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Neuroscience

Imagerie en accéléré de l’arborisation neuronale à l’aide du marquage clairsemé du virus adéno-associé à des populations de cellules rétiniennes génétiquement ciblées

Published: March 19, 2021 doi: 10.3791/62308
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Program for Neuroscience and Mental Health, Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Summary

Nous présentons ici une méthode pour étudier la morphogenèse des neurites dans les explants rétiniens postnatals de souris par microscopie confocale time-lapse. Nous décrivons une approche pour le marquage clairsemé et l’acquisition de types de cellules rétiniennes et de leurs processus fins en utilisant des vecteurs de virus adéno-associés recombinants qui expriment des protéines fluorescentes ciblées sur la membrane d’une manière dépendante de Cre.

Abstract

La découverte des mécanismes qui forment les tonnelles dendritiques nécessite des méthodes pour visualiser, imager et analyser les dendrites pendant le développement. La rétine de souris est un puissant système modèle pour l’étude des mécanismes spécifiques au type cellulaire de morphogenèse neuronale et de connectivité. L’organisation et la composition des sous-types rétiniens sont bien définies, et des outils génétiques sont disponibles pour accéder à des types spécifiques au cours du développement. De nombreux types de cellules rétiniennes contraignent également leurs dendrites et / ou axones à des couches étroites, ce qui facilite l’imagerie time-lapse. Les cultures d’explants de rétine de souris sont bien adaptées à l’imagerie de cellules vivantes à l’aide de la microscopie confocale ou multiphotonique, mais les méthodes optimisées pour l’imagerie de la dynamique des dendrites avec une résolution temporelle et structurelle font défaut. Présenté ici est une méthode pour étiqueter et imager de manière éparse le développement de populations rétiniennes spécifiques marquées par le système Cre-Lox. Les virus adéno-associés (AAV) disponibles dans le commerce utilisés ici ont exprimé des protéines fluorescentes ciblées sur la membrane d’une manière dépendante de Cre. L’administration intraoculaire d’AAV chez les souris néonatales produit un marquage fluorescent des types de cellules ciblées 4 à 5 jours après l’injection (dpi). Les signaux fluorescents membranaires sont détectables par imagerie confocale et résolvent les structures et la dynamique fines des branches. Des vidéos de haute qualité couvrant 2 à 4 h sont acquises à partir de supports plats rétiniens d’imagerie perfusés de liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné (CSPa). Un pipeline de post-traitement d’image pour la déconvolution et la correction de dérive tridimensionnelle (3D) est également fourni. Ce protocole peut être utilisé pour capturer plusieurs comportements cellulaires dans la rétine intacte et pour identifier de nouveaux facteurs contrôlant la morphogenèse des neurites. De nombreuses stratégies de développement apprises dans la rétine seront pertinentes pour comprendre la formation de circuits neuronaux ailleurs dans le système nerveux central.

Introduction

Les dendrites des neurones rétiniens forment des modèles complexes, mais spécifiques, qui influencent leur fonction dans les circuits neuronaux. Dans la rétine des vertébrés, divers types de cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) et d’interneurones de cellules amacrines présentent des morphologies dendritiques uniques qui diffèrent par la taille, l’emplacement, la longueur des branches et la densité1. Au cours du développement postnatal, les RGC et les cellules amacrines étendent les processus dendritiques exubérants dans un neuropil appelé couche plexiforme interne (IPL), où ils reçoivent des entrées de cellules bipolaires transmettant des signaux photorécepteurs2. Comme l’a montré l’imagerie en accéléré des populations rétiniennes marquées par fluorescence chez les larves de poussins ou de poissons-zèbres, la morphogenèse dendrite est très dynamique3,4,5. En quelques jours, les tonnelles dendritiques se dilatent, se remodèlent et se ramifient en sous-couches étroites de l’IPL, où elles synapsent avec des partenaires sélectionnés. Les tonnelles présentent une dynamique structurelle différente au cours du développement, avec des changements dans les taux relatifs d’ajout, de rétraction et de stabilisation des branches. Les dendrites d’amacrine et de RGC présentent également des comportements de croissance et de remodelage différents qui pourraient refléter une arborisation spécifique au type. Cependant, ces études ont suivi de larges populations d’amacrine ou de RGC et se sont concentrées sur le ciblage laminaire, qui n’est qu’un aspect de la morphologie.

Les mécanismes qui produisent la grande diversité morphologique observée entre les sous-types rétiniens sont mal compris. L’objectif de ce groupe était de développer une méthode pour capturer la dynamique des dendrites et le remodelage arboricole de sous-types rétiniens définis chez la souris. L’identification des mécanismes spécifiques au type de cellule de la modélisation des dendrites nécessite des méthodes pour visualiser et mesurer les comportements de dendrite des cellules d’intérêt. Les cultures organotypiques de rétines de souris sont bien adaptées aux études d’imagerie de cellules vivantes utilisant la microscopie confocale ou multiphotonique. Les rétines en développement sont disséquées et montées dans une explante plate qui peut être imagée pendant plusieurs heures dans une chambre d’enregistrement ou cultivée sur quelques jours avec des effets limités sur le circuit6,7. Les neurones rétiniens vivants peuvent être marqués par une variété de techniques, y compris le remplissage de colorants par électrodes, l’électroporation, l’administration biolistique de particules recouvertes de colorants lipophiles ou de plasmides codant pour des protéines fluorescentes (par exemple, Gene Gun), ainsi que des étiquettes cellulaires génétiquement codées7,8,9,10 . Cependant, ces approches sont inefficaces pour l’imagerie de la dynamique des dendrites de sous-types rétiniens spécifiques. Par exemple, les méthodes de remplissage de colorant sont à faible débit et nécessitent un appareil d’électrophysiologie et des étiquettes génétiques supplémentaires pour cibler de manière fiable les cellules d’intérêt. De plus, les forts signaux de fluorescence dans le soma peuvent obscurcir les dendrites voisines.

Les méthodes d’administration de gènes biolistiques peuvent marquer simultanément des dizaines de cellules, mais les étapes impliquant l’administration de particules à haute pression et l’incubation nocturne de la rétine isolée peuvent compromettre la physiologie cellulaire et l’excroissance dendritique. Cet article propose que des outils génétiques récents puissent être utilisés pour capturer la dynamique précoce des dendrites avec le type cellulaire et la résolution structurelle, compte tenu des critères expérimentaux suivants. Tout d’abord, pour résoudre les fines branches et les filopodes qui dominent les tonnelles en développement, la méthode devrait marquer les neurones avec des protéines fluorescentes brillantes qui remplissent les processus dans toute la tonnelle. Le marquage par fluorescence ne doit pas s’estomper en raison du photoblanchiment pendant la période d’imagerie. Diverses variantes de protéines fluorescentes ont été générées et comparées pour déterminer si elles conviennent à l’imagerie in vivo/ex vivo11 en fonction de la luminosité et de la photostabilité. Deuxièmement, les protéines fluorescentes (XFP) doivent être exprimées à des niveaux suffisamment élevés au stade le plus précoce de la morphogenèse de la dendrite, de sorte que la fenêtre de développement étroite ne soit pas manquée. Dans les analyses des points temporels statiques dans la rétine de la souris, le développement de la dendrite se produit au cours de la première semaine postnatale et comprend des phases d’excroissance, de remodelage et de stabilisation10,12,13,14,15. Troisièmement, la méthode devrait conduire à un étiquetage sélectif ou à une probabilité accrue de marquage de la sous-population neuronale d’intérêt. Quatrièmement, l’étiquetage de la sous-population cible doit être suffisamment clairsemé pour que l’ensemble de la tonnelle neuronale puisse être identifié et tracé. Bien que les sous-types de RGC et d’amacrine puissent être distingués par leurs caractéristiques morphologiques matures et leurs profils de stratification IPL16,17,18,19,20, le défi consiste à identifier des sous-types au cours du développement basés sur des structures immatures. Cette tâche est facilitée par l’expansion d’outils transgéniques pour marquer des types de cellules rétiniennes spécifiques au cours du développement.

Les lignées de souris transgéniques et knock-in dans lesquelles l’expression cellulaire et temporelle des protéines fluorescentes ou Cre est déterminée par des éléments régulateurs géniques sont largement utilisées pour étudier les types de cellules rétiniennes13,21,22,23. Des observations clés sur les modèles spécifiques de sous-type du développement de la dendrite proviennent d’études sur des rétines de souris transgéniques à des points temporels statiques10,14,24,25. Le système Cre-Lox, en particulier, permet une manipulation génique et une surveillance exquises des sous-types à l’aide d’une variété de rapporteurs, de capteurs et d’activateurs optogénétiques dépendants de la recombinase. Ces outils ont conduit à la découverte de programmes moléculaires spécifiques à un sous-type et de propriétés fonctionnelles qui sous-tendent l’assemblage de circuits rétiniens26,27,28,29,30. Cependant, ils n’ont pas encore été exploités pour étudier la dynamique des dendrites spécifiques au sous-type dans la rétine de la souris. Le marquage à faible densité peut être obtenu en combinant des lignées de souris Cre avec des transgènes introduits par électroporation ou par des AAV recombinants. Si elles sont disponibles, des lignées de Cre inductibles au tamoxifène ou des stratégies génétiques intersectionnelles peuvent également être utilisées. Enfin, la cellule doit être marquée de manière peu invasive et imagée à l’aide de paramètres d’acquisition afin de ne pas compromettre le tissu ou interférer avec la fonction cellulaire requise pour la morphogenèse dendrite.

Présenté ici est une méthode pour appliquer des outils transgéniques et la microscopie confocale pour étudier la dynamique de la dendrite dans les explants rétiniens de souris vivantes. Les lignées de souris transgéniques Cre ont été combinées avec des vecteurs AAV qui expriment des protéines fluorescentes lors de la recombinaison Cre, ce qui permet un marquage clairsemé des cellules rétiniennes d’intérêt. Les AAV disponibles dans le commerce sont administrés à la rétine néonatale par injections intravitréennes. Cet article démontre que les AAV produisent une expression fluorescente significativement élevée et spécifique au type de cellule de 4 dpi, permettant l’accès aux points de temps postnatals. Pour illustrer cette approche, l’interneuron amacrine cholinergique « starburst » a été marqué en délivrant Brainbow AAV chez des souris néonatales exprimant le transgène de la choline acétyltransférase (ChAT)-site interne du ribosome (IRES)-Cre, qui est actif dans la rétine postnatale précoce31,32. Les cellules amacrines Starburst développent une morphologie de tonnelle stéréotypée et radiale qui est façonnée par l’auto-évitement de la dendrite médiée par les protocadhérines groupées33,34. Cet article montre que la résolution des dendrites et des filopodestes d’étoiles est considérablement améliorée par les XFP à la membrane plasmique avec l’ajout du motif CAAX qui subit une farnésylation, tel qu’utilisé pour les AAV Brainbow31. Enfin, des protocoles d’imagerie en accéléré et de post-traitement ont été déterminés pour produire des images de haute qualité susceptibles d’être reconstruites dendrites et quantifiées morphométriques. Ce protocole peut être utilisé pour identifier les facteurs contrôlant la morphogenèse dendrite et pour capturer plusieurs comportements cellulaires dans la rétine intacte.

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Protocol

REMARQUE: Ce protocole s’étend sur 2 jours avec une période minimale de 4-5 jours pour la transduction virale entre les jours expérimentaux (Figure 1A). Les expériences sur les animaux sont effectuées conformément aux Lignes directrices du Conseil canadien sur les soins aux animaux pour l’utilisation des animaux en recherche et les soins aux animaux de laboratoire en vertu des protocoles approuvés par le Comité d’utilisation et de soins des animaux du Laboratoire des services aux animaux de l’Hôpital pour enfants malades (Toronto, Canada).

1. Préparations pour les injections néonatales d’AAV et les expériences d’imagerie

  1. Sélectionnez une ligne de souris Cre pour étiqueter les populations de cellules rétiniennes d’intérêt. Confirmer l’expression de la Cre recombinase au moment des injections d’AAV en passant à un rapporteur transgénique Cre ou par immunocoloration avec un anticorps Cre.
  2. Élever des souris Cre transgéniques (âgées de 8 à 16 semaines) pour générer des animaux néonatals Cre-positifs.
    REMARQUE: Pour cette démonstration, des souris Knock-in ChAT-IRES-Cre ont été utilisées pour cibler les cellules amacrines cholinergiques Starburst.
  3. Obtenir le virus AAV dépendant de la recombinase codant pour des protéines fluorescentes. Pour un marquage optimal des processus fins, sélectionnez des vecteurs qui expriment des XFP modifiés ciblant la membrane plasmique.
    REMARQUE : Cette étude a utilisé le virus Brainbow (BBV), AAV-EF1a-BbTagBY et AAV9-EF1a-BbChT (voir tableau des matériaux), qui offrent l’option d’étiquetage multicolore (Figure 1B). L’expression de la protéine fluorescente jaune améliorée farnésylée (eYFP) et de la cerise monomère (mCherry) a produit les signaux fluorescents les plus puissants pour l’imagerie en direct. Un seul BBV peut être utilisé pour imager des tonnelles individuelles, tandis que la co-injection de BBV peut être utilisée pour marquer plus de cellules ou de tonnelles voisines avec des fluorophores distincts. Si vous utilisez plusieurs protéines fluorescentes, assurez-vous que le spectre d’émission se chevauche au minimum (figure 1C). Les paramètres d’acquisition du microscope doivent être ajustés pour capturer des signaux XFP distincts.
  4. Préparer des aliquotes ∼de 3 à 5 μL d’AAV dans des tubes individuels à faible liaison pour les stocks à usage unique afin d’éviter les cycles de gel/dégel. Conserver à -80 °C.
  5. Préparez des micropipettes en verre borosilicate avec des pointes très fines à l’aide d’un extracteur de micropipette.
    REMARQUE: Les paramètres du tireur varient en fonction du filament et du tireur utilisés; voir la figure 2A pour connaître la taille et la forme finales de la pointe. Les diamètres typiques des gouttelettes sont de 600 μm.
  6. Obtenir un système de micro-injection et les tubes associés. Connectez le micro-injecteur à un port d’air sous pression.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu expérimental. (A) Ce protocole couvre 2 jours d’expériences avec une période d’infection minimale de 4 à 5 jours entre les jours expérimentaux. Les injections intraoculaires sont effectuées sur des souris néonatales pas plus âgées que le jour postnatal 3. Les rétines sont ensuite disséquées, montées à plat et imagées en direct pour capturer la fenêtre de développement souhaitée. Les cellules marquées peuvent être imagées à tout moment après les 4 à 5 jours nécessaires à l’expression virale, car il n’y a pas d’effets apparents de l’expression prolongée de l’AAV sur la morphologie de la dendrite. (B) Les vecteurs AAV Brainbow (BBV) dépendants de la cre sont injectés dans les animaux exprimant Cre31. Dans cette étude, des souris Knock-in ChAT-Cre ont été utilisées pour conduire la recombinaison Cre dans les cellules amacrines starburst. Les deux BBV codent eYFP ou tagBFP modifié, ou mCherry et mTFP, qui se terminent par un motif CAAX qui est périodiquement farnésylé pour la localisation de la membrane. Les sites Lox sont représentés par des triangles. Les vecteurs expriment soit des XFP farnésylés de manière stochastique et combinatoire dépendant de la recombinaison De Cre. Le promoteur EF1α comprend des éléments régulateurs du gène du facteur d’élongation 1α. W représente les éléments de l’élément régulateur posttranscriptionnel du virus de l’hépatite woodchuck, et pA indique la séquence de polyadénylation. (C) Les spectres d’excitation et d’émission de mCherry et eYFP, les fluorophores BBV imagés dans cette étude. Lors de l’imagerie en direct de plusieurs protéines fluorescentes, les paramètres de détection doivent être disposés de manière à séparer adéquatement les spectres d’émission en canaux distincts. Abréviations : AAV = virus adéno-associé; BBV = Brainbow AAV; ChAT = choline acétyltransférase; iRES = site interne d’entrée des ribosomes; eYFP = protéine fluorescente jaune améliorée; iTR = répétition terminale inversée; tagBP = Protéine fluorescente bleu tag; mCherry = cerise monomère; mTFP = protéine fluorescente sarcelle; XFP = toute protéine fluorescente; EF1α= facteur d’allongement 1 alpha. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Injections intravitréennes d’AAV chez des souris néonatales

  1. Décongeler une aliquote AAV sur la glace. Préparer une dilution AAV ~1:4 en utilisant une solution saline stérile ou une solution saline tamponnée au phosphate. Préparez ~0,5 μL de dilution AAV par animal (~0,25 μL par œil) au cas où la micropipette se brise et qu’une nouvelle pipette doit être remplie. Conservez le reste de l’AAV non dilué à 4 °C et utilisez-le dans les 2 semaines.
    REMARQUE: Dans cette expérience, la concentration d’AAV du fournisseur était d’environ 1-2 × 1013 teneur en génome (GC) / mL et diluée à une concentration finale de 4 × 1012 GC / mL. Optimiser la concentration virale pour obtenir la densité de marquage souhaitée.
  2. Pour visualiser les injections, ajoutez environ 1 μL de solution de colorant FCF Fast Green à 0,02 % pour chaque dilution AAV de 15 μL pour colorer la solution en bleu.
  3. Transférer une cage de souris avec une mère et une litière pour nouveau-nés (jour postnatal (P) 0,5-3) dans une salle d’intervention avec équipement de micro-injection. Gardez les animaux dans la même cage avec des nids et de la litière pour minimiser le stress maternel et le rejet des petits.
  4. Stérilisez la zone d’injection avec 70% d’éthanol et placez des coussinets de couche stériles sur les surfaces du banc. Préparez une plate-forme chaude (p. ex., un coussin chauffant) pour la récupération de l’anesthésie induite par l’hypothermie.
  5. Remblayer la micropipette avec la dilution AAV à l’aide d’un microsyringe. Sous un stéréomicroscope, cassez la pointe de la micropipette avec une aiguille de 30 G pour desceller la pointe.
    REMARQUE : La figure 2A montre la pointe remblayée, à la fois scellée (en haut) et non scellée (au milieu).
  6. Anesthésier les souris néonatales par hypothermie en plaçant 1-2 animaux sur la glace. Placez les animaux sur un gant en latex pour protéger la peau du contact direct avec la glace. Une fois que l’animal ne bouge plus en réponse au pincement de la patte (~2 min), placez l’animal sous un stéréomicroscope. Si vous le souhaitez, tatouez des coussinets de pattes avec de l’encre de tatouage et une aiguille de 30 G, et collectez des coupures de queue pour isoler l’ADN afin d’identifier les animaux par génotypage.
    REMARQUE: Une surveillance appropriée de la profondeur de l’anesthésie doit avoir lieu tout au long de la procédure.
  7. Écouvillonnez la peau recouvrant les yeux avec de l’éthanol à 70%. Utilisez une aiguille de 30 G pour ouvrir la paupière fusionnée (Figure 2B). Appliquez une légère pression avec les doigts pour ouvrir l’œil et percez un petit trou dans la cornée à la jonction cornée-sclérotique (Figure 2C).
  8. Insérez la micropipette en verre dans le trou et appuyez 2 à 4 fois sur la pédale du micro-injecteur pour injecter l’AAV dans l’espace intravitréen. Retirez lentement la micropipette et confirmez l’injection d’AAV en visualisant le colorant bleu à travers la pupille (Figure 2D).
    REMARQUE: Avec une pression d’éjection de 6-8 psi et un temps d’impulsion de 600-800 ms, une gouttelette de 600 μm de diamètre est éjectée (Figure 2A, en bas). Environ 0,23-0,45 μL de solution d’AAV est injecté par œil. La solution bleue à l’extérieur de l’œil indique que l’AAV n’a pas été injecté dans l’œil. La fuite de solution bleue du site d’injection indique que l’AAV peut avoir fui, ce qui réduit l’efficacité de la transfection.
  9. Appuyez doucement sur les paupières ensemble pour refermer le sceau et placez le chiot sur un coussin chauffant. Une fois que les animaux ont retrouvé une couleur rosâtre et sont réactifs, transférez-les doucement dans la cage de logement.
    REMARQUE: Assurez-vous que les précautions appropriées sont prises pour éviter un réchauffement trop rapide des chiots.
  10. Répétez la procédure d’injection pour les animaux restants dans la litière. Prévoyez un minimum de 4 à 5 jours pour la transduction virale avant d’imager la rétine.

Figure 2
Figure 2 : Injections intraoculaires néonatales. (A) La micropipette remblayée montre la forme de l’embout de la pipette lorsqu’elle est scellée (en haut) et après que la pointe est descellée (en bas, à gauche). La pression de pico-injection de 6-8 psi et le temps d’impulsion de 600-800 ms produisent une gouttelette de 600 μm de diamètre (en bas, à droite). Barre d’échelle = 1 mm.(B) Chiot P0 anesthésié sous grossissement 16x. La jonction de la paupière fusionnée (blanche) est fendue à l’aide d’une aiguille pointue de 30 G. Barre d’échelle = 2 mm. (C) La légère pression appliquée à l’œil expose la cornée; barre d’échelle = 2 mm. La section zoomée (rouge) montre le petit trou à la jonction cornée-sclérotique (jaune) créé avec une aiguille de 30 G; barre d’échelle = 0,5 mm. (D) Retrait de l’embout de la pipette après injection (à gauche). Le colorant Fast Green dans la solution AAV apparaît en bleu-gris à travers la pupille (milieu), par rapport à la couleur de la pupille claire avant l’injection (à droite). Barre d’échelle = 1 mm. (E) Après 4 jours, la paupière a guéri et fusionné fermée (à gauche); barre d’échelle = 2 mm. Lors de l’énucléation, le site d’injection guéri est visible (jaune); barre d’échelle = 1 mm. Notez l’emplacement du site d’injection à la frontière entre la cornée et la sclérotique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Dissections rétiniennes pour l’expérience d’imagerie

  1. Préparer l’aCSF rétinien (119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2·6H2O, 2,5 mM CaCl2·2H2O, 1 mM NaH2PO4, 11 mM de glucose et 20 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (acide libre HEPES)35. Si vous le souhaitez, préparez et congelez la solution 10x; décongeler et diluer à 1x au besoin.
  2. Oxygéner l’aCSF rétinien en bouillonnant avec du carbogène (95% O2, 5% CO2) pendant au moins 15 min. Ajustez le pH à 7,4. Conserver dans un récipient scellé jusqu’à utilisation pour s’assurer que l’aCSF reste oxygéné.
    REMARQUE: Les rétines nécessitent une concentration élevée d’O2. Il est important de garder l’aCSF oxygéné tout au long de l’expérience.
  3. Intégrez une boîte de Petri de 60 mm de diamètre dans un bac à glace (façonnez un bac à glace en plastique de laboratoire, par exemple un couvercle de boîte à pipette) et placez-la sous un stéréomicroscope. Remplissez la boîte de Petri avec de l’aCSF rétinien oxygéné.
  4. Euthanasier les souris P9 et plus jeunes par décapitation. Euthanasier les souris P10 et plus par induction d’isoflurane, ou une autre méthode approuvée en vertu du protocole animal, suivie d’une décapitation.
  5. Si les paupières sont scellées, coupez le rabat des paupières pour exposer l’œil. Utilisez des pinces pour énucléer les yeux et transférez-les dans le CCSF rétinien froid à partir de l’étape 3.3.
  6. Pour disséquer la coupe rétinienne, sous un stéréomicroscope (grossissement 25x), stabiliser l’œil en serrant le nerf optique à l’aide d’une pince Dumont #5 (Figure 3A).
  7. Percez un trou au centre de la cornée avec une aiguille de 30 G, puis insérez une pointe des microcisseurs dans le trou pour faire une incision du trou à l’extrémité de la cornée. Répétez l’opération pour faire 4 tranches dans les directions cardinales, en créant 4 « rabats » (Figure 3A).
  8. Avec deux pinces Dumont #5, saisissez et écartez les deux volets adjacents, en pelant doucement la sclérotique de la rétine. Répétez l’opération avec les lambeaux de cornée restants et retirez la sclérotique de la rétine (Figure 3B).
  9. Retirez le cristallin de la coupe rétinienne à l’aide de la pince. Avec des microcisseurs, faites 4 incisions radiales du bord de la rétine vers le nerf optique, créant 4 pétales égaux (Figure 3B). Répétez les étapes 3.4 à 3.7 pour le deuxième œil.

4. Préparation rétinienne à montage plat

  1. Préparez des disques filtrants à membrane d’ester de cellulose mixte (MCE) gris pour le montage. Si vous utilisez des filtres à membrane MCE de grand diamètre, coupez le disque en quadrants (environ 1 cm de diamètre). Placez le disque MCE au centre d’un papier filtre blanc plus grand (Figure 3D).
    REMARQUE: Les filtres MCE sont également disponibles en disques de 1 cm de diamètre. Le disque filtrant MCE doit être assez grand pour accueillir 1 à 2 rétines, mais suffisamment petit pour tenir dans la chambre d’imagerie. Comme les membranes MCE maintiennent une charge statique, minimisez le contact et la manipulation de la membrane MCE.
  2. Manipulation des rétines à l’aide de deux pinceaux de taille 3/0, retournez une tasse rétinienne sur un pinceau avec la cellule ganglionnaire rétinienne vers le bas. Soulevez doucement la rétine hors de l’aCSF, en vous assurant que la tension de l’eau ne déchire pas la rétine (Figure 3C).
  3. Tout en tenant toujours le pinceau avec la rétine, utilisez une pipette de transfert pour placer une gouttelette d’aCSF au centre du papier filtre MCE (Figure 3C, à droite). Faites flotter la rétine dans la gouttelette d’aCSF créée par la tension superficielle. Utilisez des pinceaux pour positionner le côté RGC de la rétine vers le haut dans la gouttelette et pour déplier les quatre pétales.
  4. Une fois positionné, créez un pont d’eau entre le pinceau et le papier filtre blanc pour briser la tension superficielle de la gouttelette.
    REMARQUE: Lorsque l’aCSF est méchant, la rétine adhère au papier filtre MCE (Figure 3D, E). Les rétines plates peuvent être manipulées en saisissant le disque MCE avec une pince. Si la gouttelette d’aCSF s’évacue rapidement avant de former un pont d’eau, cela peut indiquer que la membrane MCE n’est pas chargée. Utilisez une membrane MCE fraîche et minimisez le temps entre l’énucléation et l’imagerie en disséquant et en installant à plat les rétines immédiatement avant de déplacer les rétines dans la chambre d’imagerie.

Figure 3
Figure 3 : Dissection rétinienne et montage à plat sur des membranes filtrantes d’ester de cellulose mixte. (A) À gauche, un œil énucléé est stabilisé en saisissant le nerf optique avec une pince Dumont #5 (à gauche). Un petit trou est créé au centre de la cornée à l’aide d’une aiguille de 30 G (centre). Les ciseaux à micro-dissection sont utilisés pour couper la cornée en 4 rabats égaux (à droite). Barre d’échelle = 1 mm. (B) Rétine disséquée avec la sclérotique décollée à l’aide de deux pinces Dumont #5 (à gauche) et avec la lentille retirée (au centre). Rétine avec 4 coupures égales à mi-chemin dans la rétine (à droite). Barre d’échelle = 1 mm. (C) Manipulation de la rétine avec deux pinceaux fins (taille 3/0, à gauche). Rétine retournée avec des cellules ganglionnaires rétiniennes latéralement vers le bas sur un pinceau (centre) et soulevée hors de l’aCSF, en s’assurant que la tension de l’eau ne déchire pas la rétine (à droite). Barre d’échelle = 2 mm. (D) Disque à membrane MCE gris placé sur un papier filtre blanc (à gauche). Une gouttelette d’aCSF sur le disque MCE (à droite). Barre d’échelle = 1 cm. (E) Après avoir fait flotter les rétines dans la gouttelette et les avoir positionnées, créez un pont d’eau avec le papier filtre blanc pour évacuer l’aCSF, en tirant la rétine sur le papier MCE chargé (à gauche); barre d’échelle = 1 cm. L’image zoomée de la membrane MCE (rouge) montre 2 rétines montées avec des cellules ganglionnaires rétiniennes côté haut (à droite); barre d’échelle = 2 mm. Une rétine est soulignée en blanc. Abréviations: MCE = ester de cellulose mélangé; aCSF = liquide céphalo-rachidien artificiel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Imagerie confocale en accéléré de préparations vivantes de la rétine à monture entière

  1. Assemblez la chambre d’incubation d’imagerie en direct pour un microscope confocal vertical, comme le montre la figure 4.
    REMARQUE: Pour les systèmes confocaux inversés, les supports plats sont placés côté RGC directement sur le couvercle inférieur en verre de la chambre d’incubation. Une fois que les rétines entrent en contact avec le couvercle, elles ne peuvent pas être déplacées.
  2. Remplissez la chambre avec de l’aCSF oxygéné et allumez la pompe et le régulateur de température (température 32-34 °C, débit 1 mL/min). Ne laissez pas la température dépasser 34 °C.
  3. Pour transférer le support plat rétinien dans la chambre de perfusion, arrêtez la pompe et retirez l’aCSF qui se trouve dans la chambre. Placez le disque MCE avec le support plat rétinien dans la chambre d’incubation (vide).
  4. Placez un poids d’échantillon sur le support plat; pré-mouiller le poids pour briser la tension superficielle. Remplissez la chambre avec l’aCSF réchauffé et faites circuler l’aCSF à ~1 mL/min.
  5. Positionnez le nez avec l’objectif de trempage d’eau 25x (ouverture numérique 0,95) dans la chambre d’imagerie. Dépister les cellules marquées d’intérêt à l’aide d’une lumière épifluorescente (figure 4C).
  6. Ajustez le volume d’imagerie pour capturer les caractéristiques dendritiques d’intérêt.
    REMARQUE: Cette étude a capturé la tonnelle dendritique complète à 1024 x 1024 pixels par image, z-step 1 μm et une fréquence d’images de 2 min entre chaque pile z. Les tailles d’image finales sont d’environ 100 μm x 100 μm x 20 μm.
  7. Pour ajuster la puissance du laser à un réglage optimal, utilisez une table de recherche qui identifie les pixels sursaturés et sous-saturés. Pendant la numérisation, ajustez la puissance du laser de manière à ce qu’aucun pixel ne soit sursaturé (c.-à-d. à une intensité de 255 ou plus). Continuez l’imagerie aussi longtemps que nécessaire, ou jusqu’à ce qu’il y ait une diminution significative et détectable du signal fluorescent et une augmentation du bruit (généralement 2-4 h).
    REMARQUE: Une puissance laser réduite est recommandée car les algorithmes de déconvolution fonctionnent de manière optimale lorsque les pixels sont répartis sur toute la plage dynamique. L’intensité des pixels ne doit pas dépasser 254; des analyses empiriques des neurites ont révélé que les valeurs de pixels inférieures à 170 sont idéales pour la déconvolution. Des vitesses de balayage rapides (400-600 Hz) avec une moyenne de ligne (2-3) sont préférables à des balayages simples et plus lents du même temps total de séjour en pixels. La zone d’imagerie prolongée comporte souvent des photoblanchiments, mais d’autres sections d’explants restent viables. Plusieurs régions d’une monture plate peuvent être imagées, chacune pendant 2 à 4 h, avec un temps d’incubation total de 6 heures. Les séances d’imagerie au-delà de 6 h n’ont pas été systématiquement testées. La dégradation des neurites et le blebbing sont des signes que la viabilité de l’explant est en déclin.
  8. Après l’imagerie, fixez les supports plats rétiniens et le filtre à membrane avec du paraformaldéhyde froid à 4% pendant 1-2 h à 4 °C. Amplifier les étiquettes fluorescentes dans les rétines fixes par immunohistochimie pour d’autres analyses.
    REMARQUE: La fixation post-imagerie n’est pas possible lors de l’utilisation d’un confocal inversé; les rétines ne sont pas amovibles sans détruire le tissu.

Figure 4
Figure 4 : Configuration de la chambre d’incubation d’imagerie de cellules vivantes. (A) Appareil d’incubation d’imagerie en direct montrant des composants de chauffage, de solution et d’imagerie. Le double chauffage comprend une plate-forme de chambre d’incubation chauffée (cercle arrière avec électrodes de connecteur bleues) et un réchauffeur de solution en ligne. (B) Schéma de 4A. La monture plate rétinienne (rouge) sur la membrane MCE (grise) est placée dans la chambre d’incubation. Le réchauffeur de solution en ligne est connecté à une pompe de solution (non illustrée en 4A). Les dimensions de la chambre d’imagerie permettent une bonne zone de travail pour le nez objectif de trempage. (C) 25x voir une explante rétinienne injectée avec 0,23-0,45 μL de 4 × 1012 GC/mL de dilution AAV; barre d’échelle = 100 μm. L’étiquetage dense des cellules entoure souvent la tête du nerf optique (ligne pointillée, en bas à droite); barre d’échelle = 50 μm. Abréviations: MCE = ester de cellulose mélangé; GC = copies du génome; mCherry = cerise monomère; eYFP = protéine fluorescente jaune améliorée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Déconvolution et post-traitement des images dans ImageJ

  1. Importez la série d’images, divisez la série en fonction du temps et de la couleur s’il s’agit d’une image multicolore. Assurez-vous que tous les points temporels d’une couleur sont contenus dans le même dossier.
    REMARQUE: Importez les bio-formats si vous utilisez ImageJ (les bio-formats sont automatiquement inclus dans FIJI).
  2. Créez une fonction théorique d’étalement de points (PSF) à l’aide du plugin ImageJ, Diffraction PSF 3D.
    REMARQUE: Chaque canal d’imagerie nécessite son propre PSF car la longueur d’onde d’émission de protéines fluorescentes a un impact sur le PSF.
  3. Utiliser les plugins | Macros | Exécuter pour effectuer la déconvolution itérative parallèle par lots pour tous les points temporels à l’aide de la macro fournie (fichier supplémentaire 1).
    REMARQUE : Cette macro exécute 25 itérations de l’algorithme itératif WPL (Wiener Filter Preconditioned Landweber). Chaque couche de couleur doit être déconvolvée séparément.
  4. Fusionnez les couches de couleur et compilez tous les points temporels dans une Hyperstack (Image | | Hyperstacks Piles vers Hyperstack). Corrigez la dérive 3D à l’aide de Plugins | | d’inscription Dérive 3D correcte.
  5. Renvoyer l’image à une pile normale (Image | | Hyperstacks Hyperstack to Stack), et fractionner les points de temps (Image | Piles | Outils | Séparateur de pile). Utilisez le traitement par lots pour créer une projection maximale pour tous les points temporels (Process | | par lots Macro | run(« Z Project... », « projection=[Intensité maximale] »); ).
  6. Importer la séquence d’images time-lapse (File | Importer | Séquence d’images). Utilisez les outils ImageJ conventionnels pour l’analyse souhaitée de la vidéo bidimensionnelle (2D) déconcentrée et post-traitée.
    REMARQUE: Les vidéos quadridimensionnelles (3D + temps) déconcentrées et corrigées de la dérive peuvent être visualisées comme une hyperstack. Omettez l’étape précédente pour conserver les points de temps 3D.

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Representative Results

En utilisant le protocole ci-dessus, une vidéo 3D haute résolution du développement de dendrites de cellules starburst a été acquise, déconcentrée et corrigée pour la dérive 3D. Des projections maximales du plan Z ont été produites pour réaliser des vidéos 2D à des fins d’analyse (vidéo supplémentaire 1, figure 5A). La déconvolution 3D de chaque point temporel a augmenté la résolution des projections de filopodia fines (Figure 5B,C). Les protubérances de filopodes fines sont une caractéristique du développement de dendrites rétiniennes36 et doivent être visibles pendant l’imagerie. La transfection AAV produira une variabilité dans la densité de marquage cellulaire et l’intensité de fluorescence. Ainsi, filtrez le tissu étiqueté pour sélectionner les cellules avec des signaux fluorescents élevés pour l’imagerie et la production de vidéos de haute qualité. Il n’est pas recommandé d’augmenter la puissance du laser pour détecter les cellules faiblement marquées, car cela peut entraîner un photoblanchiment rapide et introduire un bruit élevé par rapport au signal. Des cellules suffisamment brillantes sont visibles à moins de 5 dpi. À 12 ppp et au-delà, les périodes prolongées d’infection par le VAA n’entraînent pas nécessairement une augmentation de la fluorescence des cellules marquées (figure 5D).

La fluorescence excessive et l’encombrement des neurites dues à l’étiquetage des cellules denses affectent la qualité de l’image et peuvent entraver les reconstructions unicellulaires. L’optimisation de la dilution et du volume de l’AAV est nécessaire pour atteindre le degré souhaité de tonnelles isolées et marquées par fluorescence qui sont séparables du reste de la population cellulaire cible. Ici, 9,2 × 108-1,8 × 109 GC viraux ont été injectés par œil pour cibler les cellules amacrines starburst (0,23-0,45 μL d’AAV avec un titre de 4 × 1012 GC / mL). L’absence d’un signal fluorescent peut refléter une technique d’injection inefficace. Lors de l’injection, la fuite de la solution bleue d’AAV du site d’injection indique que le virus n’est pas livré à la rétine, ou que le volume ou la pression d’injection est trop élevé. Un volume ou une pression d’injection excessif peut provoquer un décollement de la rétine et / ou une perte de pression oculaire, endommageant les cellules rétiniennes et réduisant l’efficacité du marquage cellulaire. Les deux problèmes peuvent être résolus avec la pratique et l’optimisation de la technique d’injection. D’autres raisons potentielles de l’absence de signal comprennent la dégradation des AAV due à un stockage inadéquat ou à une expression insuffisante de Cre parce que le transgène Cre n’est pas actif pendant la période de transfection AAV.

Une fois les vidéos déconcentrées, des analyses dynamiques, telles que le calcul des taux d’ajout de branches, de rétraction ou de stabilisation, peuvent être effectuées. En outre, une analyse statique conventionnelle peut être effectuée sur chaque période, y compris la reconstruction des neurones et les quantifications morphométriques telles que la longueur totale des branches, les angles de branche, l’ordre des branches ou le nombre de points de branche terminaux. Le résultat de ce protocole est une série chronologique de piles d’images 3D haute résolution. La plupart des vidéos dynamiques de neurites 3D sont quantifiées manuellement en tant que projection maximale à l’aide d’un logiciel de visualisation d’images open source tel que ImageJ37. Un autre outil open-source, Vaa3D38, a été développé spécifiquement pour la visualisation de grands volumes. Si les vidéos doivent être analysées en 3D, l’utilisation d’un visualiseur de temps 3D + tel que Vaa3D est recommandée. ImageJ et Vaa3D permettent un accès direct aux pixels ou aux voxels de l’image, mais souvent les reconstructions de neurones sont créées en convertissant les données de pixels en reconstructions d’arbres squelettées. Les reconstructions neuronales automatiques ou semi-automatiques pour des points temporels uniques peuvent être effectuées avec des logiciels open source39,40,41 et propriétaires. Pour analyser les reconstructions time-lapse, chaque point de la reconstruction doit être lié aux points temporels précédents et suivants. L’alignement de morphologies dendritiques complexes au fil du temps, qui peuvent être codées par plus de 500 points de données, reste un problème difficile. De nombreux outils sont disponibles, avec des forces et des limites différentes, et ils doivent être sélectionnés en fonction des analyses nécessaires à l’étude.

Figure 5
Figure 5 : Résultats représentatifs après injection intraoculaire néonatale, imagerie time-lapse et déconvolution. (A) Projections maximales de séries d’imagerie time-lapse déconvolvedées (h:min) de la cellule amacrine P6 starburst 5 jours après l’injection d’AAV. La dynamique fine des filopodes peut maintenant être analysée à l’aide des outils ImageJ conventionnels. Une zone de raffinement dendritique (boîte rouge) et une zone de croissance dendritique (boîte verte) sont mises en évidence. (B, C) Une seule cellule amacrine p6 starburst marquée avec eYFP marqué par membrane 5 jours après l’injection d’AAV (dpi) montre un marquage unicellulaire brillant. Barres d’échelle pour panneaux supérieurs = 50 μm; barres d’échelle pour les panneaux inférieurs = 25 μm. Avant (A) et après (B) déconvolution avec ImageJ. Les encarts (rouge) montrent une déblouissement résultant d’une déconvolution réussie. (D) La cellule amacrine 5dpi (à gauche) de la cellule d’étoile P6 starburst 11 dpi montre des niveaux similaires d’expression de protéines fluorescentes. L’augmentation des temps d’incubation de l’AAV n’augmente pas le signal fluorescent. Les signaux fluorescents ne diminuent pas avec des périodes d’infection AAV plus longues. Des paramètres d’acquisition et de post-traitement identiques ont été appliqués aux deux images. L’augmentation de l’épaisseur des branches et les varicosités observées à P12 sont des caractéristiques normales des cellules d’étoiles en maturation et non un artefact d’étiquetage ou d’imagerie. Barres d’échelle = 10 μm. Abréviations : AAV = virus adéno-associé; eYFP = protéine fluorescente jaune améliorée; dpi = jours après l’infection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Considérations relatives à la sélection de la lignée Cre et à la localisation des protéines fluorescentes.

(A-D) Cellules ganglionnaires rétiniennes P11 vivantes imagées à 9 dpi du BBV injectées dans des souris knock-in Vglut2-iRES-Cre, chez lesquelles cre est exprimé sélectivement dans la population RGC. (A) JAM-B RGC identifié par sa morphologie asymétrique caractéristique24. (B-D) Sous-types de RGC distincts qui diffèrent par leurs modèles de stratification des dendrites. (E) Image d’une cellule amacrine vivante P11 starburst biolistiquement transfectée avec mCherry cytosolique et capturée avec un disque confocal en rotation à 512 x 512 pixels. Le XFP cytosolique conduit à un signal de fluorescence élevé dans le soma par rapport aux fines protubérances dendritiques. La lumière floue du soma provoque une fluorescence de fond élevée lors de l’imagerie de petites projections proximales (encadré en rouge ci-dessus est illustré ci-dessous). (F) Image d’une cellule amacrine vivante P11 starburst transfectée avec eYFP ciblée sur membrane et capturée par balayage laser confocal à 1024 x 1024 pixels. Notez l’anneau de membrane fluorescente autour du soma, l’amélioration du rapport signal/bruit et la qualité des projections fines proximales au soma qui sont produites par les protéines fluorescentes ciblées sur la membrane (inset). Barres d’échelle = 50 μm et pour les panneaux inférieurs de E et F = 5 μm. Abréviations : IRES = site interne d’entrée des ribosomes; BBV = Brainbow virus adéno-associé; Vglut2 = transporteur vésiculeux de glutamate 2; XFP = toute protéine fluorescente; eYFP = protéine fluorescente jaune améliorée; mCherry = cerise monomère; RGC = cellules ganglionnaires de la rétine; JAM-B = molécule d’adhésion de jonction B. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Vidéo supplémentaire 1: Vidéo time-lapse de P6 développant des dendrites amacrines starburst, 5 jours après l’injection. Le pas de temps vidéo est de 2 min. La déconvolution et la correction de dérive 3D ont été appliquées à l’aide d’ImageJ. Les cases jaunes supérieures mettent en surbrillance les zones d’excroissance, et la boîte inférieure décrit une région d’excroissance transitoire de filopodia, d’auto-contact et de rétraction. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Fichier supplémentaire 1 : Macro ImageJ pour la déconvolution itérative parallèle par lots. La macro exécute 25 itérations de l’algorithme itératif WPL (Wiener Filter Preconditioned Landweber). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Cette vidéo démontre un pipeline expérimental qui utilise des outils génétiques existants pour imager la dynamique des dendrites des neurones rétiniens en développement avec l’imagerie confocale en direct. Les injections intraoculaires d’AAV créo-dépendants codant pour des protéines fluorescentes ciblant la membrane chez des souris néonatales ont également été démontrées. Les cellules individuelles de populations génétiquement ciblées sont marquées de manière brillante dès 4-5 dpi. Des supports plats rétiniens ont été préparés pour les chambres d’imagerie standard afin d’effectuer une imagerie confocale à cellules vivantes. Cette méthode produit des vidéos time-lapse haute résolution de cellules individuelles et de leurs projections fines. Les petites projections sont résolues et quantifiées à l’aide d’algorithmes de déconvolution et de post-traitement disponibles via des logiciels open source, notamment ImageJ, Vaa3D et ShuTu, ainsi que des logiciels sous licence disponibles auprès d’Imaris et de MBF Bioscience. Comme ce pipeline est modulaire, chaque section du protocole peut être modifiée pour s’adapter aux objectifs de l’étude. Ces éléments modulaires sont discutés ci-dessous et comprennent: 1) la sélection de la ligne Cre, 2) le choix de la protéine fluorescente et de la construction virale, 3) les méthodes d’administration des gènes et 4) la méthode d’imagerie.

Cette technique utilise des lignées transgéniques Cre pour l’accès génétique aux sous-populations de cellules rétiniennes. Cre doit être actif après la naissance et exprimé dans la population cellulaire au moment de l’injection pour augmenter la probabilité d’infection virale et le marquage cellulaire. Dans ce rapport, ChAT-Cre a été utilisé pour cibler les cellules amacrines starburst, et la lignée Vglut2-Cre a été utilisée pour cibler le développement de CGR42,43 (Figure 6). L’injection d’AAV dépendant de la cre dans des souris knock-in Vglut2-IRES-Cre a marqué une variété de RGC, y compris la cellule B de la molécule d’adhésion de jonction (Figure 6A) et les CGR bi-stratifiés (Figure 6B, C). Alternativement, de nouvelles conceptions d’AAV avec des promoteurs synthétiques qui stimulent l’expression spécifique au type de cellule pourraient éliminer le besoin de lignées transgéniques Cre44. Une autre considération pour un étiquetage efficace et lumineux adapté à l’imagerie en direct est le temps minimum requis pour la transfection et l’expression, qui peut varier en fonction du sérotype AAV, du tropisme et du titre45. Dans ces études, comme l’étiquetage médié par l’AAV nécessite un minimum de 4 à 5 dpi pour l’expression de XFP, cette méthode ne convient pas pour accéder aux points temporels postnatals précoces. Pour capturer les premiers points temporels (par exemple, P0-P4), des injections intraoculaires peuvent être effectuées in utero chez des animaux embryonnaires, comme c’est le cas pour l’électroporation in utero46. Dans les études de ce groupe sur le développement de la dendrite starburst, le schéma initial de recombinaison clairsemé de ChAT-Cre a été exploité pour marquer les cellules amacrines à sursaut d’étoile unique à P0-P4 à l’aide d’un rapporteur Cre transgénique de souris, Rosa-mTmG27. Enfin, ce protocole d’injection rétinienne AAV peut être utilisé pour marquer les populations de cellules adultes, sur la base de la confirmation de la persistance du marquage fluorescent 3 mois après l’injection sans effets délétères sur la morphologie des cellules starburst34.

Ce pipeline permet également une flexibilité dans la sélection de la construction virale. Pour capturer la dynamique des dendrites, une variété de protéines rapporteures fluorescentes peuvent être utilisées, y compris des protéines qui se localisent dans des structures subcellulaires spécifiques, des protéines d’intérêt ou signalent des changements fonctionnels tels que la dynamique de l’actine (par exemple, LifeAct) et les signaux calciques (par exemple, GCaMP). Tout vecteur AAV disponible dans le commerce ou cloné peut être utilisé, et les outils en ligne tels que fpbase.org doivent être référencés pour la luminosité et la photostabilité. Ici, des vecteurs viraux Brainbow codant pour des protéines fluorescentes avec un motif CAAX de farnsylation H-Ras ont été utilisés pour la localisation de la membrane. Au début de l’élaboration du protocole, la localisation cytosolique des XPF s’est avérée ne pas être idéale pour étudier la morphologie des neurites fines, avec une sursaturation des signaux du soma et un mauvais marquage des branches fines (Figure 6E). En comparaison, il a été démontré que les protéines fluorescentes ciblées sur la membrane marquent et résolvent les protubérances dendritiques fines (figure 6E, F). Une autre considération est la taille, la conception et la complexité de la construction virale, ce qui peut affecter le temps d’expression. Par exemple, AAV-CAG-FLEx-mClover3-CAAX a été généré, qui exprime un XFP de manière dépendante de Cre. Cette construction a une conception plus simple et se traduit par une expression efficace de 4 dpi. Ensemble, les diverses options pour les lignées Cre, les conceptions AAV et les rapporteurs de protéines fluorescentes qui sont largement disponibles à partir de dépôts (par exemple, JAX, Addgene et Viral Vector Cores) rendent ce pipeline adaptable à une variété d’études sur les types de cellules et les phénomènes de développement dans la rétine.

Bien que ce protocole détaille les injections intraoculaires d’AAV, d’autres méthodes d’administration de gènes sont disponibles telles que l’électroporation plasmidique46 et l’administration de gènes biolistiques (par exemple, Gene Gun)7. L’électroporation nécessite l’application d’une impulsion électrique, et l’administration de gènes biolistiques nécessite une incubation ex vivo d’explants rétiniens. Le marquage AAV est moins invasif que ces deux méthodes et permet des préparations aiguës d’explants de rétine juste avant l’imagerie. Par rapport à l’administration de gènes biolistiques (Figure 6E, F), les injections d’AAV ont permis d’améliorer la viabilité des tissus, mieux adaptée à l’acquisition continue nécessaire au suivi de la dynamique des neurites. Avec une technique appropriée, l’étiquetage AAV pose peu ou pas de dommages à la rétine, comme en témoigne la santé du tissu au moment de la dissection. Les injections intravitréennes infectent principalement les cellules de la couche des cellules ganglionnaires et de la couche nucléaire interne, telles que les RGC et les cellules amacrines. Plusieurs dizaines de cellules amacrines à sursaut d’étoiles sont généralement marquées, avec une densité accrue de cellules marquées autour de la tête du nerf optique (Figure 4C). Cependant, avec les trois méthodes de transfection, la coupure du nerf optique est inévitable pour obtenir des explants rétiniens et conduira à la dégénérescence RGC. Malgré la coupure du nerf optique, des études rapportent des explants rétiniens viables à partir d’une variété de modèles de vertébrés pendant 36 h et jusqu’à 6 jours après la nucléation5,6,7,47,48.

Enfin, l’utilité de la microscopie confocale pour capturer la dynamique des dendrites a été démontrée. En règle générale, une séance d’imagerie s’étend sur 2 à 4 h et se termine avant que l’on observe une dégradation tissulaire ou un saignement des neurites. Des séances d’imagerie jusqu’à 6 h ont été effectuées; toutefois, la limite supérieure n’a pas été systématiquement testée. Les zones peuvent subir un photoblanchiment en raison d’une imagerie prolongée, mais les cellules dans d’autres champs de vision de l’explante restent viables pour l’imagerie en direct. Cette méthode peut également être étendue à la microscopie multiphotonique ou à feuille de lumière pour imager la morphologie neuronale dans des couches plus profondes et des volumes plus importants. L’imagerie multiphotonique a été réalisée pour étudier la dynamique des neurites dans la rétine de souris et est mieux adaptée à l’étude des cellules dans la lame rétinienne plus profonde (par exemple, les cellules horizontales ou photoréceptrices)49. Récemment, la microscopie à feuille de lumière à cellules vivantes a été utilisée pour capturer l’angiogenèse rétinienne50, offrant une nouvelle voie pour l’imagerie en direct de la morphogenèse dans l’ensemble de la rétine. La microscopie à feuille de lumière à cellules vivantes pourrait être utilisée pour étudier l’assemblage de circuits neuronaux à plus grande échelle, comme le ciblage axon-dendrite. L’imagerie en direct multicolore est une autre application de ce pipeline qui peut être utilisée pour étudier les interactions cellule-cellule, telles que l’influence des cellules voisines sur le développement de la dendrite ou d’autres phénomènes de développement tels que le carrelage des cellules rétiniennes, y compris les sous-types RGC1, la microglie et les astrocytes.

En conclusion, un aspect difficile des études sur le développement est l’accès à ces moments critiques. Ce protocole fournit une méthode pour visualiser la morphogenèse qui se produit au cours d’une fenêtre temporelle spécifique. Le pipeline combine des outils et des techniques existants pour cibler génétiquement les populations cellulaires et exprimer des protéines fluorescentes ciblées sur la membrane. Les préparations aiguës rétiniennes à montage plat maintiennent la viabilité et les signaux fluorescents pour l’imagerie confocale à cellules vivantes pendant plusieurs heures. Les aspects transitoires et dynamiques du développement de dendrites sont capturés dans des vidéos 3D et sont post-traités à l’aide d’un logiciel open source. La capacité de capturer des vidéos 3D haute résolution est essentielle pour étudier les processus de développement dynamiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Madison Gray de m’avoir donné un coup de main alors que je n’en avais pas. Cette recherche a été soutenue par une subvention de découverte du CRSNG (RGPIN-2016-06128), une bourse Sloan en neurosciences et une chaire de recherche du Canada de niveau 2 (à J.L.L.). S. Ing-Esteves a été soutenu par le Programme de recherche en sciences de la vision et les bourses d’études supérieures-doctorales du CRSNG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Addgene viral prep #45185-AAV9
Addgene viral prep #45186-AAV9
Dissection tools
Cellulose filter paper Whatman 1001-070
Dumont #5 fine forceps FST 11252-20 Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection
Dumont forceps VWR 82027-426
Fine Scissors FST 14058-09
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size Millipore HABG01 300
Petri Dish, 50 × 15 mm VWR 470313-352
Polyethylene disposable transfer pipette VWR 470225-034
Round tip paint brush, size 3/0 Conventional art supply store Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting
Surgical Scissors FST 14007-14
Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge FST 15000-08
Live-imaging incubation system
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' Warner Instruments 64-0755
Dual channel heater controller, Model TC-344C Warner Instruments 64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective Leica 15506374
Heater controller cable Warner Instruments CC-28
Large bath incubation chamber with slice support Warner Instruments RC-27L
MPII Mini-Peristaltic Pump Harvard Apparatus 70-2027
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) Warner Instruments PM-6D
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump Harvard Apparatus 55-4148
Sample anchor (Harps) Warner Instruments 64-0260 Sample anchor must be compatible with incubation chamber
Sloflo In-line Solution Heater Warner Instruments SF-28
Neonatal Injections
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle Hamilton Company 80314
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) BD PrecisionGlide 305106
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)  WPI World Precision Instruments TW100-4
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) Sigma-Aldrich V001229 
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF Penn Vector Core AV-9-PV2453 Addgene Plasmid #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP
1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF		 Penn Vector Core AV-9-PV2454 Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line The Jackson Laboratory 6410
Fast Green FCF Dye content ≥85 % Sigma-Aldrich F7252-25G
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 Sutter Instrument Co. P-97
Green tattoo paste Ketchum MFG Co 329A
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich 806552
Pneumatic PicoPump WPI World Precision Instruments PV-820
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2) AirGas X02OX95C2003102 Supplier may vary depending on region
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES, Free Acid Bio Basic HB0264
Hydrochloric acid solution, 1 N Sigma-Aldrich H9892
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670
pH-Test strips (6.0-7.7) VWR BDH35317.604
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Sodium chloride (NaCl) Bio Basic DB0483
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich RDD007
Software
ImageJ National Institutes of Health (NIH) Open source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Neurosciences Numéro 169 Imagerie des cellules vivantes morphogenèse développement de dendrite injections intravitréennes Cre-Lox virus associé à l’adéno déconvolution cellules amacrines à sursaut d’étoiles
Imagerie en accéléré de l’arborisation neuronale à l’aide du marquage clairsemé du virus adéno-associé à des populations de cellules rétiniennes génétiquement ciblées
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Ing-Esteves, S., Lefebvre, J. L.… More

Ing-Esteves, S., Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (169), e62308, doi:10.3791/62308 (2021).

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