Summary
在这里，我们提出了一种通过延时共聚焦显微镜研究产后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种使用重组腺相关病毒载体（以 Cre依赖性方式表达膜靶向荧光蛋白）对视网膜细胞类型及其精细过程进行稀疏标记和获取的方法。
Abstract
发现树突状乔木的模式需要方法在发育过程中可视化，成像和分析树突。小鼠视网膜是一个强大的模型系统，用于研究神经元形态发生和连接的细胞类型特异性机制。视网膜亚型的组织和组成是明确的，遗传工具可用于在发育过程中访问特定类型。许多视网膜细胞类型也将其树突和/或轴突限制在狭窄的层，这有助于延时成像。小鼠视网膜外植体培养物非常适合使用共聚焦或多光子显微镜进行活细胞成像，但缺乏针对具有时间和结构分辨率的树突动力学成像优化的方法。这里介绍的是一种稀疏地标记和成像由Cre-Lox系统标记的特定视网膜群体发展的方法。这里使用的市售腺相关病毒（AAV）以Cre依赖性方式表达膜靶向荧光蛋白。新生儿小鼠中AAV的眼内递送在注射后4-5天（dpi）产生靶向细胞类型的荧光标记。膜荧光信号可通过共聚焦成像进行检测，并解析精细的分支结构和动力学。从充满含氧人工脑脊液（aCSF）的视网膜平片成像仪获取跨越2-4小时的高质量视频。还提供了用于反卷积和三维（3D）漂移校正的图像后处理管道。该协议可用于捕获完整视网膜中的几种细胞行为，并确定控制神经突起形态的新因素。在视网膜中学到的许多发育策略将与理解中枢神经系统其他地方的神经回路的形成有关。
Introduction
视网膜神经元的树突形成复杂但特定的模式，影响它们在神经回路中的功能。在脊椎动物视网膜中，不同类型的视网膜神经节细胞（RGC）和柏宁细胞中间神经元具有独特的树突形态，其树突形态在心轴大小、位置、分支长度和密度上有所不同1。在产后发育过程中，RGC和amcrine细胞将旺盛的树突突延伸到称为内丛状层（IPL）的神经瞳孔中，在那里它们接收双极细胞输入，发送光感受器信号2。通过对雏鸡或斑马鱼幼虫中荧光标记的视网膜种群进行延时成像捕获，树突形态发生具有高度动态性3，4，5。在几天内，树突状乔木膨胀，重塑并撞击到IPL的狭窄子层，在那里它们与选定的伙伴突触。乔木在发育过程中表现出不同的结构动力学，分支增加，收缩和稳定的相对速率发生变化。Amacrine和RGC枝晶也表现出不同的生长和重塑行为，这可能反映了特定类型的树木化。然而，这些研究追踪了广泛的amcrine或RGC群体，并专注于层流靶向，这只是形态学的一个方面。
产生在视网膜亚型中观察到的巨大形态多样性的机制知之甚少。该小组的目标是开发一种方法来捕获小鼠中定义的视网膜亚型的树突动力学和乔木重塑。识别树突图案化的细胞类型特异性机制需要可视化和测量目标细胞的树突行为的方法。小鼠视网膜的器官型培养非常适合使用共聚焦或多光子显微镜的活细胞成像研究。将发育中的视网膜解剖并安装到平坦的外植体中，该外植体可以在记录室中成像数小时或在几天内培养，对电路的影响有限6，7。活的视网膜神经元可以通过多种技术进行标记，包括通过电极填充染料，电穿孔，涂有亲脂性染料或编码荧光蛋白的质粒（例如，Gene Gun）的颗粒的生物传递，以及遗传编码的细胞标签7，8，9，10.然而，这些方法对于特定视网膜亚型的树突动力学成像效率低下。例如，染料填充方法的通量较低，需要电生理学设备和额外的遗传标记才能可靠地靶向感兴趣的细胞。此外，体细胞中的强荧光信号会遮挡附近的树突。
生物基因递送方法可以同时标记数十个细胞，但涉及高压颗粒递送和孤立视网膜过夜孵育的步骤可能会损害细胞生理学和树突生长。本文提出，根据以下实验标准，可以利用最近的遗传工具来捕获具有细胞类型和结构分辨率的早期树突动力学。首先，为了解决主导发育中的乔木的细枝和丝状体，该方法应该用明亮的荧光蛋白标记神经元，这些蛋白填充了整个心轴中的过程。在成像期间，荧光标记不应因光漂白而褪色。已经生成了多种荧光蛋白变体，并根据亮度和光稳定性比较了其对体内/离体成像的适用性11 。其次，荧光蛋白（XFPs）必须在树突形态发生的最早阶段以足够高的水平表达，以便不会错过狭窄的发育窗口。在对小鼠视网膜静态时间点的分析中，树突发育发生在出生后的第一周，包括生长，重塑和稳定阶段10，12，13，14，15。第三，该方法应导致选择性标记或增加感兴趣的神经元亚群的标记概率。第四，目标亚群的标记必须足够稀疏，以便可以识别和追踪整个神经元乔木。虽然RGC和amacrine亚型可以通过其成熟的形态特征和IPL分层模式来区分16，17，18，19，20，但挑战在于基于未成熟结构在发育过程中识别亚型。通过扩增转基因工具在发育过程中标记特定的视网膜细胞类型，可以促进这项任务。
转基因和敲入小鼠品系，其中荧光蛋白或Cre的细胞和时间表达由基因调节元件决定，被广泛用于研究视网膜细胞类型13，21，22，23。对树突发育亚型特异性模式的关键观察来自静态时间点对转基因小鼠视网膜的研究10，14，24，25。特别是Cre-Lox系统，它可以使用各种重组酶依赖性报告基因，传感器和光遗传学激活剂对亚型进行精细的基因操作和监测。这些工具导致了亚型特异性分子程序和功能特性的发现，这些功能特性是视网膜电路组装的基础26，27，28，29，30。然而，它们尚未被用于研究小鼠视网膜中亚型特异性的树突动力学。通过将Cre小鼠品系与通过电穿孔或重组AAV引入的转基因相结合，可以实现低密度标记。如果可行，也可以使用他莫昔芬诱导的Cre系或交叉遗传策略。最后，应以微创方式标记细胞，并使用采集参数进行成像，以免损害组织或干扰树突形态发生所需的细胞功能。
这里介绍的是一种应用转基因工具和共聚焦显微镜来研究活小鼠视网膜外植体中的树突动力学的方法。Cre转基因小鼠品系已与AAV载体相结合，后者在Cre重组时表达荧光蛋白，这允许对感兴趣的视网膜细胞进行稀疏标记。市售的 AAV 通过玻璃体内注射输送到新生儿视网膜。本文表明，AAV以4 dpi产生显着的高和细胞类型特异性荧光表达，允许访问产后时间点。为了说明这种方法，通过在表达胆碱乙酰转移酶（ChAT）-内部核糖体进入位点（IRES）-Cre转基因的新生小鼠中传递Brainbow AAV来标记胆碱能“星爆”amacrine中间神经元，该基因在产后早期视网膜中活跃31，32。Starburst amacrine细胞发展出一种刻板的放射状乔木形态，由簇状的原钙粘蛋白介导的树突自我回避形成33，34。本文表明，通过添加用于Brainbow AAVs31的经过法呢基化的CAAX基序，XFP显着提高了星爆树突和丝状体的分辨率。最后，已经确定了延时成像和后处理方案，可产生适合树突重建和形态量化的高质量图像。该协议可用于识别控制树突形态发生的因素，并捕获完整视网膜中的几种细胞行为。
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Protocol
注意：该方案跨越2天，实验日之间的病毒转导最短时间为4-5天（图1A）。动物实验是根据加拿大动物护理委员会根据病童医院动物服务实验室动物使用和护理委员会批准的协议进行的，用于研究和实验动物护理。
1. 新生儿AAV注射和成像实验的准备
- 选择Cre小鼠线以标记感兴趣的视网膜细胞群。在AAV注射时，通过与Cre转基因报告基因交叉或通过Cre抗体免疫染色来确认Cre重组酶的表达。
- 繁殖转基因Cre小鼠（8-16周龄）以产生Cre阳性的新生动物。
注意：对于此演示，ChAT-IRES-Cre敲入小鼠用于靶向胆碱能星爆amacrine细胞。 - 获得编码荧光蛋白的重组酶依赖性AAV病毒。为了对精细过程进行最佳标记，请选择表达靶向质膜的修饰XFP的载体。
注意：本研究使用了Brainbow病毒（BBV），AAV-EF1a-BbTagBY和AAV9-EF1a-BbChT（见材料表），它们提供了多色标记的选择（图1B）。法呢基化的增强型黄色荧光蛋白（eYFP）和单体樱桃（mCherry）表达为实时成像产生了最强的荧光信号。单个BBV可用于对单个心轴进行成像，而BBV的共同注射可用于标记具有不同荧光团的更多细胞或相邻心轴。如果使用多种荧光蛋白，请确保最小的发射光谱重叠（图1C）。必须调整显微镜采集参数以捕获不同的XFP信号。 - 在单个低结合管中制备∼3-5μL等分的AAV，用于一次性储备，以避免冻融循环。储存在-80°C。
- 使用微量移液器用非常细的尖端制备硼硅酸盐玻璃微量移液器。
注：拉拔器设置因所使用的灯丝和拉拔器而异。有关最终的尖端尺寸和形状，请参见 图2A 。典型的液滴直径为600μm。 - 获得显微注射系统和相关管道。将微型注射器连接到加压气口。
图1：实验概述。 （A）该协议跨越2天的实验，实验日之间的感染期至少为4-5天。在不超过产后第3天的新生小鼠上进行眼内注射。然后解剖视网膜，平装和实时成像，以捕捉所需的发育窗口。标记的细胞可以在病毒表达所需的4-5天后的任何时间成像，因为延长的AAV表达对树突形态没有明显的影响。（B）将Cre依赖性Brainbow AAV载体（BBV）注射到表达Cre31的动物中。在这项研究中，ChAT-Cre敲入小鼠用于驱动星爆amacrine细胞中的Cre重组。两个BBV编码修饰的eYFP或tagBFP，或mCherry和mTFP，它们以 CAAX 基序终止，该基序依次法呢基化以进行膜定位。Lox遗址用三角形描绘。向量以随机和组合的方式表达法呢基化的XFP，这取决于Cre重组。 EF1α 启动子包括来自伸长因子1α基因的调节元件。W表示来自土拨鼠肝炎病毒转录后调节因子的元素，pA表示多腺苷酸化序列。（C）本研究中成像的bbV荧光团mCherry和eYFP的激发和发射光谱。当对多个荧光蛋白进行实时成像时，必须安排检测参数以将发射光谱充分分离到不同的通道中。缩写： AAV = 腺相关病毒;BBV = Brainbow AAV;ChAT = 胆碱乙酰转移酶;iRES =内部核糖体进入位点;eYFP = 增强型黄色荧光蛋白;iTR = 倒置端子重复;tagBP = 标签蓝色荧光蛋白;m樱桃=单体樱桃;mTFP = 蓝绿色荧光蛋白;XFP = 任何荧光蛋白;EF1α=伸长系数1α。 请点击此处查看此图的放大版本。
2. 新生小鼠体内注射AAV
- 在冰上解冻AAV等分试样。使用无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水制备〜1：4 AAV稀释液。每只动物准备约0.5μLAAV稀释液（每只眼睛约0.25μL），以防微量移液器破裂，并且需要填充新的移液器。将剩余的未稀释的AAV储存在4°C，并在2周内使用。
注意：在本实验中，供应商AAV浓度约为1-2×1013 基因组含量（GC）/mL，并稀释至终浓度为4×1012 GC/mL。优化病毒浓度以获得所需的标记密度。 - 为了可视化注射，每15μLAAV稀释液加入约1μL0.02%快速绿色FCF染料溶液，以使溶液变为蓝色。
- 将装有母亲和新生儿窝的小鼠笼（产后日（P）0.5-3）转移到装有显微注射设备的手术室。将动物放在有巢和垫料的同一笼子里，以尽量减少母体的压力和对幼崽的排斥。
- 用70%乙醇对注射区域进行消毒，并将无菌尿布垫放在工作台表面上。准备一个温暖的平台（例如，加热垫）以从体温过低引起的麻醉中恢复。
- 使用微量注射器用AAV稀释液回填微量移液器。在立体显微镜下，用30 G针头打破微量移液管尖端以解封尖端。
注： 图2A 显示了回填尖端 - 密封（顶部）和未密封（中间）。 - 通过将1-2只动物放在冰上来通过低温麻醉新生小鼠。将动物放在乳胶手套上，以保护皮肤不直接接触冰块。一旦动物不再响应爪子捏动（约2分钟），将动物置于立体显微镜下。如果需要，用纹身墨水和30克针头纹身爪垫，并收集尾部剪以进行DNA分离，以通过基因分型识别动物。
注意：在整个手术过程中必须对麻醉深度进行适当的监测。 - 用70%乙醇擦拭眼睛上方的皮肤。使用30 G针头打开融合的眼睑（图2B）。用手指轻轻按压以睁开眼睛，并在角膜 - 巩膜连接处的角膜上戳一个小孔（图2C）。
- 将玻璃微量移液器插入孔中，然后按压微注射器脚踏板2-4次，将AAV注入玻璃体内空间。慢慢取出微量移液管，并通过通过瞳孔可视化蓝色染料来确认AAV注射（图2D）。
注：喷射压力为6-8 psi，脉冲时间为600-800 ms时，可喷射直径为600 μm的液滴（图2A，底部）。每只眼睛注射约0.23-0.45μLAAV溶液。眼睛外的蓝色溶液表明AAV没有注射到眼睛中。从注射部位泄漏的蓝色溶液表明AAV可能已经泄漏出来，降低了转染效率。 - 轻轻地将眼睑按在一起以重新密封，然后将幼崽放在加热的垫上。一旦动物恢复粉红色并反应灵敏，轻轻地将它们移回笼子。
注意：确保采取适当的预防措施，以避免幼崽过快地重新升温。 - 对窝中剩余的动物重复注射程序。在视网膜成像之前，至少等待4-5天的病毒转导。
图2：新生儿眼内注射（A）后充微量移液管显示移液器吸头密封时（顶部）和吸头解封后（底部，左侧）的形状。6-8 psi 的 Pico 注射压力和 600-800 ms 的脉冲时间会产生直径为 600 μm 的液滴（右下）。比例尺 = 1 mm.（B） 在 16 倍放大镜下麻醉的 P0 幼崽。融合的眼睑接头（白色）使用锋利的30 G针切开。（C）施加在眼睛上的轻压使角膜暴露;比例尺 = 2 毫米。缩放部分（红色）显示角膜 - 巩膜交界处的小孔（黄色），用30 G针头创建;比例尺 = 0.5 mm. （D） 注射后移液器吸头的抽出（左）。与注射前的光瞳孔颜色（右）相比，AAV溶液中的快速绿色染料通过瞳孔（中间）显示为蓝灰色。（E）4天后，眼睑愈合并融合闭合（左）;比例尺 = 2 毫米。去核后，愈合的注射部位可见（黄色）;比例尺 = 1 毫米。注意注射部位在角膜和巩膜之间边界的位置。请点击此处查看此图的放大版本。
3. 用于影像学实验的视网膜夹层
- 制备视网膜 aCSF （119 mM NaCl， 2.5 mM KCl， 1.3 mM MgCl2·6H2O， 2.5 mM CaCl2·2H2O， 1 mM NaH2PO4， 11 mM 葡萄糖和 20 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸 （HEPES 游离酸）35.如果需要，准备并冷冻10x溶液;解冻并根据需要稀释至1倍。
- 通过用碳水化合物（95%O2，5%CO 2）冒泡至少15分钟来氧化视网膜aCSF。将pH值调节至7.4。保存在密封的容器中，直到使用，以确保aCSF保持含氧。
注意：视网膜需要高浓度的O2。在整个实验过程中保持aCSF的含氧性很重要。 - 将直径为60毫米的培养皿嵌入冰盘中（用实验室塑料制作冰盘，例如移液器盒盖），并将其置于立体显微镜下。用含氧视网膜aCSF填充培养皿。
- 通过斩首对小鼠P9及更年轻的小鼠实施安乐死。通过异氟醚诱导或根据动物方案批准的替代方法对P10及以上的小鼠实施安乐死，然后进行斩首。
- 如果眼睑被密封，请切开眼睑瓣以暴露眼睛。使用镊子对眼睛进行去核，并从步骤3.3将其转移到冷视网膜aCSF中。
- 要解剖视网膜杯，在立体显微镜（放大倍数25倍）下，使用Dumont #5镊子紧握视神经来稳定眼睛（图3A）。
- 用30 G针头在角膜中心戳一个洞，然后将微剪刀的一个尖端插入孔中，从孔到角膜末端做一个切口。重复此步骤，在基本方向上做4个切片，形成4个“襟翼”（图3A）。
- 用两个Dumont #5镊子，抓住并拉开两个相邻的皮瓣，轻轻地将巩膜从视网膜上剥离。对剩余的角膜瓣重复上述步骤，并从视网膜上取出巩膜（图3B）。
- 使用镊子从视网膜杯中取出晶状体。用微剪刀，从视网膜边缘向视神经做4个桡向切口，形成4个相等的花瓣（图3B）。对第二只眼睛重复步骤3.4-3.7。
4. 视网膜平装制备
- 准备灰色混合纤维素酯（MCE）膜过滤盘进行安装。如果使用大直径MCE膜过滤器，请将圆盘切成象限（直径约1厘米）。将 MCE 光盘放在较大的白色滤纸的中心（图 3D）。
注意：MCE 过滤器也提供直径为 1 cm 的圆盘。MCE滤光片必须足够大，可以容纳1-2个视网膜，但又要足够小，可以放入成像室。由于 MCE 膜具有静电荷，因此可最大限度地减少 MCE 膜的接触和处理。 - 使用两个尺寸的3/0画笔处理视网膜，将一个视网膜杯翻转到画笔上，视网膜神经节细胞面朝下。轻轻地将视网膜从aCSF中抬起，确保水张力不会撕裂视网膜（图3C）。
- 在仍然用视网膜握住画笔的同时，使用转移移液管将一滴aCSF放在MCE滤纸的中心（图3C，右）。将视网膜漂浮到由表面张力产生的aCSF液滴中。使用画笔将视网膜RGC的一面朝上放置在液滴内，并展开四片花瓣。
- 定位后，在画笔和白色滤纸之间形成一个水桥，以打破液滴的表面张力。
注意：当aCSF消失时，视网膜将粘附在MCE滤纸上（图3D，E）。平安装的视网膜可以通过用镊子抓住MCE椎间盘来处理。如果aCSF液滴在形成水桥之前迅速渗出，这可能表明MCE膜未带电。使用新鲜的MCE膜，并在将视网膜移入成像室之前立即解剖和平贴视网膜，从而最大限度地减少去核和成像之间的时间。
图 3：视网膜夹层和平面安装到混合纤维素酯过滤膜上。 （A） 左，通过用 Dumont #5 镊子抓住视神经（左）稳定去核的眼睛。使用30 G针头（中心）在角膜中心形成一个小孔。使用显微解剖剪刀将角膜切成4个相等的皮瓣（右）。比例尺 = 1 mm. （B） 解剖视网膜，使用两个 Dumont #5 镊子（左）剥离巩膜，取出晶状体（中）。视网膜有4个相等的切口，切入视网膜的一半（右）。比例尺 = 1 毫米。（C） 用两支精细画笔处理视网膜（尺寸 3/0，左）。视网膜将视网膜神经节细胞侧向下翻转到画笔（中心）上，然后从aCSF中取出，确保水张力不会撕裂视网膜（右）。比例尺 = 2 mm. （D） 灰色 MCE 膜盘放置在白色滤纸上（左）。MCE光盘上的aCSF液滴（右）。（E）将视网膜漂浮到液滴中并放置它们后，用白色滤纸形成一个水桥以吸湿aCSF，将视网膜拉到带电的MCE纸上（左）;比例尺 = 1 厘米。MCE膜的缩放图像（红色）显示2个视网膜与视网膜神经节细胞一起朝上（右）;比例尺 = 2 毫米。一个视网膜以白色勾勒。缩写： MCE = 混合纤维素酯;aCSF = 人工脑脊液。 请点击此处查看此图的放大版本。
5. 全坐式视网膜活体制剂的延时共聚焦成像
- 组装实时成像孵育室，用于直立共聚焦显微镜，如图 4所示。
注：对于倒置共聚焦系统，将平安装座直接将RGC面朝下放置在孵育室的玻璃底盖玻片上。一旦视网膜与盖玻片接触，它们就无法移动。 - 用含氧的aCSF填充腔室，然后打开泵和温度控制器（温度32-34°C，流量1 mL / min）。不要让温度上升到34°C以上。
- 要将视网膜平装件转移到灌注室，请停止泵，并取出腔室中的aCSF。将带有视网膜平安装座的MCE盘放入（空）孵育室。
- 将样品砝码放在平板上;预润湿砝码以打破表面张力。用加热的aCSF重新填充腔室，并以~1mL / min循环aCSF。
- 将物镜转换器与25倍浸水物镜（数值孔径0.95）定位到成像室中。使用落射荧光筛选感兴趣的标记细胞（图4C）。
- 调整成像体积以捕获感兴趣的树突状特征。
注：本研究以每帧1024 x 1024像素，z步进1μm和每个z-stack之间的帧速率2分钟捕获了完整的树突轴。最终图像尺寸约为 100 μm x 100 μm x 20 μm。 - 要将激光功率调整到最佳设置，请使用可识别过饱和不足像素的查找表。扫描时，调整激光功率，使没有像素过度饱和（即，强度为255或更高）。根据需要继续成像，或直到荧光信号显着且可检测到的下降和噪声的增加（通常为2-4小时）。
注：建议降低激光功率，因为当像素分布在整个动态范围内时，反卷积算法的工作效果最佳。像素强度不应超过254;对神经突起的实证分析表明，低于170的像素值是解卷积的理想选择。具有线平均（2-3）的快速扫描速度（400-600 Hz）比相同总像素停留时间的单次较慢扫描更可取。长时间成像的区域经常出现光漂白，但其他外植体切片仍然可行。可以对平装中的多个区域进行成像，每个区域成像2-4小时，总孵育时间为6小时。超过 6 小时的影像学检查尚未得到系统测试。神经突起降解和起泡是外植体活力下降的迹象。 - 成像后，用4%多聚甲醛的冷固定视网膜平片和膜过滤器，在4°C下1-2小时。 通过免疫组织化学扩增固定视网膜中的荧光标记以进行进一步分析。
注意：使用倒置共聚焦时，无法进行成像后固定。视网膜在不破坏组织的情况下是不可移动的。
图 4：活细胞成像孵育室设置。 （A） 显示加热、溶液和成像组件的活体成像孵育装置。双加热器包括一个加热的培养箱平台（带有蓝色连接器电极的后圈）和一个在线溶液加热器。（二） 4A的示意图。将MCE膜（灰色）上的视网膜平装（红色）置于孵育室中。在线溶液加热器连接到溶液泵（ 4A中未示出）。成像室尺寸为浸渍物镜鼻提供了良好的工作区域。（C）25x观察视网膜外植体，注入0.23-0.45μL的4×1012 GC / mL的AAV稀释液;比例尺 = 100 μm。细胞的密集标记通常围绕视神经头（虚线，右下角）;比例尺 = 50 μm。缩写： MCE = 混合纤维素酯;GC = 基因组拷贝;m樱桃=单体樱桃;eYFP = 增强型黄色荧光蛋白。 请点击此处查看此图的放大版本。
6. ImageJ中的图像反卷积和后处理
- 导入图像系列，按时间拆分序列，如果是多色图像，则为彩色图像着色。确保一种颜色的所有时间点都包含在同一文件夹中。
注意：如果使用ImageJ，则导入生物格式（生物格式自动包含在斐济中）。 - 使用 ImageJ 插件 衍射 PSF 3D 创建理论点扩散函数 （PSF）。
注意：每个成像通道都需要自己的PSF，因为荧光蛋白发射波长会影响PSF。 - 使用插件|宏|运行以使用提供的宏对所有时间点执行批处理并行迭代反卷积（补充文件 1）。
注意：此宏运行 25 次迭代的 Wiener Filter 预处理 Landweber （WPL） 迭代算法。每个颜色通道必须单独解除卷积。 - 合并颜色通道，并将所有时间点编译为超堆栈（图像|超栈|堆栈到超堆栈）。使用插件|纠正 3D 漂移 注册|校正 3D 漂移。
- 将图像返回到常规堆栈（图像|超栈|超堆叠到堆栈），并拆分时间点（图像|堆栈|工具|堆栈拆分器）。使用批处理为所有时间点创建最大投影（处理|批次|宏| run（“Z Project...”， “projection=[Max Intensity]”）; ）.
- 导入延时图像序列（文件|导入|图像序列）。使用传统的 ImageJ 工具对解卷积和后处理的二维 （2D） 视频进行所需的分析。
注意：四维（3D + 时间）反卷积和漂移校正视频可以被视为超堆栈。省略上一步以保持 3D 时间点。
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Representative Results
使用上述协议，采集了星爆细胞枝晶发育的高分辨率3D视频，对其进行了解卷积，并针对3D漂移进行了校正。生成Z平面最大投影以制作用于分析的2D视频（补充视频1， 图5A）。每个时间点的3D反卷积提高了细丝状突起的分辨率（图5B，C）。细丝状突起是视网膜树突发育的特征36 ，在影像学检查过程中应可见。AAV转染将产生细胞标记密度和荧光强度的变异性。因此，筛选标记的组织以选择具有高荧光信号的细胞进行成像并产生高质量的视频。不建议增加激光功率以检测模糊标记的细胞，因为它会导致快速光漂白，并与信号相比引入高噪声。在5 dpi内可以看到足够明亮的细胞。到12 dpi及以上，延长的AAV感染期不一定导致标记细胞的荧光增加（图5D）。
密集细胞标记产生的过多荧光和神经突起会影响图像质量，并可能阻碍单细胞重建。需要优化AAV稀释度和体积，以达到与目标细胞群其余部分分离的分离和荧光标记的心轴的所需程度。在这里，每只眼睛注射9.2×108-1.8×109个病毒GC以靶向星爆amacrin细胞（0.23-0.45μLAAV，4×1012 GC / mL滴度）。没有荧光信号可能反映了低效的注射技术。注射时，从注射部位泄漏蓝色AAV溶液表明病毒未传递到视网膜，或者注射量或压力过高。过量的注射量或压力可导致视网膜脱离和/或眼压下降，损害视网膜细胞并降低细胞标记效率。这两个问题都可以通过练习和优化注射技术来解决。缺乏信号的其他潜在原因包括由于储存不当或Cre表达不足而导致AAV降解，因为Cre转基因在AAV转染期间不活跃。
一旦视频被反卷积，就可以执行动态分析，例如计算分支添加，收缩或稳定的速率。此外，可以在每个时间帧上执行传统的静态分析，包括神经元重建和形态量化，例如总分支长度，分支角度，分支顺序或末端分支点的数量。该协议的结果是高分辨率3D图像堆栈的时间序列。大多数3D神经仪动态视频都是使用开源图像可视化软件（如ImageJ37）手动量化为最大投影。另一个开源工具Vaa3D38是专门为大体积的可视化而开发的。如果要以 3D 形式分析视频，建议使用 3D + 时间可视化工具（如 Vaa3D）。ImageJ和Vaa3D允许直接访问图像中的像素或体素，但神经元重建通常是通过将像素数据转换为骨架化的树重建来创建的。单个时间点的自动或半自动神经元重建可以使用开源39，40，41 和专有软件执行。要分析延时重建，重建上的每个点都必须与前一个和后续时间点相关联。随着时间的推移，对齐复杂的树突形态（可由500多个数据点编码）仍然是一个具有挑战性的问题。有许多工具可用，具有不同的优势和局限性，必须选择它们以适应研究所需的分析。
图5：新生儿眼内注射、延时成像和反卷积后的代表性结果 （A）AAV注射后5天P6星爆amacrine细胞解卷曲延时成像系列（h：min）的最大预测。精细的丝状体动力学现在可以使用传统的ImageJ工具进行分析。树突细化区域（红色框）和树突生长区域（绿色框）突出显示。（二、三）在AAV注射（dpi）后5天用膜标记的eYFP标记的单个P6星爆amacrine细胞显示出明亮的单细胞标记。上面板比例尺 = 50 μm;下面板的标尺 = 25 μm。在 （A） 之前和之后 （B） 与 ImageJ 进行反卷积。插图（红色）显示由于成功反卷积而产生的去模糊。（D）P6星爆细胞5dpi（左）与P12星爆细胞11 dpi相比显示出相似的荧光蛋白表达水平。增加AAV孵育时间不会增加荧光信号。荧光信号不会随着AAV感染期的延长而下降。相同的采集和后处理参数应用于两幅图像。在P12处观察到的分支厚度增加和静脉曲张是成熟星爆细胞的正常特征，而不是标记或成像伪影。比例尺 = 10 μm。缩写： AAV = 腺相关病毒;eYFP = 增强型黄色荧光蛋白;dpi = 感染后天数。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：Cre品系选择和荧光蛋白定位的注意事项。
（A-D）在9 dpi下将BBV注射到Vglut2-iRES-Cre敲入小鼠中成像的活P11视网膜神经节细胞，其中Cre在RGC人群中选择性表达。（A） JAM-B RGC通过其特征性不对称形态识别24.（B-D）独特的RGC亚型，其树突分层模式不同。（E）活的P11星爆amacrine细胞的图像，用细胞质mCherry生物学转染，并用旋转盘共聚焦以512 x 512像素捕获。细胞质XFP导致体细胞中相对于细小树突突的高荧光信号。在对小的近端投影进行成像时，来自体细胞的失焦光会导致高背景荧光（上方红色框的插图如下所示）。（F）用膜靶向eYFP转染的活P11星爆amacrine细胞的图像，并通过共聚焦激光扫描以1024 x 1024像素捕获。注意体细胞周围的荧光膜环，改善的信噪比，以及膜靶向荧光蛋白（插图）产生的体细胞近端的精细突起的质量。比例尺 = 50 μm，对于E和F的下面板 = 5 μm。缩写：IRES =内部核糖体进入位点;BBV = 脑弓腺相关病毒;Vglut2 = 囊泡谷氨酸转运蛋白2;XFP = 任何荧光蛋白;eYFP = 增强型黄色荧光蛋白;m樱桃=单体樱桃;RGC = 视网膜神经节细胞;JAM-B = 连接粘附分子 B。请单击此处查看此图的放大版本。
补充视频1：注射后5天P6发展星爆岩树突的延时视频。 视频时间步长为2分钟。使用ImageJ应用反卷积和3D漂移校正。顶部的黄色框突出显示了生长区域，下部框勾勒出瞬态丝状体生长，自接触和缩回的区域。 请点击此处下载此视频。
补充文件 1： ImageJ 宏，用于批 处理并行迭代反卷积。该宏运行 Wiener Filter 预处理 Landweber （WPL） 迭代算法的 25 次迭代。请点击此处下载此文件。
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Discussion
该视频演示了一个实验管道，该管道利用现有的遗传工具，通过共聚焦实时成像对发育中的视网膜神经元的树突动力学进行成像。还证明了将编码膜靶向荧光蛋白的Cre依赖性AAVs的眼内注射到新生小鼠中。遗传靶向群体的单细胞早在4-5 dpi时就被明确标记。为标准成像室准备视网膜平片支架以执行活细胞共聚焦成像。这种方法可以生成单个细胞及其精细投影的高分辨率延时视频。使用开源软件（包括ImageJ，Vaa3D和ShuTu）提供的反卷积和后处理算法以及Imaris和MBF Bioscience提供的许可软件对小投影进行解析和量化。由于该管道是模块化的，因此可以更改每个方案部分以适应研究目标。下面讨论这些模块化元素，包括：1）Cre-line选择，2）荧光蛋白和病毒构建体的选择，3）基因递送方法，以及4）成像方法。
该技术使用Cre转基因系进行视网膜细胞亚群的遗传访问。Cre必须在产后活跃，并在注射时在整个细胞群中表达，以增加病毒感染和细胞标记的可能性。在本报告中，ChAT-Cre用于靶向星爆amacrine细胞，Vglut2-Cre系用于靶向发育中的RGCs42，43（图6）。Cre依赖性AAV注射到标记了各种RGC的Vglut2-IRES-Cre敲入小鼠中，包括连接粘附分子B细胞（图6A）和双分层RGC（图6B，C）。或者，具有驱动细胞类型特异性表达的合成启动子的AAV的新设计可以消除对Cre转基因系的需求44。适用于实时成像的高效明亮标记的另一个考虑因素是转染和表达所需的最短时间，这可能因AAV血清型，趋向性和滴度而异45。在这些研究中，由于AAV介导的标记需要至少4-5 dpi的XFP表达，因此这种方法不适合访问产后早期时间点。为了捕获早期时间点（例如，P0-P4），可以在胚胎动物的子宫内进行眼内注射，就像在子宫内电穿孔46一样。在该小组对星爆树突发育的研究中，利用ChAT-Cre的初始稀疏重组模式，使用小鼠转基因Cre报告者Rosa-mTmG27在P0-P4处标记单个星爆amacrine细胞。最后，该AAV视网膜注射方案可用于标记成体细胞群，基于对注射后3个月荧光标记持久性的确认，不会对星爆细胞形态产生有害影响34。
该管道还允许病毒构建体选择的灵活性。为了捕获树突动力学，可以使用各种荧光报告蛋白，包括局限于特定亚细胞结构的蛋白质，感兴趣的蛋白质，或报告功能变化的蛋白质，例如肌动蛋白动力学（例如，LifeAct）和钙信号（例如，GCaMP）。可以使用任何市售或克隆的AAV矢量，并且应参考 fpbase.org 等在线工具以提高亮度和光稳定性。在这里，使用H-Ras法呢基 化CAAX 基序编码荧光蛋白的Brainbow病毒载体用于膜定位。在方案开发的早期，发现XPF的胞质定位对于研究细小的神经突形态并不理想，具有来自体细胞的信号过度饱和细枝的不良标记（图6E）。通过比较，膜靶向荧光蛋白被证明可以标记和解决细小的树突突（图6E，F）。另一个考虑因素是病毒构建体的大小，设计和复杂性，这可能会影响表达时间。例如，生成了AAV-CAG-FLEx-mClover3-CAAX，它以Cre相关方式表达一个XFP。此构造具有更简单的设计，并导致 4 dpi 的有效表达。总之，Cre品系，AAV设计和荧光蛋白报告基因的多样化选择可以从存储库（例如JAX，Addgene和Viral Vector Cores）获得，使该管道适用于视网膜中细胞类型和发育现象的各种研究。
虽然该协议详细介绍了眼内AAV注射，但其他基因递送方法可用，例如质粒电穿孔46 和生物基因递送（例如，基因枪）7。电穿孔需要应用电脉冲，而生物基因递送需要视网膜外植体的离体孵育。AAV标记比这两种方法的侵入性更小，并且允许在成像之前对视网膜外植体进行急性准备。与生物基因递送（图6E，F）相比，AAV注射导致组织活力增强，更适合跟踪神经突起动力学所需的连续采集。通过适当的技术，AAV标记对视网膜几乎没有损伤，这是根据解剖时组织的健康状况判断的。玻璃体内注射主要感染神经节细胞层和内核层内的细胞，如RGC和柏油酸细胞。通常标记数十个星爆amacrine细胞，视神经头周围标记细胞的密度增加（图4C）。然而，对于所有三种转染方法，视神经切断术是不可避免的，无法获得视网膜外植体，并会导致RGC变性。尽管视神经切断，但研究报告了来自各种脊椎动物模型的可行视网膜外植体，在剪除后36小时和长达6天5，6，7，47，48。
最后，共聚焦显微镜在捕获枝晶动力学方面的实用性已经得到证实。通常，成像过程跨越2-4小时，并在观察到组织降解或神经突起之前结束。进行了长达6小时的成像会议;但是，上限尚未经过系统测试。由于长时间成像，区域可能会经历光漂白，但外植体中其他视场中的细胞仍然可用于实时成像。这种方法也可以扩展到多光子或光片显微镜，以成像更深层和更大体积的神经元形态。多光子成像已被用于研究小鼠视网膜中的神经突动力学，并且更适合研究更深视网膜层中的细胞（例如，水平或光感受器细胞）49。最近，活细胞光片显微镜用于捕获视网膜血管生成50，为整个视网膜形态发生的实时成像提供了新的途径。活细胞光片显微镜可用于研究更大规模神经回路组装，例如轴突 - 树突靶向。多色实时成像是该管道的另一种应用，可用于研究细胞 - 细胞相互作用，例如相邻细胞对树突发育的影响或其他发育现象，例如视网膜细胞的平铺，包括RGC亚型1，小胶质细胞和星形胶质细胞。
总之，发展研究的一个具有挑战性的方面是在这些关键时间点获得访问权限。该协议提供了一种可视化在特定时间窗口期间发生的形态发生的方法。该管道结合了现有的工具和技术，以遗传靶向细胞群和表达膜靶向荧光蛋白。急性视网膜平贴制剂可在数小时内保持活细胞共聚焦成像的活力和荧光信号。树突开发的瞬态和动态方面在3D视频中捕获，并使用开源软件进行后处理。捕获高分辨率3D视频的能力对于研究动态开发过程至关重要。
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Disclosures
作者没有任何内容可披露。
Acknowledgments
我们感谢麦迪逊·格雷（Madison Gray）在我没有帮助的时候帮了我一把。这项研究得到了NSERC发现补助金（RGPIN-2016-06128），斯隆神经科学奖学金和加拿大研究主席Tier 2（J.L.L）的支持。S. Ing-Esteves得到了视觉科学研究计划和NSERC研究生奖学金博士的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene viral prep #45185-AAV9 | |||
| Addgene viral prep #45186-AAV9 | |||
| Dissection tools | |||
| Cellulose filter paper | Whatman | 1001-070 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11252-20 | Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection |
| Dumont forceps | VWR | 82027-426 | |
| Fine Scissors | FST | 14058-09 | |
| Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size | Millipore | HABG01 300 | |
| Petri Dish, 50 × 15 mm | VWR | 470313-352 | |
| Polyethylene disposable transfer pipette | VWR | 470225-034 | |
| Round tip paint brush, size 3/0 | Conventional art supply store | Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting | |
| Surgical Scissors | FST | 14007-14 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Live-imaging incubation system | |||
| Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' | Warner Instruments | 64-0755 | |
| Dual channel heater controller, Model TC-344C | Warner Instruments | 64-2401 | |
| HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective | Leica | 15506374 | |
| Heater controller cable | Warner Instruments | CC-28 | |
| Large bath incubation chamber with slice support | Warner Instruments | RC-27L | |
| MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) | Warner Instruments | PM-6D | |
| Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
| Sample anchor (Harps) | Warner Instruments | 64-0260 | Sample anchor must be compatible with incubation chamber |
| Sloflo In-line Solution Heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Neonatal Injections | |||
| 10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle | Hamilton Company | 80314 | |
| 30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| 4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm) | WPI World Precision Instruments | TW100-4 | |
| Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) | Sigma-Aldrich | V001229 | |
| AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF | Penn Vector Core | AV-9-PV2453 | Addgene Plasmid #45185 |
| AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF |
Penn Vector Core | AV-9-PV2454 | Addgene Plasmid #45186 |
| ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line | The Jackson Laboratory | 6410 | |
| Fast Green FCF Dye content ≥85 % | Sigma-Aldrich | F7252-25G | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Green tattoo paste | Ketchum MFG Co | 329A | |
| Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Pneumatic PicoPump | WPI World Precision Instruments | PV-820 | |
| Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents | |||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Carbogen (5% CO2, 95% O2) | AirGas | X02OX95C2003102 | Supplier may vary depending on region |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES, Free Acid | Bio Basic | HB0264 | |
| Hydrochloric acid solution, 1 N | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pH-Test strips (6.0-7.7) | VWR | BDH35317.604 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Software | |||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Open source |
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