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Biology

एक उपन्यास रोबोटिक सिस्टम, स्पॉटिटन का उपयोग करके समय-हल किए गए अध्ययनों के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक ग्रिड तैयारी

Published: February 25, 2021 doi: 10.3791/62271
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1The National Resource for Automated Molecular Microscopy, Simons Electron Microscopy Center, New York Structural Biology Center, 2piTree Software

Summary

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्पॉटिटन, एक उपन्यास रोबोटिक प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है, जो एक आत्म-बाती, नैनोवायर ग्रिड पर ब्याज के दो नमूने वितरित करता है जो तरल क्रायोजेन में विट्रीफिकेशन से पहले न्यूनतम 90 एमएस के लिए मिश्रण करता है।

Abstract

दो या अधिक बातचीत कणों की शुरुआती मुठभेड़ से शुरू होने वाले अल्पकालिक आणविक राज्यों का कब्जा क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) के क्षेत्र में बहुत रुचि की एक प्रयोगात्मक चुनौती बनी हुई है। कुछ पद्धतिगत रणनीतियां विकसित की गई हैं जो इन "समय-हल" अध्ययनों का समर्थन करती हैं, जिनमें से एक, स्पॉटिटन-एक उपन्यास रोबोटिक सिस्टम- सटीक लौकिक और स्थानिक नियंत्रण के साथ पिकालिएटर आकार के नमूना बूंदों के वितरण को जोड़ती है। समय-हल किए गए स्पॉटिटन वर्कफ़्लो न्यूनतम नमूना मात्रा से प्रारंभिक संरचनात्मक पुनर्व्यवस्थाओं से पूछताछ करने के लिए एक विशिष्ट कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है। स्वतंत्र रूप से नियंत्रित पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसर, दो नमूनों की भूमि से निकाल दिया गया और एक नैनोवायर ईएम ग्रिड पर तेजी से मिश्रण किया क्योंकि यह क्रायोजन की ओर गिरता है। संभावित रूप से सैकड़ों ग्रिड एक नमूने के केवल कुछ माइक्रोलीटर से तेजी से उत्तराधिकार में तैयार किए जा सकते हैं। यहां, स्पॉटिटन सिस्टम के संचालन का एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल ग्रिड तैयारी के दौरान उत्पन्न होने वाली विशिष्ट समस्याओं के निवारण पर ध्यान केंद्रित करने के साथ प्रस्तुत किया गया है।

Introduction

क्रायो-ईएम को पकड़ने और उप-दूसरे टाइमस्केल (समय-हल क्रायो-ईएम) पर प्रोटीन की क्षणिक अनुरूप राज्यों को प्रकट करने की क्षमता कई समूहों द्वारा महसूस की गई है, जिसकी शुरुआत बेरिमन और अनविन1 से हुई है, जिसकी तकनीक क्रायो-ईएमएस ग्रिड2तैयार करने के लिए डबोशेट द्वारा विकसित मानक डुबकी ठंड विधि पर बनाई गई थी। उन्होंने क्रायोजेन कप के ठीक ऊपर एक परमाणु जोड़ा जिसने कंप्रेस्ड नाइट्रोजन गैस का उपयोग एक दूसरे नमूने की एक अच्छी धुंध को एक जल्दी से आगे बढ़नेवाला ईएम ग्रिड पर स्प्रे करने के लिए किया, जिसमें पहला नमूना था जिसे लागू किया गया था और एक पतली जलीय परत पर दाग दिया गया था। हालांकि इस प्रणाली के रूप में 1 एमएस के रूप में कम के रूप में मिश्रण समय प्राप्त कर सकता है, यह अभी भी उपयोगकर्ता द्वारा पहले नमूने के मैनुअल दाग की मांग की-एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कार्य-और दूसरे नमूने की एक अपेक्षाकृत उच्च मात्रा । इसके अलावा, व्यवहार में, यह जानना मुश्किल था कि दोनों नमूनों का मिश्रण कहां हुआ था, मिश्रित नमूने में एक प्रत्ययी मार्कर के रूप में फेरिटिन नैनोकणों के उपयोग की आवश्यकता होती है। हावर्ड व्हाइट और सहकर्मियों के बाद के प्रयासों ने दाग के कंप्यूटर नियंत्रण को शामिल करके और चरण3,4को छिड़ककर इस छिड़काव-मिश्रण दृष्टिकोण के नियंत्रण और प्रजनन क्षमता में सुधार किया । यह पता लगाने के लिए कि नमूने कितनी अच्छीतरह से और कहां मिश्रण करते हैं, एक ही समूह 5 और अन्य6,7,8,9,10 एक मिश्रण-छिड़काव दृष्टिकोण11 में स्थानांतरित हो गए हैं जिसमें दो नमूने या तो सिरिंज पंपों के दबाव में संकीर्ण केशिका ट्यूबों में या नाइट्रोजन गैस द्वारा संचालित माइक्रोफैब्रिकेटेड, माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में मिश्रित हैं । ये प्रीमिक्सिंग सिस्टम न केवल पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करते हैं, बल्कि समय-हल किए गए अध्ययनों के समाधान को बढ़ाने के लिए मिश्रण समय की ठीक ट्यूनिंग को भी सक्षम करते हैं।

स्पॉटिटन सिस्टम में ईएम ग्रिड में नमूना लागू करने के लिए एक वैकल्पिक तरीके के रूप में पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसर की शुरुआत ने नमूना जमाव के सटीक लक्ष्यीकरण और ग्रिड12बनाने के लिए बहुत छोटे नमूना मात्रा की आवश्यकता दोनों को सक्षम किया। बाद में, नैनोवायर ग्रिड और रूट नमूना आवेदन ("ऑन-द-फ्लाई" स्पॉटिंग) के उपयोग ने एक ब्लॉटिंग चरण की आवश्यकता को हटा दिया और13,14बार आवेदन-टू-विट्रीफिकेशन बार कम कर दिया। समय के लिए नए दृष्टिकोण के लिए हल क्रायो-EM यहां वर्णित है, आवश्यक नियंत्रण हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर उंनयन के साथ एक दूसरे मशीन Spotiton प्रणाली में जोड़ा गया था एक चलती नैनोवायर ग्रिड पर एक दूसरे नमूने की डिलीवरी सक्षम करने के लिए लगभग तुरंत पहले15के बयान के बाद । दो ओवरलैपिंग नमूने ग्रिड पर मिश्रण करते हैं क्योंकि वे विट्रिफिकेशन से पहले नैनोवायर द्वारा एक पतली जलीय परत में दुष्ट होते हैं। 90 एमएस के रूप में कम समय के रूप में मिश्रण प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य व्यावहारिक जानकारी प्रदान करना है कि पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसिंग और नैनोवायर ग्रिड का उपयोग करके समय-हल किए गए प्रयोगों का संचालन कैसे किया जाए। इसके अतिरिक्त, चूंकि उपयोग, स्थिरता और थ्रूपुट में आसानी बढ़ाने के लिए हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर को संशोधित किया जा रहा है, इसलिए यह प्रोटोकॉल पहले से सूचित विधि15के अप-टू-डेट विवरण के रूप में भी कार्य करता है।

Protocol

1. स्पॉटिटन मशीन और सॉफ्टवेयर सेट करें

  1. सिस्टम को बांटने के लिए तैयार करें(चित्रा 1)।
    1. नाइट्रोजन आपूर्ति टैंक पर मुख्य वाल्व खोलें। सुनिश्चित करें कि सिस्टम जलाशय degassed, अल्ट्रापुरे पानी से भरा हुआ है। कंप्यूटर चालू करें। मल्टीआउटलेट पावरस्ट्रिप पर स्पॉटिटन सिस्टम चालू करें।
    2. स्पॉटिटन सॉफ्टवेयर(चित्रा 2B)के यूजर इंटरफेस (यूआई) को खोलने के लिए डेस्कटॉप आइकन(चित्रा 2 ए)पर क्लिक करें। टूल्स मेनू में, 3-एक्सिस रोबोट (ग्रिड स्टेज और पिपेट चरण) और घूर्णन डिस्पेंसर हेड असेंबली (थेटा चरण) को आरंभ करने और घर करने के लिए प्रारंभिक चरणों का चयन करें। सुनिश्चित करें कि डिस्पेंसर टिप्स आरंभीकरण और होमिंग से पहले इंगित कर रहे हैं।
    3. मुख्य खिड़की पर, सेफपोजिशन (चित्र 3)पर रोबोट भेजने के लिए सेफपोजिशन पर जाएं पर क्लिक करें।
      नोट: सेफपोजपोजिशन में जाना टक्कर के जोखिम के बिना किसी भी स्थिति में रोबोट के साथ किया जा सकता है।
    4. एस्पिरेट टैब पर, जलाशय से पानी के साथ कई बार डिस्पेंसर सिर फ्लश करने के लिए प्राइम का चयन करें। जब तक पानी की निर्बाध धाराओं को दो सुझावों से उभरते देखा जा सकता है जारी रखें ।
      नोट: यह दोहराया जा सकता है अगर हवा की एक महत्वपूर्ण मात्रा तरल पदार्थ लाइनों में प्रवेश किया जब सुझावों को पिछले बंद पर मेथनॉल के साथ निकाल दिया गया ।
  2. डिस्पेंसर प्रदर्शन का निरीक्षण
    1. निरीक्षण टैब पर, प्रत्येक टिप को परीक्षण-अग्नि जल के लिए निरीक्षण कैमरे में भेजें, और दो डिस्पेंसर(चित्रा S1)से बूंद उत्पादन के पैटर्न से मेल खाते हैं।
      नोट: यदि कोई टिपबुलबुले (चित्रा S2A)या मलबे के कारण आग लगाने में विफल रहता है, तो एस्पिरेट टैब पर एक्सेस किए गए अल्ट्रासोनिक वॉश फ़ंक्शन का उपयोग करके वॉश स्टेशन(चित्रा S2B)पर सुझावों को साफ करें।
    2. लगातार आकार की असतत बूंदों की एक धारा को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक मशीन और नमूने के लिए फायरिंग आयाम (एकात्मक) को समायोजित करें।
    3. नेत्रहीन दो डिस्पेंसर द्वारा समकक्ष बूंद उत्पादन की पुष्टि करें।
      1. टिप 1 फायरिंग का वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए ऊपरी कैमरे की निगरानी में रिकॉर्ड बटन दबाएं। वापस खेलें टिप 1 फायरिंग का वीडियो दाईं ओर की निगरानी में एक ही समय में टिप 2 ऊपरी कैमरा मॉनिटर(चित्रा S1)में निकाल दिया जाता है ।
        नोट: प्रत्येक टिप फायरिंग के वीडियो रिकॉर्ड किए जाते हैं और संग्रहीत किए जाते हैं।
    4. डिस्पेंसर अब एक ग्रिड पर परीक्षण-आग के लिए तैयार हैं ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में माना गया है कि ग्रिड और पिपेट चरणों के सही संरेखण को उनके संबंधित डुबकी पदों पर सत्यापित किया गया है। सही संरेखण की पुष्टि करने में विफलता के परिणामस्वरूप टकराव हो सकता है, जिससे सुझावों या रोबोटों को नुकसान पहुंच सकता है।
  3. एक ग्रिड पर परीक्षण-आग पानी।
    1. सुनिश्चित करें कि रोबोट सेफपोजपोजिशन पर हैं।
    2. आपूर्ति एलन कुंजी का उपयोग कर ग्रिड रोबोट पर माउंट से चिमटी निकालें।
    3. पास के बेंचटॉप पर, ग्रिड ब्लॉक के किनारे पर एक परीक्षण ग्रिड, नैनोवायर साइड अप की स्थिति रखें। ध्यान से ग्रिड के रिम को पकड़ो, चिमटी(चित्रा S3)में सही ढंग से स्थिति, और चिमटी को फिर से माउंट करें।
    4. क्रायो टैब पर, ऊपरी डुबकी पथ कैमरा(ऊपरी कैमरा) के दृश्य के क्षेत्र में सुझावों को स्थानांतरित करने के लिए टिप टू कैमरा पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि लाइव को ऊपरी कैमरा मॉनिटर में चुना गया है, और ऊपरी कैमरा लाइट चालू है (मशीन कैबिनेट(चित्रा 1)के सामने डायल करें।
    5. ग्रिड रोबोट पर चिमटी माउंट। मॉनिटर के भीतर माउस पर क्लिक करके, ऊपरी कैमरा मॉनिटर में दिखाई देते हुए स्थिति टिप 1।
      नोट: केवल टिप 1 दिखाई देगा और क्लिक के स्थान पर जाएगा।
    6. ऊपरी कैमरे के सामने ग्रिड की स्थिति के लिए कैमरा करने के लिए ग्रिड पर क्लिक करें। यदि आवश्यक हो तो पहले की तरह टिप 1 स्थिति को समायोजित करें।
    7. परीक्षण-अग्नि के लिए या तो एक या दोनों डिस्पेंसर का चयन करने के लिए टिप 1, टिप2, या Tip1 और Tip2 चुनें।
      नोट: जब परीक्षण-व्यक्तिगत रूप से सुझाव फायरिंग, ग्रिड पर विभिन्न पार्श्व स्थानों पर ऊपरी कैमरा मॉनिटर में टिप 1 स्थिति के लिए माउस का उपयोग करें । यह एक गैर-ओवरलैपिंग पैटर्न में दो युक्तियों से तरल धारियों को जमा करेगा और उपयोगकर्ता को प्रत्येक टिप की पुष्टि करने की अनुमति देगा।
    8. क्रायो टैब पर, यह सुनिश्चित करें कि विट्रिफ ग्रिड का चयन नहीं किया गया है, क्यू लक्ष्यपर क्लिक करें, फिर डुबकीपर।
      नोट: पिपेट चरण थोड़ा बढ़ जाएगा, ग्रिड चरण के बाद। ग्रिड रोबोट तो फायरिंग डिस्पेंसर और ऊपरी और निचले कैमरों पिछले ग्रिड डालता है, बस डेक के ऊपर आराम करने के लिए आ रहा है । ऊपरी कैमरे से एक छवि कैप्चर यूआई के बाएं हाथ की ओर निचले कैमरे से एक छवि कैप्चर के ऊपर दिखाई देती है।
    9. ऊपरी और निचली छवियों का मूल्यांकन करें: चयनित होने पर क्या प्रत्येक टिप फायर किया? जब एक साथ निकाल दिया, दो युक्तियों से तरल पूरी तरह से ओवरलैप किया, जब व्यक्तिगत रूप से निकाल दिया से एक काफ़ी मोटा धारी बनाने?
      1. यदि या तो टिप आग लगाने में विफल रहा है, तो स्पष्ट गोलीबारी होने तक एक या कई अल्ट्रासोनिक वॉश चक्र करें।
      2. यदि नमूना धारियां पूरी तरह से ओवरलैप नहीं होती हैं, तो एक एलन कुंजी का उपयोग करके डिस्पेंसर में से एक के पार्श्व संरेखण को समायोजित करें ताकि डिस्पेंसर में से एक पर पार्श्व समायोजन पेंच को एक चौथाई मोड़ दिया जा सके, और एक परीक्षण डुबकी का प्रदर्शन किया जा सके। जब तक धारियों पूरी तरह से ओवरलैप न हो जाए तब तक दोहराएं।
        नोट: यदि दोनों युक्तियां सफलतापूर्वक और अपेक्षा के अनुसार चलाई गई हैं, तो सिस्टम नमूना ग्रिड तैयार करने के लिए तैयार है।

2. दो नमूना, मिश्रित ग्रिड तैयार करें

  1. ब्याज के मिश्रण समय को प्राप्त करने के लिए मशीन पैरामीटर XML फ़ाइल में त्वरण, मंदी और वेग मूल्यों को अपडेट करें।
    नोट: टेबल मिश्रण समय के लिए इन मूल्यों सहसंबंधित पहले15की सूचना दी गई है ।
  2. नमूना और ग्रिड तैयार करें।
    नोट: प्रोटोकॉल में इस बिंदु से, पहले ग्रिड तैयार होने से पहले 20-30 मिनट बीत जाएगा, और नमूनों को इस समय अंतराल के दौरान उचित तापमान पर रखा जाना चाहिए।
    1. एक उपयुक्त बफर के साथ वांछित सांद्रता के लिए दो नमूनों (यानी, प्रोटीन और लिगांड या अन्य बातचीत साथी) को पतला करें, आदर्श रूप से, दोनों के लिए समान।
      नोट: स्पॉटिटन ग्रिड को आम तौर पर स्वचालित डुबकी फ्रीजर के लिए उपयोग की जाने वाली प्रोटीन की तुलना में प्रोटीन की 1.5-2 गुना अधिक सांद्रता की आवश्यकता होती है। यह एक डुबकी के दौरान ग्रिड की सतह पर एक पतली जलीय परत में प्रोटीन खर्च करता है, कणों को हवा-पानी इंटरफेस पर ध्यान केंद्रित करने के लिए कम अवसर देने के न्यूनतम समय के कारण हो सकता है।
    2. क्रायोजन बाउल को लिक्विड नाइट्रोजन से भरें।
    3. प्लाज्मा 3-4 नैनोवायर ग्रिड साफ। एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में 5 डब्ल्यू, हाइड्रोजन और ऑक्सीजन, 1.5 मिनट का उपयोग करें।
      नोट: सबसे प्रभावी प्लाज्मा सफाई अवधि और नुस्खा परिवेश के तापमान और आर्द्रता और नैनोवायर ग्रिड के बैच के आधार पर दिन-प्रतिदिन से बदल सकता है। वैकल्पिक गैस मिश्रण या एक चमक छुट्टी भी प्रभावी हो सकता है, लेकिन इस उद्देश्य के लिए परीक्षण नहीं किया गया है। बफर समाधान में पानी और प्रोटीन अक्सर नैनोवायर्स द्वारा विभिन्न गति से दुष्ट होते हैं, इसलिए उस दिन एक डुबकी पर उपयोग किए जाने वाले ग्रिडों की बाती का मूल्यांकन करना सबसे अच्छा अभ्यास है जिसमें वास्तविक नमूना तिरस्कृत किया जाता है।
  3. सिस्टम में आर्द्रता का स्तर निर्धारित करें।
    नोट: ग्रिड को साफ करने और प्लाज्मा दोनों के लिए उपयोग की जाने वाली स्थितियों के अलावा, आर्द्रता एक और प्राथमिक कारक है जो नैनोवायर ग्रिड की बाती गति को प्रभावित करता है। हालांकि एक विशेष सत्र के लिए लक्ष्य प्रतिशत आर्द्रता प्रत्येक दिन और ग्रिड के बैच के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाता है, 90-95% एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है ।
    1. सुनिश्चित करें कि नेबुलाइजर अल्ट्रापुरे पानी से पर्याप्त रूप से भरा हुआ है। नेबुलाइजर में प्लग करें, और वाष्प को नेबुलाइजर कैप पर केंद्रीय बंदरगाह से बाहर निकलें।
    2. मुख्य खिड़की में लाइव आर्द्रता मॉनिटर का निरीक्षण करें, या रिपोर्ट | के तहत परिवेश आर्द्रता ट्रैकर खोलें परिवेश (चित्रा S4)। दो क्षेत्रों में आर्द्रता के स्तर की जांच करें: चैंबर और कफन।
      नोट: चैंबर Spotiton बाड़े के भीतर सभी क्षेत्रों में शामिल हैं । कफन ग्रिड और डिस्पेंसर युक्तियों की "कैमरे पर" स्थितियों को तुरंत शामिल करने वाला क्षेत्र है। काले राल कफन सेट आर्द्रता स्तर को बनाए रखता है जब बाड़े के दरवाजे ग्रिड लोड करने के लिए खोले जाते हैं।
    3. एक बार जब लक्ष्य आर्द्रता मानों तक पहुंच जाता है, तो इन मूल्यों को आर्द्रता टैब से स्वचालित रूप से या मैन्युअल रूप से बनाए रखें। स्वचालित नियंत्रणचुनें, और चुनी गई सीमा सीमा के भीतर सेटपॉइंट बनाए रखने के लिए एक सेटपॉइंट और सीमा चुनें। वैकल्पिक रूप से, मैनुअल नियंत्रणका चयन करें, और दो प्रशंसक नियंत्रण का उपयोग करके आर्द्रता के स्तर को समायोजित करें: चैंबर प्रशंसक और कफन प्रशंसक।
      नोट: चैंबर प्रशंसक पर टर्निंग बाएं बंदरगाह में एक फिल्टर के माध्यम से वाष्प खींचती है और चैंबर में प्रवेश करने से बड़ा पानी की बूंदों को रोकता है, परिवेश आर्द्रता में और अधिक वृद्धि को रोकने । जब तक चैंबर के दरवाजे बंद रहेंगे, आर्द्रता का स्तर वांछित प्रतिशत पर स्थिर हो जाएगा । कफन प्रशंसक पर टर्निंग कफन में सही बंदरगाह के माध्यम से वाष्प खींचती है । यह दोनों कक्ष में वाष्प रिलीज को कम कर देता है और कफन के भीतर आर्द्रता के स्तर को बढ़ाता है।
  4. डिस्पेंसर में नमूना लोड करें।
    1. नमूना कप में प्रत्येक नमूने के 5 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए, कप के भीतरी साइडवॉल पर बहुत ध्यान से मात्रा बांटना, तो नीचे हिला कप के नीचे करने के लिए नमूना मजबूर करने के लिए ।
    2. होल्डिंग ट्रे में नमूना कप लोड, बाईं ओर टिप 1 के लिए नमूना, दाईं ओर टिप 2 के लिए । ट्रे को मशीन में तब तक वापस धकेलें जब तक कि यह सीट न हो जाए।
    3. एस्पिरेट टैब पर, प्रत्येक टिप द्वारा एस्पिरेटेड होने वाले वॉल्यूम के लिए 3 माइक्रोन का चयन करें। सुनिश्चित करें कि नमूना ट्रे को सुरक्षित रूप से बैठाया गया है, फिर एस्पिरेट पर क्लिक करें और देखें कि कैसे पिपेट चरण डिस्पेंसर के सिर को नमूना कप में ले जाता है।
    4. नमूना कप को हटाकर और तरल स्तर में एक बूंद देख कर दोनों नमूनों की सफल आकांक्षा को सत्यापित करें।
    5. निरीक्षण टैब पर, अबाधित वितरण की पुष्टि करने के लिए निरीक्षण कैमरे के लिए प्रत्येक टिप भेजें। प्रत्येक टिप से बूंद गठन मैच के लिए आवश्यक आयाम समायोजित करें (धारा 1.2 देखें)।
      नोट: आयाम की संभावना टिप है कि प्रोटीन नमूना बांटता के लिए वृद्धि की आवश्यकता होगी ।
    6. अब सिस्टम से सैंपल ग्रिड तैयार करने की तैयारी है।
  5. नमूना ग्रिड फ्रीज करें
    1. चिमटी में एक हौसले से प्लाज्मा साफ ग्रिड लोड, लेकिन चिमटी अभी तक माउंट नहीं है । सुनिश्चित करें कि आर्द्रता का स्तर ऊंचा है, ~ 90-95%। एथेन कप भरें।
    2. निरीक्षण कैमरे के सामने दोनों युक्तियों का अंतिम परीक्षण-अग्नि करें, जिसमें कोई बाधा नहीं होने की पुष्टि हो। क्रायो टैब पर, टिप टू कैमरापर क्लिक करें।
    3. एथेन कप भरें। यदि इथेन बर्फ बनाता है, तो अतिरिक्त इथेन गैस के साथ आवश्यकतानुसार पिघल जाता है।
      नोट: चरण 2.5.4 और 2.5.5 अपेक्षाकृत जल्दी पूरा किया जाना चाहिए (<20 एस) को कम करने के लिए (i) कक्ष की उच्च आर्द्रता में नैनोवायर के संतृप्ति और (ii) संभावना है कि टिप फायरिंग प्रोटीन नमूना रोकना होगा ।
    4. ग्रिड चरण पर ग्रिड के साथ चिमटी माउंट। क्रायो टैब पर, ग्रिडपर कैमरे के लिए क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि टिप 1 ऊपरी कैमरा मॉनिटर में सही ढंग से तैनात है (चरण 1.3.4-1.3.5 देखें)।
    5. विट्रिफ ग्रिड, क्यू टारगेटपर क्लिक करें, फिर डुबकी लगाई। ठीक पर क्लिक करें जब ग्रिड रोबोट को एथेन से ग्रिड को तरल नाइट्रोजन में हॉप करने और जलमग्न शेल्फ पर छोड़ने के लिए प्रेरित किया।
      नोट: चिमटी तो वापस चैंबर में वृद्धि । तरल नाइट्रोजन के लिए हॉप के बाद, एक संकेत पूछ रहा है कि ग्रिड चिमटी से गिरा दिया जाता है । यदि यह ड्रॉप नहीं हुआ, तो नोपर क्लिक करें, और चिमटी ग्रिड को अलग करने के लिए कई बार खुल जाएगी और बंद हो जाएगी।
    6. ग्रिड(चित्रा S5)की छवियों की जांच करने के लिए तय है कि यह रखा जाना चाहिए या खारिज कर दिया ।
    7. यदि ग्रिड रखते हैं, तो इसे प्री-कूल्ड ग्रिड बॉक्स में स्थानांतरित करें। वैकल्पिक रूप से, बाद के ग्रिडों को स्पॉट करें और फिर सभी ग्रिडों को एक बार में ग्रिड बॉक्स में स्थानांतरित करें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि प्रत्येक ग्रिड को आराम क्षेत्र में इसकी स्थिति से पहचाना जा सकता है।
    8. ग्रिड को ग्रिड बॉक्स में स्थानांतरित करने के लिए, पूर्व-शांत ठीक-इत्तला दिए गए संदंश, धीरे-धीरे ग्रिड को किनारे से समझें, और इसे ग्रिड बॉक्स स्लॉट में रखें, जो पायदान के पहले स्लॉट के साथ शुरू होता है।
    9. जब सभी ग्रिड लोड हो जाते हैं, तो ग्रिड बॉक्स ढक्कन को ढक्कन उपकरण में संलग्न करें, और तरल नाइट्रोजन में प्रीकूल करें। ग्रिड बॉक्स पर ढक्कन पेंच, और एक ढक्कन उपकरण या एक पूर्वकूल्ड पेचकश के साथ कस।
    10. इमेजिंग या दीर्घकालिक भंडारण के लिए बंद ग्रिड बॉक्स को एक छोटे से देवर में जल्दी से स्थानांतरित करने के लिए बड़े संदंश का उपयोग करें।
  6. डाउनस्ट्रीम ईएम इमेजिंग के लिए ग्रिड उपयुक्तता का मूल्यांकन करें।
    1. ग्रिड के गिर जाने के तुरंत बाद यूआई के बाईं ओर प्रदर्शित होने वाले ऊपरी और निचले डुबकी पथ कैमरों से छवियों का निरीक्षण करें। बाती गति, दोनों सुझावों की सफल गोलीबारी, और दो नमूनों धारियों के ओवरलैप की सीमा का मूल्यांकन करने के लिए इन छवियों का उपयोग करें।
    2. प्रयोग दर्शक का उपयोग करके डुबकी के समय मशीन सेटिंग्स और आर्द्रता माप के साथ ऊपरी और निचले कैमरों से ग्रिड छवियों की समीक्षा करें और तुलना करें: रिपोर्ट | प्रयोग।
    3. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में इमेजिंग के लिए ग्रिड का चयन करें जो अच्छी बाती के सबूत प्रदर्शित करते हैं।

Representative Results

चित्रा 4 आरएनए पॉलीमरेज और एक १०५ बीपी डीएनए ओलिगोमर को मिलाकर एक ही बार-हल किए गए स्पॉटिटन सत्र के दौरान तैयार ग्रिडों की छवियों को दिखाता है, जो विट्रीफिकेशन15से पहले १५० एमएस के लिए प्रमोटर अनुक्रम ले जाते हैं । आंकड़ा में देखा नमूना आवेदन के बाद दो टाइमपॉइंट पर छह ग्रिड के दो उच्च गति कैमरों द्वारा उठाए गए चित्र हैं । ये कैमरे, डुबकी शैली फ्रीजर के बीच अद्वितीय, उपयोगकर्ता को तुरंत यह तय करने की अनुमति देते हैं कि नैनोवायर्स द्वारा बाती की देखी गई सीमा के आधार पर ग्रिड को रखना या त्यागना है या छोड़ना है और संभावना है कि तरल नमूने ईएम इमेजिंग के लिए काफी पतली एक जलीय परत में तैयार किए गए थे। यद्यपि एक एकल ग्रिड एक पूर्ण डेटासेट के लिए पर्याप्त बर्फ प्रदान कर सकता है, एक बार इष्टतम स्थितियों को प्राप्त करने के बाद, कई ग्रिड एक या अधिक खो जाने या दूषित होने की स्थिति में हाथ पर रखने के लिए तैयार हैं। इस सत्र में तैयार छह ग्रिडों में से, छवि कैप्चर उप-तापितीय बाती(चित्रा 4F)के साथ केवल एक दिखाते हैं।

दिखाए गए ग्रिड नमूनों और मशीन को तैयार करने के लिए एक घंटे के बाद 40 मिनट की अवधि में उत्तराधिकार में (चरण 2.5.1 से 2.5.8) तैयार किए गए थे, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है (कदम 1.1.1 से 2.4.6)। छह ग्रिडों में से, दो डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल किया गया था, और बाकी बाद में विश्लेषण के लिए अगर जरूरत के लिए बचाया गया । विट्रीफाइड ग्रिड(चित्रा 5C)पर बर्फ का पैटर्न ऊपरी कैमरा छवि(चित्रा 5B)में देखे गए जमा तरल के पैटर्न से निकटता से मेल खाता है। मिश्रित नमूनों की प्रभावी बाती, निचले कैमरे की छवि(चित्रा 5A)में एक दृश्यमान तरल धारी की कमी से स्पष्ट किया गया है, नैनोवायर-कवर ग्रिड सलाखों के साथ होता है, और नमूना शायद ही कभी उन लोगों के निकट वर्गों में बहता है जिनमें यह उतरा था। बर्फ से भरे वर्गों के भीतर, बर्फ आमतौर पर वर्ग के केंद्र में छेद के भीतर सबसे मोटी होती है और ग्रिड सलाखों(चित्रा 5E)के करीब छेद में पतली हो जाती है। अक्सर ग्रिड बार के तुरंत निकट छेद नैनोवायर्स(चित्रा 5F)की निकटता के कारण खाली होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:समय-हल स्पॉटिटन सिस्टम। 1. ऑपरेटर का वर्कस्टेशन; 2. पर्यावरण चैंबर; 3. नाइट्रोजन की आपूर्ति; 4. एथेन आपूर्ति 5. ऊपरी डुबकी पथ कैमरा 6 के लिए बैकलाइट नियंत्रण। पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसर नियंत्रक; 7. सिरिंज पंप; 8. वैक्यूम पंप; 9. पानी की आपूर्ति और बेकार बोतलों को धोएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:स्पॉटिटन सॉफ्टवेयर यूजर इंटरफेस। (A)डेस्कटॉप आइकन और स्पलैश स्क्रीन । (ख)मुख्य यूआई छह क्षेत्रों से बना है: 1. ऊपरी डुबकी पथ ("ऊपरी") और टिप निरीक्षण कैमरों के लिए प्रदर्शन क्षेत्र; 2. कम डुबकी पथ ("लोअर") कैमरे के लिए प्रदर्शन क्षेत्र; 3. टिप निरीक्षण वीडियो के लिए प्लेबैक क्षेत्र; 4. मल्टीफंक्शन टैब क्षेत्र; 5. लाइव आर्द्रता मॉनिटर; 6. लाइव सिस्टम लॉगफाइल। संक्षिप्त नाम: यूआई = यूजर इंटरफेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:स्पॉटिटन चैंबर का आंतरिक दृश्य (सेफपोजिशन में रोबोट)। 1. ग्रिड रोबोट (लाल); 2. डिस्पेंसर रोबोट (पीला); 3. ऊपरी डुबकी पथ कैमरा (गुलाबी); 4. लोअर डुबकी पथ कैमरा (हल्का नीला); 5. टिप निरीक्षण कैमरा (नारंगी); 6. आर्द्रता कफन (हरा); 7. नमूना ट्रे; 8. नेबुलाइजर असेंबली (गहरा नीला); 9. सिस्टम जलाशय और पानी की लाइनें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एक समय-हल स्पॉटिटन ग्रिड मेकिंग सत्र से प्रतिनिधि सिस्टम कैमरा छवियां। (एक -एफ) ऊपरी (बाएं) और छह ग्रिड के निचले (दाएं) डुबकी पथ कैमरा छवियों जिस पर आरएनए बहुलक और एक प्रमोटर डीएनए अनुक्रम Spotiton का उपयोग कर लागू किया गया । स्केल बार = 500 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5:स्पॉटिटन-तैयार ग्रिड पर बर्फ जमाव का पैटर्न। चित्रा 4एफमें दिखाए गए ग्रिड के(ए) लोअर और(बी)ऊपरी कैमरा छवियों और(C)एटलस के कुछ हिस्से । नमूना जमाव और मिश्रण के परिणामस्वरूप बर्फ के अनुमानित स्थान रंगीन लैवेंडर हैं। पीले तीर के साथ चिह्नित वर्ग के भीतर के क्षेत्रों (ई-जी)में चित्रित कियाजाता है। (ई) में दिखाया गया क्षेत्र पीले रंग में बॉक्स्ड है(डी)। प्रतिनिधि वर्ग(ई),छेद(एफ),और(जी)एक्सपोजर छवियों में दिखाया ग्रिड से एकत्र(ए-डी)। वर्ग और छेद छवियों में बॉक्स्ड क्षेत्र क्रमशः छेद और एक्सपोजर छवियों के अनुरूप हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन(ए-डी),5 माइक्रोन(ई),2 माइक्रोन(एफ),100 एनएम(जी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S1: टिप फायरिंग का निरीक्षण। टिप 2 फायरिंग का लाइव व्यू यूजर इंटरफेस के बाईं ओर ऊपरी कैमरा मॉनिटर में देखा जाता है, जबकि टिप 1 फायरिंग के पहले की गई रिकॉर्डिंग दाईं ओर वीडियो प्लेबैक क्षेत्र में तुलना के लिए एक लूप पर खेलती है । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करें ।

चित्रा S2: डिस्पेंसर युक्तियों की अल्ट्रासोनिक सफाई। (ए)टिप में एक हवा बुलबुला बूंद गठन को बाधित करेगा और टिप फायरिंग को रोकेगा। (ख)अल्ट्रासोनिक क्लीनिंग स्टेशन पर पानी में डूबे टिप्स एक हवा के बुलबुले को हटाने या स्पष्ट सूखे प्रोटीन को हटाने के लिए टिप छिद्र अवरुद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करें ।

चित्रा S3: चिमटी में लोड ग्रिड। (क)ग्रिड ब्लॉक के किनारे पर नैनोवायर साइड रखा गया एक ग्रिड। (ख)एक ग्रिड जो स्वयं को बंद करने वाले चिमटी में सही ढंग से तैनात है। कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करें ।

चित्रा S4: आर्द्रता ट्रैकर। कक्ष में प्रतिशत सापेक्ष आर्द्रता (गहरे नीले) और कफन (हल्का नीला) जैसा कि एक विशिष्ट ग्रिड बनाने वाले सत्र के दौरान दर्ज किया गया है। ग्रिड के समय (हरे वर्ग) ग्राफ पर प्लॉट किए जाते हैं। कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करें ।

चित्रा S5: एक डुबकी के दौरान नैनोवायर ग्रिड पर बाती । प्रतिनिधि ऊपरी(ए, सी, ई)और निचले(बी, डी, एफ)नैनोवायर ग्रिड पर बाती की डुबकी पथ कैमरा छवियां जो बहुत धीमी है(ए, बी),आदर्श(सी, डी),और बहुत तेज(ई, एफ)। एक मामूली मोटा (सफेद एरोहेड) नैनोवायर के साथ ग्रिड बार इंगित करता है जिन्हें नमूने द्वारा संतृप्त किया गया है। इन क्षेत्रों में चौकों में आम तौर पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग के लिए उपयुक्त मोटाई की बर्फ होती है। स्केल बार = 500 माइक्रोन. कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करें।

Discussion

यह प्रोटोकॉल क्रायो-ईएम इमेजिंग के लिए ग्रिड तैयार करने के लिए स्पॉटिटन रोबोटिक सिस्टम के उपयोग को रेखांकित करता है जो दो नमूने ले जाते हैं, आम तौर पर ब्याज का प्रोटीन और एक सक्रिय लिगांड, जिसे 90-500 एमएस के लिए मिलाया गया है। हालांकि कार्यप्रवाह सीधा है, वहां कुछ विचार उपयोगकर्ता को ध्यान में रखना चाहिए एक उत्पादक ग्रिड बनाने सत्र सुनिश्चित करने के लिए कर रहे हैं । सबसे पहले, यह फायरिंग से रोकने के लिए भरा या अवरुद्ध बनने के लिए पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसर युक्तियों में से एक के लिए असामान्य नहीं है। इस तरह की विफलता के परिणामस्वरूप एक तरल धारी होगी, जो ऊपरी या निचले कैमरे से छवि कैप्चर पर देखी जाती है, जो दोनों युक्तियों के बाद देखी गई तुलना में संकरा दिख रहा है। एक रुकावट टिप में एक हवा बुलबुला आवास से परिणाम सकता है, बूंद गठन में खलल न डालें, या प्रोटीन नमूना है कि बाहर सूख गया है और संकीर्ण टिप छिद्र सील से । हालांकि एस्पिरेटेड नमूना इस प्रक्रिया में खो जाता है, दोनों समस्याओं को सुझावों के अल्ट्रासोनिक वॉश और नमूने की फिर से आकांक्षा द्वारा हल किया जा सकता है। बाद में clogging और नमूना अपशिष्ट को रोकने के लिए, यह अच्छी तरह से प्रधानमंत्री (फ्लश) नमूना आकांक्षा से पहले तरल पदार्थ लाइनों के लिए महत्वपूर्ण है और कक्ष और कफन के भीतर एक उच्च और लगातार आर्द्रता के स्तर को बनाए रखने के लिए । इसके अतिरिक्त, एक विशेष रूप से उच्च एकाग्रता के साथ एक प्रोटीन नमूना अच्छी तरह से बनाए रखा आर्द्रता के बावजूद टिप फायरिंग को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि निरीक्षण टैब पर फायरिंग आयाम बढ़ाने आंशिक रूप से उच्च प्रोटीन एकाग्रता के कारण कमजोर गोलीबारी के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं, नमूना कमजोर कम से 1:2 टिप फायरिंग में सुधार होगा और clogging से बचने के ।

दूसरा, लक्षित मिश्रण अवधि के लिए इष्टतम मोटाई की बर्फ उत्पन्न करने के लिए आवश्यक आदर्श बाती गति को प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। आम तौर पर, तेजी से मिश्रण समय तेजी से बाती की आवश्यकता होगी, धीमी मिश्रण समय धीमी बाती की आवश्यकता होती है। आदर्श रूप से दुष्ट ग्रिड के लिए, ऊपरी कैमरे की छवि में एक तरल धारी स्पष्ट रूप से स्पष्ट रूप से समझ में आती है, जबकि निचले कैमरे में, धारी के स्थान में ग्रिड सलाखों का केवल एक बहुत मामूली मोटा दिखाई देता है। धीमी गति से बाती, कम कैमरा छवि पर एक काले धारी द्वारा संकेत दिया, आम तौर पर बर्फ है कि इमेजिंग के लिए बहुत मोटी है छोड़ देता है । या तो छवि पर एक धारी की अनुपस्थिति तेजी से बाती है कि छेद में कोई पानी छोड़ दिया हो सकता है इंगित करताहै (चित्रा S5)। नैनोवायर घनत्व, प्लाज्मा सफाई सेटिंग्स और अवधि जैसे कई कारक, और कक्ष आर्द्रता के जोखिम और सेट स्तर का समय बाती गति को प्रभावित कर सकता है। खराब (धीमी गति से) बाती ग्रिड पर नैनोवायर की विरल कोटिंग का परिणाम हो सकता है। नैनोवायर समाधान16के संपर्क में आने के समय को थोड़ा कमजोर और बढ़ाकर, ग्रिड बार पर नैनोवायर के घनत्व और कवरेज में वृद्धि होगी, जिससे तेजी से बाती की सुविधा मिलेगी। यदि नैनोवायर घनत्व पर्याप्त है, तो प्लाज्मा की सफाई की वाट सेटिंग या अवधि में वृद्धि से भी बाती में सुधार होगा। यहां अनुशंसित सेटिंग्स अपेक्षाकृत कम शक्ति और लंबी अवधि के हैं, लेकिन यदि आवश्यक हो तो बदला जा सकता है।

हालांकि, यदि ग्रिड और प्लाज्मा सफाई सेटिंग्स के दोनों विशिष्ट बैच ने पूर्व सत्र में अच्छी तरह से काम किया है, तो स्लो बाती प्रदर्शन नैनोवायर्स के अत्यधिक जोखिम से कक्ष के भीतर उच्च आर्द्रता तक उत्पन्न हो सकता है, जिससे नमी और कम तरल-होल्डिंग क्षमता के साथ उनकी संतृप्ति हो सकती है। कक्ष आर्द्रता के ग्रिड-संतृप्त प्रभाव को या तो चिमटी बढ़ते और ग्रिड के बीच बीता हुआ समय को कम करके कम किया जा सकता है या डुबकी से पहले सिस्टम आर्द्रता स्तर को कम किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बाद में संबंधित जोखिम लाता है कि प्रोटीन नमूने से भरी हुई टिप रोकना होगा। इस जोखिम को ऑफसेट करने के लिए, कफन में युक्तियों को धारण करें जहां उच्च आर्द्रता स्तर बनाए रखा जाता है, चिमटी को एक नया ग्रिड रखने के लिए समय की स्वीकार्य मात्रा में वृद्धि कर सकता है। अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक कम डुबकी समय (ग्रिड त्वरण और/या अधिकतम वेग में वृद्धि से प्राप्त) वास्तव में ग्रिड की बाती विशेषताओं को बदलने के बिना पतली बर्फ के साथ ग्रिड में परिणाम कर सकते हैं । हालांकि, के रूप में दो नमूनों के मिश्रण समय भी कम हो जाएगा, डुबकी समय एक कारक है कि आम तौर पर धीमी गति से बाती पता बदल जाता है नहीं है । बाती है कि बहुत तेजी से है पता करने के लिए, बर्फ है कि या तो बहुत पतली या ग्रिड छेद में अनुपस्थित है में जिसके परिणामस्वरूप, ऊपर उल्लिखित उपायों के विपरीत लिया जा सकता है ।

स्पॉटिटन कुछ फायदे और नुकसान प्रस्तुत करता है जब सबसेकंड समय-हल अध्ययनों के लिए विकसित अन्य तकनीकों की तुलना में। चूंकि मिश्रित नमूना धारी में प्रत्येक डिस्पेंसर से केवल 2-4 एनएम तरल होता है, इसलिए प्रत्येक नमूने का एक 3 μL aliquot कई ग्रिड तैयार करने के लिए पर्याप्त है- नमूना सीमित होने पर एक महत्वपूर्ण लाभ। इसके अतिरिक्त, एकीकृत कैमरों का उपयोग कर नमूना बयान का अवलोकन, हालांकि स्पॉटिटन17के लिए पूरी तरह से अद्वितीय नहीं है, अन्य मिश्रण उपकरणों की एक विशेषता नहीं है और गिर ग्रिड एक कच्चे तेल के पास के अधीन होने की अनुमति देता है/ सिस्टम का एक प्रमुख नुकसान 90 एमएस का न्यूनतम मिश्रण समय है, जो यांत्रिक घटकों की भौतिक सीमाओं द्वारा प्रतिबंधित है, जो तेजी से जैविक प्रतिक्रियाओं से पूछताछ को पहुंच से बाहर रखता है। तुलना करके, मौजूदा माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम पर नियमित रूप से 10 एमएस से कम समय हासिल किया जाता है। Spotiton आधारित पर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गिरगिट प्रणाली, डिजाइन और निर्माण सुधार ५४ एमएस के लिए ंयूनतम डुबकी समय कम कर दिया है और संभावना है कि एक दूसरे मशीन के अलावा तेजी से मिश्रण समय की अनुमति दे सकता है से Spotiton वर्तमान में पेशकश कर सकते हैं ।

आज तक, स्पॉटिटन का उपयोग करके जल्दी, अल्पकालिक आणविक राज्यों की जांच करने के लिए प्रयोगों की एक श्रृंखला आयोजित की गई है, जिसमें 70 के दशक के राइबोसोम की असेंबली, ट्रांसमेम्ब्रान आयन चैनल में कैल्शियम-ट्रिगर अनुरूप परिवर्तन, और जीटीपी हाइड्रोलिसिस15के जवाब में डायनामिन का संकीर्तन शामिल है। इन परिणामों के प्रकाशन के बाद से, स्पॉटिटन ग्रिड बनाने वाले सत्रों की थ्रूपुट, प्रजनन क्षमता और रिपोर्टिंग को बढ़ाने के लिए सिस्टम में कई बदलाव शामिल किए गए हैं। इनमें अन्य लोगों के अलावा, ड्यूल-जोन, स्वचालित आर्द्रता-निगरानी और नियंत्रण प्रणाली, प्रयोग दर्शक सुविधा, साइड-बाय-साइड टिप निरीक्षण सुविधा, और यूआई में कई मामूली अपग्रेड शामिल हैं। उन्नत प्रणाली बेहतर भविष्य दो नमूना मिश्रण उन पहले रिपोर्ट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तेजी से बाध्यकारी परख जैसे एक छोटे अणु चिकित्सकीय और उसके प्रोटीन लक्ष्य या यहां तक कि एंटीबॉडी-एंटीजन जटिल गठन के बीच के समान प्रयोगों का समर्थन करेंगे । जबकि वर्तमान और भविष्य के समय-दो बातचीत भागीदारों को शामिल प्रयोगों निश्चित रूप से जारी रहेगा, एक तिहाई piezoelectric मशीन और संबद्ध हार्डवेयर के अलावा और संभावित प्रयोगों की सीमा को व्यापक कर सकता है । उदाहरण के लिए, ब्याज के प्रोटीन के बाद डिटर्जेंट का प्रारंभिक जमाव, इसके बाद बातचीत या सक्रिय लिगामेंट डिटर्जेंट के विस्तारित जोखिम के किसी भी संभावित नकारात्मक प्रभाव को हटा सकता है, अक्सर पसंदीदा अभिविन्यास जैसे आम उप-कीटनाशक इमेजिंग परिणामों को रोकने के लिए आवश्यक होता है। पहले से प्रकाशित काम और संभावित भविष्य के अनुप्रयोगों दोनों के प्रकाश में, स्पॉटिटन क्रायो-ईएम समुदाय के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ताकि सबसेकंड समय-हल किए गए अध्ययनों के संचालन को सुविधाजनक बनाया जा सके।

Disclosures

B.C/C.S.P. एसपीटी लैबटेक के साथ एक वाणिज्यिक संबंध है, एक कंपनी है कि एक वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध साधन, गिरगिट, कि Spotiton प्रोटोटाइप पर आधारित है उत्पादन ।

Acknowledgments

हम प्रारंभिक डिजाइन और Spotiton प्रणाली के बाद के विकास के लिए इंजीनियरिंग कला LLC (एरिजोना, संयुक्त राज्य अमेरिका) में पीटर ए क्हान और टेरी Rohde शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम मदद और तकनीकी सहायता के लिए न्यूयॉर्क स्ट्रक्चरल बायोलॉजी सेंटर में सिमंस इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेंटर के कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं। यहां प्रस्तुत किया गया काम न्यूयॉर्क स्ट्रक्चरल बायोलॉजी सेंटर में स्थित नेशनल रिसोर्स फॉर ऑटोमेटेड मॉलिक्यूलर माइक्रोस्कोपी में आयोजित किया गया था, जो एनआईएच (GM103310) और सिमंस फाउंडेशन (SF349247) के अनुदानों द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffer N/A N/A
cryogenic grid storage boxes EMS (Hatfield, PA; USA) N/A
Cu/Rh 300 mesh EM grids EMS (Hatfield, PA; USA) EMS300-Cu-Rh treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018)
ethane gas TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) N/A
Grid-handling forceps EMS (Hatfield, PA; USA) 78320-5B
liquid nitrogen Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) N/A
liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA)
Picosystem Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) N/A water purification system
Protein/other sample N/A N/A
Solarus 950 plasma cleaner Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) N/A

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References

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जीव विज्ञान अंक 168 समय-हल अल्पकालिक आणविक राज्य क्रायो-ईएम विट्रीफिकेशन पीजो डिस्पेंसिंग नैनोवायर ग्रिड रोबोटिक मोशन
एक उपन्यास रोबोटिक सिस्टम, स्पॉटिटन का उपयोग करके समय-हल किए गए अध्ययनों के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक ग्रिड तैयारी
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Budell, W. C., Allegri, L., Dandey,… More

Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton. J. Vis. Exp. (168), e62271, doi:10.3791/62271 (2021).

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