Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Time-Lapse billeddannelse af neuronal arborisering ved hjælp af sparsom adeno-associeret virusmærkning af genetisk målrettede retinale cellepopulationer

Published: March 19, 2021 doi: 10.3791/62308
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Program for Neuroscience and Mental Health, Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Summary

Her præsenterer vi en metode til undersøgelse af neuritmorfogenese i postnatal mus retinale eksplantenter ved time-lapse konfokal mikroskopi. Vi beskriver en tilgang til sparsom mærkning og erhvervelse af retinale celletyper og deres fine processer ved hjælp af rekombinante adeno-associerede virusvektorer, der udtrykker membranmålrettede fluorescerende proteiner på en Cre-afhængig måde.

Abstract

Opdagelse af mekanismer, der mønstrer dendritiske arbors, kræver metoder til at visualisere, afbilde og analysere dendritter under udvikling. Musens nethinde er et kraftfuldt modelsystem til undersøgelse af celletypespecifikke mekanismer for neuronal morfogenese og forbindelse. Organiseringen og sammensætningen af retinale undertyper er veldefineret, og genetiske værktøjer er tilgængelige for at få adgang til specifikke typer under udvikling. Mange retinale celletyper begrænser også deres dendritter og / eller axoner til smalle lag, hvilket letter time-lapse-billeddannelse. Musens nethindeeksplanteringskulturer er velegnede til levende cellebilleddannelse ved hjælp af konfokal eller multifotonmikroskopi, men metoder, der er optimeret til billeddannelse af dendritdynamik med tidsmæssig og strukturel opløsning, mangler. Præsenteret her er en metode til sparsomt at mærke og afbilde udviklingen af specifikke retinale populationer præget af Cre-Lox-systemet. Kommercielt tilgængelige adenoassocierede vira (AAV'er), der anvendes her, udtrykte membranmålrettede fluorescerende proteiner på en Cre-afhængig måde. Intraokulær levering af AAV'er i neonatale mus producerer fluorescerende mærkning af målrettede celletyper 4-5 dage efter injektion (dpi). Membranens fluorescerende signaler kan detekteres ved konfokal billeddannelse og løser fine grenstrukturer og dynamik. Videoer i høj kvalitet, der spænder over 2-4 timer, erhverves fra billeddannelse af retinale flade monteringer perfuseret med iltet kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Der findes også en billedbehandlingsrørledning til dekonvolution og tredimensionel (3D) afdriftkorrektion. Denne protokol kan bruges til at fange flere cellulære adfærd i den intakte nethinde og til at identificere nye faktorer, der styrer neuritmorfogenese. Mange udviklingsstrategier, der læres i nethinden, vil være relevante for at forstå dannelsen af neurale kredsløb andre steder i centralnervesystemet.

Introduction

Dendritter af retinale neuroner danner indviklede, men specifikke mønstre, der påvirker deres funktion inden for neurale kredsløb. I hvirveldyrens nethinde bærer forskellige typer retinale ganglionceller (RGC'er) og amakrine celleinterneuroner unikke dendritiske morfologier, der adskiller sig i arborstørrelse, placering, grenlængde og densitet1. Under postnatal udvikling udvider RGC'er og amakrine celler sprudlende dendritiske processer til en neuropil kaldet det indre plexiformlag (IPL), hvor de modtager bipolære celleindgange, der transmitterer fotoreceptorsignaler2. Som fanget af time-lapse-billeddannelse af fluorescerende mærkede retinale populationer i kyllinger eller zebrafisklarver er dendritmorfogenese meget dynamisk3,4,5. Inden for få dage udvides, ombygges og forgrenes dendritiske arbors til smalle underlag i IPL, hvor de synapser med udvalgte partnere. Arbors udviser forskellige strukturelle dynamikker over udvikling, med ændringer i relative satser for grentilsætning, tilbagetrækning og stabilisering. Amakrine og RGC dendritter udviser også forskellige udvækst og ombygning adfærd, der kan afspejle typespecifik arborisering. Disse undersøgelser spores imidlertid brede amakrine eller RGC-populationer og fokuserede på laminær målretning, hvilket kun er et aspekt af morfologi.

De mekanismer, der producerer den enorme morfologiske mangfoldighed, der observeres på tværs af retinale undertyper, forstås dårligt. Formålet med denne gruppe var at udvikle en metode til at fange dendritdynamik og arbor-ombygning af definerede retinale undertyper i mus. Identifikation af celletypespecifikke mekanismer for dendritmønster kræver metoder til at visualisere og måle dendritadfærd hos celler af interesse. Organotypiske kulturer af musenethinden er velegnede til levende cellebilleddannelsesundersøgelser ved hjælp af konfokal eller multifotonmikroskopi. Udviklende nethinden dissekeres og monteres i et fladt eksplant, der kan afbildes i flere timer i et optagekammer eller dyrkes over et par dage med begrænsede virkninger på kredsløbet6,7. Levende retinale neuroner kan mærkes ved hjælp af en række teknikker, herunder farvestoffyldning med elektroder, elektroporation, biolistisk levering af partikler belagt med lipofile farvestoffer eller plasmider, der koder for fluorescerende proteiner (f.eks. Gene Gun), samt genetisk kodede celleetiketter7,8,9,10 . Disse tilgange er imidlertid ineffektive til billeddannelse af dendritdynamik af specifikke retinale undertyper. For eksempel er farvestoffyldningsmetoder lavgennemstrømning og kræver elektrofysiologiske apparater og yderligere genetiske etiketter for pålideligt at målrette mod celler af interesse. Desuden kan de stærke fluorescenssignaler i soma skjule nærliggende dendritter.

Biolistiske genleveringsmetoder kan samtidig mærke snesevis af celler, men trin, der involverer højtrykspartikellevering og inkubering natten over af isoleret nethinden, kan kompromittere cellefysiologi og dendritisk udvækst. Dette papir foreslår, at nyere genetiske værktøjer kan anvendes til at fange tidlig dendritdynamik med celletype og strukturel opløsning i betragtning af følgende eksperimentelle kriterier. For det første for at løse de fine grene og filopodier, der dominerer udviklende arbors, skal metoden mærke neuroner med lyse, fluorescerende proteiner, der fylder processer i hele arboret. Fluorescensmærkningen bør ikke falme på grund af fotoblevask i billeddannelsesperioden. En række fluorescerende proteinvarianter er blevet genereret og sammenlignet med hensyn til egnethed til in vivo/ex vivo-billeddannelse11 baseret på lysstyrke og fotostabilitet. For det andet skal de fluorescerende proteiner (XFP'er) udtrykkes på tilstrækkeligt høje niveauer af det tidligste stadium af dendritmorfogenese, således at det smalle udviklingsvindue ikke går glip af. I analyser af statiske tidspunkter i musenethinden sker dendritudvikling i løbet af den første postnatale uge og omfatter faser af udvækst, ombygning og stabilisering10,12,13,14,15. For det tredje bør metoden føre til selektiv mærkning eller til en øget sandsynlighed for mærkning af den neuronale underpopulation af interesse. For det fjerde skal mærkningen af måldelpopulationen være tilstrækkelig sparsom, således at hele neuronal arbor kan identificeres og spores. Selvom RGC og amakrine undertyper kan skelnes ved deres modne morfologiske egenskaber og IPL-stratificeringsmønstre16,17,18,19,20, er udfordringen at identificere undertyper under udvikling baseret på umodne strukturer. Denne opgave lettes af udvidelsen af transgene værktøjer til at mærke specifikke retinale celletyper under udvikling.

Transgene og knock-in muselinjer, hvor cellulær og tidsmæssig ekspression af fluorescerende proteiner eller Cre bestemmes af genregulerende elementer, anvendes i vid udstrækning til at studere retinale celletyper13,21,22,23. Nøgleobservationer om subtypespecifikke mønstre for dendritudvikling er kommet fra undersøgelser af transgene musenethinden på statiske tidspunkter10,14,24,25. Cre-Lox-systemet muliggør især udsøgt genmanipulation og overvågning af undertyper ved hjælp af en række rekombinaseafhængige journalister, sensorer og optogenetiske aktivatorer. Disse værktøjer har ført til opdagelser af subtypespecifikke molekylære programmer og funktionelle egenskaber, der ligger til grund for retinal kredsløbssamling26,27,28,29,30. De er dog endnu ikke udnyttet til at studere subtypespecifik dendritdynamik i musenehinden. Mærkning med lav densitet kan opnås ved at kombinere Cre-muselinjer med transgener indført ved elektroporation eller ved rekombinante AAV'er. Hvis det er tilgængeligt, kan tamoxifen-inducerbare Cre-linjer eller intersektionelle genetiske strategier også anvendes. Endelig skal cellen mærkes på en minimalt invasiv måde og afbildes ved hjælp af erhvervelsesparametre for ikke at kompromittere vævet eller forstyrre den cellulære funktion, der kræves til dendritmorfogenese.

Præsenteret her er en metode til at anvende transgene værktøjer og konfokal mikroskopi til at undersøge dendritdynamik i levende mus retinale eksplantenter. Cre transgene muselinjer er blevet kombineret med AAV-vektorer, der udtrykker fluorescerende proteiner ved Cre-rekombination, hvilket giver mulighed for sparsom mærkning af retinale celler af interesse. Kommercielt tilgængelige AAV'er leveres til neonatal nethinden ved intravitreale injektioner. Dette papir viser, at AAV'er producerer signifikant høje og celletypespecifikke fluorescerende udtryk med 4 dpi, hvilket giver adgang til postnatale tidspunkter. For at illustrere denne tilgang, den kolinerge "starburst" amakrine interneuron blev mærket ved at levere Brainbow AAV i neonatale mus, der udtrykker cholin acetyltransferase (ChAT)-internt ribosom entry site (IRES)-Cre transgen, som er aktiv i den tidlige postnatale nethinden31,32. Starburst amakrine celler udvikler en stereotyp og radial arbor morfologi, der er formet af dendrit selvundgåelse medieret af de klyngede protocadheriner33,34. Dette papir viser, at opløsningen af stjerneskudsdendritter og filopodier forbedres signifikant af XFP'er til plasmamembranen med tilføjelsen af CAAX-motivet, der gennemgår farnesylering, som anvendt til Brainbow AAV'erne31. Endelig er time-lapse-billeddannelse og efterbehandlingsprotokoller blevet bestemt, der producerer billeder af høj kvalitet, der er modtagelige for dendritrekonstruktion og morfometrisk kvantificering. Denne protokol kan bruges til at identificere faktorer, der styrer dendritmorfogenese og til at fange flere cellulære adfærd i den intakte nethinden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol strækker sig over 2 dage med en minimumsperiode på 4-5 dage for viral transduktion mellem forsøgsdage (figur 1A). Dyreforsøg udføres i overensstemmelse med Canadian Council on Animal Care Guidelines for Use of Animals in Research and Laboratory Animal Care i henhold til protokoller godkendt af Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee på Hospital for Sick Children (Toronto, Canada).

1. Forberedelser til neonatale AAV-injektioner og billeddannelsesforsøg

  1. Vælg en Cre-muselinje for at mærke de retinale cellepopulationer af interesse. Bekræft Cre rekombinasekspression på tidspunktet for AAV-injektioner ved at krydse til en Cre transgen reporter eller gennem immunstaining med et Cre-antistof.
  2. Rac transgene Cre-mus (8-16 uger gamle) for at generere Cre-positive neonatale dyr.
    BEMÆRK: Til denne demonstration blev ChAT-IRES-Cre knock-in mus brugt til at målrette mod de kolinerge Starburst amakrine celler.
  3. Få rekombinaseafhængig AAV-virus, der koder for fluorescerende protein(er). For optimal mærkning af fine processer skal du vælge vektorer, der udtrykker modificerede HHV'er rettet mod plasmamembranen.
    BEMÆRK: Denne undersøgelse anvendte Brainbow-virus (BBV), AAV-EF1a-BbTagBY og AAV9-EF1a-BbChT (se materialetabel), som giver mulighed for flerfarvet mærkning (figur 1B). Farnesyleret forbedret gult fluorescerende protein (eYFP) og monomert kirsebærudtryk (mCherry) producerede de stærkeste fluorescerende signaler til levende billeddannelse. En enkelt BBV kan bruges til at afbilde individuelle arbors, mens co-injektion af BBV'er kan bruges til at mærke flere celler eller nærliggende arbors med forskellige fluoroforer. Hvis du bruger flere fluorescerende proteiner, skal du sikre minimal overlapning af emissionsspektret (figur 1C). Parametre til anskaffelse af mikroskop skal justeres for at fange forskellige XFP-signaler.
  4. Forbered ∼3-5 μL alikvoter af AAV'er i individuelle lavbindende rør til engangslagre for at undgå fryse-/optøningscyklusser. Opbevares ved -80 °C.
  5. Forbered borosilikatglasmikropipetter med meget fine spidser ved hjælp af en mikropipettetrækker.
    BEMÆRK: Aftrækerindstillingerne varierer afhængigt af filament og aftræk, der bruges; se figur 2A for den endelige spidsstørrelse og -form. Typiske dråbediametre er 600 μm.
  6. Få et mikroinjektionssystem og tilhørende slange. Tilslut mikroinjektoren til en trykluftport.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel oversigt. (A) Denne protokol strækker sig over 2 dages forsøg med mindst 4-5 dages infektionsperiode mellem forsøgsdage. Intraokulære injektioner udføres på neonatale mus, der ikke er ældre end postnatal dag 3. Nethinden dissekeres derefter, fladmonteres og live-images for at fange det ønskede udviklingsvindue. Mærkede celler kan afbildes når som helst efter de nødvendige 4-5 dage, der er nødvendige for viral ekspression, da der ikke er nogen tilsyneladende virkninger af langvarig AAV-ekspression på dendritmorfologi. (B) Cre-afhængige Brainbow AAV-vektorer (BBV) injiceres i dyr, der udtrykker Cre31. I denne undersøgelse blev ChAT-Cre knock-in mus brugt til at drive Cre rekombination i starburst amakrine celler. De to BGV'er koder for modificeret eYFP eller tagBFP eller mCherry og mTFP, som ender i et CAAX-motiv , der sekventielt er farnesyleret til membranlokalisering. Lox-steder er afbildet med trekanter. Vektorerne udtrykker enten farnesylerede XSP'er på en stokastisk og kombinatorisk måde afhængig af Cre-rekombination. EF1α-promotoren indeholder regulatoriske elementer fra forlængelsesfaktor 1α-genet. W repræsenterer elementer fra woodchuck hepatitis virus posttranskriptionelt reguleringselement, og pA angiver polyadenyleringssekvensen. (C) Excitations- og emissionsspektrene for mCherry og eYFP, BBV-fluoroforerne afbildet i denne undersøgelse. Ved levende billeddannelse af flere fluorescerende proteiner skal detektionsparametrene være anbragt således, at emissionsspektrene adskilles tilstrækkeligt i forskellige kanaler. Forkortelser: AAV = adeno-associeret virus; BBV = Brainbow AAV; ChAT = cholin acetyltransferase; iRES = internt ribosomindgangssted; eYFP = forbedret gult fluorescerende protein; iTR = omvendt terminal gentagelse; tagBP = Tag-blåt fluorescerende protein; mCherry = monomer kirsebær; mTFP = blågrøn fluorescerende protein; XFP = ethvert fluorescerende protein; EF1α= forlængelsesfaktor 1 alfa. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Intravitreale injektioner af AAV'er i neonatale mus

  1. Tø en AAV-aliquot op på is. Forbered en ~ 1: 4 AAV-fortynding ved hjælp af steril saltvand eller fosfatbufret saltvand. Forbered ~ 0,5 μL AAV-fortynding pr. Dyr (~ 0,25 μL pr. Øje), hvis mikropipetten går i stykker, og en ny pipette skal fyldes. Opbevar den resterende ufortyndede AAV ved 4 °C, og brug den inden for 2 uger.
    BEMÆRK: I dette forsøg var leverandørens AAV-koncentration ~ 1-2 × 1013 genomindhold (GC) / ml og fortyndet til en endelig koncentration på 4 × 1012 GC / ml. Optimer viruskoncentrationen for at opnå den ønskede mærkningstæthed.
  2. For at visualisere injektionerne tilsættes ca. 1 μL 0,02 % Fast Green FCF-farvestofopløsning for hver 15 μL AAV-fortynding for at farve opløsningen blå.
  3. Overfør et musebur med dæmning og nyfødt kuld (postnatal dag (P) 0,5-3) til et procedurerum med mikroinjektionsudstyr. Hold dyrene i samme bur med rede og strøelse for at minimere moderens stress og afvisning af hvalpe.
  4. Steriliser injektionsområdet med 70% ethanol, og læg sterile blepuder på bænkoverflader. Forbered en varm platform (f.eks. En varmepude) til genopretning fra hypotermi-induceret anæstesi.
  5. Genopfyld mikropipetten med AAV-fortyndingen ved hjælp af en mikrosyring. Under et stereomikroskop skal du bryde mikropipettespidsen med en 30 G nål for at løsne spidsen.
    BEMÆRK: Figur 2A viser den genopfyldte spids - både forseglet (øverst) og uforseglet (midten).
  6. Anæstesi neonatale mus ved hypotermi ved at placere 1-2 dyr på is. Læg dyr på en latexhandske for at beskytte huden mod direkte kontakt med is. Når dyret ikke længere bevæger sig som reaktion på poteklemme (~ 2 minutter), skal du placere dyret under et stereomikroskop. Hvis det ønskes, tatovering pote puder med tatovering blæk og 30 G nål, og indsamle hale udklip til DNA isolationfor at identificere dyr ved genotyping.
    BEMÆRK: Passende overvågning af dybden af anæstesi skal ske under hele proceduren.
  7. Swab huden overlyser øjnene med 70% ethanol. Brug en 30 G nål til at åbne det smeltede øjenlåg (figur 2B). Påfør let tryk med fingrene for at åbne øjet, og stik et lille hul gennem hornhinden ved hornhinde-sclera-krydset (figur 2C).
  8. Indsæt glasmikropipetten i hullet, og tryk på mikroinjektorfodpedalen 2-4 gange for at injicere AAV'en i det intravitreale rum. Fjern langsomt mikropipetten, og bekræft AAV-injektionen ved at visualisere blåt farvestof gennem pupillen (figur 2D).
    BEMÆRK: Med et udstødningstryk på 6-8 psi og pulstid på 600-800 ms skubbes en dråbe med en diameter på 600 μm ud (figur 2A, nederst). Ca. 0,23-0,45 μL AAV-opløsning injiceres pr. Øje. Blå opløsning uden for øjet indikerer, at AAV ikke blev injiceret i øjet. Blå opløsning, der lækker fra injektionsstedet, indikerer, at AAV kan være lækket ud, hvilket reducerer transfektionseffektiviteten.
  9. Tryk forsigtigt øjenlågene sammen for at forsegle igen, og læg hvalpen på en opvarmet pude. Når dyrene genvinder en lyserød farve og reagerer, skal du forsigtigt overføre dem tilbage til husburet.
    BEMÆRK: Sørg for, at der træffes passende forholdsregler for at undgå for hurtig genopvarmning af hvalpene.
  10. Gentag injektionsproceduren for de resterende dyr i kuldet. Tillad mindst 4-5 dage til viral transduktion, før du billeddannelse af nethinden.

Figure 2
Figur 2: Neonatale intraokulære injektioner. (A) Genopfyldt mikropipette viser pipettespidsens form, når den er forseglet (øverst), og efter at spidsen er forseglet (nederst, til venstre). Pico-injektionstryk på 6-8 psi og pulstid på 600-800 ms producerer en dråbe med en diameter på 600 μm (nederst, til højre). Skalabjælke = 1 mm.(B) Bedøjpetiseret P0-hvalp under 16x forstørrelse. Det smeltede øjenlågskryds (hvidt) spaltes åbent ved hjælp af en skarp 30 G nål. Skalastang = 2 mm. (C) Let tryk, der påføres øjet, udsætter hornhinden; skalastang = 2 mm. Zoomet sektion (rød) viser det lille hul ved hornhinde-sclera-krydset (gult) oprettet med en 30 G nål; skalastang = 0,5 mm. (D) Tilbagetrækning af pipettespidsen efter injektion (til venstre). Hurtiggrønt farvestof i AAV-opløsningen fremstår som blågråt gennem pupillen (midten) sammenlignet med den lyse pupilfarve før injektion (til højre). Skalastang = 1 mm. (E) Efter 4 dage er øjenlåget helet og smeltet lukket (venstre); skalastang = 2 mm. Ved enukleation er det helede injektionssted synligt (gult); skalastang = 1 mm. Bemærk placeringen af injektionsstedet ved grænsen mellem hornhinden og scleraen. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Retinale dissektioner til billeddannelseseksperiment

  1. Forbered retinal aCSF (119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2·6H2O, 2,5 mM CaCl2·2H2O, 1 mM NaH2PO4, 11 mM glucose og 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES-fri syre)35. Hvis det ønskes, fremstilles og fryses 10x opløsning; optø og fortynd til 1x efter behov.
  2. Oxygenere retinal aCSF ved at boble med carbogen (95% O2, 5% CO2) i mindst 15 min. Juster pH til 7,4. Opbevares i en forseglet beholder indtil brug for at sikre, at aCSF forbliver iltet.
    BEMÆRK: Nethinden kræver en høj koncentration af O2. Det er vigtigt at holde aCSF iltet gennem hele eksperimentet.
  3. Integrer en petriskål med en diameter på 60 mm i en isbakke (mode en isbakke ud af laboratorieplast, f.eks. Et pipettebokslåg), og læg den under et stereomikroskop. Fyld petriskålen med iltet retinal aCSF.
  4. Afliv mus P9 og yngre ved halshugning. Afliv mus P10 og ældre ved isofluraninduktion eller en alternativ metode, der er godkendt i henhold til dyreprotokollen, efterfulgt af halshugning.
  5. Hvis øjenlågene er forseglet, skal du skære øjenlågsklappen for at udsætte øjet. Brug tang til at enukleere øjnene, og overfør dem til den kolde retinale aCSF fra trin 3.3.
  6. For at dissekere retinalkoppen under et stereomikroskop (forstørrelse 25x) stabiliseres øjet ved at klemme synsnerven ved hjælp af en Dumont #5 tang (figur 3A).
  7. Stik et hul i midten af hornhinden med en 30 G nål, og indsæt derefter en spids af mikrosaksen i hullet for at lave et snit fra hullet til enden af hornhinden. Gentag for at lave 4 skiver i kardinalretningerne, hvilket skaber 4 "klapper" (figur 3A).
  8. Med to Dumont #5 tang skal du gribe og trække de to tilstødende klapper fra hinanden og forsigtigt skrælle sclera fra nethinden. Gentag med de resterende hornhindeklapper, og fjern scleraen fra nethinden (figur 3B).
  9. Fjern linsen fra retinalkoppen ved hjælp af tangen. Med mikrosaks laves 4 radiale snit fra nethindens kant mod synsnerven, hvilket skaber 4 lige store kronblade (figur 3B). Gentag trin 3.4-3.7 for det andet øje.

4. Retinal fladmonteret forberedelse

  1. Forbered grå blandede celluloseester (MCE) membranfilterskiver til montering. Hvis du bruger MCE-membranfiltre med stor diameter, skal du skære disken i kvadranter (ca. 1 cm på tværs). Placer MCE-disken på midten af et større hvidt filterpapir (figur 3D).
    BEMÆRK: MCE-filtre fås også i skiver med en diameter på 1 cm. MCE-filterskiven skal være stor nok til at passe til 1-2 nethinden, men lille nok til at passe ind i billedkammeret. Da MCE-membraner holder en statisk ladning, minimeres kontakt og håndtering af MCE-membranen.
  2. Håndtering af nethinden ved hjælp af to størrelse 3/0 pensler, vend en retinal kop på en pensel med retinal ganglion celle side nedad. Løft forsigtigt nethinden ud af aCSF'en, og sørg for, at vandspændingen ikke river nethinden (figur 3C).
  3. Mens du stadig holder penslen med nethinden, skal du bruge en overførselspipette til at placere en dråbe aCSF i midten af MCE-filterpapiret (figur 3C, til højre). Flyd nethinden ind i dråben af aCSF skabt af overfladespændingen. Brug pensler til at placere nethinden RGC-siden op i dråben og til at folde de fire kronblade ud.
  4. Når den er placeret, skal du oprette en vandbro mellem penslen og det hvide filterpapir for at bryde dråbens overfladespænding.
    BEMÆRK: Når aCSF er ondt væk, klæber nethinden til MCE-filterpapiret (figur 3D,E). Fladmonterede nethinden kan håndteres ved at gribe fat i MCE-skiven med tang. Hvis aCSF-dråben hurtigt transporteres væk, inden der dannes en vandbro, kan dette tyde på, at MCE-membranen ikke er opladet. Brug en frisk MCE-membran, og minimer tiden mellem enukleation og billeddannelse ved at dissekere og fladmonterings nethinder umiddelbart før du flytter nethinden ind i billedkammeret.

Figure 3
Figur 3: Retinal dissektion og fladmontering på blandede celluloseesterfiltermembraner. (A) Til venstre stabiliseres et enukleeret øje ved at gribe fat i synsnerven med Dumont #5 tang (venstre). Et lille hul oprettes i midten af hornhinden ved hjælp af en 30 G nål (i midten). Mikrodissektionssaks bruges til at skære hornhinden i 4 lige klapper (højre). Skalastang = 1 mm. (B) Dissekeret nethinde med sclera skrællet af ved hjælp af to Dumont #5 tang (venstre) og med linsen fjernet (i midten). Nethinden med 4 lige store snit halvvejs ind i nethinden (til højre). Vægtstang = 1 mm. (C) Håndtering af nethinden med to fine pensler (størrelse 3/0, venstre). Nethinden vendte med retinale ganglionceller med siden nedad på en pensel (i midten) og løftes ud af aCSF, hvilket sørger for, at vandspændingen ikke river nethinden (højre). Vægtstang = 2 mm. (D) Grå MCE-membranskive anbragt på et hvidt filterpapir (til venstre). En dråbe aCSF på MCE-disken (til højre). Skalastang = 1 cm. (E) Når du har svævet nethinden i dråben og placeret dem, skal du oprette en vandbro med det hvide filterpapir for at transportere aCSF'en og trække nethinden på det ladede MCE-papir (til venstre); skala bar = 1 cm. Zoomet billede af MCE-membranen (rød) viser 2 nethinder monteret med retinale ganglionceller med siden op (højre); skalastang = 2 mm. En nethinde er skitseret i hvidt. Forkortelser: MCE = blandet celluloseester; aCSF = kunstig cerebrospinalvæske. Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Time-lapse konfokal billeddannelse af levende helmonterede nethindepræparater

  1. Saml inkubationskammeret til levende billeddannelse til et opretstående konfokalmikroskop som vist i figur 4.
    BEMÆRK: For omvendte konfokalsystemer placeres flade RGC-sider nedad direkte på inkubationskammerets glasbundsdæksler. Når nethinden kommer i kontakt med dæksedlen, kan de ikke flyttes.
  2. Fyld kammeret med iltet aCSF, og tænd pumpen og temperaturregulatoren (temperatur 32-34 °C, strømningshastighed 1 ml/min). Lad ikke temperaturen stige til over 34 °C.
  3. For at overføre retinal flat-mount til perfusionskammeret skal du stoppe pumpen og fjerne aCSF'en, der er i kammeret. Anbring MCE-skiven med retinal fladmonteringen i det (tomme) inkubationskammer.
  4. Anbring en prøvevægt på det flade beslag; forvæde vægten for at bryde overfladespændingen. Genopfyld kammeret med den opvarmede aCSF, og cirkulere aCSF ved ~ 1 ml / min.
  5. Placer næsestykket med 25x vanddypningsmålet (numerisk blænde 0,95) i billedkammeret. Skærm for mærkede celler af interesse ved hjælp af epifluorescerende lys (figur 4C).
  6. Juster billedvolumen for at fange dendritiske funktioner af interesse.
    BEMÆRK: Denne undersøgelse fangede den komplette dendritiske arbor ved 1024 x 1024 pixels pr. Ramme, z-trin 1 μm og en billedhastighed på 2 minutter mellem hver z-stak. Endelige billedstørrelser er ~ 100 μm x 100 μm x 20 μm.
  7. Hvis du vil justere lasereffekten til en optimal indstilling, skal du bruge en opslagstabel, der identificerer både overmættede og undermættede pixels. Under scanningen skal du justere lasereffekten, så ingen pixels er overmættede (dvs. ved en intensitet på 255 eller derover). Fortsæt med at billeddanne, så længe det er nødvendigt, eller indtil der er et signifikant og påviseligt fald i fluorescerende signal og stigning i støj (typisk 2-4 timer).
    BEMÆRK: Reduceret lasereffekt anbefales, da dekonvolutionsalgoritmer fungerer optimalt, når pixels fordeles over hele det dynamiske område. Pixelintensiteten må ikke overstige 254; empiriske analyser af neuritter afslørede, at pixelværdier under 170 er ideelle til dekonvolution. Hurtige scanningshastigheder (400-600 Hz) med linjegennemsnit (2-3) foretrækkes frem for enkelte, langsommere scanninger af den samme samlede pixelopnørelsestid. Området med langvarig billeddannelse ofte fotobleches, men andre explant sektioner forbliver levedygtige. Flere regioner i en flad montering kan afbildes, hver i 2-4 timer, med en samlet inkubationstid på 6 timer. Billedbehandlingssessioner ud over 6 timer er ikke blevet systematisk testet. Neuritnedbrydning og blødning er tegn på, at eksplantationens levedygtighed er faldende.
  8. Efter billeddannelse fastgøres retinale fladbeslag og membranfilter med koldt 4% paraformaldehyd i 1-2 timer ved 4 ° C. Forstærk de fluorescerende etiketter i de faste nethinden ved hjælp af immunhistokemi til yderligere analyser.
    BEMÆRK: Fiksering efter billeddannelse er ikke mulig, når du bruger en omvendt konfokal; nethinden er ikke aftagelig uden at ødelægge vævet.

Figure 4
Figur 4: Opsætning af levende cellebilleddannelsesinkubationskammer. (A) Live-imaging inkubationsapparater, der viser opvarmnings-, opløsnings- og billeddannelseskomponenter. Dobbelt varmelegeme inkluderer en opvarmet inkubationskammerplatform (bagcirkel med blå stikelektroder) og en in-line opløsningsvarmer. B) Skematisk diagram over 4A. Retinal flat-mount (rød) på MCE-membran (grå) placeres i inkubationskammeret. In-line-opløsningsvarmeren er tilsluttet en opløsningspumpe (ikke afbildet i 4A). Billedkammerdimensioner giver et godt arbejdsområde for den dyppende objektive næse. (C) 25x visning af et retinalt eksplantationsmiddel injiceret med 0,23-0,45 μL af 4 × 1012 GC/ml AAV-fortynding; skalabjælke = 100 μm. Tæt mærkning af celler omgiver ofte det optiske nervehoved (stiplet linje, nederst til højre); skalastang = 50 μm. Forkortelser: MCE = blandet celluloseester; GC = genomkopier; mCherry = monomer kirsebær; eYFP = forbedret gult fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Billeddekonvolution og efterbehandling i ImageJ

  1. Importer billedserien, opdel serien efter tid, og farve, hvis det er et flerfarvet billede. Sørg for, at alle tidspunkter for en farve er indeholdt i den samme mappe.
    BEMÆRK: Importer bioformater, hvis du bruger ImageJ (Bio-formater er automatisk inkluderet i FIJI).
  2. Opret en teoretisk punktspredningsfunktion (PSF) ved hjælp af ImageJ-pluginet, Diffraction PSF 3D.
    BEMÆRK: Hver billedbehandlingskanal kræver sin egen PSF, da fluorescerende proteinemissionsbølgelængde påvirker PSF.
  3. Brug plugins | Makroer | Kør for at udføre batch Parallel Iterative Deconvolution for alle tidspunkter ved hjælp af den medfølgende makro (Supplerende fil 1).
    BEMÆRK: Denne makro kører 25 iterationer af Wiener Filter Preconditioned Landweber (WPL) iterative algoritme. Hver farvekanal skal dekonvolveres separat.
  4. Flet farvekanalerne, og kompiler alle tidspunkter til en Hyperstack (image | Hyperstacks | Stakke til Hyperstack). Ret 3D-driften ved hjælp af plugins | | Korrekt 3D-drift.
  5. Returner billedet til en almindelig stak (Billede | Hyperstacks | Hyperstack to Stack), og opdel tidspunkterne (Billede | Stakke | Værktøjer | Stack Splitter). Brug batchbehandling til at oprette maksimal projektion for alle tidspunkter (Proces | Batch | Makro | run("Z Project...", "projection=[Max Intensity]"); ).
  6. Importer timelapse-billedsekvensen (File | Import | Billedsekvens). Brug konventionelle ImageJ-værktøjer til ønsket analyse af dekonvolveret og efterbehandlet todimensionel (2D) video.
    BEMÆRK: Firedimensionelle (3D + tid) dekonvolverede og driftkorrigerede videoer kan ses som en hyperstack. Udelad det forrige trin for at opretholde 3D-tidspunkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af ovenstående protokol blev en højopløselig 3D-video af udvikling af starburstcelledendritter erhvervet, dekonvolveret og korrigeret for 3D-drift. Z-plan maksimale fremskrivninger blev produceret for at lave 2D-videoer til analyse (supplerende video 1, figur 5A). 3D-dekonvolution af hvert tidspunkt øgede opløsningen af fine filopodia-fremskrivninger (figur 5B,C). Fine filopodia fremspring er et træk ved at udvikle retinale dendritter36 og bør være synlige under billeddannelse. AAV-transfektion vil producere variabilitet i cellemærkningstæthed og fluorescensintensitet. Skærm således det mærkede væv for at vælge celler med høje fluorescerende signaler til billeddannelse og produktion af videoer i høj kvalitet. Det anbefales ikke at øge lasereffekten til at detektere svagt mærkede celler, da det kan føre til hurtig fotoblegning og introducere høj støj sammenlignet med signalet. Tilstrækkeligt lyse celler er synlige inden for 5 dpi. Ved 12 dpi og derover fører langvarige AAV-infektionsperioder ikke nødvendigvis til øget fluorescens af mærkede celler (figur 5D).

Overdreven fluorescens og neurittrængsel fra tæt cellemærkning påvirker billedkvaliteten og kan hindre enkeltcellerekonstruktioner. Optimering af AAV-fortynding og volumen er nødvendig for at opnå den ønskede grad af isolerede og fluorescerende mærkede arbors, der kan adskilles fra resten af målcellepopulationen. Her blev 9,2 × 108-1,8 × 109 virale GC'er injiceret pr. øje for at målrette stjerneskudte amakrine celler (0,23-0,45 μL AAV med en 4 × 1012 GC / ml titer). Fraværet af et fluorescerende signal kan afspejle en ineffektiv injektionsteknik. Under injektion indikerer lækage af den blå AAV-opløsning fra injektionsstedet, at virussen ikke leveres til nethinden, eller at injektionsvolumenet eller trykket er for højt. Overskydende injektionsvolumen eller tryk kan forårsage nethindeløsning og / eller tab af okulært tryk, beskadige nethindecellerne og reducere cellemærkningseffektiviteten. Begge problemer kan løses med øvelse og optimering af injektionsteknikken. Andre potentielle årsager til manglen på signal omfatter nedbrydning af AAV'erne fra forkert opbevaring eller utilstrækkelig Cre-ekspression, fordi Cre-transgenet ikke er aktivt i perioden med AAV-transfektion.

Når videoer er dekonvolveret, kan dynamiske analyser, såsom beregning af hastigheden for grentilføjelse, tilbagetrækning eller stabilisering, udføres. Derudover kan konventionel statisk analyse udføres på hver tidsramme, herunder neuronrekonstruktion og morfometriske kvantificeringer såsom total grenlængde, grenvinkler, grenrækkefølge eller antal terminale grenpunkter. Resultatet af denne protokol er en tidsserie af 3D-billedstakke i høj opløsning. De fleste dynamiske 3D-neuritvideoer kvantificeres manuelt som en maksimal projektion ved hjælp af en open source-billedvisualiseringssoftware som ImageJ37. Et andet open source-værktøj, Vaa3D38, er udviklet specielt til visualisering af store mængder. Hvis videoer skal analyseres i 3D, anbefales det at bruge en 3D + tidsvisualisator som Vaa3D. ImageJ og Vaa3D giver direkte adgang til pixels eller voxels i billedet, men ofte oprettes neuronrekonstruktioner ved at konvertere pixeldata til skeleterede trærekonstruktioner. Automatiske eller halvautomatiske neuronrekonstruktioner til enkelte tidspunkter kan udføres med open source39,40,41 og proprietær software. For at analysere time-lapse-rekonstruktioner skal hvert punkt på rekonstruktionen knyttes til det foregående og de efterfølgende tidspunkter. Justering af komplekse dendritiske morfologier over tid, som kan kodes af op mod 500 datapunkter, er fortsat et udfordrende problem. Der findes mange værktøjer med forskellige styrker og begrænsninger, og de skal udvælges, så de passer til de analyser, der er nødvendige for undersøgelsen.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative resultater efter neonatal intraokulær injektion, time-lapse-billeddannelse og dekonvolution. (A) Maksimale fremskrivninger af dekonvolverede time-lapse-billeddannelsesserier (h:min) af P6 starburst amakrine celle 5 dage efter AAV-injektion. Fin filopodiadynamik kan nu analyseres ved hjælp af konventionelle ImageJ-værktøjer. Et område med dendritisk raffinement (rød boks) og et område med dendritisk udvækst (grøn boks) fremhæves. (B, C) Enkelt P6 starburst amakrin celle mærket med membranmærket eYFP 5 dage efterAAV injektion (dpi) viser lys enkeltcelle mærkning. Skalastænger til øvre paneler = 50 μm; skalastænger til nedre paneler = 25 μm. Før (A) og efter (B) dekonvolution med ImageJ. Insets (rød) viser deblurring som følge af vellykket dekonvolution. (D) P6 starburst amacrine cell 5dpi (venstre) sammenlignet med P12 starburst celle 11 dpi viser lignende niveauer af fluorescerende proteinekspression. Forøgelse af AAV-inkubationstider øger ikke fluorescerende signal. De fluorescerende signaler falder ikke med længere AAV-infektionsperioder. Identiske anskaffelses- og efterbehandlingsparametre blev anvendt på begge billeder. Øget grentykkelse og varikositeter observeret ved P12 er normale træk ved modne stjerneskudsceller og ikke en mærkning eller billeddannelsesartefakt. Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: AAV = adeno-associeret virus; eYFP = forbedret gult fluorescerende protein; dpi = dage efterinfektion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Overvejelser om valg af Cre-linje og fluorescerende proteinlokalisering.

(A-D) Levende P11 retinale ganglionceller afbildet ved 9 dpi af BBV injiceret i Vglut2-iRES-Cre knock-in mus, hvor Cre selektivt udtrykkes i RGC-populationen. A) JAM-B RGC identificeret ved sin karakteristiske asymmetriske morfologi24. (B-D) Forskellige RGC-undertyper, der adskiller sig i deres dendritstratificeringsmønstre. (E) Billede af levende P11 starburst amakrine celle biolistisk transfekteret med cytosolisk mCherry og fanget med roterende disk konfokal på 512 x 512 pixels. Den cytosoliske XFP fører til højt fluorescenssignal i soma i forhold til de fine dendritiske fremspring. Ufokuseret lys fra soma forårsager høj baggrundsfluorescens ved billeddannelse af små proksimale fremspring (indsætning i rød boks ovenfor er vist nedenfor). (F) Billede af levende P11 starburst amakrine celle transfekteret med membran-målrettet eYFP og fanget ved konfokal laserscanning ved 1024 x 1024 pixels. Bemærk den fluorescerende membranring omkring somaen, det forbedrede signal-støj-forhold og kvaliteten af de fine fremspring, der er proksimale til soma, der produceres af membranmålrettede fluorescerende proteiner (indsat). Skalastænger = 50 μm og for nedre paneler af E og F = 5 μm. Forkortelser: IRES = internt ribosomindgangssted; BBV = Brainbow adeno-associeret virus; Vglut2 = vesikulær glutamattransportør 2; XFP = ethvert fluorescerende protein; eYFP = forbedret gult fluorescerende protein; mCherry = monomer kirsebær; RGC = retinale ganglionceller; JAM-B = krydsadhæsionsmolekyle B. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende video 1: Time-lapse video af P6, der udvikler starburst amakrine dendritter, 5 dage efterinjektion. Video time-step er 2 min. Dekonvolution og 3D-driftkorrektion blev anvendt ved hjælp af ImageJ. Top gule felter fremhæver områder med udvækst, og den nederste boks skitserer et område med forbigående filopodia-udvækst, selvkontakt og tilbagetrækning. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende fil 1: ImageJ-makro til batch Parallel Iterativ Deconvolution. Makroen kører 25 iterationer af Wiener Filter Preconditioned Landweber (WPL) iterative algoritme. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne video demonstrerer en eksperimentel pipeline, der bruger eksisterende genetiske værktøjer til at afbilde dendritdynamik ved udvikling af retinale neuroner med konfokal live-imaging. Også demonstreret er intraokulære injektioner af Cre-afhængige AAV'er, der koder membranmålrettede fluorescerende proteiner i neonatale mus. Enkeltceller fra genetisk målrettede populationer er stærkt mærket så tidligt som 4-5 dpi. Retinale fladmonteringer blev forberedt til standard billeddannelseskamre til at udføre levende celle konfokal billeddannelse. Denne metode producerer time-lapse-videoer i høj opløsning af enkeltceller og deres fine fremskrivninger. Små fremskrivninger løses og kvantificeres ved hjælp af dekonvolutions- og efterbehandlingsalgoritmer, der er tilgængelige via open source-software, herunder ImageJ, Vaa3D og ShuTu, samt licenseret software tilgængelig fra Imaris og MBF Bioscience. Da denne pipeline er modulær, kan hvert protokolafsnit ændres, så det passer til undersøgelsens mål. Disse modulære elementer diskuteres nedenfor og omfatter: 1) Cre-line udvælgelse, 2) valg af fluorescerende protein og viral konstruktion, 3) genleveringsmetoder og 4) billeddannelsesmetode.

Denne teknik bruger Cre transgene linjer til genetisk adgang til retinale celle subpopulationer. Cre skal være aktiv postnatalt og udtrykt på tværs af cellepopulationen på injektionstidspunktet for at øge sandsynligheden for virusinfektion og cellemærkning. I denne rapport blev ChAT-Cre brugt til at målrette starburst amakrine celler, og Vglut2-Cre-linjen blev brugt til at målrette udviklingen af RGC'er42,43 (figur 6). Cre-afhængig AAV-injektion i Vglut2-IRES-Cre knock-in-mus mærkede en række RGC'er, herunder krydsadhæsionsmolekylet B-celle (figur 6A) og bistratificerede RGC'er (figur 6B, C). Alternativt kan nye design af AAV'er med syntetiske promotorer, der driver celletypespecifikt udtryk, eliminere behovet for Cre transgene linjer44. En anden overvejelse for effektiv og lys mærkning, der er egnet til levende billeddannelse, er den minimale tid, der kræves til transfektion og ekspression, som kan variere afhængigt af AAV-serotypen, tropismen og titeren45. I disse undersøgelser, da AAV-medieret mærkning kræver mindst 4-5 dpi for XFP-ekspression, er denne metode ikke egnet til at få adgang til tidlige postnatale tidspunkter. For at fange tidlige tidspunkter (f.eks. P0-P4) kan intraokulære injektioner udføres i livmoderen hos embryonale dyr, som det gøres for in utero elektroporation46. I denne gruppes studier af udviklingen af stjerneskud dendrit blev det oprindelige sparsomme rekombinationsmønster af ChAT-Cre udnyttet til at mærke enkeltstjerneskud amakrine celler på P0-P4 ved hjælp af en musetransgen Cre-reporter, Rosa-mTmG27. Endelig kan denne AAV retinale injektionsprotokol bruges til at mærke voksne cellepopulationer baseret på bekræftelsen af persistensen af fluorescerende mærkning 3 måneder efter injektion uden skadelige virkninger på stjerneskudscellemorfologi34.

Denne pipeline giver også mulighed for fleksibilitet i udvælgelsen af viral konstruktion. For at fange dendritdynamik kan en række fluorescerende reporterproteiner anvendes, herunder proteiner, der lokaliserer til specifikke subcellulære strukturer, proteiner af interesse eller rapporterer funktionelle ændringer såsom actindynamik (f.eks. LifeAct) og calciumsignaler (f.eks. GCaMP). Enhver kommercielt tilgængelig eller klonet AAV-vektor kan anvendes, og onlineværktøjer som fpbase.org bør refereres til for lysstyrke og fotostabilitet. Her blev Brainbow virale vektorer, der koder for fluorescerende proteiner med et H-Ras farnesylering CAAX-motiv, brugt til membranlokalisering. Tidligt i protokoludviklingen viste cytosolisk lokalisering af XPF'er sig ikke at være ideel til at studere fin neuritmorfologi med en overmætning af signaler fra soma og dårlig mærkning af fine grene (figur 6E). Til sammenligning viste det sig, at membranmålrettede fluorescerende proteiner mærkede og løste fine dendritiske fremspring (figur 6E,F). En anden overvejelse er størrelsen, designet og kompleksiteten af den virale konstruktion, som kan påvirke udtrykstiden. For eksempel blev AAV-CAG-FLEx-mClover3-CAAX genereret, hvilket udtrykker en XFP på en Cre-afhængig måde. Denne konstruktion har et enklere design og resulterer i et effektivt udtryk med 4 dpi. Sammen gør de forskellige muligheder for Cre-linjer, AAV-design og fluorescerende proteinreportere, der er bredt tilgængelige fra lagre (f.eks. JAX, Addgene og Viral Vector Cores), denne pipeline tilpasningsdygtig til en række undersøgelser af celletyper og udviklingsfænomener i nethinden.

Selvom denne protokol beskriver intraokulære AAV-injektioner, er andre genleveringsmetoder tilgængelige, såsom plasmidelektroporation46 og biolistisk genlevering (f.eks. Gene Gun)7. Elektroporation kræver anvendelse af en elektrisk puls, og biolistisk genlevering kræver ex vivo-inkubation af retinale eksplantationer. AAV-mærkning er mindre invasiv end begge disse metoder og tillader akutte præparater af nethindens eksplantationer lige før billeddannelse. Sammenlignet med biolistisk genlevering (figur 6E,F) resulterede AAV-injektioner i forbedret vævs levedygtighed, der var bedre egnet til kontinuerlig erhvervelse, der var nødvendig for at spore neuritdynamik. Med korrekt teknik udgør AAV-mærkning ringe eller ingen skade på nethinden, som bedømt ud fra vævets sundhed på dissektionstidspunktet. Intravitreale injektioner inficerer primært celler i ganglioncellelaget og det indre nukleare lag, såsom RGC'erne og amakrine celler. Mange snesevis af starburst amakrine celler er typisk mærket, med en øget tæthed af mærkede celler omkring det optiske nervehoved (figur 4C). Men med alle tre transfektionsmetoder er optisk nerveafskæring uundgåelig for at opnå retinale eksplantationer og vil føre til RGC-degeneration. På trods af optisk nerveafskæring rapporterer undersøgelser levedygtige retinale eksplantationer fra en række hvirveldyrmodeller i 36 timer og op til 6 dages postukleation5,6,7,47,48.

Endelig er nytten af konfokal mikroskopi til at fange dendritdynamik blevet påvist. Typisk strækker en billeddannelsessession sig over 2-4 timer og afsluttes, før vævsnedbrydning eller neuritblødning observeres. Billeddannelsessessioner op til 6 timer er blevet gennemført; Den øvre grænse er imidlertid ikke blevet systematisk testet. Områder kan gennemgå fotoblegning på grund af langvarig billeddannelse, men celler i andre synsfelter i eksplantationen forbliver levedygtige til levende billeddannelse. Denne metode kan også udvides til multifoton eller lightsheet mikroskopi til billede neuronal morfologi i dybere lag og større volumener. Multifotonbilleddannelse er blevet udført for at studere neuritdynamik i musenethinden og er bedre egnet til at studere celler i dybere retinale lamina (f.eks. Vandrette eller fotoreceptorceller)49. For nylig blev live-celle lightsheet mikroskopi brugt til at fange retinal angiogenese50, hvilket giver en ny vej til live-billeddannelse af morfogenese i hele nethinden. Live-celle lightsheet mikroskopi kunne bruges til at studere neurale kredsløb samling i større skalaer, såsom axon-dendrit målretning. Flerfarvet live-imaging er en anden anvendelse af denne rørledning, der kan bruges til at undersøge celle-celle-interaktioner, såsom nabocellernes indflydelse på dendritudvikling eller andre udviklingsfænomener såsom flisebelægning af retinale celler, herunder RGC-undertyper1, microglia og astrocytter.

Afslutningsvis er et udfordrende aspekt af udviklingsstudier at få adgang på disse kritiske tidspunkter. Denne protokol giver en metode til at visualisere morfogenese, der opstår under et specifikt tidsmæssigt vindue. Pipelinen kombinerer eksisterende værktøjer og teknikker til genetisk at målrette cellepopulationer og udtrykke membranmålrettede fluorescerende proteiner. Akutte retinale fladmonterede præparater opretholder levedygtighed og fluorescerende signaler til levende cellekonfokal billeddannelse over flere timer. Forbigående og dynamiske aspekter af dendritudvikling fanges i 3D-videoer og efterbehandles ved hjælp af open source-software. Evnen til at optage 3D-videoer i høj opløsning er afgørende for at undersøge dynamiske udviklingsprocesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Madison Gray for at give mig en hånd, da jeg ikke havde nogen. Denne forskning blev støttet af et NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), et Sloan Fellowship i neurovidenskab og en Canada Research Chair Tier 2 (til LER). S. Ing-Esteves blev støttet af Vision Science Research Program og NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Addgene viral prep #45185-AAV9
Addgene viral prep #45186-AAV9
Dissection tools
Cellulose filter paper Whatman 1001-070
Dumont #5 fine forceps FST 11252-20 Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection
Dumont forceps VWR 82027-426
Fine Scissors FST 14058-09
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size Millipore HABG01 300
Petri Dish, 50 × 15 mm VWR 470313-352
Polyethylene disposable transfer pipette VWR 470225-034
Round tip paint brush, size 3/0 Conventional art supply store Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting
Surgical Scissors FST 14007-14
Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge FST 15000-08
Live-imaging incubation system
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' Warner Instruments 64-0755
Dual channel heater controller, Model TC-344C Warner Instruments 64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective Leica 15506374
Heater controller cable Warner Instruments CC-28
Large bath incubation chamber with slice support Warner Instruments RC-27L
MPII Mini-Peristaltic Pump Harvard Apparatus 70-2027
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) Warner Instruments PM-6D
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump Harvard Apparatus 55-4148
Sample anchor (Harps) Warner Instruments 64-0260 Sample anchor must be compatible with incubation chamber
Sloflo In-line Solution Heater Warner Instruments SF-28
Neonatal Injections
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle Hamilton Company 80314
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) BD PrecisionGlide 305106
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)  WPI World Precision Instruments TW100-4
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) Sigma-Aldrich V001229 
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF Penn Vector Core AV-9-PV2453 Addgene Plasmid #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP
1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF		 Penn Vector Core AV-9-PV2454 Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line The Jackson Laboratory 6410
Fast Green FCF Dye content ≥85 % Sigma-Aldrich F7252-25G
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 Sutter Instrument Co. P-97
Green tattoo paste Ketchum MFG Co 329A
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich 806552
Pneumatic PicoPump WPI World Precision Instruments PV-820
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2) AirGas X02OX95C2003102 Supplier may vary depending on region
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES, Free Acid Bio Basic HB0264
Hydrochloric acid solution, 1 N Sigma-Aldrich H9892
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670
pH-Test strips (6.0-7.7) VWR BDH35317.604
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Sodium chloride (NaCl) Bio Basic DB0483
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich RDD007
Software
ImageJ National Institutes of Health (NIH) Open source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
  2. Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synaptic specificity and retinal circuit formation. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental biology. 10 (1), 379 (2021).
  3. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  4. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52 (4), 609-621 (2006).
  5. Wong, W. T., Faulkner-Jones, B. E., Sanes, J. R., Wong, R. O. Rapid dendritic remodeling in the developing retina: dependence on neurotransmission and reciprocal regulation by Rac and Rho. The Journal of Neuroscience. 20 (13), 5024-5036 (2000).
  6. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nature Protocols. 5 (7), 1347-1352 (2010).
  7. Morgan, J. L., Wong, R. O. L. Ballistic labeling with fluorescent dyes and indicators. Current Protocols in Neuroscience. 43 (1), 1-10 (2008).
  8. Nickerson, P. E. B., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Developmental Biology. 13, 24 (2013).
  9. Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. L. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
  10. Coombs, J. L., Van Der List, D., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells during postnatal development. The Journal of Comparative Neurology. 503 (6), 803-814 (2007).
  11. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  12. Stacy, R. C., Wong, R. O. L. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 456 (2), 154-166 (2003).
  13. Kay, J. N., et al. Retinal ganglion cells with distinct directional preferences differ in molecular identity, structure, and central projections. The Journal of Neuroscience. 31 (21), 7753-7762 (2011).
  14. Liu, J., Sanes, J. R. Cellular and molecular analysis of dendritic morphogenesis in a retinal cell type that senses color contrast and ventral motion. The Journal of Neuroscience. 37 (50), 12247-12262 (2017).
  15. Diao, L., Sun, W., Deng, Q., He, S. Development of the mouse retina: emerging morphological diversity of the ganglion cells. Journal of Neurobiology. 61 (2), 236-249 (2004).
  16. Coombs, J., vander List, D., Wang, G. Y., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells. Neuroscience. 140 (1), 123-136 (2006).
  17. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  18. Sümbül, U., et al. A genetic and computational approach to structurally classify neuronal types. Nature Communications. 5, 3512 (2014).
  19. Lin, B., Masland, R. H. Populations of wide-field amacrine cells in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 499 (5), 797-809 (2006).
  20. Macneil, M. A., Heussy, J. K., Dacheux, R. F., Raviola, E., Masland, R. H. The shapes and numbers of amacrine cells: Matching of photofilled with Golgi-stained cells in the rabbit retina and comparison with other mammalian species. Journal of Comparative Neurology. 413 (2), 305-326 (1999).
  21. Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
  22. Jo, A., Xu, J., Deniz, S., Cherian, S., DeVries, S. H., Zhu, Y. Intersectional strategies for targeting amacrine and ganglion cell types in the mouse retina. Frontiers in Neural Circuits. 12, 66 (2018).
  23. Siegert, S., et al. Genetic address book for retinal cell types. Nature Neuroscience. 12 (9), 1197-1204 (2009).
  24. Kim, I. -J., Zhang, Y., Meister, M., Sanes, J. R. Laminar restriction of retinal ganglion cell dendrites and axons: subtype-specific developmental patterns revealed with transgenic markers. The Journal of Neuroscience. 30 (4), 1452-1462 (2010).
  25. Peng, Y. -R., Tran, N. M., Krishnaswamy, A., Kostadinov, D., Martersteck, E. M., Sanes, J. R. Satb1 regulates contactin 5 to pattern dendrites of a mammalian retinal ganglion cell. Neuron. 95 (4), 869-883 (2017).
  26. Duan, X., Krishnaswamy, A., Dela Huerta, I., Sanes, J. R. Type II cadherins guide assembly of a direction-selective retinal circuit. Cell. 158 (4), 793-807 (2014).
  27. Ray, T. A., et al. Formation of retinal direction-selective circuitry initiated by starburst amacrine cell homotypic contact. eLife. 7, 34241 (2018).
  28. Krishnaswamy, A., Yamagata, M., Duan, X., Hong, Y. K., Sanes, J. R. Sidekick 2 directs formation of a retinal circuit that detects differential motion. Nature. 524 (7566), 466-470 (2015).
  29. Caval-Holme, F., Zhang, Y., Feller, M. B. Gap junction coupling shapes the encoding of light in the developing retina. Current Biology. 29 (23), 4024-4035 (2019).
  30. Lucas, J. A., Schmidt, T. M. Cellular properties of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells during postnatal development. Neural Development. 14 (1), 8 (2019).
  31. Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. 10 (6), 540-547 (2013).
  32. Rossi, J., et al. Melanocortin-4 receptors expressed by cholinergic neurons regulate energy balance and glucose homeostasis. Cell Metabolism. 13 (2), 195-204 (2011).
  33. Lefebvre, J. L., Kostadinov, D., Chen, W. V., Maniatis, T., Sanes, J. R. Protocadherins mediate dendritic self-avoidance in the mammalian nervous system. Nature. 488 (7412), 517-521 (2012).
  34. Ing-Esteves, S., et al. Combinatorial effects of alpha- and gamma-protocadherins on neuronal survival and dendritic self-avoidance. The Journal of Neuroscience. 38 (11), 2713-2729 (2018).
  35. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. L. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (1), (2013).
  36. Ramoa, A. S., Campbell, G., Shatz, C. J. Transient morphological features of identified ganglion cells in living fetal and neonatal retina. Science. 237 (4814), 522-525 (1987).
  37. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  38. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
  39. Cuntz, H., Forstner, F., Borst, A., Häusser, M. One rule to grow them all: a general theory of neuronal branching and its practical application. PLoS Computational Biology. 6 (8), 1000877 (2010).
  40. Xiao, H., Peng, H. APP2: automatic tracing of 3D neuron morphology based on hierarchical pruning of a gray-weighted image distance-tree. Bioinformatics. 29 (11), 1448-1454 (2013).
  41. Nanda, S., et al. Design and implementation of multi-signal and time-varying neural reconstructions. Scientific data. 5, 170207 (2018).
  42. Sherry, D. M., Wang, M. M., Bates, J., Frishman, L. J. Expression of vesicular glutamate transporter 1 in the mouse retina reveals temporal ordering in development of rod vs. cone and ON vs. OFF circuits. The Journal of Comparative Neurology. 465 (4), 480-498 (2003).
  43. Johnson, J., et al. Vesicular neurotransmitter transporter expression in developing postnatal rodent retina: GABA and glycine precede glutamate. The Journal of Neuroscience. 23 (2), 518-529 (2003).
  44. Jüttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
  45. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  46. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (31), e1333 (2009).
  47. Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e190 (2007).
  48. Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. The Journal of Comparative Neurology. 476 (3), 254-266 (2004).
  49. Huckfeldt, R. M., et al. Transient neurites of retinal horizontal cells exhibit columnar tiling via homotypic interactions. Nature Neuroscience. 12 (1), 35-43 (2009).
  50. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779 (2020).

Tags

Neurovidenskab Udgave 169 Levende cellebilleddannelse morfogenese dendritudvikling intravitreale injektioner Cre-Lox Adeno-associeret virus dekonvolution starburst amakrine celler
Time-Lapse billeddannelse af neuronal arborisering ved hjælp af sparsom adeno-associeret virusmærkning af genetisk målrettede retinale cellepopulationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ing-Esteves, S., Lefebvre, J. L.… More

Ing-Esteves, S., Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (169), e62308, doi:10.3791/62308 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter