Summary
Hier presenteren we een methode voor het onderzoeken van neurietmorfogenese in postnatale muis retinale explantaten door time-lapse confocale microscopie. We beschrijven een aanpak voor schaarse etikettering en acquisitie van retinale celtypen en hun fijne processen met behulp van recombinante adeno-geassocieerde virusvectoren die membraangerichte fluorescerende eiwitten op een Cre-afhankelijke manier tot expressie brengen.
Abstract
Het ontdekken van mechanismen die dendritische priëlen patroon, vereist methoden om dendrieten tijdens de ontwikkeling te visualiseren, in beeld te brengen en te analyseren. Het netvlies van de muis is een krachtig modelsysteem voor het onderzoek van celtypespecifieke mechanismen van neuronale morfogenese en connectiviteit. De organisatie en samenstelling van retinale subtypen zijn goed gedefinieerd en genetische hulpmiddelen zijn beschikbaar om toegang te krijgen tot specifieke typen tijdens de ontwikkeling. Veel retinale celtypen beperken ook hun dendrieten en / of axonen tot smalle lagen, wat time-lapse beeldvorming vergemakkelijkt. Explantaatculturen van muizen zijn zeer geschikt voor live-cell imaging met behulp van confocale of multifotonenmicroscopie, maar methoden die zijn geoptimaliseerd voor het afbeelden van dendrietdynamica met temporele en structurele resolutie ontbreken. Hier wordt een methode gepresenteerd om de ontwikkeling van specifieke retinale populaties gemarkeerd door het Cre-Lox-systeem spaarzaam te labelen en in beeld te brengen. Commercieel verkrijgbare adeno-geassocieerde virussen (AAV's) die hier worden gebruikt, brachten membraangerichte fluorescerende eiwitten tot expressie op een Cre-afhankelijke manier. Intraoculaire toediening van AAV's bij neonatale muizen produceert fluorescerende etikettering van gerichte celtypen 4-5 dagen na injectie (dpi). De fluorescerende signalen van het membraan zijn detecteerbaar door confocale beeldvorming en lossen fijne takstructuren en dynamica op. Video's van hoge kwaliteit van 2-4 uur worden verkregen van het afbeelden van retinale flat-mounts doordrenkt met zuurstofrijk kunstmatig hersenvocht (aCSF). Ook wordt een beeld-nabewerkingspijplijn geleverd voor deconvolutie en driedimensionale (3D) driftcorrectie. Dit protocol kan worden gebruikt om verschillende cellulaire gedragingen in het intacte netvlies vast te leggen en om nieuwe factoren te identificeren die de morfogenese van neuriet regelen. Veel ontwikkelingsstrategieën die in het netvlies worden geleerd, zullen relevant zijn voor het begrijpen van de vorming van neurale circuits elders in het centrale zenuwstelsel.
Introduction
Dendrieten van retinale neuronen vormen ingewikkelde, maar specifieke patronen die hun functie binnen neurale circuits beïnvloeden. In het netvlies van gewervelde dieren dragen verschillende soorten retinale ganglioncellen (RGC's) en interneuronen van amacrinecellen unieke dendritische morfologieën die verschillen in arborgrootte, locatie, taklengte en dichtheid1. Tijdens de postnatale ontwikkeling breiden RGC's en amacrinecellen uitbundige dendritische processen uit tot een neuropil die de binnenste plexiforme laag (IPL) wordt genoemd, waar ze bipolaire celingangen ontvangen die fotoreceptorsignalen verzenden2. Zoals vastgelegd door time-lapse beeldvorming van fluorescerend gelabelde retinale populaties in kuiken- of zebravislarven, is de morfogenese van dendriet zeer dynamisch3,4,5. Binnen enkele dagen breiden dendritische priëlen zich uit, vervormen en vertakken ze naar smalle sublagen van de IPL, waar ze synapsen met geselecteerde partners. De priëlen vertonen verschillende structurele dynamieken gedurende de ontwikkeling, met veranderingen in relatieve snelheden van taktoevoeging, terugtrekking en stabilisatie. Amacrine- en RGC-dendrieten vertonen ook verschillende uitgroei- en remodelleringsgedragingen die typespecifieke arborisatie kunnen weerspiegelen. Deze studies volgden echter brede amacrine- of RGC-populaties en richtten zich op laminaire targeting, wat slechts één aspect van morfologie is.
De mechanismen die de enorme morfologische diversiteit produceren die wordt waargenomen in retinale subtypen zijn slecht begrepen. Het doel van deze groep was om een methode te ontwikkelen om dendrietdynamica en arbor remodeling van gedefinieerde retinale subtypen bij muizen vast te leggen. Het identificeren van celtypespecifieke mechanismen van dendrietpatronen vereist methoden om dendrietgedrag van interessante cellen te visualiseren en te meten. Organotypische culturen van het netvlies van muizen zijn zeer geschikt voor live-cell imaging studies met behulp van confocale of multifotonenmicroscopie. Ontwikkelende netvliezen worden ontleed en gemonteerd in een platte explant die gedurende enkele uren in een opnamekamer kan worden afgebeeld of gedurende enkele dagen kan worden gekweekt met beperkte effecten op het circuit6,7. Levende retinale neuronen kunnen worden gelabeld door een verscheidenheid aan technieken, waaronder kleurstofvulling door elektroden, elektroporatie, biolistische afgifte van deeltjes bedekt met lipofiele kleurstoffen of plasmiden die coderen voor fluorescerende eiwitten (bijv. Gene Gun), evenals genetisch gecodeerde cellabels7,8,9,10 . Deze benaderingen zijn echter inefficiënt voor het afbeelden van dendrietdynamica van specifieke retinale subtypen. Verfvulmethoden hebben bijvoorbeeld een lage doorvoer en vereisen elektrofysiologische apparatuur en aanvullende genetische labels om op betrouwbare wijze cellen van belang te targeten. Bovendien kunnen de sterke fluorescentiesignalen in de soma nabijgelegen dendrieten verdoezelen.
Biolistische genafgiftemethoden kunnen tegelijkertijd tientallen cellen labelen, maar stappen met hogedrukdeeltjesafgifte en nachtelijke incubatie van geïsoleerd netvlies kunnen de celfysiologie en dendritische uitgroei in gevaar brengen. Dit artikel stelt voor dat recente genetische hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om vroege dendrietdynamica vast te leggen met celtype en structurele resolutie, gezien de volgende experimentele criteria. Ten eerste, om de fijne takken en filopodia op te lossen die zich ontwikkelende priëlen domineren, moet de methode neuronen labelen met heldere, fluorescerende eiwitten die processen in het hele prieel vullen. De fluorescentielabeling mag niet vervagen als gevolg van fotobleaching tijdens de beeldvormingsperiode. Er zijn verschillende fluorescerende eiwitvarianten gegenereerd en vergeleken voor geschiktheid voor in vivo/ex vivo beeldvorming11 op basis van helderheid en fotostabiliteit. Ten tweede moeten de fluorescerende eiwitten (XFP's) in voldoende hoge niveaus tot expressie worden gebracht door het vroegste stadium van dendrietmorfogenese, zodat het smalle ontwikkelingsvenster niet wordt gemist. In analyses van statische tijdpunten in het netvlies van de muis vindt dendrietontwikkeling plaats tijdens de eerste postnatale week en omvat fasen van uitgroei, remodellering en stabilisatie10,12,13,14,15. Ten derde moet de methode leiden tot selectieve etikettering of tot een grotere kans op etikettering van de neuronale subpopulatie van belang. Ten vierde moet de etikettering van de doelsubpopulatie voldoende dun zijn om het gehele neuronale prieel te kunnen identificeren en traceren. Hoewel RGC- en amacrine-subtypen kunnen worden onderscheiden door hun volwassen morfologische kenmerken en IPL-stratificatiepatronen16,17,18,19,20, is de uitdaging om subtypen tijdens de ontwikkeling te identificeren op basis van onvolgroeide structuren. Deze taak wordt vergemakkelijkt door de uitbreiding van transgene hulpmiddelen om specifieke retinale celtypen tijdens de ontwikkeling te labelen.
Transgene en knock-in muislijnen waarin cellulaire en temporele expressie van fluorescerende eiwitten of Cre wordt bepaald door genregulerende elementen worden veel gebruikt om retinale celtypen te bestuderen13,21,22,23. Belangrijke observaties over subtypespecifieke patronen van dendrietontwikkeling zijn afkomstig van studies van transgene muizenvliezen op statische tijdpunten10,14,24,25. Met name het Cre-Lox-systeem maakt uitstekende genmanipulatie en monitoring van subtypen mogelijk met behulp van een verscheidenheid aan recombinase-afhankelijke reporters, sensoren en optogenetische activatoren. Deze hulpmiddelen hebben geleid tot ontdekkingen van subtypespecifieke moleculaire programma's en functionele eigenschappen die ten grondslag liggen aan retinale circuitassemblage26,27,28,29,30. Ze moeten echter nog worden gebruikt om subtypespecifieke dendrietdynamica in het netvlies van de muis te bestuderen. Labeling met lage dichtheid kan worden bereikt door Cre-muislijnen te combineren met transgenen die worden geïntroduceerd door elektroporatie of door recombinante AAV's. Indien beschikbaar, kunnen tamoxifen-induceerbare Cre-lijnen of intersectionele genetische strategieën ook worden gebruikt. Ten slotte moet de cel op een minimaal invasieve manier worden geëtiketteerd en in beeld worden gebracht met behulp van acquisitieparameters om het weefsel niet in gevaar te brengen of de cellulaire functie te verstoren die nodig is voor de morfogenese van dendriet.
Hier wordt een methode gepresenteerd om transgene hulpmiddelen en confocale microscopie toe te passen om dendrietdynamiek in retinale explantaten van levende muizen te onderzoeken. Cretransgene muislijnen zijn gecombineerd met AAV-vectoren die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen bij Cre-recombinatie, wat een schaarse labeling van retinale cellen van belang mogelijk maakt. Commercieel verkrijgbare AAV's worden geleverd aan neonatale netvlies door intravitreale injecties. Dit artikel toont aan dat AAV's een significant hoge en celtypespecifieke fluorescerende expressie produceren met 4 dpi, waardoor toegang tot postnatale tijdspunten mogelijk is. Om deze benadering te illustreren, werd de cholinerge "starburst" amacrine interneuron gelabeld door Brainbow AAV af te leveren bij neonatale muizen die de choline-acetyltransferase (ChAT) -interne ribosoom entry site (IRES) -Cre transgen tot expressie brengen, dat actief is in het vroege postnatale retina31,32. Starburst amacrine cellen ontwikkelen een stereotiepe en radiale arbor morfologie die wordt gevormd door dendriet zelfvermijding gemedieerd door de geclusterde protocadherinen33,34. Dit artikel toont aan dat de resolutie van starburst dendrieten en filopodia aanzienlijk wordt verbeterd door XFP's aan het plasmamembraan met de toevoeging van het CAAX-motief dat farnesylatie ondergaat, zoals gebruikt voor de Brainbow AAV's31. Ten slotte zijn time-lapse beeldvorming en nabewerkingsprotocollen vastgesteld die beelden van hoge kwaliteit produceren die vatbaar zijn voor dendrietreconstructie en morfometrische kwantificering. Dit protocol kan worden gebruikt om factoren te identificeren die de morfogenese van dendriet regelen en om verschillende cellulaire gedragingen in het intacte netvlies vast te leggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Dit protocol beslaat 2 dagen met een minimale periode van 4-5 dagen voor virale transductie tussen experimentele dagen (figuur 1A). Dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de Canadian Council on Animal Care Guidelines for Use of Animals in Research and Laboratory Animal Care volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee in het Hospital for Sick Children (Toronto, Canada).
1. Voorbereidingen voor de neonatale AAV-injecties en beeldvormingsexperimenten
- Selecteer een Cre-muislijn om de retinale celpopulaties van belang te labelen. Bevestig Cre-recombinase-expressie op het moment van AAV-injecties door over te steken naar een Cre-transgene reporter of door immunostaining met een Cre-antilichaam.
- Fok transgene Cre-muizen (8-16 weken oud) om Cre-positieve neonatale dieren te genereren.
OPMERKING: Voor deze demonstratie werden ChAT-IRES-Cre knock-in muizen gebruikt om de cholinerge Starburst amacrinecellen aan te vallen. - Verkrijg recombinase-afhankelijk AAV-virus dat codeert voor fluorescerend eiwit (en). Voor een optimale etikettering van fijne processen selecteert u vectoren die gemodificeerde XFP's uitdrukken die zich richten op het plasmamembraan.
OPMERKING: In deze studie werd gebruikgemaakt van het Brainbow-virus (BBV), AAV-EF1a-BbTagBY en AAV9-EF1a-BbChT (zie Tabel met materialen), die de optie bieden voor meerkleurige etikettering (figuur 1B). Farnesylated enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) en monomeric Cherry (mCherry) expressie produceerden de sterkste fluorescerende signalen voor live imaging. Een enkele BBV kan worden gebruikt om individuele priëlen in beeld te brengen, terwijl co-injectie van BBV's kan worden gebruikt om meer cellen of naburige priëlen met verschillende fluoroforen te labelen. Als u meerdere fluorescerende eiwitten gebruikt, zorg dan voor minimale overlap van het emissiespectrum (figuur 1C). Microscoopacquisitieparameters moeten worden aangepast om verschillende XFP-signalen op te vangen. - Bereid ∼3-5 μL aliquots van AAV's in afzonderlijke laagbindende buizen voor voorraden voor eenmalig gebruik om vries-/dooicycli te voorkomen. Bewaren bij -80 °C.
- Bereid borosilicaatglas micropipettes met zeer fijne uiteinden met behulp van een micropipette puller.
OPMERKING: De instellingen van de trekker variëren afhankelijk van het filament en de trekker die worden gebruikt; zie figuur 2A voor de uiteindelijke tipgrootte en -vorm. Typische druppeldiameters zijn 600 μm. - Verkrijg een micro-injectiesysteem en bijbehorende slangen. Sluit de micro-injector aan op een luchtpoort onder druk.
Figuur 1: Experimenteel overzicht. (A) Dit protocol omvat 2 dagen experimenten met een minimale infectieperiode van 4-5 dagen tussen experimentele dagen. Intraoculaire injecties worden uitgevoerd op neonatale muizen die niet ouder zijn dan postnatale dag 3. Netvliezen worden vervolgens ontleed, plat gemonteerd en live-gebeeld om het gewenste ontwikkelingsvenster vast te leggen. Gelabelde cellen kunnen op elk moment na de vereiste 4-5 dagen die nodig zijn voor virale expressie in beeld worden gebracht, omdat er geen duidelijke effecten zijn van langdurige AAV-expressie op de morfologie van dendriet. (B) Cre-afhankelijke Brainbow AAV-vectoren (BBV) worden geïnjecteerd in dieren die Cre31 tot expressie brengen. In deze studie werden ChAT-Cre knock-in muizen gebruikt om Cre-recombinatie in starburst amacrinecellen te stimuleren. De twee BBV's coderen gemodificeerde eYFP of tagBFP, of mCherry en mTFP, die eindigen in een CAAX-motief dat sequentieel wordt gefarnesyleerd voor membraanlokalisatie. Lox-sites worden afgebeeld met driehoeken. De vectoren drukken ofwel gefarnesyleerde XFP's uit op een stochastische en combinatorische manier, afhankelijk van Cre-recombinatie. De EF1α-promotor bevat regulerende elementen van het elongatiefactor 1α-gen. W vertegenwoordigt elementen uit het posttransscriptionele regulerende element van het houthechthe hepatitisvirus en pA geeft de polyadenylation-sequentie aan. (C) De excitatie- en emissiespectra van mCherry en eYFP, de BBV-fluoroforen die in deze studie zijn afgebeeld. Bij live-imaging van meerdere fluorescerende eiwitten moeten de detectieparameters worden gerangschikt om emissiespectra adequaat in verschillende kanalen te scheiden. Afkortingen: AAV = adeno-associated virus; BBV = Brainbow AAV; ChAT = choline-acetyltransferase; iRES = interne ribosoom entry site; eYFP = verbeterd geel fluorescerend eiwit; iTR = omgekeerde terminalrepetitie; tagBP = Tag-blauw fluorescerend eiwit; mCherry = monomere kers; mTFP = groenblauw fluorescerend eiwit; XFP = elk fluorescerend eiwit; EF1α= rekfactor 1 alfa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Intravitreale injecties van AAV's bij neonatale muizen
- Ontdooi een AAV aliquot op ijs. Bereid een ~1:4 AAV verdunning met behulp van steriele zoutoplossing of fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Bereid ~ 0,5 μL AAV-verdunning per dier (~ 0,25 μL per oog) voor het geval de micropipette breekt en een nieuwe pipet moet worden gevuld. Bewaar de resterende onverdunde AAV bij 4 °C en gebruik binnen 2 weken.
OPMERKING: In dit experiment was de AAV-concentratie van de leverancier ~ 1-2 × 1013 genoomgehalte (GC) / ml en verdund tot een uiteindelijke concentratie van 4 × 1012 GC / ml. Optimaliseer de virale concentratie om de gewenste etiketteringsdichtheid te verkrijgen. - Om de injecties te visualiseren, voegt u ongeveer 1 μL 0,02% Fast Green FCF-kleurstofoplossing toe voor elke 15 μL AAV-verdunning om de oplossing blauw te kleuren.
- Breng een muizenkooi met moeder- en pasgeboren nest (postnatale dag (P) 0,5-3) over naar een procedureruimte met micro-injectieapparatuur. Houd de dieren in dezelfde kooi met nesten en beddengoed om maternale stress en afwijzing van pups te minimaliseren.
- Steriliseer het injectiegebied met 70% ethanol en plaats steriele luierkussens op bankoppervlakken. Bereid een warm platform voor (bijvoorbeeld een verwarmingskussen) voor herstel van door onderkoeling veroorzaakte anesthesie.
- Vul de micropipette met de AAV-verdunning met behulp van een microsyringe. Breek onder een stereomicroscoop de micropipettepunt met een naald van 30 G om de punt los te maken.
OPMERKING: Figuur 2A toont de teruggevulde punt - zowel verzegeld (boven) als niet-verzegeld (midden). - Verdoof neonatale muizen door onderkoeling door 1-2 dieren op ijs te plaatsen. Plaats dieren op een latex handschoen om de huid te beschermen tegen direct contact met ijs. Zodra het dier niet langer beweegt als reactie op pootknijpen (~ 2 min), plaats het dier onder een stereomicroscoop. Indien gewenst, tattoo voetzolen met tattoo inkt en 30 G naald, en verzamelen staartknipsels voor DNA-isolatieom dieren te identificeren door genotypering.
OPMERKING: Gedurende de hele procedure moet de diepte van de anesthesie op de juiste manier worden gecontroleerd. - Veeg de huid boven de ogen af met 70% ethanol. Gebruik een naald van 30 G om het vergroeide ooglid te openen (figuur 2B). Oefen lichte druk uit met de vingers om het oog te openen en prik een klein gaatje door het hoornvlies op de kruising tussen hoornvlies en sclera (figuur 2C).
- Steek de glazen micropipette in het gat en druk 2-4 keer op het microinjectorvoetpedaal om de AAV in de intravitreale ruimte te injecteren. Verwijder langzaam de micropipette en bevestig de AAV-injectie door blauwe kleurstof door de pupil te visualiseren (figuur 2D).
OPMERKING: Bij een uitwerpdruk van 6-8 psi en een pulstijd van 600-800 ms wordt een druppel met een diameter van 600 μm uitgeworpen (figuur 2A, onderkant). Ongeveer 0,23-0,45 μL AAV-oplossing wordt per oog geïnjecteerd. Blauwe oplossing buiten het oog geeft aan dat de AAV niet in het oog is geïnjecteerd. Blauwe oplossing die uit de injectieplaats lekt, geeft aan dat de AAV mogelijk is uitgelekt, waardoor de transfectie-efficiëntie wordt verminderd. - Druk de oogleden voorzichtig tegen elkaar om opnieuw af te sluiten en plaats de pup op een verwarmd kussentje. Zodra de dieren een roze kleur hebben hersteld en reageren, breng je ze voorzichtig terug naar de woonkooi.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de juiste voorzorgsmaatregelen worden genomen om te voorkomen dat de pups te snel opnieuw worden opgewarmd. - Herhaal de injectieprocedure voor de resterende dieren in het nest. Wacht minimaal 4-5 dagen voor virale transductie voordat u het netvlies in beeld brengt.
Figuur 2: Neonatale intraoculaire injecties. (A) Met de achterkant gevulde micropipette toont de vorm van de pipetpunt wanneer deze is verzegeld (boven) en nadat de punt is losgemaakt (onder, links). Pico-injectiedruk van 6-8 psi en pulstijd van 600-800 ms produceert een druppel met een diameter van 600 μm (onder, rechts). Schaalbalk = 1 mm.(B) Verdoofde P0 pup onder 16x vergroting. De gesmolten ooglidverbinding (wit) wordt opengesneden met een scherpe naald van 30 G. Schaalbalk = 2 mm. (C) Lichte druk op het oog legt het hoornvlies bloot; schaalbalk = 2 mm. Ingezoomde sectie (rood) toont het kleine gaatje bij de kruising hoornvlies-sclera (geel) gemaakt met een naald van 30 G; schaalbalk = 0,5 mm. (D) Terugtrekking van de pipetpunt na injectie (links). Snelle groene kleurstof in de AAV-oplossing verschijnt als blauwgrijs door de pupil (midden), in vergelijking met de lichte pupilkleur vóór injectie (rechts). Schaalbalk = 1 mm. (E) Na 4 dagen is het ooglid genezen en dichtgesmolten (links); schaalbalk = 2 mm. Bij enucleatie is de genezen injectieplaats zichtbaar (geel); schaalbalk = 1 mm. Let op de locatie van de injectieplaats op de grens tussen het hoornvlies en sclera. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Retinale dissecties voor beeldvormingsexperiment
- Bereid retinale aCSF (119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2·6H2O, 2,5 mM CaCl2·2H2O, 1 mM NaH2PO4, 11 mM glucose en 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES vrij zuur)35. Indien gewenst, bereid en vries 10x oplossing in; ontdooien en verdun tot 1x indien nodig.
- Oxygeneer de retinale aCSF door te borrelen met carbogen (95% O2, 5% CO2) gedurende minimaal 15 minuten. Stel de pH in op 7,4. Bewaren in een verzegelde container tot gebruik om ervoor te zorgen dat de aCSF zuurstofrijk blijft.
OPMERKING: Netvliezen vereisen een hoge concentratie O2. Het is belangrijk om aCSF gedurende het hele experiment zuurstofrijk te houden. - Sluit een petrischaaltje met een diameter van 60 mm in een ijsbak (maak een ijsbak van laboratoriumplastic, bijvoorbeeld een deksel van een pipetdoos) en plaats deze onder een stereomicroscoop. Vul de petrischaal met zuurstofrijke retinale aCSF.
- Euthanaseer muizen P9 en jonger door onthoofding. Euthanaseer muizen P10 en ouder door isofluraaninductie, of een alternatieve methode die is goedgekeurd volgens het dierprotocol, gevolgd door onthoofding.
- Als de oogleden zijn verzegeld, snijdt u de ooglidflap af om het oog bloot te leggen. Gebruik een tang om de ogen te enucleeren en breng ze over naar de koude retinale aCSF vanaf stap 3.3.
- Om de retinale cup te ontleden, onder een stereomicroscoop (vergroting 25x), stabiliseer het oog door de oogzenuw vast te klemmen met behulp van een Dumont #5-tang (figuur 3A).
- Prik een gat in het midden van het hoornvlies met een naald van 30 G en steek vervolgens een punt van de microscisors in het gat om een incisie te maken van het gat naar het einde van het hoornvlies. Herhaal dit om 4 plakjes in de windrichtingen te maken, waardoor 4 "flappen" ontstaan (Figuur 3A).
- Met twee Dumont #5 tangen pak je de twee aangrenzende flappen vast en trek je ze uit elkaar, waarbij je de sclera voorzichtig van het netvlies pelt. Herhaal dit met de resterende hoornvliesflappen en verwijder de sclera van het netvlies (figuur 3B).
- Verwijder de lens van de retinale cup met behulp van de tang. Maak met microscisors 4 radiale incisies van de rand van het netvlies naar de oogzenuw, waardoor 4 gelijke bloemblaadjes ontstaan (figuur 3B). Herhaal stap 3.4-3.7 voor het tweede oog.
4. Retinale flat-mount voorbereiding
- Bereid grijze gemengde cellulose-ester (MCE) membraanfilterschijven voor op montage. Als u MCE-membraanfilters met een grote diameter gebruikt, snijdt u de schijf in kwadranten (ongeveer 1 cm breed). Plaats de MCE-schijf op het midden van een groter wit filterpapier (afbeelding 3D).
OPMERKING: MCE-filters zijn ook verkrijgbaar in schijven met een diameter van 1 cm. De MCE-filterschijf moet groot genoeg zijn om 1-2 netvliezen te passen, maar klein genoeg om in de beeldvormingskamer te passen. Omdat MCE-membranen een statische lading vasthouden, minimaliseert u het contact en de hantering van het MCE-membraan. - Pak netvliezen aan met behulp van twee maat 3/0 verfkwasten, draai een retinale cup op een penseel met de retinale ganglioncel naar beneden. Til het netvlies voorzichtig uit de aCSF en zorg ervoor dat de waterspanning het netvlies niet scheurt (figuur 3C).
- Terwijl u de kwast nog steeds met het netvlies vasthoudt, gebruikt u een transferpipet om een druppel aCSF in het midden van het MCE-filterpapier te plaatsen (figuur 3C, rechts). Drijf het netvlies in de druppel aCSF die ontstaat door de oppervlaktespanning. Gebruik verfkwasten om de RGC-kant van het netvlies naar boven in de druppel te plaatsen en de vier bloemblaadjes uit te vouwen.
- Eenmaal geplaatst, maak je een waterbrug tussen de verfkwast en wit filterpapier om de oppervlaktespanning van de druppel te breken.
OPMERKING: Wanneer aCSF wordt afgevoerd, zal het netvlies zich hechten aan het MCE-filterpapier (figuur 3D, E). Plat gemonteerde netvliezen kunnen worden behandeld door de MCE-schijf met een tang vast te pakken. Als de aCSF-druppel snel wegloopt voordat een waterbrug wordt gevormd, kan dit erop wijzen dat het MCE-membraan niet is geladen. Gebruik een vers MCE-membraan en minimaliseer de tijd tussen enucleatie en beeldvorming door netvliezen te ontleden en plat te monteren onmiddellijk voordat het netvlies naar de beeldvormingskamer wordt verplaatst.
Figuur 3: Retinale dissectie en vlakke montage op gemengde cellulose-esterfiltermembranen. (A) Links wordt een geënucleeerd oog gestabiliseerd door de oogzenuw vast te pakken met Dumont #5-tang (links). Een klein gaatje wordt gemaakt in het midden van het hoornvlies met behulp van een naald van 30 G (midden). Microdissectiescharen worden gebruikt om het hoornvlies in 4 gelijke flappen te snijden (rechts). Schaalbalk = 1 mm. (B) Ontleed netvlies met de sclera afgepeld met behulp van twee Dumont #5 tangen (links) en met de lens verwijderd (midden). Netvlies met 4 gelijke sneden halverwege in het netvlies (rechts). Schaalbalk = 1 mm. (C) Bediening van het netvlies met twee fijne penselen (maat 3/0, links). Netvlies omgedraaid met retinale ganglioncellen met de zijkant naar beneden op een penseel (midden) en uit aCSF getild, zodat de waterspanning het netvlies niet scheurt (rechts). Schaalbalk = 2 mm. (D) Grijze MCE-membraanschijf geplaatst op een wit filterpapier (links). Een druppel aCSF op de MCE-schijf (rechts). Schaalbalk = 1 cm. (E) Nadat de netvliezen in de druppel zijn gedobberd en ze hebben geplaatst, maakt u een waterbrug met het witte filterpapier om de aCSF af te voeren en trekt u het netvlies op het geladen MCE-papier (links); schaalbalk = 1 cm. Ingezoomde afbeelding van het MCE-membraan (rood) toont 2 netvliezen gemonteerd met retinale ganglioncellen naar boven (rechts); schaalbalk = 2 mm. Eén netvlies is wit omlijnd. Afkortingen: MCE = mixed cellulose ester; aCSF = kunstmatig hersenvocht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Time-lapse confocale beeldvorming van live whole-mount retina preparaten
- Monteer de live-imaging incubatiekamer voor een rechtopstaande confocale microscoop zoals te zien in figuur 4.
OPMERKING: Voor omgekeerde confocale systemen worden flat-mounts RGC-zijde naar beneden direct op de glazen bodemdekplaat van de incubatiekamer geplaatst. Zodra het netvlies contact maakt met de coverslip, kunnen ze niet worden verplaatst. - Vul de kamer met zuurstofrijke aCSF en schakel de pomp en temperatuurregelaar in (temperatuur 32-34 °C, debiet 1 ml/min). Laat de temperatuur niet boven de 34 °C uitkomen.
- Om de retinale flat-mount over te brengen naar de perfusiekamer, stopt u de pomp en verwijdert u de aCSF die zich in de kamer bevindt. Plaats de MCE-schijf met de retinale flat-mount in de (lege) incubatiekamer.
- Plaats een monstergewicht op de flat-mount; maak het gewicht voorbevochtigd om de oppervlaktespanning te breken. Vul de kamer opnieuw met de verwarmde aCSF en laat aCSF circuleren met ~ 1 ml / min.
- Plaats het neusstuk met het 25x waterdippende objectief (numeriek diafragma 0,95) in de beeldvormingskamer. Screen op gelabelde cellen van belang met behulp van epifluorescent licht (figuur 4C).
- Pas het beeldvolume aan om interessante dendritische kenmerken vast te leggen.
OPMERKING: Deze studie legde het volledige dendritische prieel vast op 1024 x 1024 pixels per frame, z-stap 1 μm en een framesnelheid van 2 minuten tussen elke z-stack. Uiteindelijke afbeeldingsformaten zijn ~ 100 μm x 100 μm x 20 μm. - Als u het laservermogen wilt aanpassen aan een optimale instelling, gebruikt u een opzoektabel die zowel oververzadigde als onderverzadigde pixels identificeert. Pas tijdens het scannen het laservermogen zodanig aan dat er geen pixels oververzadigd zijn (d.w.z. bij een intensiteit van 255 of hoger). Ga door met beeldvorming zolang als nodig is, of totdat er een significante en detecteerbare afname van het fluorescerende signaal en de toename van ruis is (meestal 2-4 uur).
OPMERKING: Verminderd laservermogen wordt aanbevolen omdat deconvolutie-algoritmen optimaal werken wanneer pixels over het volledige dynamische bereik worden verdeeld. Pixelintensiteit mag niet hoger zijn dan 254; empirische analyses van neurieten toonden aan dat pixelwaarden onder de 170 ideaal zijn voor deconvolutie. Hoge scansnelheden (400-600 Hz) met lijngemiddelden (2-3) hebben de voorkeur boven enkele, langzamere scans van dezelfde totale pixelverblijftijd. Het gebied van langdurige beeldvorming fotobleekt vaak, maar andere explantsecties blijven levensvatbaar. Meerdere regio's in een flat-mount kunnen worden afgebeeld, elk voor 2-4 uur, met een totale incubatietijd van 6 uur. Beeldvormingssessies na 6 uur zijn niet systematisch getest. Neurietafbraak en blaten zijn tekenen dat de levensvatbaarheid van de explant afneemt. - Bevestig na beeldvorming de retinale flat-mounts en het membraanfilter met koud 4% paraformaldehyde gedurende 1-2 uur bij 4 °C. Versterk de fluorescerende labels in de vaste netvliezen door immunohistochemie voor verdere analyses.
OPMERKING: Post-imaging fixatie is niet mogelijk bij gebruik van een omgekeerde confocale; netvliezen zijn niet verwijderbaar zonder het weefsel te vernietigen.
Figuur 4: Live-cell imaging incubatiekameropstelling. (A) Live-imaging incubatieapparatuur met verwarmings-, oplossings- en beeldvormingscomponenten. Dubbele verwarming omvat een verwarmd incubatiekamerplatform (achtercirkel met blauwe connectorelektroden) en een in-line oplossingsverwarmer. (B) Schematisch schema van 4A. Retinale flat-mount (rood) op MCE-membraan (grijs) wordt in de incubatiekamer geplaatst. De in-line oplossingsverwarming is aangesloten op een oplossingspomp (niet afgebeeld in 4A). De afmetingen van de beeldvormingskamer zorgen voor een goed werkgebied voor de neus van het dompeldoel. (C) 25x een retinale explant bekijken die is geïnjecteerd met 0,23-0,45 μL van 4 × 1012 GC/ml AAV-verdunning; schaalbalk = 100 μm. Dichte labeling van cellen omringt vaak de oogzenuwkop (stippellijn, rechtsonder); schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: MCE = mixed cellulose ester; GC = genoomkopieën; mCherry = monomere kers; eYFP = versterkt geel fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Beelddeconvolutie en nabewerking in ImageJ
- Importeer de afbeeldingsreeks, splits de reeks op tijd en kleur als het een afbeelding met meerdere kleuren is. Zorg ervoor dat alle tijdspunten voor één kleur zich in dezelfde map bevinden.
OPMERKING: Importeer bio-indelingen als u ImageJ gebruikt (bio-indelingen worden automatisch opgenomen in FIJI). - Maak een theoretische point-spread functie (PSF) met behulp van de ImageJ plugin, Diffraction PSF 3D.
OPMERKING: Elk beeldvormingskanaal heeft zijn eigen PSF nodig omdat de golflengte van fluorescerende eiwitemissie van invloed is op de PSF. - Plug-ins gebruiken | Macro's | Uitvoeren om batch parallelle iteratieve deconvolutie uit te voeren voor alle tijdspunten met behulp van de meegeleverde macro (aanvullend bestand 1).
OPMERKING: Deze macro voert 25 iteraties uit van het Iteratieve algoritme van Wiener Filter Preconditioned Landweber (WPL). Elk kleurkanaal moet afzonderlijk worden gedeconvoleerd. - Voeg de kleurkanalen samen en compileer alle tijdpunten in een Hyperstack (Image | Hyperstacks | Stapels naar Hyperstack). Corrigeer de 3D-drift met behulp van plug-ins | Registratie | Corrigeer 3D Drift.
- De afbeelding terugzetten naar een gewone stapel (Afbeelding | Hyperstacks | Hyperstack naar Stack) en splits de tijdspunten (Afbeelding | Stapels | Gereedschap | Stack Splitter). Batchverwerking gebruiken om maximale projectie voor alle tijdspunten te maken (proces| Batch | Macro-| run("Z Project...", "projection=[Max Intensity]"); ).
- Importeer de time-lapse-afbeeldingsreeks (bestand | | importeren Afbeeldingsvolgorde). Gebruik conventionele ImageJ-tools voor de gewenste analyse van gedeconvolgeerde en nabewerkte tweedimensionale (2D) video.
OPMERKING: Vierdimensionale (3D + tijd) gedeconvolgeerde en drift-gecorrigeerde video's kunnen worden gezien als een hyperstack. Laat de vorige stap weg om 3D-tijdpunten te behouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het bovenstaande protocol werd een 3D-video met hoge resolutie van het ontwikkelen van starburst-celdendrieten verkregen, gedeconvoleerd en gecorrigeerd voor 3D-drift. Z-plane maximale projecties werden geproduceerd om 2D-video's te maken voor analyse (Aanvullende video 1, figuur 5A). 3D-deconvolutie van elk tijdstip verhoogde de resolutie van fijne filopodiaprojecties (figuur 5B,C). Fijne filopodia-uitsteeksels zijn een kenmerk van de ontwikkeling van retinale dendrieten36 en moeten zichtbaar zijn tijdens beeldvorming. AAV-transfectie zal variabiliteit veroorzaken in celetiketteringsdichtheid en fluorescentie-intensiteit. Screen dus het gelabelde weefsel om cellen met hoge fluorescerende signalen te selecteren voor beeldvorming en het produceren van video's van hoge kwaliteit. Het verhogen van het laservermogen om slecht gelabelde cellen te detecteren wordt niet aanbevolen, omdat dit kan leiden tot snel fotobleeken en hoge ruis kan introduceren in vergelijking met het signaal. Voldoende heldere cellen zijn zichtbaar binnen 5 dpi. Met 12 dpi en meer leiden langdurige AAV-infectieperioden niet noodzakelijkerwijs tot verhoogde fluorescentie van gelabelde cellen (figuur 5D).
Overmatige fluorescentie en neurietverdringing door dichte celetikettering beïnvloedt de beeldkwaliteit en kan eencellige reconstructies belemmeren. Optimalisatie van de AAV-verdunning en het volume is vereist om de gewenste mate van geïsoleerde en fluorescerend gelabelde priëlen te bereiken die scheidbaar zijn van de rest van de doelcelpopulatie. Hier werden 9,2 × 108-1,8 × 109 virale GC's per oog geïnjecteerd om starburst-amacrinecellen te targeten (0,23-0,45 μL AAV met een titer van 4 × 1012 GC / ml). De afwezigheid van een fluorescerend signaal kan een inefficiënte injectietechniek weerspiegelen. Tijdens het injecteren geeft lekkage van de blauwe AAV-oplossing van de injectieplaats aan dat het virus niet op het netvlies wordt afgeleverd of dat het injectievolume of de druk te hoog is. Overmatig injectievolume of druk kan netvliesloslating en/of verlies van oogdruk veroorzaken, waardoor de retinale cellen worden beschadigd en de efficiëntie van celetikettering wordt verminderd. Beide problemen kunnen worden opgelost met oefening en optimalisatie van de injectietechniek. Andere mogelijke redenen voor het gebrek aan signaal zijn degradatie van de AAV's door onjuiste opslag of onvoldoende Cre-expressie omdat het Cre-transgen niet actief is tijdens de periode van AAV-transfectie.
Zodra video's zijn gedeconvolteerd, kunnen dynamische analyses, zoals het berekenen van de snelheid van vertakkingstoevoeging, terugtrekking of stabilisatie, worden uitgevoerd. Bovendien kan conventionele statische analyse worden uitgevoerd op elk tijdsbestek, inclusief neuronreconstructie en morfometrische kwantificeringen zoals totale taklengte, vertakkingshoeken, vertakkingsvolgorde of aantal terminale aftakkingspunten. Het resultaat van dit protocol is een tijdreeks van 3D-beeldstapels met hoge resolutie. De meeste dynamische 3D-neurietvideo's worden handmatig gekwantificeerd als een maximale projectie met behulp van een open-source beeldvisualisatiesoftware zoals ImageJ37. Een andere open-source tool, Vaa3D38, is speciaal ontwikkeld voor visualisatie van grote volumes. Als video's in 3D moeten worden geanalyseerd, wordt het gebruik van een 3D + tijdvisualizer zoals Vaa3D aanbevolen. ImageJ en Vaa3D bieden directe toegang tot de pixels of voxels in het beeld, maar vaak worden neuronreconstructies gemaakt door pixelgegevens om te zetten in geskeletiseerde boomreconstructies. Automatische of semi-automatische neuronreconstructies voor enkele tijdspunten kunnen worden uitgevoerd met open-source39,40,41 en propriëtaire software. Om time-lapse reconstructies te analyseren, moet elk punt op de reconstructie worden gekoppeld aan de vorige en de volgende tijdspunten. Het uitlijnen van complexe dendritische morfologieën in de loop van de tijd, die kunnen worden gecodeerd door meer dan 500 gegevenspunten, blijft een uitdagend probleem. Er zijn veel hulpmiddelen beschikbaar, met verschillende sterktes en beperkingen, en ze moeten worden geselecteerd om te voldoen aan de analyses die nodig zijn voor het onderzoek.
Figuur 5: Representatieve resultaten na neonatale intraoculaire injectie, time-lapse beeldvorming en deconvolutie. (A) Maximale projecties van gedeconvolgeerde time-lapse beeldvormingsreeksen (h:min) van P6 starburst amacrinecel 5 dagen na AAV-injectie. Fijne filopodiadynamica kan nu worden geanalyseerd met behulp van conventionele ImageJ-tools. Een gebied van dendritische verfijning (rode doos) en een gebied van dendritische uitgroei (groene doos) zijn gemarkeerd. (B, C) Enkele P6 starburst amacrine cel gelabeld met membraan-gelabelde eYFP 5 dagen naAAV injectie (dpi) toont heldere eencellige etikettering. Schaalbalken voor bovenste panelen = 50 μm; schaalbalken voor onderste panelen = 25 μm. Voor (A) en na (B) deconvolutie met ImageJ. Inzetstukken (rood) vertonen deblurring als gevolg van succesvolle deconvolutie. (D) P6 starburst amacrine cel 5dpi (links) vergeleken met P12 starburst cel 11 dpi vertoont vergelijkbare niveaus van fluorescerende eiwitexpressie. Toenemende AAV-incubatietijden verhogen het fluorescerende signaal niet. De fluorescerende signalen nemen niet af bij langere AAV-infectieperioden. Identieke acquisitie- en nabewerkingsparameters werden op beide afbeeldingen toegepast. Verhoogde takdikte en spataderen waargenomen bij P12 zijn normale kenmerken van rijpende starburstcellen en geen etiketterings- of beeldvormingsartefact. Schaalbalken = 10 μm. Afkortingen: AAV = adeno-associated virus; eYFP = verbeterd geel fluorescerend eiwit; dpi = dagen na infectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Overwegingen voor Cre-lijnselectie en fluorescerende eiwitlokalisatie.
(A-D) Levende P11 retinale ganglioncellen afgebeeld op 9 dpi van de BBV geïnjecteerd in Vglut2-iRES-Cre knock-in muizen, waarbij Cre selectief tot expressie komt in de RGC-populatie. (A) JAM-B RGC geïdentificeerd door zijn karakteristieke asymmetrische morfologie24. (B-D) Verschillende RGC-subtypen die verschillen in hun dendrietstratificatiepatronen. (E) Afbeelding van levende P11 starburst amacrine cel bioloog getransfecteerd met cytosolic mCherry en gevangen met draaiende schijf confocale op 512 x 512 pixels. Het cytosolische XFP leidt tot een hoog fluorescentiesignaal in de soma ten opzichte van de fijne dendritische uitsteeksels. Onscherp licht van de soma veroorzaakt hoge achtergrondfluorescentie bij het afbeelden van kleine proximale projecties (inzet in rood vak hierboven wordt hieronder weergegeven). (F) Afbeelding van levende P11 starburst amacrine cel getransfecteerd met membraan-gerichte eYFP en vastgelegd door confocale laserscanning op 1024 x 1024 pixels. Let op de fluorescerende membraanring rond de soma, de verbeterde signaal-ruisverhouding en de kwaliteit van de fijne projecties proximaal aan de soma die worden geproduceerd door membraangerichte fluorescerende eiwitten (inzet). Schaalstaven = 50 μm en voor onderste panelen van E en F = 5 μm. Afkortingen: IRES = interne ribosoom entry site; BBV = Brainbow adeno-geassocieerd virus; Vglut2 = vesiculaire glutamaattransporter 2; XFP = elk fluorescerend eiwit; eYFP = verbeterd geel fluorescerend eiwit; mCherry = monomere kers; RGC = retinale ganglioncellen; JAM-B = junction adhesion molecule B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video 1: Time-lapse video van P6 die starburst amacrine dendrieten ontwikkelt, 5 dagen nainjectie. Video time-step is 2 min. Deconvolutie en 3D-driftcorrectie werden toegepast met ImageJ. Bovenste gele vakken markeren gebieden van uitgroei en de onderste doos schetst een gebied van voorbijgaande filopodia-uitgroei, zelfcontact en terugtrekking. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullend bestand 1: ImageJ macro voor batch parallelle iteratieve deconvolutie. De macro draait 25 iteraties van het Wiener Filter Preconditioned Landweber (WPL) iteratieve algoritme. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze video demonstreert een experimentele pijplijn die bestaande genetische hulpmiddelen gebruikt om de dendrietdynamiek van ontwikkelende retinale neuronen in beeld te brengen met confocale live-imaging. Ook aangetoond zijn intraoculaire injecties van Cre-afhankelijke AAV's die coderen voor membraangerichte fluorescerende eiwitten in neonatale muizen. Afzonderlijke cellen van genetisch gerichte populaties worden al helder gelabeld als 4-5 dpi. Retinale flat-mounts werden voorbereid voor standaard beeldvormingskamers om live-cell confocale beeldvorming uit te voeren. Deze methode produceert time-lapse-video's met hoge resolutie van afzonderlijke cellen en hun fijne projecties. Kleine projecties worden opgelost en gekwantificeerd met behulp van deconvolutie- en nabewerkingsalgoritmen die beschikbaar zijn via open-source software, waaronder ImageJ, Vaa3D en ShuTu, evenals gelicentieerde software die beschikbaar is bij Imaris en MBF Bioscience. Omdat deze pijplijn modulair is, kan elke protocolsectie worden aangepast aan de doelstellingen van het onderzoek. Deze modulaire elementen worden hieronder besproken en omvatten: 1) Cre-line selectie, 2) keuze van fluorescerend eiwit en virale constructie, 3) genafgiftemethoden en 4) beeldvormingsmethode.
Deze techniek maakt gebruik van Cre transgene lijnen voor genetische toegang tot retinale cel subpopulaties. Cre moet postnataal actief zijn en tot expressie komen in de celpopulatie op het moment van injectie om de kans op virale infectie en celetikettering te vergroten. In dit rapport werd ChAT-Cre gebruikt om starburst amacrinecellen aan te pakken, en de Vglut2-Cre-lijn werd gebruikt om zich te richten op ontwikkelende RGC's42,43 (figuur 6). Cre-afhankelijke AAV-injectie in Vglut2-IRES-Cre knock-in muizen labelde een verscheidenheid aan RGC's, waaronder de junction adhesiemolecuul B-cel (figuur 6A) en bi-gestratificeerde RGC's (figuur 6B, C). Als alternatief kunnen nieuwe ontwerpen van AAV's met synthetische promotors die celtypespecifieke expressie aansturen, de noodzaak van Cre-transgene lijnen elimineren44. Een andere overweging voor efficiënte en heldere etikettering die geschikt is voor live-imaging is de minimale tijd die nodig is voor transfectie en expressie, die kan variëren afhankelijk van het AAV-serotype, tropisme en titer45. In deze studies, aangezien AAV-gemedieerde etikettering een minimum van 4-5 dpi vereist voor XFP-expressie, is deze methode niet geschikt voor toegang tot vroege postnatale tijdpunten. Om vroege tijdspunten vast te leggen (bijv. P0-P4), kunnen intraoculaire injecties worden uitgevoerd in utero bij embryonale dieren, zoals gedaan voor in utero-elektroporatie46. In de studies van deze groep naar de ontwikkeling van starburst dendriet, werd het initiële schaarse recombinatiepatroon van ChAT-Cre gebruikt om enkele starburst amacrinecellen op P0-P4 te labelen met behulp van een muistransgene Cre-reporter, Rosa-mTmG27. Ten slotte kan dit AAV retinale injectieprotocol worden gebruikt om volwassen celpopulaties te labelen, op basis van de bevestiging van de persistentie van fluorescerende etikettering 3 maanden na injectie zonder schadelijke effecten op de morfologie van de starburstcel34.
Deze pijplijn zorgt ook voor flexibiliteit in virale constructselectie. Om dendrietdynamica vast te leggen, kan een verscheidenheid aan fluorescerende reportereiwitten worden gebruikt, waaronder eiwitten die lokaliseren naar specifieke subcellulaire structuren, interessante eiwitten of functionele veranderingen rapporteren zoals actinedynamica (bijv. LifeAct) en calciumsignalen (bijv. GCaMP). Elke commercieel beschikbare of gekloonde AAV-vector kan worden gebruikt en online tools zoals fpbase.org moeten worden geraadpleegd voor helderheid en fotostabiliteit. Hier werden Brainbow virale vectoren die coderen voor fluorescerende eiwitten met een H-Ras farnesylatie CAAX-motief gebruikt voor membraanlokalisatie. Vroeg in de protocolontwikkeling bleek cytosolische lokalisatie van XPF's niet ideaal te zijn voor het bestuderen van fijne neurietmorfologie, met een oververzadiging van signalen van de soma en slechte etikettering van fijne takken (figuur 6E). Ter vergelijking: membraangerichte fluorescerende eiwitten bleken fijne dendritische uitsteeksels te labelen en op te lossen (figuur 6E,F). Een andere overweging is de grootte, het ontwerp en de complexiteit van het virale construct, die de expressietijd kunnen beïnvloeden. Er werd bijvoorbeeld AAV-CAG-FLEx-mClover3-CAAX gegenereerd, dat één XFP op een Cre-afhankelijke manier uitdrukt. Deze constructie heeft een eenvoudiger ontwerp en resulteert in een efficiënte expressie met 4 dpi. Samen maken de diverse opties voor Cre-lijnen, AAV-ontwerpen en fluorescerende eiwitreporters die op grote schaal beschikbaar zijn in repositories (bijv. JAX, Addgene en Viral Vector Cores) deze pijplijn aanpasbaar aan een verscheidenheid aan studies van celtypen en ontwikkelingsverschijnselen in het netvlies.
Hoewel dit protocol intraoculaire AAV-injecties beschrijft, zijn er andere genafgiftemethoden beschikbaar, zoals plasmide-elektroporatie46 en biolistische genafgifte (bijv. Gene Gun)7. Elektroporatie vereist het toepassen van een elektrische puls en biolistische genafgifte vereist ex vivo incubatie van retinale explantaten. AAV-etikettering is minder invasief dan beide methoden en maakt acute preparaten van retina-explantaten mogelijk vlak voordat de beeldvorming plaatsvindt. Vergeleken met biolistische genafgifte (figuur 6E, F), resulteerden AAV-injecties in verbeterde levensvatbaarheid van weefsel die beter geschikt was voor continue acquisitie die nodig was om de neurietdynamiek te volgen. Met de juiste techniek veroorzaakt AAV-etikettering weinig tot geen schade aan het netvlies, zoals beoordeeld aan de hand van de gezondheid van het weefsel op het moment van dissectie. Intravitreale injecties infecteren voornamelijk cellen in de ganglioncellaag en de binnenste nucleaire laag, zoals de RGC's en amacrinecellen. Vele tientallen starburst amacrine cellen worden meestal gelabeld, met een verhoogde dichtheid van gelabelde cellen rond de oogzenuwkop (figuur 4C). Bij alle drie de transfectiemethoden is het verbreken van de oogzenuw echter onvermijdelijk om retinale explantaten te verkrijgen en zal dit leiden tot RGC-degeneratie. Ondanks het verbreken van de oogzenuw, rapporteren studies levensvatbare retinale explantaten van een verscheidenheid aan gewervelde modellen gedurende 36 uur en tot 6 dagen postucleatie5,6,7,47,48.
Ten slotte is het nut van confocale microscopie om dendrietdynamica vast te leggen aangetoond. Meestal duurt een beeldvormingssessie 2-4 uur en wordt deze afgesloten voordat weefselafbraak of neuriet blebbing wordt waargenomen. Beeldvormingssessies tot 6 uur zijn uitgevoerd; de bovengrens is echter niet systematisch getoetst. Gebieden kunnen fotobleeken ondergaan als gevolg van langdurige beeldvorming, maar cellen in andere gezichtsvelden in de explant blijven levensvatbaar voor live-imaging. Deze methode kan ook worden uitgebreid naar multifoton- of lightsheet-microscopie om neuronale morfologie in diepere lagen en grotere volumes in beeld te brengen. Multifoton imaging is uitgevoerd om neurietdynamica in het netvlies van muizen te bestuderen en is beter geschikt voor het bestuderen van cellen in diepere retinale lamina (bijv. Horizontale of fotoreceptorcellen)49. Onlangs werd live-cell lightsheet-microscopie gebruikt om retinale angiogenese50 vast te leggen, wat een nieuwe weg biedt voor live-imaging van morfogenese in het hele netvlies. Live-cell lightsheet microscopie kan worden gebruikt om neurale circuitassemblage op grotere schalen te bestuderen, zoals axon-dendriet targeting. Multicolor live-imaging is een andere toepassing van deze pijplijn die kan worden gebruikt om cel-celinteracties te onderzoeken, zoals de invloed van naburige cellen op de dendrietontwikkeling of andere ontwikkelingsverschijnselen zoals betegeling van retinale cellen, waaronder RGC-subtypen1, microglia en astrocyten.
Kortom, een uitdagend aspect van ontwikkelingsstudies is het verkrijgen van toegang op deze kritieke tijdstippen. Dit protocol biedt een methode om morfogenese te visualiseren die optreedt tijdens een specifiek temporel venster. De pijplijn combineert bestaande tools en technieken om celpopulaties genetisch te targeten en membraangerichte fluorescerende eiwitten tot expressie te brengen. Acute retinale flat-mount preparaten behouden levensvatbaarheid en fluorescerende signalen voor live-cell confocale beeldvorming gedurende meerdere uren. Voorbijgaande en dynamische aspecten van dendrietontwikkeling worden vastgelegd in 3D-video's en worden nabewerkt met behulp van open-source software. De mogelijkheid om 3D-video's met hoge resolutie vast te leggen is essentieel bij het onderzoeken van dynamische ontwikkelingsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Madison Gray dat ze me een hand heeft gegeven toen ik er geen had. Dit onderzoek werd ondersteund door een NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), een Sloan Fellowship in Neuroscience en een Canada Research Chair Tier 2 (aan J.L.L). S. Ing-Esteves werd ondersteund door het Vision Science Research Program en NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene viral prep #45185-AAV9 | |||
| Addgene viral prep #45186-AAV9 | |||
| Dissection tools | |||
| Cellulose filter paper | Whatman | 1001-070 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11252-20 | Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection |
| Dumont forceps | VWR | 82027-426 | |
| Fine Scissors | FST | 14058-09 | |
| Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size | Millipore | HABG01 300 | |
| Petri Dish, 50 × 15 mm | VWR | 470313-352 | |
| Polyethylene disposable transfer pipette | VWR | 470225-034 | |
| Round tip paint brush, size 3/0 | Conventional art supply store | Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting | |
| Surgical Scissors | FST | 14007-14 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Live-imaging incubation system | |||
| Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' | Warner Instruments | 64-0755 | |
| Dual channel heater controller, Model TC-344C | Warner Instruments | 64-2401 | |
| HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective | Leica | 15506374 | |
| Heater controller cable | Warner Instruments | CC-28 | |
| Large bath incubation chamber with slice support | Warner Instruments | RC-27L | |
| MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) | Warner Instruments | PM-6D | |
| Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
| Sample anchor (Harps) | Warner Instruments | 64-0260 | Sample anchor must be compatible with incubation chamber |
| Sloflo In-line Solution Heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Neonatal Injections | |||
| 10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle | Hamilton Company | 80314 | |
| 30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| 4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm) | WPI World Precision Instruments | TW100-4 | |
| Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) | Sigma-Aldrich | V001229 | |
| AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF | Penn Vector Core | AV-9-PV2453 | Addgene Plasmid #45185 |
| AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF |
Penn Vector Core | AV-9-PV2454 | Addgene Plasmid #45186 |
| ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line | The Jackson Laboratory | 6410 | |
| Fast Green FCF Dye content ≥85 % | Sigma-Aldrich | F7252-25G | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Green tattoo paste | Ketchum MFG Co | 329A | |
| Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Pneumatic PicoPump | WPI World Precision Instruments | PV-820 | |
| Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents | |||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Carbogen (5% CO2, 95% O2) | AirGas | X02OX95C2003102 | Supplier may vary depending on region |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES, Free Acid | Bio Basic | HB0264 | |
| Hydrochloric acid solution, 1 N | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pH-Test strips (6.0-7.7) | VWR | BDH35317.604 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Software | |||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Open source |
References
- Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
- Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synaptic specificity and retinal circuit formation. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental biology. 10 (1), 379 (2021).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52 (4), 609-621 (2006).
- Wong, W. T., Faulkner-Jones, B. E., Sanes, J. R., Wong, R. O. Rapid dendritic remodeling in the developing retina: dependence on neurotransmission and reciprocal regulation by Rac and Rho. The Journal of Neuroscience. 20 (13), 5024-5036 (2000).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nature Protocols. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Morgan, J. L., Wong, R. O. L. Ballistic labeling with fluorescent dyes and indicators. Current Protocols in Neuroscience. 43 (1), 1-10 (2008).
- Nickerson, P. E. B., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Developmental Biology. 13, 24 (2013).
- Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. L. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
- Coombs, J. L., Van Der List, D., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells during postnatal development. The Journal of Comparative Neurology. 503 (6), 803-814 (2007).
- Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
- Stacy, R. C., Wong, R. O. L. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 456 (2), 154-166 (2003).
- Kay, J. N., et al. Retinal ganglion cells with distinct directional preferences differ in molecular identity, structure, and central projections. The Journal of Neuroscience. 31 (21), 7753-7762 (2011).
- Liu, J., Sanes, J. R. Cellular and molecular analysis of dendritic morphogenesis in a retinal cell type that senses color contrast and ventral motion. The Journal of Neuroscience. 37 (50), 12247-12262 (2017).
- Diao, L., Sun, W., Deng, Q., He, S. Development of the mouse retina: emerging morphological diversity of the ganglion cells. Journal of Neurobiology. 61 (2), 236-249 (2004).
- Coombs, J., vander List, D., Wang, G. Y., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells. Neuroscience. 140 (1), 123-136 (2006).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Sümbül, U., et al. A genetic and computational approach to structurally classify neuronal types. Nature Communications. 5, 3512 (2014).
- Lin, B., Masland, R. H. Populations of wide-field amacrine cells in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 499 (5), 797-809 (2006).
- Macneil, M. A., Heussy, J. K., Dacheux, R. F., Raviola, E., Masland, R. H. The shapes and numbers of amacrine cells: Matching of photofilled with Golgi-stained cells in the rabbit retina and comparison with other mammalian species. Journal of Comparative Neurology. 413 (2), 305-326 (1999).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Jo, A., Xu, J., Deniz, S., Cherian, S., DeVries, S. H., Zhu, Y. Intersectional strategies for targeting amacrine and ganglion cell types in the mouse retina. Frontiers in Neural Circuits. 12, 66 (2018).
- Siegert, S., et al. Genetic address book for retinal cell types. Nature Neuroscience. 12 (9), 1197-1204 (2009).
- Kim, I. -J., Zhang, Y., Meister, M., Sanes, J. R. Laminar restriction of retinal ganglion cell dendrites and axons: subtype-specific developmental patterns revealed with transgenic markers. The Journal of Neuroscience. 30 (4), 1452-1462 (2010).
- Peng, Y. -R., Tran, N. M., Krishnaswamy, A., Kostadinov, D., Martersteck, E. M., Sanes, J. R. Satb1 regulates contactin 5 to pattern dendrites of a mammalian retinal ganglion cell. Neuron. 95 (4), 869-883 (2017).
- Duan, X., Krishnaswamy, A., Dela Huerta, I., Sanes, J. R. Type II cadherins guide assembly of a direction-selective retinal circuit. Cell. 158 (4), 793-807 (2014).
- Ray, T. A., et al. Formation of retinal direction-selective circuitry initiated by starburst amacrine cell homotypic contact. eLife. 7, 34241 (2018).
- Krishnaswamy, A., Yamagata, M., Duan, X., Hong, Y. K., Sanes, J. R. Sidekick 2 directs formation of a retinal circuit that detects differential motion. Nature. 524 (7566), 466-470 (2015).
- Caval-Holme, F., Zhang, Y., Feller, M. B. Gap junction coupling shapes the encoding of light in the developing retina. Current Biology. 29 (23), 4024-4035 (2019).
- Lucas, J. A., Schmidt, T. M. Cellular properties of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells during postnatal development. Neural Development. 14 (1), 8 (2019).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. 10 (6), 540-547 (2013).
- Rossi, J., et al. Melanocortin-4 receptors expressed by cholinergic neurons regulate energy balance and glucose homeostasis. Cell Metabolism. 13 (2), 195-204 (2011).
- Lefebvre, J. L., Kostadinov, D., Chen, W. V., Maniatis, T., Sanes, J. R. Protocadherins mediate dendritic self-avoidance in the mammalian nervous system. Nature. 488 (7412), 517-521 (2012).
- Ing-Esteves, S., et al. Combinatorial effects of alpha- and gamma-protocadherins on neuronal survival and dendritic self-avoidance. The Journal of Neuroscience. 38 (11), 2713-2729 (2018).
- Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. L. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (1), (2013).
- Ramoa, A. S., Campbell, G., Shatz, C. J. Transient morphological features of identified ganglion cells in living fetal and neonatal retina. Science. 237 (4814), 522-525 (1987).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
- Cuntz, H., Forstner, F., Borst, A., Häusser, M. One rule to grow them all: a general theory of neuronal branching and its practical application. PLoS Computational Biology. 6 (8), 1000877 (2010).
- Xiao, H., Peng, H. APP2: automatic tracing of 3D neuron morphology based on hierarchical pruning of a gray-weighted image distance-tree. Bioinformatics. 29 (11), 1448-1454 (2013).
- Nanda, S., et al. Design and implementation of multi-signal and time-varying neural reconstructions. Scientific data. 5, 170207 (2018).
- Sherry, D. M., Wang, M. M., Bates, J., Frishman, L. J. Expression of vesicular glutamate transporter 1 in the mouse retina reveals temporal ordering in development of rod vs. cone and ON vs. OFF circuits. The Journal of Comparative Neurology. 465 (4), 480-498 (2003).
- Johnson, J., et al. Vesicular neurotransmitter transporter expression in developing postnatal rodent retina: GABA and glycine precede glutamate. The Journal of Neuroscience. 23 (2), 518-529 (2003).
- Jüttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (31), e1333 (2009).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e190 (2007).
- Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. The Journal of Comparative Neurology. 476 (3), 254-266 (2004).
- Huckfeldt, R. M., et al. Transient neurites of retinal horizontal cells exhibit columnar tiling via homotypic interactions. Nature Neuroscience. 12 (1), 35-43 (2009).
- Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779 (2020).
