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Neuroscience

Imaging time-lapse dell'arborizzazione neuronale utilizzando l'etichettatura del virus adeno-associato sparso di popolazioni di cellule retiniche geneticamente mirate

Published: March 19, 2021 doi: 10.3791/62308
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Program for Neuroscience and Mental Health, Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Summary

Qui, presentiamo un metodo per studiare la morfogenesi dei neuriti negli espianti retinici postnatali di topo mediante microscopia confocale time-lapse. Descriviamo un approccio per l'etichettatura sparsa e l'acquisizione di tipi di cellule retiniche e dei loro processi fini utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti che esprimono proteine fluorescenti mirate alla membrana in modo Cre-dipendente.

Abstract

La scoperta di meccanismi che modellano i pergole dendritiche richiede metodi per visualizzare, immaginare e analizzare i dendriti durante lo sviluppo. La retina del topo è un potente sistema modello per lo studio dei meccanismi specifici del tipo cellulare della morfogenesi neuronale e della connettività. L'organizzazione e la composizione dei sottotipi di retina sono ben definite e sono disponibili strumenti genetici per accedere a tipi specifici durante lo sviluppo. Molti tipi di cellule retiniche vincolano anche i loro dendriti e / o assoni a strati stretti, il che facilita l'imaging time-lapse. Le colture di espianto della retina del topo sono adatte per l'imaging di cellule vive utilizzando la microscopia confocale o multifotonica, ma mancano metodi ottimizzati per l'imaging della dinamica della dendrite con risoluzione temporale e strutturale. Qui viene presentato un metodo per etichettare e visualizzare scarsamente lo sviluppo di specifiche popolazioni retiniche caratterizzate dal sistema Cre-Lox. I virus adeno-associati disponibili in commercio (AAV) qui utilizzati hanno espresso proteine fluorescenti mirate alla membrana in modo Cre-dipendente. La somministrazione intraoculare di AAV nei topi neonatali produce l'etichettatura fluorescente dei tipi di cellule mirate entro 4-5 giorni dall'iniezione (dpi). I segnali fluorescenti a membrana sono rilevabili mediante imaging confocale e risolvono strutture e dinamiche di rami fini. Video di alta qualità della durata di 2-4 ore vengono acquisiti dall'imaging di supporti piatti retinici perfusi con liquido cerebrospinale artificiale ossigenato (aCSF). Viene inoltre fornita una pipeline di post-elaborazione delle immagini per la deconvoluzione e la correzione tridimensionale (3D) della deriva. Questo protocollo può essere utilizzato per catturare diversi comportamenti cellulari nella retina intatta e per identificare nuovi fattori che controllano la morfogenesi dei neuriti. Molte strategie di sviluppo apprese nella retina saranno rilevanti per comprendere la formazione di circuiti neurali altrove nel sistema nervoso centrale.

Introduction

I dendriti dei neuroni retinici formano schemi intricati, ma specifici, che influenzano la loro funzione all'interno dei circuiti neurali. Nella retina dei vertebrati, diversi tipi di cellule gangliari retiniche (RGC) e interneuroni a cellule amacrine portano morfologie dendritiche uniche che differiscono per dimensioni del pergolato, posizione, lunghezza del ramo e densità1. Durante lo sviluppo postnatale, gli RGC e le cellule amacrine estendono i processi dendritici esuberanti in un neuropil chiamato strato plessiforme interno (IPL), dove ricevono input di cellule bipolari che trasmettono segnali fotorecettori2. Come catturato dall'imaging time-lapse di popolazioni retiniche marcate fluorescentemente in larve di pulcino o zebrafish, la morfogenesi dei dendrite è altamente dinamica3,4,5. In pochi giorni, i pergole dendritiche si espandono, rimodellano e si ramificano in stretti sottostrati dell'IPL, dove si sinapsino con partner selezionati. I pergole mostrano diverse dinamiche strutturali rispetto allo sviluppo, con cambiamenti nei tassi relativi di aggiunta di rami, retrazione e stabilizzazione. I dendriti di amacrina e RGC mostrano anche diversi comportamenti di crescita e rimodellamento che potrebbero riflettere l'arborizzazione specifica del tipo. Tuttavia, questi studi hanno monitorato ampie popolazioni di amacrine o RGC e si sono concentrati sul targeting laminare, che è solo un aspetto della morfologia.

I meccanismi che producono la vasta diversità morfologica osservata tra i sottotipi di retina sono poco conosciuti. L'obiettivo di questo gruppo era quello di sviluppare un metodo per catturare la dinamica dei dendriti e il rimodellamento del pergolato di sottotipi retinici definiti nei topi. L'identificazione dei meccanismi specifici del tipo di cellula del pattern dendrite richiede metodi per visualizzare e misurare i comportamenti dei dendrite delle cellule di interesse. Le colture organotipiche di retine di topo sono adatte per studi di imaging di cellule vive utilizzando la microscopia confocale o multifotonica. Le retine in via di sviluppo vengono sezionate e montate in un impianto piatto che può essere ripreso per diverse ore in una camera di registrazione o coltivato in pochi giorni con effetti limitati sul circuito6,7. I neuroni retinici vivi possono essere etichettati con una varietà di tecniche, tra cui il riempimento del colorante mediante elettrodi, l'elettroporazione, la somministrazione biolistica di particelle rivestite con coloranti lipofili o plasmidi che codificano proteine fluorescenti (ad esempio, Gene Gun), nonché etichette cellulari geneticamente codificate7,8,9,10 . Tuttavia, questi approcci sono inefficienti per l'imaging della dinamica dei dendriti di specifici sottotipi di retina. Ad esempio, i metodi di riempimento dei coloranti sono a bassa produttività e richiedono apparecchiature di elettrofisiologia ed etichette genetiche aggiuntive per indirizzare in modo affidabile le cellule di interesse. Inoltre, i forti segnali di fluorescenza nel soma possono oscurare i dendriti vicini.

I metodi di consegna dei geni biolistici possono etichettare simultaneamente dozzine di cellule, ma i passaggi che coinvolgono la consegna di particelle ad alta pressione e l'incubazione notturna della retina isolata possono compromettere la fisiologia cellulare e la crescita dendritica. Questo documento propone che i recenti strumenti genetici possano essere impiegati per catturare le prime dinamiche dei dendriti con il tipo di cellula e la risoluzione strutturale, dati i seguenti criteri sperimentali. In primo luogo, per risolvere i rami sottili e i filopodi che dominano i pergolati in via di sviluppo, il metodo dovrebbe etichettare i neuroni con proteine luminose e fluorescenti che riempiono i processi nell'intero pergolato. L'etichettatura a fluorescenza non deve sbiadire a causa del fotosbiancamento durante il periodo di imaging. È stata generata una varietà di varianti proteiche fluorescenti e confrontate per l'idoneità per l'imaging in vivo/ex vivo11 in base alla luminosità e alla fotostabilità. In secondo luogo, le proteine fluorescenti (XFP) devono essere espresse a livelli sufficientemente elevati dal primo stadio della morfogenesi della dendrite, in modo che non si perda la stretta finestra di sviluppo. Nelle analisi dei timepoint statici nella retina del topo, lo sviluppo di dendrite avviene durante la prima settimana postnatale e comprende fasi di crescita, rimodellamento e stabilizzazione10,12,13,14,15. In terzo luogo, il metodo dovrebbe portare a un'etichettatura selettiva o ad una maggiore probabilità di etichettatura della sottopopolazione neuronale di interesse. In quarto luogo, l'etichettatura della sottopopolazione bersaglio deve essere sufficientemente scarsa in modo che l'intero pergolato neuronale possa essere identificato e rintracciato. Sebbene i sottotipi di RGC e amacrina possano essere distinti per le loro caratteristiche morfologiche mature e i modelli di stratificazione IPL16,17,18,19,20, la sfida è identificare i sottotipi durante lo sviluppo basati su strutture immature. Questo compito è facilitato dall'espansione di strumenti transgenici per etichettare specifici tipi di cellule retiniche durante lo sviluppo.

Le linee di topo transgeniche e knock-in in cui l'espressione cellulare e temporale di proteine fluorescenti o Cre è determinata da elementi regolatori genici sono ampiamente utilizzate per studiare i tipi di cellule retiniche13,21,22,23. Osservazioni chiave sui modelli specifici del sottotipo di sviluppo di dendrite provengono da studi su retine di topi transgenici a timepoint statici10,14,24,25. Il sistema Cre-Lox, in particolare, consente una squisita manipolazione genica e il monitoraggio dei sottotipi utilizzando una varietà di reporter, sensori e attivatori optogenetici dipendenti dalla ricombinasi. Questi strumenti hanno portato alla scoperta di programmi molecolari specifici del sottotipo e proprietà funzionali che sono alla base dell'assemblaggio del circuito retinico26,27,28,29,30. Tuttavia, devono ancora essere sfruttati per studiare la dinamica dei dendriti specifici del sottotipo nella retina del topo. L'etichettatura a bassa densità può essere ottenuta combinando le linee di topo Cre con i transgeni introdotti dall'elettroporazione o dagli AAV ricombinanti. Se disponibili, possono essere utilizzate anche linee Cre inducibili dal tamoxifene o strategie genetiche intersezionali. Infine, la cellula deve essere marcata in modo minimamente invasivo e fotografata utilizzando parametri di acquisizione in modo da non compromettere il tessuto o interferire con la funzione cellulare richiesta per la morfogenesi dei dendriti.

Qui viene presentato un metodo per applicare strumenti transgenici e microscopia confocale per studiare la dinamica dei dendriti negli espianti retinici di topo vivo. Le linee di topo transgenico Cre sono state combinate con vettori AAV che esprimono proteine fluorescenti sulla ricombinazione cre, che consente l'etichettatura sparsa delle cellule retiniche di interesse. Gli AAV disponibili in commercio vengono consegnati alla retina neonatale mediante iniezioni intravitreali. Questo documento dimostra che gli AAV producono un'espressione fluorescente significativamente elevata e specifica del tipo di cellula di 4 dpi, consentendo l'accesso ai punti temporali postnatali. Per illustrare questo approccio, l'interneurone colinergico "starburst" amacrina è stato etichettato consegnando Brainbow AAV in topi neonatali che esprimono il sito di ingresso del ribosoma interno alla colina acetilsi (ChAT) (IRES)-Cre transgene, che è attivo nella retina postnatale precoce31,32. Le cellule amacrine Starburst sviluppano una morfologia stereotipata e radiale del pergolato che è modellata dall'auto-evitamento della dendrite mediata dalle protocadherine raggruppate33,34. Questo documento mostra che la risoluzione dei dendriti starburst e dei filopodi è significativamente migliorata dagli XFP alla membrana plasmatica con l'aggiunta del motivo CAAX che subisce la farnesilazione, come usato per gli AAV Brainbow31. Infine, sono stati determinati protocolli di imaging e post-elaborazione time-lapse che producono immagini di alta qualità suscettibili di ricostruzione di dendrite e quantificazione morfometrica. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare i fattori che controllano la morfogenesi dei dendriti e per catturare diversi comportamenti cellulari nella retina intatta.

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Protocol

NOTA: Questo protocollo si estende su 2 giorni con un periodo minimo di 4-5 giorni per la trasduzione virale tra i giorni sperimentali (Figura 1A). Gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care per l'uso degli animali nella ricerca e nella cura degli animali da laboratorio secondo protocolli approvati dal Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee presso l'Hospital for Sick Children (Toronto, Canada).

1. Preparazioni per le iniezioni neonatali di AAV ed esperimenti di imaging

  1. Selezionare una linea del mouse Cre per etichettare le popolazioni di cellule retiniche di interesse. Confermare l'espressione di Cre ricombinasi al momento delle iniezioni di AAV incrociando un reporter transgenico Cre o attraverso l'immunocolorazione con un anticorpo Cre.
  2. Alleva topi Cre transgenici (8-16 settimane) per generare animali neonatali Cre-positivi.
    NOTA: Per questa dimostrazione, i topi knock-in ChAT-IRES-Cre sono stati utilizzati per colpire le cellule colinergiche di amacrina Starburst.
  3. Ottenere il virus AAV ricombinasi-dipendente che codifica per le proteine fluorescenti. Per un'etichettatura ottimale dei processi fini, selezionare i vettori che esprimono XFP modificati mirati alla membrana plasmatica.
    NOTA: Questo studio ha utilizzato il virus Brainbow (BBV), AAV-EF1a-BbTagBY e AAV9-EF1a-BbChT (vedi Tabella dei materiali), che forniscono l'opzione per l'etichettatura multicolore (Figura 1B). L'espressione della proteina fluorescente gialla potenziata farnesilata (eYFP) e della ciliegia monomerica (mCherry) ha prodotto i segnali fluorescenti più forti per l'imaging dal vivo. Un singolo BBV può essere utilizzato per visualizzare singoli pergole, mentre la co-iniezione di BBV può essere utilizzata per etichettare più cellule o pergole vicine con fluorofori distinti. Se si utilizzano più proteine fluorescenti, assicurarsi una sovrapposizione minima dello spettro di emissione (Figura 1C). I parametri di acquisizione del microscopio devono essere regolati per catturare segnali XFP distinti.
  4. Preparare aliquote ∼3-5 μL di AAV in singoli tubi a bassa legatura per scorte monouso per evitare cicli di congelamento/scongelamento. Conservare a -80 °C.
  5. Preparare micropipette di vetro borosilicato con punte molto fini utilizzando un estrattore di micropipette.
    NOTA: le impostazioni dell'estrattore variano a seconda del filamento e dell'estrattore utilizzato; vedere la Figura 2A per le dimensioni e la forma della punta finale. I diametri tipici delle goccioline sono 600 μm.
  6. Ottenere un sistema di microiniezione e tubi associati. Collegare il microiniettore a una porta d'aria pressurizzata.

Figure 1
Figura 1: Panoramica sperimentale. (A) Questo protocollo copre 2 giorni di esperimenti con un periodo di infezione minimo di 4-5 giorni tra i giorni sperimentali. Le iniezioni intraoculari vengono eseguite su topi neonatali non più vecchi del giorno 3 postnatale. Le retine vengono quindi sezionate, montate in piano e fotografate dal vivo per catturare la finestra di sviluppo desiderata. Le cellule marcate possono essere fotografate in qualsiasi momento dopo i 4-5 giorni necessari per l'espressione virale, poiché non vi sono effetti apparenti dell'espressione prolungata di AAV sulla morfologia dei dendriti. (B) I vettori AAV Cre-dipendenti brainbow (BBV) vengono iniettati in animali che esprimono Cre31. In questo studio, i topi knock-in ChAT-Cre sono stati utilizzati per guidare la ricombinazione cre nelle cellule amacrine starburst. I due BBV codificano eYFP o tagBFP modificati, o mCherry e mTFP, che terminano in un motivo CAAX che viene farnesilato sequenzialmente per la localizzazione della membrana. I siti Lox sono raffigurati con triangoli. I vettori esprimono XFP farnesilati in modo stocastico e combinatorio dipendente dalla ricombinazione di Cre. Il promotore EF1α include elementi regolatori del gene del fattore di allungamento 1α. W rappresenta gli elementi dell'elemento regolatore post-trascrizionale del virus dell'epatite woodchuck e pA indica la sequenza di poliadenilazione. (C) Gli spettri di eccitazione ed emissione di mCherry ed eYFP, i fluorofori BBV ripresi in questo studio. Quando si esegue l'imaging dal vivo di più proteine fluorescenti, i parametri di rilevamento devono essere disposti in modo da separare adeguatamente gli spettri di emissione in canali distinti. Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato; BBV = Brainbow AAV; ChAT = colina acetiltransferasi; iRES = sito di ingresso interno del ribosoma; eYFP = proteina fluorescente gialla potenziata; iTR = ripetizione terminale invertita; tagBP = Tag-blue proteina fluorescente; mCherry = ciliegia monomerica; mTFP = proteina fluorescente verde acqua; XFP = qualsiasi proteina fluorescente; EF1α= fattore di allungamento 1 alfa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Iniezioni intravitreali di AAV in topi neonatali

  1. Scongelare un'aliquota AAV sul ghiaccio. Preparare una diluizione AAV ~1:4 utilizzando soluzione salina sterile o soluzione salina tamponata con fosfato. Preparare ~ 0,5 μL di diluizione AAV per animale (~ 0,25 μL per occhio) nel caso in cui la micropipetta si rompa e una nuova pipetta debba essere riempita. Conservare il restante AAV non diluito a 4 °C e utilizzare entro 2 settimane.
    NOTA: In questo esperimento, la concentrazione di AAV del fornitore era ~ 1-2 × contenuto del genoma 1013 (GC) / mL e diluita a una concentrazione finale di 4 × 1012 GC / mL. Ottimizzare la concentrazione virale per ottenere la densità di etichettatura desiderata.
  2. Per visualizzare le iniezioni, aggiungere circa 1 μL di soluzione colorante Fast Green FCF allo 0,02% per ogni 15 μL di diluizione AAV per colorare la soluzione di blu.
  3. Trasferire una gabbia per topi con diga e lettiera neonatale (giorno postnatale (P) 0,5-3) in una sala operatoria con apparecchiature di microiniezione. Tieni gli animali nella stessa gabbia con nidi e lettiere per ridurre al minimo lo stress materno e il rifiuto dei cuccioli.
  4. Sterilizzare l'area di iniezione con il 70% di etanolo e posizionare i cuscinetti per pannolini sterili sulle superfici del banco. Preparare una piattaforma calda (ad esempio, una piastra riscaldante) per il recupero dall'anestesia indotta da ipotermia.
  5. Riempire la micropipetta con la diluizione AAV utilizzando una microsiringa. Sotto uno stereomicroscopio, rompere la punta della micropipetta con un ago da 30 G per aprire la punta.
    NOTA: la Figura 2A mostra la punta riempita, sia sigillata (in alto) che non sigillata (al centro).
  6. Anestetizzare i topi neonatali per ipotermia mettendo 1-2 animali sul ghiaccio. Metti gli animali su un guanto di lattice per proteggere la pelle dal contatto diretto con il ghiaccio. Una volta che l'animale non si muove più in risposta al pizzico della zampa (~ 2 min), posiziona l'animale sotto uno stereomicroscopio. Se lo si desidera, tatuare i cuscinetti delle zampe con inchiostro per tatuaggi e ago da 30 G e raccogliere ritagli di coda per l'isolamento del DNA per identificare gli animali mediante genotipizzazione.
    NOTA: durante tutta la procedura deve essere effettuato un adeguato monitoraggio della profondità dell'anestesia.
  7. Tamponare la pelle sovrastante gli occhi con il 70% di etanolo. Utilizzare un ago da 30 G per aprire la palpebra fusa (Figura 2B). Applicare una leggera pressione con le dita per aprire l'occhio e praticare un piccolo foro attraverso la cornea alla giunzione cornea-sclera (Figura 2C).
  8. Inserire la micropipetta di vetro nel foro e premere il pedale del microiniettore 2-4 volte per iniettare l'AAV nello spazio intravitreale. Rimuovere lentamente la micropipetta e confermare l'iniezione di AAV visualizzando il colorante blu attraverso la pupilla (Figura 2D).
    NOTA: con una pressione di espulsione di 6-8 psi e un tempo di impulso di 600-800 ms, viene espulsa una goccia di diametro 600 μm (Figura 2A, in basso). Circa 0,23-0,45 μL di soluzione AAV vengono iniettati per occhio. La soluzione blu all'esterno dell'occhio indica che l'AAV non è stato iniettato nell'occhio. La soluzione blu che fuoriesce dal sito di iniezione indica che l'AAV potrebbe essere fuoriuscito, riducendo l'efficienza di trasfezione.
  9. Premere delicatamente le palpebre insieme per sigillare nuovamente e posizionare il cucciolo su un cuscinetto riscaldato. Una volta che gli animali recuperano un colore rosato e sono reattivi, trasferiscili delicatamente nella gabbia di stabulazione.
    NOTA: Assicurarsi che vengano prese le precauzioni appropriate per evitare un riscaldamento troppo rapido dei cuccioli.
  10. Ripetere la procedura di iniezione per gli animali rimanenti nella lettiera. Lasciare un minimo di 4-5 giorni per la trasduzione virale prima di visualizzare la retina.

Figure 2
Figura 2: Iniezioni intraoculari neonatali. (A) La micropipetta riempita mostra la forma della punta della pipetta quando è sigillata (in alto) e dopo che la punta è stata aperta (in basso, a sinistra). La pressione di pico-iniezione di 6-8 psi e il tempo di impulso di 600-800 ms producono una goccia di 600 μm di diametro (in basso, a destra). Barra della scala = 1 mm.(B) Cucciolo P0 anestetizzato con ingrandimento 16x. La giunzione palpebrale fusa (bianca) viene aperta a fessura utilizzando un ago affilato da 30 G. Scala bar = 2 mm. (C) La leggera pressione applicata all'occhio espone la cornea; barra della scala = 2 mm. La sezione ingrandita (rossa) mostra il piccolo foro alla giunzione cornea-sclera (giallo) creato con un ago da 30 G; barra della scala = 0,5 mm. (D) Ritiro della punta della pipetta dopo l'iniezione (a sinistra). Il colorante Fast Green nella soluzione AAV appare come blu-grigio attraverso la pupilla (al centro), rispetto al colore della pupilla chiara prima dell'iniezione (a destra). Barra della scala = 1 mm. (E) Dopo 4 giorni, la palpebra è guarita e si è fusa chiusa (a sinistra); barra della scala = 2 mm. Al momento dell'enucleazione, il sito di iniezione guarito è visibile (giallo); barra della scala = 1 mm. Si noti la posizione del sito di iniezione al confine tra la cornea e la sclera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Dissezioni retiniche per esperimenti di imaging

  1. Preparare l'aCSF retinico (119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2·6H2O, 2,5 mM CaCl2·2H2O, 1 mM NaH2PO4, 11 mM glucosio e 20 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (acido libero HEPES)35. Se lo si desidera, preparare e congelare la soluzione 10x; scongelare e diluire a 1x secondo necessità.
  2. Ossigenare l'aCSF retinico gorgogliando con carbogeno (95% O2, 5% CO2) per un minimo di 15 min. Regolare il pH a 7,4. Conservare in un contenitore sigillato fino all'uso per assicurarsi che l'aCSF rimanga ossigenato.
    NOTA: le retine richiedono un'alta concentrazione di O2. È importante mantenere l'aCSF ossigenato durante l'esperimento.
  3. Incorporare una capsula di Petri di 60 mm di diametro in un vassoio del ghiaccio (creare un vassoio del ghiaccio in plastica da laboratorio, ad esempio un coperchio della scatola della pipetta) e posizionarlo sotto uno stereomicroscopio. Riempire la capsula di Petri con aCSF retinico ossigenato.
  4. Eutanasia topi P9 e più giovani per decapitazione. Eutanasia topi P10 e più anziani per induzione di isoflurano, o un metodo alternativo approvato secondo il protocollo animale, seguito da decapitazione.
  5. Se le palpebre sono sigillate, tagliare il lembo palpebrale per esporre l'occhio. Utilizzare una pinza per enucleare gli occhi e trasferirli nell'aCSF retinico freddo dal passaggio 3.3.
  6. Per sezionare la coppa retinica, sotto uno stereomicroscopio (ingrandimento 25x), stabilizzare l'occhio stringendo il nervo ottico usando un forcepe Dumont #5 (Figura 3A).
  7. Fai un buco al centro della cornea con un ago da 30 G, quindi inserisci una punta dei microscissori nel foro per fare un'incisione dal foro all'estremità della cornea. Ripetere l'operazione per fare 4 fette nelle direzioni cardinali, creando 4 "lembi" (Figura 3A).
  8. Con due pinze Dumont #5, afferrare e tirare i due lembi adiacenti, staccando delicatamente la sclera dalla retina. Ripetere con i lembi corneali rimanenti e rimuovere la sclera dalla retina (Figura 3B).
  9. Rimuovere la lente dalla coppa retinica usando la pinza. Con i microscissori, fare 4 incisioni radiali dal bordo della retina verso il nervo ottico, creando 4 petali uguali (Figura 3B). Ripetere i passaggi 3.4-3.7 per il secondo occhio.

4. Preparazione retinica a montaggio piatto

  1. Preparare dischi filtranti a membrana a membrana MCE (Grey Mixed Cellulose Estere) per il montaggio. Se si utilizzano filtri a membrana MCE di grande diametro, tagliare il disco in quadranti (circa 1 cm di diametro). Posizionare il disco MCE al centro di una carta da filtro bianca più grande (Figura 3D).
    NOTA: i filtri MCE sono disponibili anche in dischi da 1 cm di diametro. Il disco filtrante MCE deve essere abbastanza grande da contenere 1-2 retine, ma abbastanza piccolo da adattarsi alla camera di imaging. Poiché le membrane MCE mantengono una carica statica, ridurre al minimo il contatto e la gestione della membrana MCE.
  2. Maneggiando le retine usando due pennelli 3/0 di dimensioni, capovolgere una tazza retinica su un pennello con la cellula gangliare retinica rivolta verso il basso. Sollevare delicatamente la retina dall'aCSF, assicurandosi che la tensione dell'acqua non strappi la retina (Figura 3C).
  3. Mentre si tiene ancora il pennello con la retina, utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare una goccia di aCSF al centro della carta da filtro MCE (Figura 3C, a destra). Far galleggiare la retina nella goccia di aCSF creata dalla tensione superficiale. Utilizzare pennelli per posizionare il lato RGC della retina verso l'alto all'interno della goccia e per aprire i quattro petali.
  4. Una volta posizionato, creare un ponte d'acqua tra il pennello e la carta da filtro bianca per rompere la tensione superficiale della goccia.
    NOTA: quando aCSF è lontano, la retina aderirà alla carta da filtro MCE (Figura 3D,E). Le retine piatte possono essere maneggiate afferrando il disco MCE con una pinza. Se la goccia aCSF si allontana rapidamente prima di formare un ponte d'acqua, ciò potrebbe indicare che la membrana MCE non è carica. Utilizzare una nuova membrana MCE e ridurre al minimo il tempo tra l'enucleazione e l'imaging sezionando e montando le retine immediatamente prima di spostare le retine nella camera di imaging.

Figure 3
Figura 3: Dissezione retinica e montaggio piatto su membrane filtranti miste estere di cellulosa. (A) A sinistra, un occhio enucleato viene stabilizzato afferrando il nervo ottico con una pinza Dumont #5 (a sinistra). Un piccolo foro viene creato al centro della cornea usando un ago da 30 G (al centro). Le forbici da micro-dissezione vengono utilizzate per tagliare la cornea in 4 lembi uguali (a destra). Barra della scala = 1 mm. (B) Retina sezionata con la sclera staccata usando due pinze Dumont #5 (a sinistra) e con la lente rimossa (al centro). Retina con 4 tagli uguali a metà della retina (a destra). Barra della scala = 1 mm. (C) Manipolazione della retina con due pennelli fini (dimensione 3/0, a sinistra). Retina capovolta con cellule gangliari retiniche rivolte verso il basso su un pennello (al centro) e sollevata da aCSF, assicurandosi che la tensione dell'acqua non strappi la retina (a destra). Barra della scala = 2 mm. (D) Disco a membrana MCE grigia posto su una carta da filtro bianca (a sinistra). Una goccia di aCSF sul disco MCE (a destra). Barra della scala = 1 cm. (E) Dopo aver fatto fluttuare le retine nella goccia e averle posizionate, creare un ponte d'acqua con la carta da filtro bianca per aspirare l'aCSF, tirando la retina sulla carta MCE carica (a sinistra); barra della scala = 1 cm. L'immagine ingrandita della membrana MCE (rossa) mostra 2 retine montate con cellule gangliari retiniche rivolte verso l'alto (a destra); barra della scala = 2 mm. Una retina è delineata in bianco. Abbreviazioni: MCE = estere misto di cellulosa; aCSF = liquido cerebrospinale artificiale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Imaging confocale time-lapse di preparati di retina a montaggio intero dal vivo

  1. Assemblare la camera di incubazione live-imaging per un microscopio confocale verticale come mostrato nella Figura 4.
    NOTA: per i sistemi confocali invertiti, i supporti piatti sono posizionati RGC lateralmente verso il basso direttamente sul coperchio del fondo di vetro della camera di incubazione. Una volta che le retine entrano in contatto con il coverslip, non possono essere spostate.
  2. Riempire la camera con aCSF ossigenato e accendere la pompa e il regolatore di temperatura (temperatura 32-34 °C, portata 1 mL/min). Non lasciare che la temperatura superi i 34 °C.
  3. Per trasferire il supporto piatto retinico nella camera di perfusione, arrestare la pompa e rimuovere l'aCSF che si trova nella camera. Posizionare il disco MCE con il supporto piatto retinico nella camera di incubazione (vuota).
  4. Posizionare un peso del campione sul supporto piatto; pre-bagnare il peso per rompere la tensione superficiale. Riempire la camera con l'aCSF riscaldato e far circolare aCSF a ~1 mL/min.
  5. Posizionare il nasello con l'obiettivo di immersione in acqua 25x (apertura numerica 0,95) nella camera di imaging. Screening per le cellule di interesse marcate utilizzando luce epifluorescente (Figura 4C).
  6. Regolare il volume di imaging per acquisire le caratteristiche dendritiche di interesse.
    NOTA: questo studio ha catturato il pergolato dendritico completo a 1024 x 1024 pixel per fotogramma, z-step 1 μm e un frame rate di 2 min tra ogni z-stack. Le dimensioni finali dell'immagine sono ~ 100 μm x 100 μm x 20 μm.
  7. Per regolare la potenza del laser su un'impostazione ottimale, utilizzare una tabella di ricerca che identifichi sia i pixel sovrasaturi che quelli sottosaturi. Durante la scansione, regolare la potenza del laser in modo tale che nessun pixel sia sovrasaturato (cioè ad un'intensità di 255 o superiore). Continuare l'imaging per tutto il tempo necessario o fino a quando non si verifica un calo significativo e rilevabile del segnale fluorescente e un aumento del rumore (in genere 2-4 ore).
    NOTA: si consiglia una potenza laser ridotta in quanto gli algoritmi di deconvoluzione funzionano in modo ottimale quando i pixel sono distribuiti sull'intera gamma dinamica. L'intensità dei pixel non deve superare 254; le analisi empiriche dei neuriti hanno rivelato che valori di pixel inferiori a 170 sono ideali per la deconvoluzione. Velocità di scansione elevate (400-600 Hz) con media di linea (2-3) sono preferibili a scansioni singole e più lente dello stesso tempo di permanenza totale dei pixel. L'area di imaging prolungato spesso fotosbianche, ma altre sezioni di espianto rimangono vitali. È possibile visualizzare più regioni in un montaggio piatto, ciascuna per 2-4 ore, con un tempo di incubazione totale di 6 ore. Le sessioni di imaging oltre le 6 ore non sono state testate sistematicamente. La degradazione dei neuriti e il blebbing sono segni che la vitalità dell'espianto è in declino.
  8. Dopo l'imaging, fissare i supporti piatti retinici e il filtro a membrana con paraformaldeide fredda al 4% per 1-2 ore a 4 °C. Amplificare le etichette fluorescenti nelle retine fisse mediante immunoistochimica per ulteriori analisi.
    NOTA: la fissazione post-imaging non è possibile quando si utilizza una confocale invertita; le retine non sono rimovibili senza distruggere il tessuto.

Figure 4
Figura 4: Configurazione della camera di incubazione per l'imaging a cellule vive. (A) Apparecchiature di incubazione per immagini dal vivo che mostrano componenti di riscaldamento, soluzione e imaging. Il doppio riscaldatore include una piattaforma a camera di incubazione riscaldata (cerchio posteriore con elettrodi connettore blu) e un riscaldatore di soluzione in linea. (B) Schema schematico di 4A. Il montaggio piatto retinico (rosso) sulla membrana MCE (grigio) viene posizionato nella camera di incubazione. Il riscaldatore di soluzione in linea è collegato a una pompa di soluzione (non raffigurata in 4A). Le dimensioni della camera di imaging consentono una buona area di lavoro per il naso dell'obiettivo di immersione. (C) 25x vista un espianto retinico iniettato con 0,23-0,45 μL di 4 × 1012 GC/mL di diluizione AAV; barra della scala = 100 μm. L'etichettatura densa delle cellule spesso circonda la testa del nervo ottico (linea tratteggiata, in basso a destra); barra della scala = 50 μm. Abbreviazioni: MCE = estere misto di cellulosa; GC = copie del genoma; mCherry = ciliegia monomerica; eYFP = proteina fluorescente gialla potenziata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Deconvoluzione e post-elaborazione delle immagini in ImageJ

  1. Importare la serie di immagini, dividere la serie per tempo e colore se si tratta di un'immagine multicolore. Assicurarsi che tutti i punti temporali per un colore siano contenuti nella stessa cartella.
    NOTA: Importare i formati bio se si utilizza ImageJ (i formati bio sono automaticamente inclusi in FIJI).
  2. Creare una funzione teorica di diffusione puntuale (PSF) utilizzando il plugin ImageJ, Diffraction PSF 3D.
    NOTA: ogni canale di imaging richiede la propria PSF poiché la lunghezza d'onda di emissione della proteina fluorescente influisce sulla PSF.
  3. Usa i plugin | macro | Eseguire per eseguire la deconvoluzione iterativa parallela batch per tutti i punti temporali utilizzando la macro fornita (file supplementare 1).
    Nota : questa macro esegue 25 iterazioni dell'algoritmo iterativo WpL (Node Filter Preconditioned Landweber) del filtro di Wiener. Ogni canale di colore deve essere deconvolto separatamente.
  4. Unisci i canali di colore e compila tutti i punti temporali in un Hyperstack (Image | Hyperstacks | Stacks to Hyperstack). Correggi la deriva 3D usando Plugins | | di registrazione Deriva 3D corretta.
  5. Riportare l'immagine a una pila normale (Image | Hyperstacks | Hyperstack to Stack) e dividere i punti temporali (Immagine | Stack | Strumenti | Stack Splitter). Utilizzare l'elaborazione batch per creare la proiezione massima per tutti i punti temporali (Process | | batch macro | run("Z Project...", "projection=[Max Intensity]"); ).
  6. Importare la sequenza di immagini time-lapse (File | Importare | Sequenza di immagini). Utilizzare gli strumenti ImageJ convenzionali per l'analisi desiderata di video bidimensionali (2D) deconvoluti e post-elaborati.
    NOTA: i video deconvolti e corretti alla deriva quadridimensionali (3D + tempo) possono essere visualizzati come un hyperstack. Ometti il passaggio precedente per mantenere i punti temporali 3D.

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Representative Results

Utilizzando il protocollo di cui sopra, è stato acquisito, deconvoluto e corretto un video 3D ad alta risoluzione dello sviluppo di dendriti di cellule starburst. Sono state prodotte proiezioni massime del piano Z per realizzare video 2D per l'analisi (Video supplementare 1, Figura 5A). La deconvoluzione 3D di ogni punto temporale ha aumentato la risoluzione delle proiezioni di filopodi fini (Figura 5B, C). Le protrusioni sottili della filopodia sono una caratteristica dello sviluppo di dendriti retinici36 e dovrebbero essere visibili durante l'imaging. La trasfezione AAV produrrà variabilità nella densità di etichettatura cellulare e nell'intensità di fluorescenza. Pertanto, selezionare il tessuto etichettato per selezionare le cellule con segnali fluorescenti elevati per l'imaging e la produzione di video di alta qualità. Non è consigliabile aumentare la potenza del laser per rilevare celle scarsamente marcate, in quanto può portare a un rapido fotosbiancamento e introdurre un rumore elevato rispetto al segnale. Le celle sufficientemente luminose sono visibili entro 5 dpi. Entro 12 dpi e oltre, periodi prolungati di infezione da AAV non portano necessariamente ad un aumento della fluorescenza delle cellule marcate (Figura 5D).

L'eccessiva fluorescenza e l'affollamento di neuriti dall'etichettatura di cellule dense influiscono sulla qualità dell'immagine e possono ostacolare le ricostruzioni unicellulari. L'ottimizzazione della diluizione e del volume AAV è necessaria per ottenere il grado desiderato di pergole isolate ed etichettate fluorescentemente che sono separabili dal resto della popolazione cellulare target. Qui, 9,2 × 108-1,8 × 109 GC virali sono stati iniettati per occhio per bersaglio le cellule amacrine starburst (0,23-0,45 μL di AAV con un titolo di 4 × 1012 GC / mL). L'assenza di un segnale fluorescente potrebbe riflettere una tecnica di iniezione inefficiente. Durante l'iniezione, la fuoriuscita della soluzione blu di AAV dal sito di iniezione indica che il virus non viene consegnato alla retina o che il volume o la pressione di iniezione sono troppo alti. L'eccesso di volume o pressione di iniezione può causare il distacco della retina e/o la perdita di pressione oculare, danneggiando le cellule retiniche e riducendo l'efficienza di marcatura cellulare. Entrambi i problemi possono essere risolti con la pratica e l'ottimizzazione della tecnica di iniezione. Altre potenziali ragioni per la mancanza di segnale includono la degradazione degli AAV da una memorizzazione impropria o un'espressione Cre insufficiente perché il transgene Cre non è attivo durante il periodo di trasfezione AAV.

Una volta che i video sono deconvolti, è possibile eseguire analisi dinamiche, come il calcolo dei tassi di aggiunta di ramo, retrazione o stabilizzazione. Inoltre, l'analisi statica convenzionale può essere eseguita su ogni intervallo di tempo, compresa la ricostruzione dei neuroni e le quantificazioni morfometriche come la lunghezza totale dei rami, gli angoli dei rami, l'ordine dei rami o il numero di punti terminali dei rami. Il risultato di questo protocollo è una serie temporale di stack di immagini 3D ad alta risoluzione. La maggior parte dei video dinamici di neurite 3D sono quantificati manualmente come proiezione massima utilizzando un software di visualizzazione delle immagini open source come ImageJ37. Un altro strumento open source, Vaa3D38, è stato sviluppato appositamente per la visualizzazione di grandi volumi. Se i video devono essere analizzati in 3D, si consiglia l'uso di un visualizzatore di tempo 3D + come Vaa3D. ImageJ e Vaa3D consentono l'accesso diretto ai pixel o ai voxel nell'immagine, ma spesso le ricostruzioni neuronali vengono create convertendo i dati dei pixel in ricostruzioni di alberi scheletrati. Ricostruzioni neuronali automatiche o semiautomatiche per singoli punti temporali possono essere eseguite con software open-source39,40,41 e proprietario. Per analizzare le ricostruzioni time-lapse, ogni punto della ricostruzione deve essere collegato ai punti temporali precedenti e successivi. L'allineamento di morfologie dendritiche complesse nel tempo, che possono essere codificate da oltre 500 punti dati, rimane un problema impegnativo. Sono disponibili molti strumenti, con diversi punti di forza e limiti, e devono essere selezionati per soddisfare le analisi necessarie per lo studio.

Figure 5
Figura 5: Risultati rappresentativi dopo iniezione intraoculare neonatale, imaging time-lapse e deconvoluzione. (A) Proiezioni massime di serie di imaging time-lapse deconvoluto (h:min) di cellule amacrine starburst P6 5 giorni dopo l'iniezione di AAV. La dinamica dei filopodi fini può ora essere analizzata utilizzando gli strumenti ImageJ convenzionali. Vengono evidenziate un'area di raffinamento dendritico (scatola rossa) e un'area di escrescenza dendritica (scatola verde). (B, C) Una singola cellula amacrina starburst P6 marcata con eYFP marcata con membrana 5 giorni dopo l'iniezione AAV (dpi) mostra un'etichettatura brillante a singola cellula. Barre di scala per pannelli superiori = 50 μm; barre di scala per pannelli inferiori = 25 μm. Prima (A) e dopo (B) deconvoluzione con ImageJ. Gli inserti (rossi) mostrano il deblurring come risultato di una deconvoluzione riuscita. (D) La cellula amacrina starburst P6 5dpi (sinistra) rispetto alla cellula starburst P12 11 dpi mostra livelli simili di espressione proteica fluorescente. L'aumento dei tempi di incubazione AAV non aumenta il segnale fluorescente. I segnali fluorescenti non diminuiscono con periodi di infezione da AAV più lunghi. Parametri di acquisizione e post-elaborazione identici sono stati applicati a entrambe le immagini. L'aumento dello spessore del ramo e le varicosità osservate a P12 sono caratteristiche normali delle cellule starburst in maturazione e non un artefatto di etichettatura o imaging. Barre della scala = 10 μm. Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato; eYFP = proteina fluorescente gialla potenziata; dpi = giorni postnfection. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Considerazioni per la selezione della linea Cre e la localizzazione delle proteine fluorescenti.

(A-D) Cellule gangliari retiniche P11 vive fotografate a 9 dpi del BBV iniettato in topi knock-in Vglut2-iRES-Cre, in cui Cre è espresso selettivamente nella popolazione RGC. (A) JAM-B RGC identificato dalla sua caratteristica morfologia asimmetrica24. (B-D) Sottotipi RGC distinti che differiscono nei loro modelli di stratificazione dei dendriti. (E) Immagine di cellule amacrine P11 starburst vive trasfettate biolisticamente con mCherry citosolico e catturate con confocale a disco rotante a 512 x 512 pixel. L'XFP citosolico porta ad un segnale di alta fluorescenza nel soma rispetto alle protrusioni dendritiche fini. La luce sfocata dal soma provoca un'elevata fluorescenza di fondo durante l'imaging di piccole proiezioni prossimali (l'inserto nella casella rossa sopra è mostrato di seguito). (F) Immagine di cellule amacrine P11 starburst vive trasfettate con eYFP mirata a membrana e catturata mediante scansione laser confocale a 1024 x 1024 pixel. Si noti l'anello di membrana fluorescente attorno al soma, il rapporto segnale-rumore migliorato e la qualità delle proiezioni fini prossimali al soma prodotte da proteine fluorescenti mirate alla membrana (inserto). Barre di scala = 50 μm e per pannelli inferiori di E e F = 5 μm. Abbreviazioni: IRES = sito di ingresso del ribosoma interno; BBV = Brainbow virus adeno-associato; Vglut2 = trasportatore vescicolare del glutammato 2; XFP = qualsiasi proteina fluorescente; eYFP = proteina fluorescente gialla potenziata; mCherry = ciliegia monomerica; RGC = cellule gangliari retiniche; JAM-B = molecola di adesione di giunzione B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video supplementare 1: Video time-lapse di P6 che sviluppa dendriti di amacrina starburst, 5 giorni dopo l'assunzione. Il tempo di percorrenza del video è di 2 minuti. La deconvoluzione e la correzione della deriva 3D sono state applicate utilizzando ImageJ. Le caselle gialle superiori evidenziano le aree di crescita e la casella inferiore delinea una regione di crescita transitoria della filopodia, auto-contatto e retrazione. Clicca qui per scaricare questo video.

File supplementare 1: Macro ImageJ per la deconvoluzione iterativa parallela batch. La macro esegue 25 iterazioni dell'algoritmo iterativo WpL (Wiener Filter Preconditioned Landweber). Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Questo video dimostra una pipeline sperimentale che utilizza gli strumenti genetici esistenti per visualizzare le dinamiche dendrite dello sviluppo di neuroni retinici con imaging vivo confocale. Sono state dimostrate anche iniezioni intraoculari di AAV Cre-dipendenti che codificano proteine fluorescenti mirate alla membrana nei topi neonatali. Le singole cellule di popolazioni geneticamente mirate sono marcate brillantemente già a 4-5 dpi. I supporti piatti retinici sono stati preparati per le camere di imaging standard per eseguire l'imaging confocale delle cellule vive. Questo metodo produce video time-lapse ad alta risoluzione di singole celle e delle loro proiezioni fini. Piccole proiezioni vengono risolte e quantificate utilizzando algoritmi di deconvoluzione e post-elaborazione disponibili tramite software open source, tra cui ImageJ, Vaa3D e ShuTu, nonché software concesso in licenza disponibile da Imaris e MBF Bioscience. Poiché questa pipeline è modulare, ogni sezione del protocollo può essere modificata per adattarsi agli obiettivi dello studio. Questi elementi modulari sono discussi di seguito e includono: 1) selezione cre-linea, 2) scelta della proteina fluorescente e del costrutto virale, 3) metodi di consegna del gene e 4) metodo di imaging.

Questa tecnica utilizza linee transgeniche Cre per l'accesso genetico alle sottopopolazioni di cellule retiniche. Cre deve essere attivo postnatale ed espresso in tutta la popolazione cellulare al momento dell'iniezione per aumentare la probabilità di infezione virale e l'etichettatura cellulare. In questo rapporto, ChAT-Cre è stato utilizzato per colpire le cellule amacrine starburst e la linea Vglut2-Cre è stata utilizzata per indirizzare lo sviluppo di RGC42,43 (Figura 6). L'iniezione di AAV cre-dipendente in topi knock-in Vglut2-IRES-Cre ha etichettato una varietà di RGC, tra cui la molecola di adesione di giunzione B cell (Figura 6A) e RGC b-stratificate (Figura 6B, C). In alternativa, nuovi progetti di AAV con promotori sintetici che guidano l'espressione specifica del tipo di cellula potrebbero eliminare la necessità di linee transgeniche Cre44. Un'altra considerazione per un'etichettatura efficiente e luminosa adatta per l'imaging dal vivo è il tempo minimo richiesto per la trasfezione e l'espressione, che può variare a seconda del sierotipo AAV, del trofismo e del titolo45. In questi studi, poiché l'etichettatura mediata da AAV richiede un minimo di 4-5 dpi per l'espressione XFP, questo metodo non è adatto per accedere ai primi timepoint postnatali. Per catturare i primi timepoint (ad esempio, P0-P4), le iniezioni intraoculari possono essere eseguite in utero in animali embrionali, come fatto per l'elettroporazione in utero46. Negli studi di questo gruppo sullo sviluppo di dendrite starburst, il modello iniziale di ricombinazione sparsa di ChAT-Cre è stato sfruttato per etichettare singole cellule amacrine starburst a P0-P4 utilizzando un reporter Cre transgenico di topo, Rosa-mTmG27. Infine, questo protocollo di iniezione retinica AAV può essere utilizzato per etichettare popolazioni cellulari adulte, in base alla conferma della persistenza dell'etichettatura fluorescente 3 mesi dopo l'iniezione senza effetti deleteri sulla morfologia delle cellule starburst34.

Questa pipeline consente anche flessibilità nella selezione dei costrutti virali. Per catturare la dinamica dei dendriti, è possibile utilizzare una varietà di proteine reporter fluorescenti, comprese le proteine che si localizzano in specifiche strutture subcellulari, proteine di interesse o riportano cambiamenti funzionali come la dinamica dell'actina (ad esempio, LifeAct) e i segnali di calcio (ad esempio, GCaMP). È possibile utilizzare qualsiasi vettore AAV disponibile in commercio o clonato e strumenti online come fpbase.org dovrebbero essere referenziati per luminosità e fotostabilità. Qui, i vettori virali brainbow che codificano proteine fluorescenti con un motivo CAAX di farnesilazione H-Ras sono stati utilizzati per la localizzazione della membrana. All'inizio dello sviluppo del protocollo, la localizzazione citosolica degli XPF non è risultata essere ideale per studiare la morfologia dei neuriti fini, con una sovrasaturazione dei segnali provenienti dal soma e una scarsa etichettatura dei rami fini (Figura 6E). In confronto, le proteine fluorescenti mirate alla membrana hanno dimostrato di etichettare e risolvere le protrusioni dendritiche fini (Figura 6E, F). Un'altra considerazione è la dimensione, il design e la complessità del costrutto virale, che può influenzare il tempo di espressione. Ad esempio, è stato generato AAV-CAG-FLEx-mClover3-CAAX, che esprime un XFP in modo Cre-dipendente. Questo costrutto ha un design più semplice e si traduce in un'espressione efficiente di 4 dpi. Insieme, le diverse opzioni per le linee Cre, i progetti AAV e i reporter di proteine fluorescenti che sono ampiamente disponibili dai repository (ad esempio, JAX, Addgene e Viral Vector Cores) rendono questa pipeline adattabile a una varietà di studi sui tipi di cellule e sui fenomeni di sviluppo nella retina.

Sebbene questo protocollo descriva in dettaglio le iniezioni intraoculari di AAV, sono disponibili altri metodi di consegna genica come l'elettroporazione plasmidica46 e la consegna di geni biolistici (ad esempio, Gene Gun)7. L'elettroporazione richiede l'applicazione di un impulso elettrico e la consegna biolica del gene richiede l'incubazione ex vivo di espianti retinici. L'etichettatura AAV è meno invasiva di entrambi questi metodi e consente preparazioni acute di espianti della retina appena prima dell'imaging. Rispetto alla somministrazione di geni biolistici (Figura 6E, F), le iniezioni di AAV hanno portato a una maggiore vitalità tissutale che era più adatta per l'acquisizione continua necessaria per tracciare la dinamica dei neuriti. Con una tecnica adeguata, l'etichettatura AAV pone poco o nessun danno alla retina, come giudicato dalla salute del tessuto al momento della dissezione. Le iniezioni intravitreali infettano principalmente le cellule all'interno dello strato di cellule gangliari e dello strato nucleare interno, come le RGC e le cellule amacrine. Molte dozzine di cellule amacrine starburst sono tipicamente etichettate, con una maggiore densità di cellule marcate intorno alla testa del nervo ottico (Figura 4C). Tuttavia, con tutti e tre i metodi di trasfezione, il taglio del nervo ottico è inevitabile per ottenere espianti retinici e porterà alla degenerazione RGC. Nonostante il taglio del nervo ottico, gli studi riportano espianti retinici vitali da una varietà di modelli di vertebrati per 36 ore e fino a 6 giorni dopo l'enucleazione5,6,7,47,48.

Infine, è stata dimostrata l'utilità della microscopia confocale per catturare la dinamica dei dendriti. In genere, una sessione di imaging dura 2-4 ore e si conclude prima che si osservi la degradazione dei tessuti o il blebbing dei neuriti. Sono state condotte sessioni di imaging fino a 6 ore; tuttavia, il limite superiore non è stato sistematicamente testato. Le aree potrebbero subire fotosbiancamento a causa dell'imaging prolungato, ma le cellule in altri campi visivi nell'espianto rimangono vitali per l'imaging dal vivo. Questo metodo può anche essere esteso alla microscopia multifotone o lightsheet per visualizzare la morfologia neuronale in strati più profondi e volumi più grandi. L'imaging multifotonico è stato eseguito per studiare la dinamica dei neuriti nella retina del topo ed è più adatto per studiare le cellule nella lamina retinica più profonda (ad esempio, cellule orizzontali o fotorecettori)49. Recentemente, la microscopia lightsheet a cellule vive è stata utilizzata per catturare l'angiogenesi retinica50, offrendo una nuova strada per l'imaging dal vivo della morfogenesi nell'intera retina. La microscopia con foglio di luce a cellule vive potrebbe essere utilizzata per studiare l'assemblaggio di circuiti neurali su scale più ampie, come il targeting assone-dendrite. L'imaging live multicolore è un'altra applicazione di questa pipeline che può essere utilizzata per studiare le interazioni cellula-cellula, come l'influenza delle cellule vicine sullo sviluppo di dendriti o altri fenomeni di sviluppo come la piastrellatura di cellule retiniche tra cui sottotipi RGC1, microglia e astrociti.

In conclusione, un aspetto impegnativo degli studi sullo sviluppo è l'accesso a questi punti critici. Questo protocollo fornisce un metodo per visualizzare la morfogenesi che si verifica durante una specifica finestra temporale. La pipeline combina strumenti e tecniche esistenti per colpire geneticamente le popolazioni cellulari ed esprimere proteine fluorescenti mirate alla membrana. I preparati a montaggio piatto retinico acuto mantengono la vitalità e i segnali fluorescenti per l'imaging confocale a cellule vive per diverse ore. Gli aspetti transitori e dinamici dello sviluppo di dendrite sono catturati in video 3D e sono post-elaborati utilizzando software open source. La capacità di catturare video 3D ad alta risoluzione è essenziale per indagare i processi di sviluppo dinamico.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Madison Gray per avermi dato una mano quando non ne avevo. Questa ricerca è stata supportata da un NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), una Sloan Fellowship in Neuroscience e una Canada Research Chair Tier 2 (a J.L.L). S. Ing-Esteves è stato supportato dal Vision Science Research Program e dal NSERC Postgraduate Scholarships-Doctorals.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Addgene viral prep #45185-AAV9
Addgene viral prep #45186-AAV9
Dissection tools
Cellulose filter paper Whatman 1001-070
Dumont #5 fine forceps FST 11252-20 Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection
Dumont forceps VWR 82027-426
Fine Scissors FST 14058-09
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size Millipore HABG01 300
Petri Dish, 50 × 15 mm VWR 470313-352
Polyethylene disposable transfer pipette VWR 470225-034
Round tip paint brush, size 3/0 Conventional art supply store Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting
Surgical Scissors FST 14007-14
Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge FST 15000-08
Live-imaging incubation system
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' Warner Instruments 64-0755
Dual channel heater controller, Model TC-344C Warner Instruments 64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective Leica 15506374
Heater controller cable Warner Instruments CC-28
Large bath incubation chamber with slice support Warner Instruments RC-27L
MPII Mini-Peristaltic Pump Harvard Apparatus 70-2027
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) Warner Instruments PM-6D
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump Harvard Apparatus 55-4148
Sample anchor (Harps) Warner Instruments 64-0260 Sample anchor must be compatible with incubation chamber
Sloflo In-line Solution Heater Warner Instruments SF-28
Neonatal Injections
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle Hamilton Company 80314
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) BD PrecisionGlide 305106
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)  WPI World Precision Instruments TW100-4
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) Sigma-Aldrich V001229 
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF Penn Vector Core AV-9-PV2453 Addgene Plasmid #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP
1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF		 Penn Vector Core AV-9-PV2454 Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line The Jackson Laboratory 6410
Fast Green FCF Dye content ≥85 % Sigma-Aldrich F7252-25G
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 Sutter Instrument Co. P-97
Green tattoo paste Ketchum MFG Co 329A
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich 806552
Pneumatic PicoPump WPI World Precision Instruments PV-820
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2) AirGas X02OX95C2003102 Supplier may vary depending on region
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES, Free Acid Bio Basic HB0264
Hydrochloric acid solution, 1 N Sigma-Aldrich H9892
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670
pH-Test strips (6.0-7.7) VWR BDH35317.604
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Sodium chloride (NaCl) Bio Basic DB0483
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich RDD007
Software
ImageJ National Institutes of Health (NIH) Open source

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References

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Neuroscienze Numero 169 Imaging di cellule vive morfogenesi sviluppo di dendriti iniezioni intravitreali Cre-Lox virus adeno-associato deconvoluzione cellule amacrine starburst
Imaging time-lapse dell'arborizzazione neuronale utilizzando l'etichettatura del virus adeno-associato sparso di popolazioni di cellule retiniche geneticamente mirate
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Ing-Esteves, S., Lefebvre, J. L.… More

Ing-Esteves, S., Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (169), e62308, doi:10.3791/62308 (2021).

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