Summary
Här presenterar vi en metod för att undersöka neuritmorfogenes i postnatala mus retinala explanter genom time-lapse konfokalmikroskopi. Vi beskriver ett tillvägagångssätt för gles märkning och förvärv av retinala celltyper och deras fina processer med hjälp av rekombinanta adenoassocierade virusvektorer som uttrycker membranriktade fluorescerande proteiner på ett Cre-beroende sätt.
Abstract
Att upptäcka mekanismer som mönstrar dendritiska arbors kräver metoder för att visualisera, avbilda och analysera dendriter under utvecklingen. Musens näthinna är ett kraftfullt modellsystem för undersökning av celltypsspecifika mekanismer för neuronal morfogenes och anslutning. Organisationen och sammansättningen av retinala subtyper är väldefinierade, och genetiska verktyg är tillgängliga för att komma åt specifika typer under utvecklingen. Många retinala celltyper begränsar också sina dendriter och / eller axoner till smala lager, vilket underlättar time-lapse-avbildning. Mus näthinnans explantkulturer är väl lämpade för levande cellavbildning med konfokal eller multifotonmikroskopi, men metoder optimerade för avbildning av dendritdynamik med tidsmässig och strukturell upplösning saknas. Här presenteras en metod för att sparsamt märka och avbilda utvecklingen av specifika näthinnepopulationer markerade med Cre-Lox-systemet. Kommersiellt tillgängliga adenoassocierade virus (AAV) som används här uttryckte membraninriktade fluorescerande proteiner på ett Cre-beroende sätt. Intraokulär leverans av AAV hos neonatala möss ger fluorescerande märkning av riktade celltyper med 4-5 dagar efter injektion (dpi). Membranfluorescerande signaler kan detekteras genom konfokal avbildning och löser fina grenstrukturer och dynamik. Högkvalitativa videor som sträcker sig över 2-4 timmar förvärvas från bildbehandling av retinala platta fästen perfuserade med syresatt konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF). Dessutom tillhandahålls en bild efterbehandlingsrörledning för dekonvolution och tredimensionell (3D) driftkorrigering. Detta protokoll kan användas för att fånga flera cellulära beteenden i den intakta näthinnan och för att identifiera nya faktorer som styr neuritmorfogenesen. Många utvecklingsstrategier som lärs in i näthinnan kommer att vara relevanta för att förstå bildandet av neurala kretsar någon annanstans i centrala nervsystemet.
Introduction
Dendriter av retinala neuroner bildar invecklade, men ändå specifika, mönster som påverkar deras funktion inom neurala kretsar. I ryggradsdjurens näthinna bär olika typer av retinala ganglionceller (RGC) och amakrincellinterneuroner unika dendritiska morfologier som skiljer sig åt i trädborrstorlek, plats, grenlängd och densitet1. Under postnatal utveckling förlänger RGC och amakrina celler sprudlande dendritiska processer till en neuropil som kallas det inre plexiformskiktet (IPL), där de tar emot bipolära cellingångar som överför fotoreceptorsignaler2. Som fångats genom time-lapse-avbildning av fluorescerande märkta retinala populationer hos kyckling- eller zebrafisklarver är dendritmorfogenesen mycket dynamisk3,4,5. Inom några dagar expanderar, ombygger och förgrenar sig dendritiska arbors till smala underlager av IPL, där de synaps med utvalda partners. Arbors uppvisar olika strukturell dynamik över utveckling, med förändringar i relativa hastigheter för grenaddition, indragning och stabilisering. Amakrin- och RGC-dendriter uppvisar också olika utväxt- och ombyggnadsbeteenden som kan återspegla typspecifik arborisering. Dessa studier spårade dock breda amakrin- eller RGC-populationer och fokuserade på laminär inriktning, vilket bara är en aspekt av morfologin.
Mekanismerna som producerar den stora morfologiska mångfalden som observerats över retinala subtyper är dåligt förstådda. Syftet med denna grupp var att utveckla en metod för att fånga dendritdynamik och arborremodellering av definierade retinala subtyper hos möss. Att identifiera celltypsspecifika mekanismer för dendritmönster kräver metoder för att visualisera och mäta dendritbeteenden hos celler av intresse. Organotypiska kulturer av musnäthinnor är väl lämpade för levande cellavbildningsstudier med konfokal eller multifotonmikroskopi. Utvecklande näthinnor dissekeras och monteras i en platt explant som kan avbildas i flera timmar i en inspelningskammare eller odlas under några dagar med begränsade effekter på kretsarna6,7. Levande retinala neuroner kan märkas med en mängd olika tekniker, inklusive färgämnesfyllning med elektroder, elektroporering, biolistisk leverans av partiklar belagda med lipofila färgämnen eller plasmider som kodar för fluorescerande proteiner (t.ex. genpistol), samt genetiskt kodade celletiketter7,8,9,10 . Dessa metoder är emellertid ineffektiva för avbildning av dendritdynamik hos specifika retinala subtyper. Till exempel är färgämnesfyllningsmetoder låg genomströmning och kräver elektrofysiologiapparater och ytterligare genetiska etiketter för att på ett tillförlitligt sätt rikta in sig på celler av intresse. Dessutom kan de starka fluorescenssignalerna i soma dölja närliggande dendriter.
Biolistiska genleveransmetoder kan samtidigt märka dussintals celler, men steg som involverar högtryckspartikelleverans och inkubation över natten av isolerad näthinna kan äventyra cellfysiologin och dendritisk utväxt. Detta dokument föreslår att nya genetiska verktyg kan användas för att fånga tidig dendritdynamik med celltyp och strukturell upplösning, med tanke på följande experimentella kriterier. För det första, för att lösa de fina grenarna och filopodierna som dominerar utvecklande arbors, bör metoden märka neuroner med ljusa, fluorescerande proteiner som fyller processer i hela trädborrningen. Fluorescensmärkningen bör inte blekna på grund av fotoblekning under avbildningsperioden. En mängd olika fluorescerande proteinvarianter har genererats och jämförts för lämplighet för in vivo/ex vivo-avbildning11 baserat på ljusstyrka och fotostabilitet. För det andra måste fluorescerande proteiner (FFP) uttryckas i tillräckligt höga nivåer vid det tidigaste stadiet av dendritmorfogenes, så att det smala utvecklingsfönstret inte missas. I analyser av statiska tidpunkter i musens näthinna sker dendritutveckling under den första postnatala veckan och inkluderar faser av utväxt, ombyggnad och stabilisering10,12,13,14,15. För det tredje bör metoden leda till selektiv märkning eller till ökad sannolikhet för märkning av den neuronala subpopulationen av intresse. För det fjärde måste märkningen av måldelpopulationen vara tillräckligt gles så att hela den neuronala trädborrningen kan identifieras och spåras. Även om RGC och amakrinsubtyper kan särskiljas genom sina mogna morfologiska egenskaper och IPL-stratifieringsmönster16,17,18,19,20, är utmaningen att identifiera subtyper under utveckling baserat på omogna strukturer. Denna uppgift underlättas av utvidgningen av transgena verktyg för att märka specifika retinala celltyper under utvecklingen.
Transgena och knock-in muslinjer där cellulärt och tidsmässigt uttryck av fluorescerande proteiner eller Cre bestäms av genreglerande element används ofta för att studera retinala celltyper13,21,22,23. Viktiga observationer om subtypspecifika mönster för dendritutveckling har kommit från studier av transgena musnäthinnor vid statiska tidpunkter10,14,24,25. Cre-Lox-systemet möjliggör i synnerhet utsökt genmanipulation och övervakning av subtyper med hjälp av en mängd olika rekombinasberoende reportrar, sensorer och optogenetiska aktivatorer. Dessa verktyg har lett till upptäckter av subtypspecifika molekylära program och funktionella egenskaper som ligger till grund för retinal kretsmontering26,27,28,29,30. De har dock ännu inte utnyttjats för att studera subtypspecifik dendritdynamik i musnäthinnan. Märkning med låg densitet kan uppnås genom att kombinera Cre-muslinjer med transgener som introduceras genom elektroporering eller genom rekombinanta AAV. Om tillgängligt kan tamoxifeninducerbara Cre-linjer eller intersektionella genetiska strategier också användas. Slutligen bör cellen märkas på ett minimalt invasivt sätt och avbildas med hjälp av förvärvsparametrar för att inte äventyra vävnaden eller störa cellulär funktion som krävs för dendritmorfogenes.
Här presenteras en metod för att tillämpa transgena verktyg och konfokalmikroskopi för att undersöka dendritdynamiken i levande mus retinala explanter. Cre transgena muslinjer har kombinerats med AAV-vektorer som uttrycker fluorescerande proteiner vid Cre-rekombination, vilket möjliggör gles märkning av retinala celler av intresse. Kommersiellt tillgängliga AAV levereras till neonatal näthinna genom intravitreala injektioner. Detta dokument visar att AAV producerar signifikant högt och celltypsspecifikt fluorescerande uttryck med 4 dpi, vilket ger tillgång till postnatala tidpunkter. För att illustrera detta tillvägagångssätt märktes den kolinerga "starburst" amakrininterneuron genom att leverera Brainbow AAV hos neonatala möss som uttrycker kolinacetyltransferas (ChAT) -inre ribosomingångsstället (IRES) -Cre-transgen, som är aktiv i den tidiga postnatala näthinnan31,32. Starburst amakrinceller utvecklar en stereotyp och radiell arbormorfologi som formas av dendrit självundvikande medierad av de klustrade protokadherinerna33,34. Detta dokument visar att upplösningen av starburst dendriter och filopodia förbättras avsevärt av FPP till plasmamembranet med tillsats av CAAX-motivet som genomgår farnesylering, som används för Brainbow AAVs31. Slutligen har time-lapse-avbildnings- och efterbehandlingsprotokoll fastställts som producerar högkvalitativa bilder som är mottagliga för dendritrekonstruktion och morfometrisk kvantifiering. Detta protokoll kan användas för att identifiera faktorer som styr dendritmorfogenes och för att fånga flera cellulära beteenden i den intakta näthinnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll sträcker sig över 2 dagar med en minsta period på 4-5 dagar för viral transduktion mellan experimentella dagar (Figur 1A). Djurförsök utförs i enlighet med Canadian Council on Animal Care Guidelines for Use of Animals in Research and Laboratory Animal Care enligt protokoll som godkänts av Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee vid Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada).
1. Förberedelser för neonatala AAV-injektioner och avbildningsexperiment
- Välj en Cre-muslinje för att märka de retinala cellpopulationerna av intresse. Bekräfta Cre-rekombinasuttryck vid tidpunkten för AAV-injektioner genom att gå över till en Cre-transgen reporter eller genom immunfärgning med en Cre-antikropp.
- Ras transgena Cre möss (8-16 veckor gamla) för att generera Cre-positiva neonatala djur.
OBS: För denna demonstration användes ChAT-IRES-Cre knock-in-möss för att rikta in sig på de kolinerga Starburst-amakrincellerna. - Skaffa rekombinasberoende AAV-virus som kodar för fluorescerande protein(er). För optimal märkning av fina processer, välj vektorer som uttrycker modifierade FFP: er som riktar sig mot plasmamembranet.
OBS: Denna studie använde Brainbow-viruset (BBV), AAV-EF1a-BbTagBY och AAV9-EF1a-BbChT (se Materialtabell), som ger möjlighet till flerfärgad märkning (figur 1B). Farnesylerat förbättrat gult fluorescerande protein (eYFP) och monomeriskt körsbärsuttryck (mCherry) gav de starkaste fluorescerande signalerna för levande avbildning. En enda BBV kan användas för att avbilda enskilda arbors, medan saminjektion av BBF kan användas för att märka fler celler eller närliggande arbors med distinkta fluoroforer. Om du använder flera fluorescerande proteiner, se till att minsta utsläppsspektrum överlappar varandra (figur 1C). Parametrar för förvärv av mikroskop måste justeras för att fånga distinkta XFP-signaler. - Förbered ∼3-5 μL alikvoter av AAV i enskilda lågbindande rör för engångslager för att undvika frys-/upptiningscykler. Förvara vid -80 °C.
- Förbered borosilikatglasmikropipetter med mycket fina spetsar med en mikropipettavdragare.
OBS: Pullerinställningarna varierar beroende på filament och avdragare som används; Se figur 2A för slutlig spetsstorlek och form. Typiska droppdiametrar är 600 μm. - Skaffa ett mikroinjektionssystem och tillhörande slangar. Anslut mikroinjektorn till en tryckluftsport.
Figur 1: Experimentell översikt. (A) Detta protokoll sträcker sig över 2 dagars experiment med minst 4-5 dagars infektionsperiod mellan experimentella dagar. Intraokulära injektioner utförs på neonatala möss som inte är äldre än postnatal dag 3. Näthinnor dissekeras sedan, plattmonteras och live-avbildas för att fånga önskat utvecklingsfönster. Märkta celler kan avbildas när som helst efter de nödvändiga 4-5 dagar som behövs för viralt uttryck, eftersom det inte finns några uppenbara effekter av långvarigt AAV-uttryck på dendritmorfologi. (B) Cre-beroende Brainbow AAV-vektorer (BBV) injiceras i djur som uttrycker Cre31. I denna studie användes ChAT-Cre knock-in-möss för att driva Cre-rekombination i starburst-amakrinceller. De två BFV: erna kodar modifierad eYFP eller tagBFP, eller mCherry och mTFP, som avslutas i ett CAAX-motiv som sekventiellt farnesyleras för membranlokalisering. Lox-platser är avbildade med trianglar. Vektorerna uttrycker antingen farnesylerade DFP på ett stokastiskt och kombinatoriskt sätt beroende av Cre-rekombination. EF1α-promotorn innehåller reglerande element från förlängningsfaktorn 1α-genen. W representerar element från woodchuck hepatitvirus posttranscriptional regulatoriskt element, och pA indikerar polyadenyleringssekvensen. (C) Excitations- och emissionsspektra för mCherry och eYFP, BBV-fluoroforerna som avbildas i denna studie. Vid live-imaging av flera fluorescerande proteiner måste detektionsparametrarna ordnas för att på ett adekvat sätt separera emissionsspektra i distinkta kanaler. Förkortningar: AAV = adenoassocierat virus; BBV = Hjärnbåge AAV; ChAT = kolinacetyltransferas; iRES = inre ribosomingångsplats; eYFP = förbättrat gult fluorescerande protein; iTR = inverterad terminalupprepning; tagBP = Taggblått fluorescerande protein; mCherry = monomerisk körsbär; mTFP = teal fluorescerande protein; XFP = något fluorescerande protein; EF1α= töjningsfaktor 1 alfa. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Intravitreala injektioner av AAV hos neonatala möss
- Tina en AAV-alikvot på is. Förbered en ~ 1: 4 AAV-utspädning med steril saltlösning eller fosfatbuffrad saltlösning. Förbered ~ 0,5 μL AAV-utspädning per djur (~ 0,25 μL per öga) om mikropipetten går sönder och en ny pipett måste fyllas. Förvara resterande outspädd AAV vid 4 °C och använd inom 2 veckor.
OBS: I detta experiment var leverantörens AAV-koncentration ~ 1-2 × 1013 genominnehåll (GC) / ml och späddes till en slutlig koncentration av 4 × 1012 GC / ml. Optimera viruskoncentrationen för att erhålla önskad märkningsdensitet. - För att visualisera injektionerna, tillsätt cirka 1 μL av 0,02% Fast Green FCF-färglösning för varje 15 μL AAV-utspädning för att färga lösningen blå.
- Överför en musbur med damm och nyfödd kull (postnatal dag (P) 0,5-3) till ett procedurrum med mikroinjektionsutrustning. Håll djuren i samma bur med bon och sängkläder för att minimera moderns stress och avstötning av valpar.
- Sterilisera injektionsområdet med 70% etanol och placera sterila blöjkuddar på bänkytor. Förbered en varm plattform (t.ex. en värmedyna) för återhämtning från hypotermiinducerad anestesi.
- Återfyll mikropipetten med AAV-utspädningen med en mikrosyring. Under ett stereomikroskop, bryt mikropipettspetsen med en 30 G nål för att lossa spetsen.
OBS: Figur 2A visar den återfyllda spetsen - både förseglad (överst) och oförseglad (mitten). - Bedöva neonatala möss genom hypotermi genom att placera 1-2 djur på is. Placera djur på en latexhandske för att skydda huden från direkt kontakt med is. När djuret inte längre rör sig som svar på tass nypa (~ 2 min), placera djuret under ett stereomikroskop. Om så önskas, tatuering tassar med tatuering bläck och 30 G nål, och samla svansklipp för DNA-isoleringför att identifiera djur genom genotypning.
OBS: Lämplig övervakning av anestesidjupet måste ske under hela proceduren. - Svabba huden över ögonen med 70% etanol. Använd en 30 G nål för att öppna det smälta ögonlocket (Figur 2B). Applicera lätt tryck med fingrarna för att öppna ögat och sticka ett litet hål genom hornhinnan vid hornhinnan-sclera-korsningen (figur 2C).
- Sätt in glasmikropipetten i hålet och tryck på mikroinjektorfotpedalen 2-4 gånger för att injicera AAV i det intravitreala utrymmet. Ta långsamt bort mikropipetten och bekräfta AAV-injektionen genom att visualisera blått färgämne genom pupillen (Figur 2D).
OBS: Med ett utstötningstryck på 6-8 psi och pulstid på 600-800 ms matas en droppe med en diameter på 600 μm ut (figur 2A, botten). Cirka 0,23-0,45 μL AAV-lösning injiceras per öga. Blå lösning utanför ögat indikerar att AAV inte injicerades i ögat. Blå lösning som läcker från injektionsstället indikerar att AAV kan ha läckt ut, vilket minskar transfektionseffektiviteten. - Tryck försiktigt ihop ögonlocken för att försegla igen och placera valpen på en uppvärmd kudde. När djuren har återhämtat sig en rosa färg och är lyhörda, överför dem försiktigt tillbaka till husburet.
OBS: Se till att lämpliga försiktighetsåtgärder vidtas för att undvika för snabb uppvärmning av valparna. - Upprepa injektionsproceduren för de återstående djuren i kullen. Låt minst 4-5 dagar för viral transduktion innan du avbildar näthinnan.
Figur 2: Neonatala intraokulära injektioner. (A) Återfylld mikropipett visar formen på pipettspetsen när den är förseglad (överst) och efter att spetsen är oförseglad (botten, vänster). Pico-injektionstryck på 6-8 psi och pulstid på 600-800 ms ger en droppe med en diameter på 600 μm (botten, höger). Skalstång = 1 mm.(B) Sövd P0-valp under 16x förstoring. Den smälta ögonlockskorsningen (vit) slits öppen med en skarp 30 G nål. Skalstång = 2 mm. (C) Lätt tryck applicerat på ögat exponerar hornhinnan; skalstång = 2 mm. Zoomad sektion (röd) visar det lilla hålet vid hornhinnan-sclera-korsningen (gul) skapad med en 30 G nål; skalstång = 0,5 mm. (D) Uttag av pipettspetsen efter injektion (vänster). Snabbt grönt färgämne i AAV-lösningen visas som blågrått genom pupillen (mitten), jämfört med den ljusa pupillfärgen före injektion (höger). Skalstång = 1 mm. (E) Efter 4 dagar har ögonlocket läkt och smält stängt (vänster); skalstång = 2 mm. Vid enukleation är det läkta injektionsstället synligt (gult); skalstång = 1 mm. Observera placeringen av injektionsstället vid gränsen mellan hornhinnan och sclera. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Retinala dissektioner för avbildningsexperiment
- Förbered retinal aCSF (119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2·6H2O, 2,5 mM CaCl2·2H2O, 1 mM NaH2PO4, 11 mM glukos och 20 mM 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES-fri syra)35. Om så önskas, förbered och frys 10x lösning; tina och späd till 1x efter behov.
- Syresätt retinal aCSF genom att bubbla med karbogen (95% O2, 5% CO2) i minst 15 min. Justera pH till 7,4. Förvara i en förseglad behållare tills den används för att säkerställa att aCSF förblir syresatt.
OBS: Näthinnor kräver en hög koncentration av O2. Det är viktigt att hålla aCSF syresatt under hela experimentet. - Bädda in en petriskål med en diameter på 60 mm i en isbricka (forma en isbricka av laboratorieplast, t.ex. ett pipettlådelock) och placera den under ett stereomikroskop. Fyll petriskålen med syresatt retinal aCSF.
- Avliva möss P9 och yngre genom halshuggning. Avliva möss P10 och äldre genom isofluraninduktion, eller en alternativ metod som godkänts enligt djurprotokollet, följt av halshuggning.
- Om ögonlocken är förseglade, skär ögonlocksfliken för att exponera ögat. Använd pincett för att enukleera ögonen och överför dem till den kalla retinala aCSF från steg 3.3.
- För att dissekera näthinnans kopp, under ett stereomikroskop (förstoring 25x), stabilisera ögat genom att klämma fast synnerven med en Dumont # 5 forcep (Figur 3A).
- Poke ett hål i mitten av hornhinnan med en 30 G nål och sätt sedan in en spets av mikroscissorerna i hålet för att göra ett snitt från hålet till slutet av hornhinnan. Upprepa för att göra 4 skivor i kardinalriktningarna, skapa 4 "flikar" (Figur 3A).
- Med två Dumont #5 pincett, ta tag i och dra isär de två intilliggande flikarna och skala försiktigt sclera från näthinnan. Upprepa med de återstående hornhinneflikarna och ta bort sclera från näthinnan (figur 3B).
- Ta bort linsen från näthinnan med tången. Med mikrosnedgivare gör du 4 radiella snitt från näthinnans kant mot synnerven, vilket skapar 4 lika kronblad (Figur 3B). Upprepa steg 3.4-3.7 för det andra ögat.
4. Retinal plattmonterad förberedelse
- Förbered grå blandade cellulosaester (MCE) membranfilterskivor för montering. Om du använder MCE-membranfilter med stor diameter, skär skivan i kvadranter (ungefär 1 cm över). Placera MCE-skivan i mitten av ett större vitt filterpapper (figur 3D).
OBS: MCE-filter finns också i skivor med en diameter på 1 cm. MCE-filterskivan måste vara tillräckligt stor för att passa 1-2 näthinnor, men tillräckligt liten för att passa in i bildkammaren. Eftersom MCE-membran håller en statisk laddning, minimera kontakt och hantering av MCE-membranet. - Hantera näthinnor med två storlek 3/0 penslar, vänd en retinal kopp på en pensel med retinal ganglioncellsidan nedåt. Lyft försiktigt näthinnan ur aCSF och se till att vattenspänningen inte sliter näthinnan (Figur 3C).
- Medan du fortfarande håller penseln med näthinnan, använd en överföringspipett för att placera en droppe aCSF i mitten av MCE-filterpapperet (Figur 3C, till höger). Flyt näthinnan i droppen av aCSF som skapas av ytspänningen. Använd penslar för att placera näthinnans RGC-sida uppåt i droppen och för att fälla ut de fyra kronbladen.
- När du väl är placerad skapar du en vattenbro mellan penseln och vitt filterpapper för att bryta droppens ytspänning.
OBS: När aCSF är bortsjuknad kommer näthinnan att fästa vid MCE-filterpapperet (figur 3D,E). Plattmonterade näthinnor kan hanteras genom att ta tag i MCE-skivan med pincett. Om aCSF-droppen snabbt transporteras bort innan den bildar en vattenbro kan detta indikera att MCE-membranet inte är laddat. Använd ett nytt MCE-membran och minimera tiden mellan enukleation och avbildning genom att dissekera och platta näthinnor omedelbart innan näthinnorna flyttas in i bildkammaren.
Figur 3: Retinal dissektion och platt montering på blandade cellulosaesterfiltermembran. (A) Vänster stabiliseras ett enukleerat öga genom att ta tag i synnerven med Dumont # 5 pincett (vänster). Ett litet hål skapas i mitten av hornhinnan med en 30 G nål (mitten). Mikrodissektionssax används för att skära hornhinnan i 4 lika flikar (höger). Skalstång = 1 mm. (B) Dissekerad näthinna med sclera avskalad med två Dumont #5 pincett (vänster) och med linsen borttagen (mitten). Näthinnan med 4 lika stora snitt halvvägs in i näthinnan (höger). Skalstång = 1 mm. (C) Hantering av näthinnan med två fina pensle (storlek 3/0, vänster). Näthinnan vänds med retinala ganglionceller med sidan nedåt på en pensel (mitten) och lyfts ut ur aCSF, se till att vattenspänningen inte sliter näthinnan (höger). Skalstång = 2 mm. (D) Grå MCE-membranskiva placerad på ett vitt filterpapper (vänster). En droppe aCSF på MCE-skivan (höger). Vågstång = 1 cm. (E) Efter att ha flytit näthinnorna i droppen och placerat dem, skapa en vattenbro med det vita filterpapperet för att transportera aCSF och dra näthinnan på det laddade MCE-papperet (vänster); skalstång = 1 cm. Zoomad bild av MCE-membranet (rött) visar 2 näthinnor monterade med retinala ganglionceller med sidan uppåt (höger); skalstång = 2 mm. En näthinna är skisserad i vitt. Förkortningar: MCE = blandad cellulosaester; aCSF = artificiell cerebrospinalvätska. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Time-lapse-konfokal avbildning av levande helmonterade näthinnepreparat
- Montera inkubationskammaren för levande avbildning för ett upprätt konfokalmikroskop som ses i figur 4.
OBS: För inverterade konfokalsystem placeras platta fästen RGC-sidan nedåt direkt på inkubationskammarens glasbottenskydd. När näthinnorna kommer i kontakt med täckglaset kan de inte flyttas. - Fyll kammaren med syresatt aCSF och slå på pumpen och temperaturregulatorn (temperatur 32-34 °C, flödeshastighet 1 ml/min). Låt inte temperaturen stiga över 34 °C.
- För att överföra retinalens platta fäste till perfusionskammaren, stoppa pumpen och ta bort aCSF som finns i kammaren. Placera MCE-skivan med näthinnans platta fäste i den (tomma) inkubationskammaren.
- Placera en provvikt på det platta fästet; förvåta vikten för att bryta ytspänningen. Fyll på kammaren med den uppvärmda aCSF och cirkulera aCSF vid ~ 1 ml / min.
- Placera nosstycket med 25x vattendoppningsmålet (numerisk bländare 0,95) i bildkammaren. Skärm för märkta celler av intresse med epifluorescent ljus (Figur 4C).
- Justera bildvolymen för att fånga dendritiska funktioner av intresse.
OBS: Denna studie fångade hela dendritiska trädborrningen med 1024 x 1024 pixlar per bildruta, z-steg 1 μm och en bildhastighet på 2 minuter mellan varje z-stack. Slutliga bildstorlekar är ~ 100 μm x 100 μm x 20 μm. - Om du vill justera lasereffekten till en optimal inställning använder du en uppslagstabell som identifierar både övermättade och undermättade pixlar. Justera lasereffekten så att inga pixlar är övermättade (dvs. med en intensitet på 255 eller högre) under skanningen. Fortsätt avbildningen så länge som krävs, eller tills det finns en signifikant och detekterbar minskning av fluorescerande signal och ökning av brus (vanligtvis 2-4 timmar).
OBS: Minskad lasereffekt rekommenderas eftersom dekonvolutionsalgoritmer fungerar optimalt när pixlar fördelas över hela det dynamiska området. Pixelintensiteten bör inte överstiga 254; empiriska analyser av neuriter avslöjade att pixelvärden under 170 är idealiska för dekonvolution. Snabba skanningshastigheter (400-600 Hz) med linjemedelvärde (2-3) är att föredra framför enkla, långsammare skanningar med samma totala pixeluppehållstid. Området för långvarig avbildning fotobleaches ofta, men andra explantsektioner förblir livskraftiga. Flera regioner i ett platt fäste kan avbildas, var och en i 2-4 timmar, med en total inkubationstid på 6 timmar. Avbildningssessioner utöver 6 timmar har inte testats systematiskt. Neuritnedbrytning och blebbing är tecken på att explantens livskraft minskar. - Efter avbildning, fixera näthinnans platta fästen och membranfiltret med kall 4% paraformaldehyd i 1-2 timmar vid 4 ° C. Förstärk de fluorescerande etiketterna i de fasta näthinnorna med immunohistokemi för vidare analyser.
OBS: Fixering efter avbildning är inte möjlig vid användning av en inverterad konfokal; näthinnor är inte avtagbara utan att förstöra vävnaden.
Figur 4: Inkubationskammarens inställning för livecellavbildning. (A) Inkubationsapparat för liveavbildning som visar värme-, lösnings- och bildkomponenter. Dubbelvärmare inkluderar en uppvärmd inkubationskammarplattform (bakcirkel med blå kontaktelektroder) och en in-line lösningsvärmare. (B) Schematiskt diagram över 4A. Retinal plattmonterad (röd) på MCE-membran (grå) placeras i inkubationskammaren. In-line-lösningsvärmaren är ansluten till en lösningspump (inte avbildad i 4A). Bildkammarens dimensioner möjliggör ett bra arbetsområde för doppningsmålnosen. (C) 25x visa en retinal explant injicerad med 0,23-0,45 μL av 4 × 1012 GC/ml AAV-utspädning; skalstång = 100 μm. Tät märkning av celler omger ofta det optiska nervhuvudet (streckad linje, längst ner till höger); skalstång = 50 μm. Förkortningar: MCE = blandad cellulosaester; GC = genomkopior; mCherry = monomerisk körsbär; eYFP = förbättrat gult fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
6. Bilddekonvolution och efterbehandling i ImageJ
- Importera bildserien, dela upp serien efter tid och färg om det är en flerfärgsbild. Se till att alla tidpunkter för en färg finns i samma mapp.
OBS: Importera bioformat om du använder ImageJ (Bio-format ingår automatiskt i FIJI). - Skapa en teoretisk punktspridningsfunktion (PSF) med hjälp av ImageJ-plugin, Diffraktion PSF 3D.
OBS: Varje bildkanal kräver sin egen PSF eftersom fluorescerande proteinemissionsvåglängd påverkar PSF. - Använd plugins | Makron | Kör för att utföra parallell iterativ dekonvolution i batch för alla tidpunkter med hjälp av det angivna makrot (tilläggsfil 1).
OBS: Detta makro kör 25 iterationer av Wiener Filter Preconditioned Landweber (WPL) iterativa algoritm. Varje färgkanal måste dekonvolveras separat. - Slå samman färgkanalerna och kompilera alla tidpunkter till en Hyperstack (Image | Hyperstackar | Staplar till Hyperstack). Korrigera 3D-avdriften med Plugins | Registrering | Rätt 3D-drift.
- Återställ bilden till en vanlig stack (Bild | Hyperstackar | Hyperstack till Stack) och dela upp tidspunkterna (Bild | Staplar | Verktyg | Stack Splitter). Använd batchbearbetning för att skapa maximal projektion för alla tidpunkter (Process | Sats | Makro | run("Z Project...", "projection=[Max Intensity]"); ).
- Importera timelapse-bildsekvensen (File | Importera | Bildsekvens). Använd konventionella ImageJ-verktyg för önskad analys av dekonvolverad och efterbehandlad tvådimensionell (2D) video.
OBS: Fyrdimensionella (3D + tid) dekonvolverade och driftkorrigerade videor kan ses som en hyperstack. Utelämna föregående steg för att upprätthålla 3D-tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av ovanstående protokoll förvärvades, dekonvolverades och korrigerades en högupplöst 3D-video av att utveckla starburstcelldendriter för 3D-drift. Z-plan maximala projektioner producerades för att göra 2D-videor för analys (kompletterande video 1, figur 5A). 3D-dekonvolution för varje tidpunkt ökade upplösningen av fina filopodiaprojektioner (figur 5B, C). Fina filopodiautsprång är ett kännetecken för att utveckla retinala dendriter36 och bör vara synliga under avbildningen. AAV-transfektion kommer att producera variation i cellmärkningstäthet och fluorescensintensitet. Således screena den märkta vävnaden för att välja celler med höga fluorescerande signaler för avbildning och produktion av högkvalitativa videor. Att öka laserkraften för att upptäcka svagt märkta celler rekommenderas inte, eftersom det kan leda till snabb fotoblekning och införa högt brus jämfört med signalen. Tillräckligt ljusa celler är synliga inom 5 dpi. Vid 12 dpi och därefter leder förlängda AAV-infektionsperioder inte nödvändigtvis till ökad fluorescens av märkta celler (figur 5D).
Överdriven fluorescens och neuritträngning från tät cellmärkning påverkar bildkvaliteten och kan hindra encellsrekonstruktioner. Optimering av AAV-utspädningen och volymen krävs för att uppnå önskad grad av isolerade och fluorescerande märkta arbors som är separerbara från resten av målcellpopulationen. Här injicerades 9,2 × 108-1,8 × 109 virala GC per öga för att rikta in sig på starburst-amakrinceller (0,23-0,45 μL AAV med en 4 × 1012 GC / ml-titer). Frånvaron av en fluorescerande signal kan återspegla en ineffektiv injektionsteknik. Under injektion indikerar läckage av den blå AAV-lösningen från injektionsstället att viruset inte levereras till näthinnan eller att injektionsvolymen eller trycket är för högt. Överskott av injektionsvolym eller tryck kan orsaka retinalavskiljning och / eller förlust av okulärt tryck, skada retinala celler och minska cellmärkningseffektiviteten. Båda problemen kan lösas med övning och optimering av injektionstekniken. Andra potentiella orsaker till bristen på signal inkluderar nedbrytning av AAV: erna från felaktig lagring eller otillräckligt Cre-uttryck eftersom Cre-transgenen inte är aktiv under AAV-transfektionsperioden.
När videor har dekonvolverats kan dynamiska analyser, till exempel beräkning av hastigheter för grenaddition, indragning eller stabilisering, utföras. Dessutom kan konventionell statisk analys utföras på varje tidsram, inklusive neuronrekonstruktion och morfometriska kvantifieringar såsom total grenlängd, grenvinklar, grenordning eller antal terminala grenpunkter. Resultatet av detta protokoll är en tidsserie av högupplösta 3D-bildstackar. De flesta dynamiska 3D-neuritvideor kvantifieras manuellt som en maximal projektion med hjälp av en bildvisualiseringsprogramvara med öppen källkod som ImageJ37. Ett annat verktyg med öppen källkod, Vaa3D38, har utvecklats speciellt för visualisering av stora volymer. Om videor ska analyseras i 3D rekommenderas användning av en 3D + tidsvisualiserare som Vaa3D. ImageJ och Vaa3D ger direkt åtkomst till pixlarna eller voxlarna i bilden, men ofta skapas neuronrekonstruktioner genom att omvandla pixeldata till skelettiserade trädrekonstruktioner. Automatiska eller halvautomatiska neuronrekonstruktioner för enstaka tidpunkter kan utföras med öppen källkod39,40,41 och proprietär programvara. För att analysera time-lapse-rekonstruktioner måste varje punkt på rekonstruktionen kopplas till föregående och efterföljande tidspunkter. Att anpassa komplexa dendritiska morfologier över tid, som kan kodas av upp till 500 datapunkter, är fortfarande ett utmanande problem. Många verktyg finns tillgängliga, med olika styrkor och begränsningar, och de måste väljas för att passa de analyser som behövs för studien.
Figur 5: Representativa resultat efter neonatal intraokulär injektion, time-lapse-avbildning och dekonvolution. (A) Maximala projektioner av dekonvolverade time-lapse-avbildningsserier (h: min) av P6 starburst-amakrincell 5 dagar efter AAV-injektion. Fin filopodiadynamik kan nu analyseras med konventionella ImageJ-verktyg. Ett område med dendritisk förfining (röd ruta) och ett område med dendritisk utväxt (grön ruta) markeras. (B, C) Enkel P6 starburst amakrincell märkt med membranmärkt eYFP 5 dagar efterAAV-injektion (dpi) visar ljus encellsmärkning. Skalstänger för övre paneler = 50 μm; skalstänger för nedre paneler = 25 μm. Före (A) och efter (B) dekonvolution med ImageJ. Insets (röd) visar deblurring som ett resultat av framgångsrik dekonvolution. (D) P6 starburst amacrin cell 5dpi (vänster) jämfört med P12 starburst cell 11 dpi visar liknande nivåer av fluorescerande proteinuttryck. Ökande AAV-inkubationstider ökar inte fluorescerande signal. De fluorescerande signalerna minskar inte med längre AAV-infektionsperioder. Identiska förvärvs- och efterbehandlingsparametrar tillämpades på båda bilderna. Ökad grentjocklek och varikositeter observerade vid P12 är normala egenskaper hos mogna starburstceller och inte en märkning eller avbildningsartefakt. Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: AAV = adenoassocierat virus; eYFP = förbättrat gult fluorescerande protein; dpi = dagar efter fektion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Överväganden för val av Cre-linje och fluorescerande proteinlokalisering.
(A-D) Levande P11 retinala ganglionceller avbildade vid 9 dpi av BBV injicerade i Vglut2-iRES-Cre knock-in-möss, där Cre uttrycks selektivt i RGC-populationen. A) JAM-B RGC identifierad genom sin karakteristiska asymmetriska morfologi24. (B-D) Distinkta RGC-undertyper som skiljer sig åt i sina dendritstratifieringsmönster. (E) Bild av levande P11 starburst amacrincell biolistiskt transfekterad med cytosolisk mCherry och fångad med snurrande skivkonfokal vid 512 x 512 pixlar. Den cytosoliska XFP leder till hög fluorescenssignal i soma i förhållande till de fina dendritiska utsprången. Out-of-focus-ljus från soma orsakar hög bakgrundsfluorescens vid avbildning av små proximala utsprång (infälld i röd ruta ovan visas nedan). (F) Bild av levande P11 starburst amakrincell transfekterad med membranriktad eYFP och fångad genom konfokal laserskanning vid 1024 x 1024 pixlar. Notera den fluorescerande membranringen runt soma, det förbättrade signal-brusförhållandet och kvaliteten på de fina utsprången som är proximala till soma som produceras av membranriktade fluorescerande proteiner (infällda). Skalstänger = 50 μm och för nedre paneler av E och F = 5 μm. Förkortningar: IRES = intern ribosomingångsplats; BBV = Hjärnbåge adeno-associerat virus; Vglut2 = vesikulär glutamattransportör 2; XFP = något fluorescerande protein; eYFP = förbättrat gult fluorescerande protein; mCherry = monomerisk körsbär; RGC = retinala ganglionceller; JAM-B = korsningsadhesionsmolekyl B. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande video 1: Time-lapse video av P6 som utvecklar starburst amacrine dendrites, 5 dagar efterinjektion. Videotidssteget är 2 minuter. Dekonvolution och 3D-driftkorrigering tillämpades med ImageJ. De övre gula rutorna markerar områden med utväxt, och den nedre rutan skisserar en region med övergående filopodia utväxt, självkontakt och indragning. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande fil 1: ImageJ-makro för batch Parallel Iterative Deconvolution. Makrot kör 25 iterationer av den iterativa algoritmen Wiener Filter Preconditioned Landweber (WPL). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna video visar en experimentell pipeline som använder befintliga genetiska verktyg för att avbilda dendritdynamiken för att utveckla retinala neuroner med konfokal live-imaging. Dessutom demonstreras intraokulära injektioner av Cre-beroende AAV som kodar för membraninriktade fluorescerande proteiner i neonatala möss. Enstaka celler av genetiskt riktade populationer är ljust märkta så tidigt som 4-5 dpi. Retinala platta fästen förbereddes för standardavbildningskammare för att utföra konfokal avbildning med levande celler. Denna metod producerar högupplösta time-lapse-videor av enskilda celler och deras fina projektioner. Små projektioner löses och kvantifieras med hjälp av dekonvolutions- och efterbehandlingsalgoritmer tillgängliga via programvara med öppen källkod, inklusive ImageJ, Vaa3D och ShuTu, samt licensierad programvara tillgänglig från Imaris och MBF Bioscience. Eftersom denna pipeline är modulär kan varje protokollavsnitt ändras för att passa målen för studien. Dessa modulära element diskuteras nedan och inkluderar: 1) Cre-line urval, 2) val av fluorescerande protein och viral konstruktion, 3) genleveransmetoder och 4) avbildningsmetod.
Denna teknik använder Cre transgena linjer för genetisk tillgång till retinala cellunderpopulationer. Cre måste vara aktiv postnatalt och uttryckas över cellpopulationen vid injektionstillgången för att öka sannolikheten för virusinfektion och cellmärkning. I denna rapport användes ChAT-Cre för att rikta in sig på starburst-amakrinceller, och Vglut2-Cre-linjen användes för att rikta in sig på att utveckla RGC42,43 (Figur 6). Cre-beroende AAV-injektion i Vglut2-IRES-Cre knock-in-möss märkta en mängd olika RGC, inklusive korsningsadhesionsmolekylen B-cell (figur 6A) och bistratifierade RGC (figur 6B, C). Alternativt kan nya konstruktioner av AAV med syntetiska promotorer som driver celltypsspecifika uttryck eliminera behovet av Cre transgena linjer44. Ett annat övervägande för effektiv och ljus märkning som är lämplig för live-imaging är den minsta tid som krävs för transfektion och uttryck, vilket kan variera beroende på AAV-serotyp, tropism och titer45. I dessa studier, eftersom AAV-medierad märkning kräver minst 4-5 dpi för XFP-uttryck, är denna metod inte lämplig för åtkomst till tidiga postnatala tidpunkter. För att fånga tidiga tidpunkter (t.ex. P0-P4) kan intraokulära injektioner utföras in utero hos embryonala djur, vilket görs för in utero elektroporation46. I denna grupps studier av starburst dendritutveckling utnyttjades det initiala glesa rekombinationsmönstret för ChAT-Cre för att märka enstaka starburst amacrinceller vid P0-P4 med hjälp av en mustransgen Cre-reporter, Rosa-mTmG27. Slutligen kan detta AAV-retinalinjektionsprotokoll användas för att märka vuxna cellpopulationer, baserat på bekräftelsen av persistensen av fluorescerande märkning 3 månader efter injektion utan skadliga effekter på starburstcellmorfologi34.
Denna pipeline möjliggör också flexibilitet i val av viral konstruktion. För att fånga dendritdynamik kan en mängd olika fluorescerande reporterproteiner användas, inklusive proteiner som lokaliseras till specifika subcellulära strukturer, proteiner av intresse eller rapporterar funktionella förändringar som aktindynamik (t.ex. LifeAct) och kalciumsignaler (t.ex. GCaMP). Alla kommersiellt tillgängliga eller klonade AAV-vektorer kan användas, och onlineverktyg som fpbase.org bör refereras till för ljusstyrka och fotostabilitet. Här användes Brainbow virala vektorer som kodar för fluorescerande proteiner med ett H-Ras farnesylering CAAX-motiv för membranlokalisering. Tidigt i protokollutvecklingen visade sig cytosolisk lokalisering av XPF inte vara idealisk för att studera fin neuritmorfologi, med en övermättnad av signaler från soma och dålig märkning av fina grenar (Figur 6E). Som jämförelse visade sig membraninriktade fluorescerande proteiner märka och lösa fina dendritiska utsprång (figur 6E,F). Ett annat övervägande är storleken, designen och komplexiteten hos den virala konstruktionen, vilket kan påverka uttryckstiden. Till exempel genererades AAV-CAG-FLEx-mClover3-CAAX, som uttrycker en XFP på ett Cre-beroende sätt. Denna konstruktion har en enklare design och resulterar i effektivt uttryck med 4 dpi. Tillsammans gör de olika alternativen för Cre-linjer, AAV-mönster och fluorescerande proteinreportrar som är allmänt tillgängliga från förvar (t.ex. JAX, Addgene och Viral Vector Cores) denna pipeline anpassningsbar till en mängd olika studier av celltyper och utvecklingsfenomen i näthinnan.
Även om detta protokoll beskriver intraokulära AAV-injektioner, finns andra genleveransmetoder tillgängliga, såsom plasmidelektroporering46 och biolistisk genleverans (t.ex. Gene Gun)7. Elektroporering kräver applicering av en elektrisk puls, och biolistisk genleverans kräver ex vivo-inkubation av retinala explanter. AAV-märkning är mindre invasiv än båda dessa metoder och tillåter akuta preparat av näthinnans explanter strax före avbildning. Jämfört med biolistisk genleverans (figur 6E,F) resulterade AAV-injektioner i förbättrad vävnadsviabilitet som var bättre lämpad för kontinuerligt förvärv som behövs för att spåra neuritdynamik. Med rätt teknik utgör AAV-märkning liten eller ingen skada på näthinnan, vilket bedöms av vävnadens hälsa vid dissektionstillgången. Intravitreala injektioner infekterar främst celler i ganglioncellskiktet och det inre kärnskiktet, såsom RGC och amakrinceller. Många dussintals starburst amakrinceller är vanligtvis märkta, med en ökad densitet av märkta celler runt synnervshuvudet (Figur 4C). Men med alla tre transfektionsmetoderna är optisk nervavskiljning oundviklig för att erhålla retinala explanter och kommer att leda till RGC-degenerering. Trots avskiljning av synnerven rapporterar studier livskraftiga retinala explanter från en mängd olika ryggradsdjursmodeller i 36 timmar och upp till 6 dagar postukleation5,6,7,47,48.
Slutligen har nyttan av konfokalmikroskopi för att fånga dendritdynamik visats. Vanligtvis sträcker sig en avbildningssession 2-4 timmar och avslutas innan vävnadsnedbrytning eller neuritblebbing observeras. Bildbehandlingssessioner upp till 6 timmar har genomförts; Den övre gränsen har dock inte testats systematiskt. Områden kan genomgå fotoblekning på grund av långvarig avbildning, men celler i andra synfält i explanten förblir livskraftiga för levande avbildning. Denna metod kan också utvidgas till multifoton- eller ljusarkmikroskopi för att avbilda neuronal morfologi i djupare lager och större volymer. Multifotonavbildning har utförts för att studera neuritdynamik i musens näthinna och är bättre lämpad för att studera celler i djupare retinalamina (t.ex. horisontella celler eller fotoreceptorceller)49. Nyligen användes live-cell lightsheet mikroskopi för att fånga retinal angiogenes50, vilket erbjuder en ny väg för levande avbildning av morfogenes i hela näthinnan. Live-cell lightsheet mikroskopi kan användas för att studera neural kretsmontering i större skala, såsom axon-dendrit inriktning. Multicolor live-imaging är en annan tillämpning av denna pipeline som kan användas för att undersöka cell-cellinteraktioner, såsom påverkan av närliggande celler på dendritutveckling eller andra utvecklingsfenomen som kakel av retinala celler inklusive RGC-subtyper1, mikroglia och astrocyter.
Sammanfattningsvis är en utmanande aspekt av utvecklingsstudier att få tillgång till dessa kritiska tidpunkter. Detta protokoll tillhandahåller en metod för att visualisera morfogenes som uppstår under ett specifikt tidsfönster. Pipelinen kombinerar befintliga verktyg och tekniker för att genetiskt rikta in sig på cellpopulationer och uttrycka membraninriktade fluorescerande proteiner. Akuta retinala platta preparat upprätthåller livskraft och fluorescerande signaler för konfokal avbildning av levande celler under flera timmar. Övergående och dynamiska aspekter av dendritutveckling fångas i 3D-videor och efterbehandlas med hjälp av programvara med öppen källkod. Möjligheten att spela in högupplösta 3D-videor är avgörande för att undersöka dynamiska utvecklingsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Madison Gray för att hon gav mig en hand när jag inte hade någon. Denna forskning stöddes av ett NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), ett Sloan Fellowship in Neuroscience och en Canada Research Chair Tier 2 (till J.L.L). S. Ing-Esteves stöddes av Vision Science Research Program och NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene viral prep #45185-AAV9 | |||
| Addgene viral prep #45186-AAV9 | |||
| Dissection tools | |||
| Cellulose filter paper | Whatman | 1001-070 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11252-20 | Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection |
| Dumont forceps | VWR | 82027-426 | |
| Fine Scissors | FST | 14058-09 | |
| Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size | Millipore | HABG01 300 | |
| Petri Dish, 50 × 15 mm | VWR | 470313-352 | |
| Polyethylene disposable transfer pipette | VWR | 470225-034 | |
| Round tip paint brush, size 3/0 | Conventional art supply store | Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting | |
| Surgical Scissors | FST | 14007-14 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Live-imaging incubation system | |||
| Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' | Warner Instruments | 64-0755 | |
| Dual channel heater controller, Model TC-344C | Warner Instruments | 64-2401 | |
| HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective | Leica | 15506374 | |
| Heater controller cable | Warner Instruments | CC-28 | |
| Large bath incubation chamber with slice support | Warner Instruments | RC-27L | |
| MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) | Warner Instruments | PM-6D | |
| Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
| Sample anchor (Harps) | Warner Instruments | 64-0260 | Sample anchor must be compatible with incubation chamber |
| Sloflo In-line Solution Heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Neonatal Injections | |||
| 10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle | Hamilton Company | 80314 | |
| 30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| 4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm) | WPI World Precision Instruments | TW100-4 | |
| Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) | Sigma-Aldrich | V001229 | |
| AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF | Penn Vector Core | AV-9-PV2453 | Addgene Plasmid #45185 |
| AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF |
Penn Vector Core | AV-9-PV2454 | Addgene Plasmid #45186 |
| ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line | The Jackson Laboratory | 6410 | |
| Fast Green FCF Dye content ≥85 % | Sigma-Aldrich | F7252-25G | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Green tattoo paste | Ketchum MFG Co | 329A | |
| Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Pneumatic PicoPump | WPI World Precision Instruments | PV-820 | |
| Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents | |||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Carbogen (5% CO2, 95% O2) | AirGas | X02OX95C2003102 | Supplier may vary depending on region |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES, Free Acid | Bio Basic | HB0264 | |
| Hydrochloric acid solution, 1 N | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pH-Test strips (6.0-7.7) | VWR | BDH35317.604 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Software | |||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Open source |
References
- Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
- Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synaptic specificity and retinal circuit formation. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental biology. 10 (1), 379 (2021).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52 (4), 609-621 (2006).
- Wong, W. T., Faulkner-Jones, B. E., Sanes, J. R., Wong, R. O. Rapid dendritic remodeling in the developing retina: dependence on neurotransmission and reciprocal regulation by Rac and Rho. The Journal of Neuroscience. 20 (13), 5024-5036 (2000).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nature Protocols. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Morgan, J. L., Wong, R. O. L. Ballistic labeling with fluorescent dyes and indicators. Current Protocols in Neuroscience. 43 (1), 1-10 (2008).
- Nickerson, P. E. B., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Developmental Biology. 13, 24 (2013).
- Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. L. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
- Coombs, J. L., Van Der List, D., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells during postnatal development. The Journal of Comparative Neurology. 503 (6), 803-814 (2007).
- Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
- Stacy, R. C., Wong, R. O. L. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 456 (2), 154-166 (2003).
- Kay, J. N., et al. Retinal ganglion cells with distinct directional preferences differ in molecular identity, structure, and central projections. The Journal of Neuroscience. 31 (21), 7753-7762 (2011).
- Liu, J., Sanes, J. R. Cellular and molecular analysis of dendritic morphogenesis in a retinal cell type that senses color contrast and ventral motion. The Journal of Neuroscience. 37 (50), 12247-12262 (2017).
- Diao, L., Sun, W., Deng, Q., He, S. Development of the mouse retina: emerging morphological diversity of the ganglion cells. Journal of Neurobiology. 61 (2), 236-249 (2004).
- Coombs, J., vander List, D., Wang, G. Y., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells. Neuroscience. 140 (1), 123-136 (2006).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Sümbül, U., et al. A genetic and computational approach to structurally classify neuronal types. Nature Communications. 5, 3512 (2014).
- Lin, B., Masland, R. H. Populations of wide-field amacrine cells in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 499 (5), 797-809 (2006).
- Macneil, M. A., Heussy, J. K., Dacheux, R. F., Raviola, E., Masland, R. H. The shapes and numbers of amacrine cells: Matching of photofilled with Golgi-stained cells in the rabbit retina and comparison with other mammalian species. Journal of Comparative Neurology. 413 (2), 305-326 (1999).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Jo, A., Xu, J., Deniz, S., Cherian, S., DeVries, S. H., Zhu, Y. Intersectional strategies for targeting amacrine and ganglion cell types in the mouse retina. Frontiers in Neural Circuits. 12, 66 (2018).
- Siegert, S., et al. Genetic address book for retinal cell types. Nature Neuroscience. 12 (9), 1197-1204 (2009).
- Kim, I. -J., Zhang, Y., Meister, M., Sanes, J. R. Laminar restriction of retinal ganglion cell dendrites and axons: subtype-specific developmental patterns revealed with transgenic markers. The Journal of Neuroscience. 30 (4), 1452-1462 (2010).
- Peng, Y. -R., Tran, N. M., Krishnaswamy, A., Kostadinov, D., Martersteck, E. M., Sanes, J. R. Satb1 regulates contactin 5 to pattern dendrites of a mammalian retinal ganglion cell. Neuron. 95 (4), 869-883 (2017).
- Duan, X., Krishnaswamy, A., Dela Huerta, I., Sanes, J. R. Type II cadherins guide assembly of a direction-selective retinal circuit. Cell. 158 (4), 793-807 (2014).
- Ray, T. A., et al. Formation of retinal direction-selective circuitry initiated by starburst amacrine cell homotypic contact. eLife. 7, 34241 (2018).
- Krishnaswamy, A., Yamagata, M., Duan, X., Hong, Y. K., Sanes, J. R. Sidekick 2 directs formation of a retinal circuit that detects differential motion. Nature. 524 (7566), 466-470 (2015).
- Caval-Holme, F., Zhang, Y., Feller, M. B. Gap junction coupling shapes the encoding of light in the developing retina. Current Biology. 29 (23), 4024-4035 (2019).
- Lucas, J. A., Schmidt, T. M. Cellular properties of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells during postnatal development. Neural Development. 14 (1), 8 (2019).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. 10 (6), 540-547 (2013).
- Rossi, J., et al. Melanocortin-4 receptors expressed by cholinergic neurons regulate energy balance and glucose homeostasis. Cell Metabolism. 13 (2), 195-204 (2011).
- Lefebvre, J. L., Kostadinov, D., Chen, W. V., Maniatis, T., Sanes, J. R. Protocadherins mediate dendritic self-avoidance in the mammalian nervous system. Nature. 488 (7412), 517-521 (2012).
- Ing-Esteves, S., et al. Combinatorial effects of alpha- and gamma-protocadherins on neuronal survival and dendritic self-avoidance. The Journal of Neuroscience. 38 (11), 2713-2729 (2018).
- Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. L. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (1), (2013).
- Ramoa, A. S., Campbell, G., Shatz, C. J. Transient morphological features of identified ganglion cells in living fetal and neonatal retina. Science. 237 (4814), 522-525 (1987).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
- Cuntz, H., Forstner, F., Borst, A., Häusser, M. One rule to grow them all: a general theory of neuronal branching and its practical application. PLoS Computational Biology. 6 (8), 1000877 (2010).
- Xiao, H., Peng, H. APP2: automatic tracing of 3D neuron morphology based on hierarchical pruning of a gray-weighted image distance-tree. Bioinformatics. 29 (11), 1448-1454 (2013).
- Nanda, S., et al. Design and implementation of multi-signal and time-varying neural reconstructions. Scientific data. 5, 170207 (2018).
- Sherry, D. M., Wang, M. M., Bates, J., Frishman, L. J. Expression of vesicular glutamate transporter 1 in the mouse retina reveals temporal ordering in development of rod vs. cone and ON vs. OFF circuits. The Journal of Comparative Neurology. 465 (4), 480-498 (2003).
- Johnson, J., et al. Vesicular neurotransmitter transporter expression in developing postnatal rodent retina: GABA and glycine precede glutamate. The Journal of Neuroscience. 23 (2), 518-529 (2003).
- Jüttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (31), e1333 (2009).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e190 (2007).
- Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. The Journal of Comparative Neurology. 476 (3), 254-266 (2004).
- Huckfeldt, R. M., et al. Transient neurites of retinal horizontal cells exhibit columnar tiling via homotypic interactions. Nature Neuroscience. 12 (1), 35-43 (2009).
- Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779 (2020).
