Summary
Protokollen som presenteres her beskriver bruken av Spotiton, et nytt robotsystem, for å levere to prøver av interesse på et selvtransporterende nanotrådnett som blandes i minst 90 ms før vitrifisering i flytende kryogen.
Abstract
Fangsten av kortvarige molekylære tilstander utløst av det tidlige møtet av to eller flere interagerende partikler fortsetter å være en eksperimentell utfordring av stor interesse for feltet kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). Noen få metodologiske strategier er utviklet som støtter disse "tidsavklarte" studiene, hvorav den ene, Spotiton-et nytt robotsystem- kombinerer dispensering av picoliter-størrelse prøvedråper med presis tidsmessig og romlig kontroll. Den tidsavklarte Spotiton-arbeidsflyten gir en unik effektiv tilnærming for å forhøre tidlige strukturelle omorganiseringer fra minimalt utvalgsvolum. Avfyrt fra uavhengig kontrollerte piezoelektriske dispensere, to prøver lander og blander seg raskt på et nanotråd EM-rutenett når det stuper mot kryoogenet. Potensielt kan hundrevis av nett tilberedes i rask rekkefølge fra bare noen få mikroliter av en prøve. Her presenteres en detaljert trinnvis protokoll for driften av Spotiton-systemet med fokus på feilsøking av spesifikke problemer som oppstår under nettforberedelse.
Introduction
Potensialet for kryo-EM til å fange og avsløre forbigående konformasjonstilstander av proteiner på under-andre tidsskala (tidsavklart kryo-EM) har blitt realisert av flere grupper, som begynner med Berriman og Unwin1 hvis teknikk bygget på standard frysingsmetode utviklet av Dubochet for å forberede cryo-EM-rutenett2. De la til en forstøver like over kryoogenkoppen som brukte komprimert nitrogengass til å sprøyte en fin tåke av en annen prøve på et stupt EM-rutenett som inneholdt en første prøve som hadde blitt påført og blottet til et tynt vandig lag. Selv om dette systemet kunne oppnå blandetider så lave som 1 ms, krevde det fortsatt manuell oppblåsthet av den første prøven av brukeren - en teknisk utfordrende oppgave - og et relativt høyt volum av den andre prøven. Videre var det i praksis vanskelig å vite hvor blanding av de to prøvene hadde skjedd, noe som krevde bruk av ferritin nanopartikler som en fiducial markør i den blandede prøven. Etterfølgende innsats fra Howard White og medarbeidere forbedret kontroll og reproduserbarhet av denne sprøyteblandingsmetoden ved å inkorporere datakontroll av oppblåsthets- og sprøytetrinnene3,4. For å adressere hvor godt og hvor prøvene blandes, har samme gruppe5 og andre6,7,8,9,10 flyttet til en blandingssprøytemetode11 der to prøver blandes enten i smale kapillære rør under trykk av sprøytepumper eller i mikrofabricated, mikrofluidic chips drevet av nitrogengass. Disse forblandingssystemene sikrer ikke bare fullstendig blanding, men gjør det også mulig å finjustere blandetidene for å øke oppløsningen av tidsavklarte studier.
Innføringen av piezoelektriske dispensere som en alternativ måte å bruke prøve på EM-rutenett i Spotiton-systemet gjorde det mulig med både presis målretting av prøveavsetning og kravet om et mye mindre prøvevolum for å lage et rutenett12. Senere fjernet bruken av nanotrådgitter og underveis prøveprogram ("on-the-fly" spotting) behovet for et blottingstrinn og redusert applikasjons-til-vitrifisering ganger13,14. For den nye tilnærmingen til tids løst cryo-EM beskrevet her, ble en annen dispenser sammen med de nødvendige kontrollmaskinvare- og programvareoppgraderingene lagt til Spotiton-systemet for å muliggjøre levering av en annen prøve på et bevegelig nanotrådnett nesten umiddelbart etter avsetning av de første15. De to overlappende prøvene blandes på rutenettet da de er onde av nanotrådene i et tynt vandig lag før vitrifisering. Blandetider så lave som 90 ms kan oppnås. Denne protokollen har til hensikt å gi praktisk informasjon om hvordan man utfører tidsavklarte eksperimenter ved hjelp av piezoelektriske dispenserings- og nanotrådnett. I tillegg, etter hvert som maskinvaren og programvaren endres for å forbedre brukervennligheten, konsekvensen og gjennomstrømningen, fungerer denne protokollen også som en oppdatert beskrivelse av den tidligere rapporterte metoden15.
Protocol
1. Sett opp Spotiton-maskinen og programvaren
- Klargjør systemet for dispensering (figur 1).
- Åpne hovedventilen på nitrogentilførselstanken. Sørg for at systemreservoaret er fylt med avgasset, ultrarent vann. Slå på datamaskinen. Slå på Spotiton-systemet på powerstripen med flere utløp.
- Klikk skrivebordsikonet (Figur 2A) for å åpne brukergrensesnittet (UI) for Spotiton-programvaren (Figur 2B). Velg Initialiser faser på Verktøy-menyen for å initialisere og hjem 3-akserobotene (rutenetttrinn og pipettetrinn) og den roterende dispenserhodeenheten (theta-fasen). Pass på at dispenserspissene peker ned før initialisering og homing.
- I hovedvinduet klikker du på Gå til SafePosition for å sende robotene til SafePosition (figur 3).
MERK: Flytting til SafePosition kan gjøres med roboter i en hvilken som helst posisjon uten risiko for kollisjon. - På Aspirate-fanen velger du Prime for å skylle dispenserhodene flere ganger med vann fra reservoaret. Fortsett til uavbrutte strømmer av vann kan sees som kommer fra de to spissene.
MERK: Dette må kanskje gjentas hvis et betydelig luftvolum kom inn i væskeledningene da spissene ble spylt med metanol ved siste avstenging.
- Inspiser dispenserytelsen
- I kategorien Kontroller sender du hvert tips til inspeksjonskameraet for å teste brannvann, og matcher mønsteret for dråpeproduksjon fra de to dispenserne (figur S1).
MERK: Hvis et tips ikke avfyres på grunn av en boble (Figur S2A) eller rusk, rengjør spissene på vaskestasjonen (Figur S2B) ved hjelp av ultralydvaskfunksjonen som er tilgjengelig i kategorien Aspirate . - Juster avfyringsamplituden (enhetsløs) for hver dispenser og prøve for å oppnå en strøm av diskrete dråper av konsistent størrelse.
- Bekreft tilsvarende dråpeproduksjon visuelt av de to dispenserne.
- Trykk på Record-knappen i den øvre kameraskjermen for å spille inn en video av Tip 1-avfyring. Spill av videoen med tupp 1-avfyring på høyre skjerm samtidig som Tips 2 utløses i den øvre kameraskjermen (Figur S1).
MERK: Videoer av hver tupp avfyres og lagres.
- Trykk på Record-knappen i den øvre kameraskjermen for å spille inn en video av Tip 1-avfyring. Spill av videoen med tupp 1-avfyring på høyre skjerm samtidig som Tips 2 utløses i den øvre kameraskjermen (Figur S1).
- Dispensere er nå klare til å teste brann på et rutenett.
MERK: Denne protokollen forutsetter at riktig justering av rutenett- og pipettestadiene ved deres respektive stupeposisjoner er verifisert. Unnlatelse av å bekrefte riktig justering kan føre til kollisjon, skade tipsene eller robotene.
- I kategorien Kontroller sender du hvert tips til inspeksjonskameraet for å teste brannvann, og matcher mønsteret for dråpeproduksjon fra de to dispenserne (figur S1).
- Test-brann vann på et rutenett.
- Sørg for at robotene er på SafePosition.
- Fjern pinsettene fra braketten på rutenettroboten ved hjelp av den medfølgende unbrakonøkkelen.
- På en benkeplate i nærheten plasserer du et testgitter, nanotrådsiden opp, på kanten av rutenettblokken. Ta forsiktig tak i kanten på gitteret, plasser riktig i pinsettene (figur S3), og monter pinsettene på nytt.
- I kategorien Cryo klikker du på Tips til kamera for å flytte tipsene inn i synsfeltet til det øvre dashbordbanekameraet ( øvrekamera). Kontroller at Live er valgt i den øvre kameraskjermen, og at det øvre kameralyset er slått på (slå på foran maskinkabinettet (figur 1).
- Monter pinsettene på rutenettroboten. Posisjonstips 1, synlig i den øvre kameraskjermen, ved å klikke med musen på skjermen.
MERK: Bare tips 1 vil være synlige og flyttes til plasseringen av klikket. - Klikk Rutenett til kamera for å plassere rutenettet foran det øvre kameraet. Juster tips 1 posisjon som før, om nødvendig.
- Velg enten Tips1, Tips2eller Tips1 og Tips2 for å velge én av eller begge dispenserne som skal testes.
MERK: Når du tester spissene individuelt, bruker du musen til å plassere Tips 1 i den øvre kameraskjermen på forskjellige sidesteder på rutenettet. Dette vil deponere væskestriper fra de to spissene i et ikke-overlappende mønster og la brukeren bekrefte at hvert tips har avfyrt. - Kontroller at Vitrify Grid ikke er valgt i kategorien Cryo , klikk Kømål, og klikk deretter På Dykk.
MERK: Pipettetrinnet vil stige litt, etterfulgt av rutenettet. Rutenettroboten stuper deretter rutenettet forbi avfyringsdispenserne og øvre og nedre kameraer, og kommer til å hvile like over dekk. Et bilde fra det øvre kameraet vises over et bilde tatt fra det nedre kameraet til venstre i brukergrensesnittet. - Evaluer de øvre og nedre bildene: Ble hvert tips avfyrt når de ble valgt? Når den ble avfyrt sammen, overlappet væsken fra de to spissene fullt ut, og skapte en merkbart tykkere stripe enn når den ble avfyrt individuelt?
- Hvis begge tipsene ikke klarte å skyte, utfør en eller flere ultralydvasksykluser til klar avfyring er observert.
- Hvis prøvestripene ikke overlapper helt, justerer du sidejusteringen til en av dispenserne ved hjelp av en unbrakonøkkel for å dreie sidejusteringsskruen på en av dispenserne en kvart omdreining, og utfør et testdykk. Gjenta til stripene overlapper fullstendig.
MERK: Hvis begge tipsene avfyres vellykket og som forventet, er systemet klart til å klargjøre prøvegitter.
2. Forbered to-prøve, blandede rutenett
- Oppdater verdiene for akselerasjon, retardasjon og hastighet i XML-filen maskinparametere for å oppnå blandingstiden for interesse.
MERK: Tabeller som korrelerer disse verdiene med blandetider, er tidligere rapportert15. - Klargjør prøven og rutenettene.
MERK: Fra dette punktet i protokollen vil det gå 20-30 min før det første rutenettet er forberedt, og prøver bør holdes ved riktig temperatur i løpet av dette tidsintervallet.- Fortynn to prøver (dvs. protein og ligand eller annen interagerende partner) til de ønskede konsentrasjonene med en passende buffer, ideelt sett det samme for begge.
MERK: Spotiton-gitter krever 1,5-2 ganger høyere konsentrasjoner av protein enn det som vanligvis brukes til automatiske dykkfrysere. Dette kan skyldes minimal tid proteinet tilbringer i et tynt vandig lag på rutenettoverflaten under et dykk, noe som gir partikler mindre mulighet til å konsentrere seg ved luftvannsgrensesnittet. - Fyll kryogenskålen med flytende nitrogen.
- Plasma rene 3-4 nanowire rutenett. Bruk 5 W, hydrogen og oksygen, 1,5 min som utgangspunkt.
MERK: Den mest effektive plasmarengjøringsvarigheten og oppskriften kan endres fra dag til dag basert på omgivelsestemperatur og fuktighet og batchen av nanotrådgitter som brukes. Alternative gassblandinger eller en glødeutladning kan også være effektive, men har ikke blitt testet for dette formålet. Ettersom vann og protein i bufferløsning ofte er ondt ved forskjellige hastigheter av nanotråder, er det best å evaluere fukttransporten av rutenettene som skal brukes den dagen på et stup der selve prøven dispenseres.
- Fortynn to prøver (dvs. protein og ligand eller annen interagerende partner) til de ønskede konsentrasjonene med en passende buffer, ideelt sett det samme for begge.
- Still inn fuktighetsnivået i systemet.
MERK: I tillegg til forholdene som brukes til både å lage og plasmarense gitteret, er fuktighet en annen primærfaktor som påvirker fukttransporterende hastighet på nanotrådgitter. Selv om målprosentens fuktighet for en bestemt økt bestemmes empirisk for hver dag og gruppe rutenett, er 90-95% et godt utgangspunkt.- Sørg for at forstøveren er fylt tilstrekkelig med ultrarent vann. Koble til forstøveren, og følg dampen ut av sentralporten på forstøverhetten.
- Vær oppmerksom på skjermen for levende luftfuktighet i hovedvinduet, eller åpne omgivelsesfuktighetssporeren under Rapporter | Omgivelsestemperatur (figur S4). Kontroller fuktighetsnivået i de to sonene: Kammer og likkled.
MERK: Kammeret inkluderer alle områder i Spotiton-kabinettet. Likkled er området som umiddelbart omfatter "ved kamera" -posisjonene til rutenettet og dispenserspissene. Det svarte harpiksdekselet opprettholder det innstilte fuktighetsnivået når kabinettdørene åpnes for å laste et rutenett. - Når målfuktighetsverdiene er nådd, opprettholder du disse verdiene enten automatisk eller manuelt fra Fuktighet-fanen. Velg Automatisk kontroll, og velg et settpunkt og en terskelverdi for å opprettholde angitt punkt innenfor den valgte terskelgrensen. Du kan også velge Manuell kontrollog justere fuktighetsnivået ved hjelp av de to viftekontrollene: kammervifte og dekselvifte.
MERK: Når du slår på kammerviften, trekkes dampen gjennom et filter i venstre port og forhindrer at større vanndråper kommer inn i kammeret, noe som forhindrer ytterligere økning i omgivelsesfuktigheten. Så lenge kammerdørene forblir lukket, vil fuktighetsnivået stabilisere seg i ønsket prosentandel. Når du slår på dekselviften, trekkes dampen gjennom høyre port inn i dekselet. Dette reduserer både damputløsning i kammeret og øker fuktighetsnivået i dekselet.
- Legg prøven i dispenserne.
- Tilsett 5 μL av hver prøve i prøvekoppene.
MERK: For å unngå å introdusere bobler, dispenser volumet svært forsiktig på koppens indre sidevegg, og rist deretter ned for å tvinge prøven til bunnen av koppen. - Legg prøvekoppene i holderbrettet, prøven for tips 1 til venstre, for tips 2 til høyre. Skyv skuffen tilbake i maskinen til den sitter.
- Velg 3 μL på Aspirate-fanen for at volumet skal aspireres av hvert tips. Forsikre deg om at prøvebrettet sitter sikkert, klikk deretter på Aspirate og følg hvordan pipettetrinnet beveger dispenserhodene inn i prøvekoppene.
- Kontroller vellykket aspirasjon av begge prøvene ved å fjerne prøvekoppene og observere en dråpe i væskenivået.
- I kategorien Kontroller sender du hvert tips til inspeksjonskameraet for å bekrefte uhindret utlevering. Juster amplituden etter behov for å matche dråpeformasjonen fra hver spiss (se pkt. 1.2).
MERK: Amplitude må sannsynligvis økes for spissen som dispenserer proteinprøven. - Systemet er nå klart til å klargjøre et eksempelrutenett.
- Tilsett 5 μL av hver prøve i prøvekoppene.
- Fryse eksempelrutenett
- Last et nykonsendret plasmarengjort rutenett inn i pinsettene, men ikke monter pinsettene ennå. Sørg for at fuktighetsnivået er forhøyet, ~ 90-95%. Fyll etankoppen.
- Utfør en siste test-brann av begge tipsene foran inspeksjonskameraet, og bekrefter ingen hindring. Klikk Tips til kamerai kategorien Cryo .
- Fyll etankopp. Hvis det dannes etanis, smelter det etter behov med ekstra etangass.
MERK: Trinn 2.5.4 og 2.5.5 bør fullføres relativt raskt (<20 s) for å minimere (i) metning av nanotrådene i kammerets høye luftfuktighet og (ii) sannsynligheten for at spissen som avfyrer proteinprøven vil tette. - Monter pinsettene med rutenettet på rutenettet. Klikk Rutenett til kamerai kategorien Cryo . Kontroller at tips 1 er riktig plassert i den øvre kameraskjermen (se trinn 1.3.4-1.3.5).
- Klikk Vitrify Grid, Queue Targetog deretter Plunge. Klikk på OK når du blir bedt om å kommandere rutenettroboten til å hoppe over rutenettet fra etan til flytende nitrogen og slippe det ut på den nedsenkede hyllen.
MERK: Pinsettene stiger deretter tilbake i kammeret. Etter hoppet til flytende nitrogen vises en ledetekst som spør om rutenettet falt fra pinsettene. Hvis den ikke falt, klikker du på Nei, og pinsettene åpnes og lukkes flere ganger for å løsne rutenettet. - Undersøk bilder av rutenettet (Figur S5) for å finne ut om det skal beholdes eller forkastes.
- Hvis du beholder rutenettet, overfører du det til den forhåndskjølte rutenettboksen. Alternativt kan du oppdage etterfølgende rutenett og deretter overføre alle rutenett samtidig til rutenettboksen, og pass på at hvert rutenett kan identifiseres ved sin posisjon i hvileområdet.
- For å overføre rutenettet til en gitterboks, forhåndskjøl finspissede tang, ta forsiktig tak i rutenettet ved kanten og plasser det i et rutenettboksspor, og start med det første sporet til venstre for hakket som går med klokken.
- Når alle gitterene er lastet, fester du lokket på gitterkassen til lokkverktøyet og forkjøler i flytende nitrogen. Skru lokket på gitterboksen, og stram til med et lokkverktøy eller en ferdigkjølt skrutrekker.
- Bruk store tang til raskt å overføre den lukkede rutenettboksen til en liten dewar for avbildning eller langsiktig lagring.
- Evaluer rutenett egnethet for nedstrøms EM-avbildning.
- Vær oppmerksom på bildene fra de øvre og nedre dypbanekameraene som vises på venstre side av brukergrensesnittet umiddelbart etter at et rutenett er stupt. Bruk disse bildene til å evaluere fukttransporterende hastighet, vellykket avfyring av begge tipsene og omfanget av overlapping av de to prøvestripene.
- Se gjennom og sammenlign rutenettbildene fra de øvre og nedre kameraene sammen med maskininnstillingene og fuktighetsmålingene på tidspunktet for utstikket ved hjelp av eksperimentviseren: Rapporter | Eksperimenter.
- Velg gitter for avbildning i elektronmikroskopet som viser tegn på god fukttransport.
Representative Results
Figur 4 viser bilder av gitter som er klargjort under en enkelt tidsavklart Spotiton-økt ved å blande RNA-polymerase og en 105 bp DNA-oligomer som bærer en promotorsekvens i 150 ms før vitrifisering15. Sett i figuren er bilder tatt av de to høyhastighetskameraene på seks rutenett på to tidspunkter etter prøveprogram. Disse kameraene, unike blant frysere i dyp stil, lar brukeren umiddelbart bestemme om de skal beholde eller kaste et rutenett basert på den observerte omfanget av fukting av nanotrådene og sannsynligheten for at væskeprøvene ble trukket inn i et vandig lag tynt nok til EM-avbildning. Selv om et enkelt rutenett kan gi tilstrekkelig is til et komplett datasett, når optimale forhold er oppnådd, er flere rutenett forberedt på å holde seg tilgjengelig i tilfelle en eller flere går tapt eller er forurenset. Av de seks rutenettene som er klargjort i denne økten, viser bildeopptakene bare ett med suboptimal fukttransport (Figur 4F).
Rutenettene som ble vist ble utarbeidet (trinn 2.5.1 til og med 2.5.8) etter hverandre over en periode på 40 minutter etter en time for å klargjøre prøvene og maskinen som beskrevet i protokollen (trinn 1.1.1 til 2.4.6). Av de seks rutenettene ble to brukt til datainnsamling, og resten ble lagret for senere analyse om nødvendig. Ismønsteret på et vitrifisert rutenett (Figur 5C) samsvarer tett med mønsteret av avsatt væske sett i det øvre kamerabildet (Figur 5B). Effektiv fukttransport av de blandede prøvene, tydeliggjort av mangelen på en synlig væskestripe i det nedre kamerabildet (figur 5A), oppstår langs de nanotråddekkede rutenettstengene, og prøver flyter sjelden over i firkanter ved siden av de der den landet. Innenfor isfylte firkanter er isen vanligvis tykkest inne i hullene i midten av torget og blir tynnere i hull nærmere gitterstengene (Figur 5E). Ofte er hull rett ved siden av rutenettstengene tomme på grunn av nærhet til nanotrådene (Figur 5F).
Figur 1: Det tidsavklarte Spotiton-systemet. 1. Operatørens arbeidsstasjon; 2. Miljøkammer; 3. Nitrogenforsyning; 4. Etanforsyning 5. Bakgrunnsbelysningskontroll for øvre stupebanekamera 6. Piezoelektriske dispenserkontrollere; 7. Sprøytepumper; 8. Vakuumpumpe; 9. Vask vanntilførselen og avfallsflaskene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Brukergrensesnitt forSpotiton-programvare. (A) Skrivebordsikon og velkomstbilde. (B) Hovedgrensesnittet består av seks områder: 1. visningsområde for øvre stupebane ("øvre") og tipsinspeksjonskameraer; 2. visningsområde for nedre stupebane ("nedre") kamera; 3. Avspillingsområde for tipsinspeksjonsvideoer; 4. Multifunksjons faneområde; 5. Strømfuktighetsmonitor; 6. Loggfil for levende system. Forkortelse: UI = brukergrensesnitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Innvendig visning av Spotiton-kammeret (roboter i SafePosition). 1. Grid robot (rød); 2. Dispenser robot (gul); 3. Øvre stupebanekamera (rosa); 4. Nedre hoppebanekamera (lyseblå); 5. Tips inspeksjonskamera (oransje); 6. Fuktighetsdeksel (grønt); 7. prøveskuff; 8. Forstøvermontering (mørk blå); 9. Systemreservoar og vannledninger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative systemkamerabilder fra en tidsavklart Spotiton-rutenettøkt. (A -F) Øvre (venstre) og nedre (høyre) stupe bane kamerabilder av seks rutenett som RNA polymerase og en promotor DNA-sekvens ble brukt ved hjelp av Spotiton. Skalalinje = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Mønster av isavsetning på et Spotiton-forberedt rutenett. Deler av (A) nedre og (B) øvre kamerabilder og (C) atlas av rutenettet vist i figur 4F. Omtrentlige steder av is som følge av prøveavsetning og blanding er farget lavendel. Områder i firkanten som er merket med en gul pilspiss, er avbildet i (E-G). Området vist i (E) er innrammet i gult i (D). Representativ firkant (E), hull (F) og (G) eksponeringsbilder samlet inn fra rutenettet vist i (A-D). De innfelte områdene i kvadrat- og hullbildene tilsvarer henholdsvis hull- og eksponeringsbildene. Skalastenger = 100 μm (A-D), 5 μm (E), 2 μm (F), 100 nm (G). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur S1: Inspeksjon av tuppfyring. En live view av Tip 2-avfyring vises i den øvre kameraskjermen til venstre for brukergrensesnittet, mens et opptak gjort tidligere av Tip 1-avfyring spilles av på en løkke for sammenligning i videoavspillingsområdet til høyre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S2: Ultralydrengjøring av dispenserspisser. En luftboble i tipset (A) vil forstyrre dråpeformasjonen og forhindre at spissen avfyres. (B) Tips nedsenket i vann på ultralydrengjøringsstasjonen for å fjerne en luftboble eller klart tørket protein som blokkerer spissåpningen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S3: Laster rutenettet i pinsett. (A) Et rutenett plassert nanowire side opp på kanten av rutenettet blokken. (B) Et rutenett plassert riktig i selvlukkende pinsett. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S4: Fuktighetssporer. Prosentandelen relativ fuktighet i kammeret (mørkeblå) og deksel (lyseblå) som registrert under en typisk grid-making økt. Tidene for rutenettdykk (grønne firkanter) er plottet på grafen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S5: Fukting på nanotrådgitter under et stup. Representative upper (A, C, E) og lower (B, D, F) stuper banekamerabilder av fukttransporterende på nanotrådgitter som er for trege (A, B), ideelle (C, D) og for fort (E, F). En liten fortykning (hvite pilspisser) indikerer rutenettstenger med nanotråder som er mettet av prøve. Firkanter i disse områdene inneholder vanligvis is av passende tykkelse for elektron mikroskopisk avbildning. Skalalinje = 500 μm. Klikk her last ned denne filen.
Discussion
Denne protokollen skisserer bruken av Spotiton robotsystem for å forberede rutenett for kryo-EM-avbildning som bærer to prøver, vanligvis et protein av interesse og en aktiverende ligand, som har blitt blandet i 90-500 ms. Selv om arbeidsflyten er enkel, er det noen få hensyn brukeren må huske på for å sikre en produktiv rutenettøkt. For det første er det ikke uvanlig at en av de piezoelektriske dispenserspissene blir tilstoppet eller blokkert for å forhindre at den avfyres. En slik feil vil resultere i en flytende stripe, sett på bildeopptak fra øvre eller nedre kamera, noe som er synlig smalere enn det som er sett etter at begge tipsene ble avfyrt. En blokkering kan skyldes en luftboble som ligger i spissen, forstyrrer dråpeformasjonen, eller fra proteinprøve som har tørket ut og forseglet den smale spissåpningen. Selv om den aspirerte prøven går tapt i prosessen, kan begge problemene løses ved en ultralydvask av spissene og re-aspirasjon av prøven. For å forhindre etterfølgende tilstopping og prøveavfall, er det avgjørende å klargjøre (skylle) væskelinjene grundig før prøveaspirasjon og opprettholde et høyt og konsistent fuktighetsnivå i kammeret og dekselet. I tillegg kan en proteinprøve med en spesielt høy konsentrasjon påvirke spissfyring til tross for godt vedlikeholdt fuktighet. Selv om økning av avfyringsamplituden på inspeksjonsfanen delvis kan kompensere for svak avfyring på grunn av høy proteinkonsentrasjon, vil fortynning av prøven minst 1:2 forbedre spissavfyring og unngå tilstopping.
For det andre kan det være vanskelig å oppnå den ideelle fukttransporterende hastigheten som trengs for å generere is med optimal tykkelse for den målrettede blandevarigheten. Generelt vil raskere blandetider kreve raskere fukttransporterende, langsommere blandetider krever langsommere fukttransport. For det ideelt onde rutenettet er en flytende stripe tydelig merkbar i det øvre kamerabildet, mens i det nedre kameraet forblir bare en veldig liten fortykning av rutenettstengene i plasseringen av stripen synlig. Langsom fukttransport, indikert med en mørk stripe på det nedre kamerabildet, etterlater vanligvis is som er for tykk for avbildning. Fravær av stripe på et av bildene indikerer rask fukttransport som kanskje ikke har etterlatt vann i hullene (Figur S5). Flere faktorer som nanotrådtetthet, plasmarengjøringsinnstillinger og varighet, og tid for eksponering for og angitt nivå av kammerfuktighet kan påvirke fukttransporterende hastighet. Dårlig (langsom) fukttransport kan være et resultat av et sparsomt belegg av nanotråder på rutenettet. Ved å fortynne og øke eksponeringstiden for nanotrådløsningen16litt, vil tettheten og dekningen av nanotråder på rutenettstengene øke, noe som letter raskere fukttransport. Hvis nanotrådtettheten er tilstrekkelig, vil det også forbedre fukttransporten hvis du øker wattstyrkeinnstillingen eller varigheten av plasmarengjøring. Innstillingene som anbefales her, har relativt lav effekt og lang varighet, men kan endres om nødvendig.
Imidlertid, hvis både den spesifikke batchen av rutenett og plasmarengjøringsinnstillinger har fungert bra i en tidligere økt, kan langsom fuktytelse oppstå ved overdreven eksponering av nanotrådene til høy luftfuktighet i kammeret, noe som fører til metning med fuktighet og redusert væskeholdingskapasitet. Den rutenettmetningseffekten av kammerfuktighet kan reduseres ved enten å minimere den forløpte tiden mellom pinsettmontering og gitter som stuper eller reduserer systemets fuktighetsnivå før et stup. Det skal imidlertid bemerkes at sistnevnte bringer den tilknyttede risikoen for at spissen lastet med proteinprøve vil tette. For å kompensere for denne risikoen, kan det å holde spissene i dekselet der et høyt fuktighetsnivå opprettholdes, øke den tillatte tiden for å montere pinsett som holder et nytt rutenett. Til slutt bør det bemerkes at redusert stupetid (oppnådd ved å øke rutenettakselerasjonen og / eller maksimal hastighet) kan resultere i rutenett med tynnere is uten å endre de fuktende egenskapene til rutenettet. Men ettersom blandingstiden til de to prøvene også vil bli redusert, er ikke dykktid en faktor som vanligvis endres for å håndtere langsom fukttransport. For å adressere fukttransport som er for rask, noe som resulterer i is som enten er for tynn eller fraværende i rutenetthullene, kan det motsatte av tiltakene som er skissert ovenfor, tas.
Spotiton presenterer visse fordeler og ulemper sammenlignet med andre teknikker utviklet for subsecond tidsavklarte studier. Siden den blandede prøvestripen bare inneholder 2-4 nL væske fra hver dispenser, er en enkelt 3 μL aliquot av hver prøve tilstrekkelig til å forberede mange rutenett - en viktig fordel når prøven er begrenset. I tillegg er observasjon av prøveavsetning ved hjelp av integrerte kameraer, men ikke helt unik for Spotiton17, ikke en funksjon av andre mikseenheter og gjør at stupte rutenett kan bli utsatt for en grov bestått / mislykket evaluering, noe som reduserer screeningtiden sterkt. En viktig ulempe ved systemet er en minimum blandingstid på 90 ms, begrenset av de fysiske begrensningene til de mekaniske komponentene, som setter avhør av raskere biologiske reaksjoner utenfor rekkevidde. Til sammenligning oppnås ganger mindre enn 10 ms rutinemessig på eksisterende mikrofluidiske systemer. På det Spotiton-baserte, kommersielt tilgjengelige kameleonsystemet har design- og konstruksjonsforbedringer redusert minimum stupetid til 54 ms og øker muligheten for at tillegg av en annen dispenser kan tillate raskere blandetider enn Spotiton for tiden kan tilby.
Til dags dato har det blitt utført en rekke eksperimenter for å undersøke tidlige, kortvarige molekylære tilstander ved hjelp av Spotiton, inkludert montering av 70S ribosomet, kalsiumutløste konformasjonsendringer i en transmembranionkanal og innsnevring av dynamin som svar på GTP hydrolyse15. Siden publiseringen av disse resultatene har flere endringer blitt innlemmet i systemet for å forbedre gjennomstrømningen, reproduserbarheten og rapporteringen av Spotiton-nettproduksjonsøkter. Disse inkluderer blant annet dual-zone, automatisk fuktighetsovervåking og kontrollsystem, eksperimentviserfunksjonen, side-ved-side tipsinspeksjonsfunksjonen og flere mindre oppgraderinger til brukergrensesnittet. Det oppgraderte systemet vil bedre støtte fremtidige to-prøve blandingseksperimenter som ligner de tidligere rapporterte, samt raske bindende analyser som mellom et lite molekylterapeutisk og proteinmålet eller til og med antistoff-antigenkompleksdannelse. Mens nåværende og fremtidige tidsavklarte eksperimenter som involverer to interagerende partnere sikkert vil fortsette, kan tillegg av en tredje piezoelektrisk dispenser og tilhørende maskinvare ytterligere utvide spekteret av mulige eksperimenter. For eksempel kan innledende avsetning av et vaskemiddel etterfulgt av proteinet av interesse, etterfulgt av den interagerende eller aktiverende liganden fjerne potensiell negativ innvirkning av utvidet eksponering for vaskemiddelet, ofte nødvendig for å forhindre vanlige suboptimale bildebehandlingsresultater som foretrukket orientering. I lys av både det allerede publiserte arbeidet og potensielle fremtidige applikasjoner, representerer Spotiton et viktig verktøy for cryo-EM-samfunnet for å lette gjennomføringen av undersecond tidsavklarte studier.
Disclosures
B.C./C.S.P. har et kommersielt forhold til SPT Labtech, et selskap som produserer et kommersielt tilgjengelig instrument, kameleon, som er basert på Spotiton-prototypen.
Acknowledgments
Vi vil takke Peter A. Kahn og Terry Rohde hos Engineering Arts LLC (Arizona, USA) for første design og påfølgende utvikling av Spotiton-systemet. Vi takker de ansatte ved Simons Electron Microscopy Center ved New York Structural Biology Center for hjelp og teknisk støtte. Arbeidet som presenteres her ble utført ved National Resource for Automated Molecular Microscopy lokalisert ved New York Structural Biology Center, støttet av tilskudd fra NIH (GM103310) og Simons Foundation (SF349247).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
References
- Berriman, J., Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).
- White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, Pt 6 1024-1031 (2019).
- Lu, Z., et al. Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).
- Kaledhonkar, S., et al. Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).
- Fu, Z., et al. The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy. Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).
- Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip. Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New features and applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Dandey, V. P., et al. Time-resolved cryo-EM using Spotiton. Nature Methods. 17, 897-900 (2020).
- Wei, H., et al. Optimizing "self-wicking" nanowire grids. Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).
- Ravelli, R. B. G., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).
