец, следует отметить, что сокращение времени погружения (достигаемое за счет увеличения ускорения сетки и/или максимальной скорости) может привести к сеткам с более тонким льдом без фактического изменения характеристик влаги сетки. Однако, поскольку время смешивания двух образцов также будет сокращено, время погружения не является фактором, который обычно изменяется для решения проблемы медленного впитывания. Чтобы справиться с слишком быстрым витием, приводящим к слишком тонкому льду, либо отсутствующему в отверстиях сетки, могут быть приняты противоположные меры, описанные выше.
Spotiton представляет определенные преимущества и недостатки по сравнению с другими методами, разработанными для субсекундных исследований с временным разрешением. Поскольку смешанная полоса образца содержит только 2-4 нл жидкости из каждого дозатора, одной аликвоты 3 мкл каждого образца достаточно для приготовления многих решеток, что является ключевым преимуществом при ограниченном количестве проб. Кроме того, наблюдение за осаждением проб с помощью встроенных камер, хотя и не является полностью уникальным для Spotiton17,не является особенностью других смесительных устройств и позволяет подвергать погруженные сетки грубой оценке прохода /отказа, что значительно сокращает время скрининга. Одним из ключевых недостатков системы является минимальное время перемешивания 90 мс, ограниченное физическими ограничениями механических компонентов, что делает опрос более быстрых биологических реакций недоступным. Для сравнения, на существующих микрофлюидных системах обычно достигается время менее 10 мс. На коммерчески доступной системе хамелеона на основе Spotiton конструктивные и строительные усовершенствования сократили минимальное время погружения до 54 мс и повысили вероятность того, что добавление второго дозатора может обеспечить более быстрое время смешивания, чем Spotiton может предложить в настоящее время.
На сегодняшний день был проведен ряд экспериментов для изучения ранних, короткоживущих молекулярных состояний с использованием Spotiton, включая сборку рибосомы 70S, вызванные кальцием конформационные изменения в трансмембранном ионном канале и сужение динамина в ответ на гидролиз GTP15. С момента публикации этих результатов в систему было внесено несколько изменений для повышения пропускной способности, воспроизводимости и отчетности о сеансах создания сетки Spotiton. К ним относятся, среди прочего, двухзонная система автоматического мониторинга и контроля влажности, функция просмотра экспериментов, функция параллельного контроля подсказок и несколько незначительных обновлений пользовательского интерфейса. Модернизированная система будет лучше поддерживать будущие эксперименты по смешиванию двух образцов, аналогичные тем, о которых сообщалось ранее, а также анализы быстрого связывания, такие как между терапевтическим средством с малой молекулой и его белковой мишенью или даже образованием комплекса антитело-антиген. В то время как текущие и будущие эксперименты с временными решениями с участием двух взаимодействующих партнеров, безусловно, будут продолжаться, добавление третьего пьезоэлектрического дозатора и связанного с ним оборудования может еще больше расширить диапазон возможных экспериментов. Например, первоначальное осаждение моющего средства с последующим интересующим белком, за которым следует взаимодействующий или активирующий лиганд, может устранить любое потенциальное негативное воздействие длительного воздействия моющего средства, часто необходимое для предотвращения общих неоптимальных результатов визуализации, таких как предпочтительная ориентация. В свете как уже опубликованной работы, так и потенциальных будущих применений, Spotiton представляет собой важный инструмент для сообщества крио-ЭМ для облегчения проведения субсекундных исследований с временным разрешением.
Disclosures
B.C./C.S.P. имеют коммерческие отношения с SPT Labtech, компанией, которая производит коммерчески доступный инструмент хамелеон, основанный на прототипе Spotiton.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Питера А. Кана и Терри Роде из Engineering Arts LLC (Аризона, США) за первоначальное проектирование и последующую разработку системы Spotiton. Мы благодарим сотрудников Центра электронной микроскопии Саймонса в Нью-Йоркском центре структурной биологии за помощь и техническую поддержку. Работа, представленная здесь, была проведена в Национальном ресурсе автоматизированной молекулярной микроскопии, расположенном в Нью-Йоркском центре структурной биологии, при поддержке грантов NIH (GM103310) и Фонда Саймонса (SF349247).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
References
- Berriman, J., Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).
- White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, Pt 6 1024-1031 (2019).
- Lu, Z., et al. Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).
- Kaledhonkar, S., et al. Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).
- Fu, Z., et al. The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy. Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).
- Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip. Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New features and applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Dandey, V. P., et al. Time-resolved cryo-EM using Spotiton. Nature Methods. 17, 897-900 (2020).
- Wei, H., et al. Optimizing "self-wicking" nanowire grids. Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).
- Ravelli, R. B. G., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).
