Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Tidsforløpavbildning av nevronal arborisering ved hjelp av sparsom adeno-assosiert virusmerking av genetisk målrettede retinalcellepopulasjoner

Published: March 19, 2021 doi: 10.3791/62308
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Program for Neuroscience and Mental Health, Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Summary

Her presenterer vi en metode for å undersøke nevritt morfogenese i postnatal mus retinal explants ved tidsforløp konfokal mikroskopi. Vi beskriver en tilnærming for sparsommerking og oppkjøp av retinal celletyper og deres fine prosesser ved hjelp av rekombinante adeno-assosierte virusvektorer som uttrykker membran-målrettede fluorescerende proteiner på en Cre-avhengig måte.

Abstract

Å oppdage mekanismer som mønster dendritiske arbors krever metoder for å visualisere, bilde og analysere dendritter under utvikling. Mus netthinnen er et kraftig modellsystem for undersøkelse av celletypespesifikke mekanismer for nevronal morfogenese og tilkobling. Organiseringen og sammensetningen av retinal subtyper er veldefinerte, og genetiske verktøy er tilgjengelige for å få tilgang til bestemte typer under utvikling. Mange retinal celletyper begrenser også dendrittene og/eller axonene til smale lag, noe som letter tidsforløpavbildningen. Mus netthinnen explant kulturer er godt egnet for live-celle avbildning ved hjelp av confocal eller multiphoton mikroskopi, men metoder optimalisert for avbildning dendrite dynamikken med temporal og strukturell oppløsning mangler. Presentert her er en metode for å sparsomt merke og bilde utviklingen av spesifikke netthinnepopulasjoner preget av Cre-Lox-systemet. Kommersielt tilgjengelige adeno-assosierte virus (AAVs) som brukes her uttrykte membran-målrettede fluorescerende proteiner på en Cre-avhengig måte. Intraokulær levering av AAVer hos nyfødte mus produserer fluorescerende merking av målrettede celletyper med 4-5 dager etter injeksjon (dpi). Membranfluorescerende signaler kan påvises ved konfektavbildning og løse fine grenstrukturer og dynamikk. Videoer av høy kvalitet som spenner over 2-4 timer er anskaffet fra imaging retinal flat-mounts perfused med oksygenert kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Også gitt er et bilde etterbehandling rørledning for dekonvolusjon og tredimensjonal (3D) drift korreksjon. Denne protokollen kan brukes til å fange opp flere cellulære atferd i den intakte netthinnen og for å identifisere nye faktorer som kontrollerer nevritt morfogenese. Mange utviklingsstrategier lært i netthinnen vil være relevante for å forstå dannelsen av nevrale kretser andre steder i sentralnervesystemet.

Introduction

Dendritter av retinal nevroner danner intrikate, men spesifikke, mønstre som påvirker deres funksjon i nevrale kretser. I virveldyr netthinnen, ulike typer retinal ganglion celler (RGCs) og amacrine celle interneurons bære unike dendritiske morfologier som varierer i arbor størrelse, plassering, gren lengde, og tetthet1. Under postnatal utvikling utvider RGCer og amacrine celler sprudlende dendrittiske prosesser til en neuropil kalt det indre plexiformlaget (IPL), hvor de mottar bipolare celleinnganger som overfører fotoreseptorsignaler2. Som fanget av tidsforløpavbildning av fluorescerende merkede retinalpopulasjoner hos kylling- eller sebrafisklarver, er dendritmorfogenese svært dynamisk3,4,5. I løpet av få dager utvides, ombygges og ramifiseres dendritiske arbors for å begrense underlagene til IPL, der de synapserer med utvalgte partnere. Arbors viser forskjellig strukturell dynamikk over utvikling, med endringer i relative rater av gren tillegg, tilbaketrekning og stabilisering. Amacrine og RGC dendritter viser også forskjellige utvekst- og ombyggingsvirkemåter som kan gjenspeile typespesifikk arborisering. Imidlertid sporet disse studiene brede amacrine- eller RGC-populasjoner og fokuserte på laminær målretting, som bare er ett aspekt av morfologi.

Mekanismene som produserer det enorme morfologiske mangfoldet som observeres på tvers av netthinneundertyper, er dårlig forstått. Målet med denne gruppen var å utvikle en metode for å fange dendritdynamikk og arbor ombygging av definerte retinal subtyper hos mus. Identifisering av celletypespesifikke mekanismer for dendritmønster krever metoder for å visualisere og måle dendritoppførsel av celler av interesse. Organotypiske kulturer av mus netthinner er godt egnet for levende celle bildestudier ved hjelp av konfikal eller multifoton mikroskopi. Utvikling av netthinner dissekeres og monteres i en flat utvisning som kan avbildes i flere timer i et opptakskammer eller dyrkes over noen dager med begrensede effekter på kretsløpet6,7. Levende retinal nevroner kan merkes med en rekke teknikker, inkludert fargestofffylling av elektroder, elektroporasjon, biolistisk levering av partikler belagt med lipofile fargestoffer eller plasmider som koder fluorescerende proteiner (f.eks. Gene Gun), samt genetisk kodede celleetiketter7,8,9,10 . Disse tilnærmingene er imidlertid ineffektive for avbildning av dendritdynamikk av spesifikke netthinneundertyper. For eksempel er fargestofffyllingsmetoder lav gjennomstrømning og krever elektrofysiologiapparater og ekstra genetiske etiketter for pålitelig å målrette celler av interesse. Videre kan de sterke fluorescenssignalene i soma skjule nærliggende dendritter.

Biolistiske genleveringsmetoder kan samtidig merke dusinvis av celler, men trinn som involverer høytrykkspartikkellevering og nattinkubasjon av isolert netthinne kan kompromittere cellefysiologi og dendritisk utvekst. Denne artikkelen foreslår at nyere genetiske verktøy kan brukes til å fange tidlig dendritdynamikk med celletype og strukturell oppløsning, gitt følgende eksperimentelle kriterier. For det første, for å løse de fine grenene og filopodia som dominerer utviklingen av arbors, bør metoden merke nevroner med lyse, fluorescerende proteiner som fyller prosesser i hele arboret. Fluorescensmerkingen skal ikke falme på grunn av fotobleking i bildeperioden. En rekke fluorescerende proteinvarianter er generert og sammenlignet for egnethet for in vivo/ex vivo imaging11 basert på lysstyrke og fotostabilitet. For det andre må fluorescerende proteiner (XFPer) uttrykkes på tilstrekkelig høye nivåer ved det tidligste stadiet av dendritmorfogenese, slik at det smale utviklingsvinduet ikke går glipp av. I analyser av statiske tidspunkter i musetina forekommer dendritutvikling i løpet av den første barseluken og inkluderer faser av utvekst, ombygging og stabilisering10,12,13,14,15. For det tredje bør metoden føre til selektiv merking eller økt sannsynlighet for merking av den nevronale subpopulasjonen av interesse. For det fjerde må merkingen av måldelpopulasjonen være tilstrekkelig sparsom slik at hele nevronal arbor kan identifiseres og spores. Selv om RGC og amacrine undertyper kan preges av deres modne morfologiske egenskaper og IPL stratifiseringsmønstre16,17,18,19,20, er utfordringen å identifisere undertyper under utvikling basert på umodne strukturer. Denne oppgaven forenkles ved utvidelse av transgene verktøy for å merke spesifikke netthinnecelletyper under utvikling.

Transgene og knock-in muselinjer der cellulære og temporale uttrykk for fluorescerende proteiner eller Cre bestemmes av genregulatoriske elementer er mye brukt til å studere retinal celletyper13,21,22,23. Sentrale observasjoner om subtypespesifikke mønstre for dendritutvikling har kommet fra studier av transgene mus netthinner på statiske tidspunkter10,14,24,25. Spesielt Cre-Lox-systemet muliggjør utsøkt genmanipulering og overvåking av undertyper ved hjelp av en rekke rekombinaseavhengige reportere, sensorer og optogenetiske aktivatorer. Disse verktøyene har ført til funn av subtypespesifikke molekylære programmer og funksjonelle egenskaper som ligger til grunn for retinal kretsmontering26,27,28,29,30. Imidlertid har de ennå ikke blitt utnyttet til å studere subtype-spesifikk dendritdynamikk i mus netthinnen. Merking med lav tetthet kan oppnås ved å kombinere Cre-muselinjer med transgenes introdusert av elektroporasjon eller ved rekombinante AAVer. Hvis tilgjengelig, tamoxifen-inducible Cre linjer eller interseksjonelle genetiske strategier kan også brukes. Til slutt bør cellen merkes på en minimalt invasiv måte og avbildet ved hjelp av oppkjøpsparametere for ikke å kompromittere vevet eller forstyrre cellulær funksjon som kreves for dendritmorfogenese.

Presentert her er en metode for å bruke transgene verktøy og konfokal mikroskopi for å undersøke dendritdynamikk i levende mus retinal explants. Cre transgene muselinjer har blitt kombinert med AAV-vektorer som uttrykker fluorescerende proteiner ved Cre-rekombinasjon, noe som gir mulighet for sparsom merking av retinalceller av interesse. Kommersielt tilgjengelige AAVer leveres til neonatal netthinne ved intravitreale injeksjoner. Dette dokumentet viser at AAVer produserer betydelig høyt og celletypespesifikk fluorescerende uttrykk med 4 dpi, noe som gir tilgang til postnatale tidspunkter. For å illustrere denne tilnærmingen ble den kolinerge "starburst" amacrine internuron merket ved å levere Brainbow AAV i neonatale mus som uttrykker kolin acetyltransferase (ChAT)-intern ribosome entry site (IRES)-Cre transgene, som er aktiv i den tidlige postnatale netthinnen31,32. Starburst amacrine celler utvikle en stereotyp og radial arbor morfologi som er formet av dendrite selvunngåelse formidlet av klynget protocadherins33,34. Dette papiret viser at oppløsningen av stjerneskudd dendritter og filopodia er betydelig forbedret av XFPs til plasmamembranen med tilsetning av CAAX-motivet som gjennomgår farnesylering, som brukes til Brainbow AAVs31. Til slutt er det fastslått tidsforløpavbildnings- og etterbehandlingsprotokoller som produserer bilder av høy kvalitet som kan brukes til dendritrekonstruksjon og morfometrisk kvantifisering. Denne protokollen kan brukes til å identifisere faktorer som kontrollerer dendritmorfogenese og for å fange opp flere cellulære atferd i den intakte netthinnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Denne protokollen strekker seg over 2 dager med en minimumsperiode på 4-5 dager for viral transduksjon mellom eksperimentelle dager (figur 1A). Dyreforsøk utføres i samsvar med Canadian Council on Animal Care Guidelines for Use of Animals in Research and Laboratory Animal Care under protokoller godkjent av Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee ved Hospital for Sick Children (Toronto, Canada).

1. Forberedelser til neonatale AAV-injeksjoner og avbildningsforsøk

  1. Velg en Cre-muselinje for å merke de interessemessige retinalcellepopulasjonene. Bekreft Cre rekombinere uttrykk på tidspunktet for AAV injeksjoner ved å krysse til en Cre transgen reporter eller gjennom immunostaining med en Cre antistoff.
  2. Ras transgene Cre mus (8-16 uker gammel) for å generere Cre-positive nyfødte dyr.
    MERK: For denne demonstrasjonen ble ChAT-IRES-Cre knock-in mus brukt til å målrette de kolinerge Starburst amacrine cellene.
  3. Få rekombininasavhengig AAV-viruskoding av fluorescerende protein(er). For optimal merking av fine prosesser, velg vektorer som uttrykker modifiserte XFPer rettet mot plasmamembranen.
    MERK: Denne studien brukte Brainbow-viruset (BBV), AAV-EF1a-BbTagBY og AAV9-EF1a-BbChT (se Materialfortegnelse), som gir mulighet for flerfarget merking (figur 1B). Farnesylert forbedret gult fluorescerende proteinuttrykk (eYFP) og monomerisk kirsebæruttrykk (mCherry) ga de sterkeste fluorescerende signalene for levende avbildning. En enkelt BBV kan brukes til å avbilde individuelle arbors, mens co-injeksjon av BBVs kan brukes til å merke flere celler eller nærliggende arbors med distinkte fluoroforer. Hvis du bruker flere fluorescerende proteiner, må du sikre minimalt utslippsspektrumoverlapping (figur 1C). Mikroskopanskaffelsesparametere må justeres for å fange opp distinkte XFP-signaler.
  4. Forbered ∼3-5 μL aliquots av AAVs i individuelle lavbindingsrør for engangslagre for å unngå fryse / tine sykluser. Oppbevars ved -80 °C.
  5. Forbered borosilikatglassmikropipetter med veldig fine spisser ved hjelp av en mikropipettetrekker.
    MERK: Trekkinnstillingene varierer avhengig av filament og puller som brukes; se figur 2A for endelig spissstørrelse og -form. Typiske dråpediametre er 600 μm.
  6. Skaff deg et mikroinjeksjonssystem og tilhørende rør. Koble mikroinjektoren til en trykkluftport.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentell oversikt. (A) Denne protokollen spenner over 2 dager med eksperimenter med minimum 4-5-dagers infeksjonsperiode mellom eksperimentelle dager. Intraokulære injeksjoner utføres på nyfødte mus som ikke er eldre enn postnatal dag 3. Netthinner blir deretter dissekert, flatmontert og live-imaged for å fange ønsket utviklingsvindu. Merkede celler kan avbildes når som helst etter de nødvendige 4-5 dagene som trengs for viralt uttrykk, da det ikke er noen tilsynelatende effekter av langvarig AAV-uttrykk på dendritmorfologi. (B) Cre-avhengige Brainbow AAV-vektorer (BBV) injiseres i dyr som uttrykker Cre31. I denne studien ble ChAT-Cre knock-in mus brukt til å drive Cre rekombinasjon i stjerneskudd amacrine celler. De to BBV-ene koder modifisert eYFP eller tagBFP, eller mCherry og mTFP, som avsluttes i et CAAX-motiv som er sekvensielt farnesylert for membranlokalisering. Lox nettsteder er avbildet med trekanter. Vektorene uttrykker enten farnesylerte XFPer på en stokastisk og kombinatorisk måte avhengig av Cre-rekombinasjon. EF1α-promotoren inkluderer regulatoriske elementer fra forlengelsesfaktoren 1α gen. W representerer elementer fra woodchuck hepatittvirus posttranscriptional regulatorisk element, og pA indikerer polyadenyleringssekvensen. (C) Eksitasjons- og utslippsspektraet til mCherry og eYFP, BBV-fluoroforene som er avbildet i denne studien. Ved levende avbildning av flere fluorescerende proteiner må deteksjonsparametrene ordnes for å skille utslippsspektra tilstrekkelig i forskjellige kanaler. Forkortelser: AAV = adeno-assosiert virus; BBV = Brainbow AAV; ChAT = kolin acetyltransferase; iRES = innvendig ribosome inngangssted; eYFP = forbedret gult fluorescerende protein; iTR = invertert terminal gjentakelse; tagBP = Tag-blå fluorescerende protein; mCherry = monomerisk kirsebær; mTFP = blågrønn fluorescerende protein; XFP = noe fluorescerende protein; EF1α= forlengelsesfaktor 1 alfa. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Intravitreale injeksjoner av AAVer hos nyfødte mus

  1. Tine en AAV aliquot på is. Forbered en ~1:4 AAV-fortynning ved hjelp av steril saltvann eller fosfatbufret saltvann. Forbered ~ 0,5 μL AAV-fortynning per dyr (~ 0,25 μL per øye) i tilfelle mikropipetten brytes, og en ny pipette må fylles. Oppbevar den gjenværende ufortynnede AAV ved 4 °C, og bruk den innen 2 uker.
    MERK: I dette eksperimentet var leverandørenS AAV-konsentrasjon ~ 1-2 × 1013 genominnhold (GC) / ml og fortynnet til en endelig konsentrasjon på 4 × 1012 GC / ml. Optimaliser den virale konsentrasjonen for å oppnå ønsket merkingstetthet.
  2. For å visualisere injeksjonene, tilsett ca. 1 μL 0,02% Fast Green FCF fargestoffoppløsning for hver 15 μL AAV-fortynning for å fargelegge oppløsningen blå.
  3. Overfør et musebur med demning og nyfødt søppel (barseldag (P) 0,5-3) til et prosedyrerom med mikroinjeksjonsutstyr. Hold dyrene i samme bur med reir og sengetøy for å minimere mors stress og avvisning av valper.
  4. Steriliser injeksjonsområdet med 70% etanol, og plasser sterile bleieputer på benkflater. Forbered en varm plattform (f.eks. en varmepute) for utvinning fra hypotermiindusert anestesi.
  5. Fyll mikropipetten på nytt med AAV-fortynning ved hjelp av en mikrosyring. Under et stereomikroskop bryter du mikropipettespissen med en 30 G nål for å forsegle spissen.
    MERK: Figur 2A viser den etterfylte spissen både forseglet (øverst) og uforseglet (i midten).
  6. Bedøv neonatal mus ved hypotermi ved å plassere 1-2 dyr på is. Plasser dyr på en latekshanske for å beskytte huden mot direkte kontakt med is. Når dyret ikke lenger beveger seg som svar på poteklemme (~ 2 min), plasser dyret under et stereomikroskop. Om ønskelig, tatovering pote pads med tatovering blekk og 30 G nål, og samle hale klippinger for DNA isolasjonfor å identifisere dyr ved genotyping.
    MERK: Passende overvåking av anestesidybden må skje gjennom hele prosedyren.
  7. Vattpinne huden overlyd øynene med 70% etanol. Bruk en 30 G nål til å åpne det smeltede øyelokket (figur 2B). Påfør lett trykk med fingrene for å åpne øyet, og stikk et lite hull gjennom hornhinnen ved hornhinnen-sclera-krysset (figur 2C).
  8. Sett glassmikropipetten inn i hullet, og trykk mikroinjektorfotpedalen 2-4 ganger for å injisere AAV i det intravitreale rommet. Fjern mikropipetten langsomt, og bekreft AAV-injeksjon ved å visualisere blått fargestoff gjennom eleven (figur 2D).
    MERK: Med et utkasttrykk på 6-8 psi og pulstid på 600-800 ms kastes et dråpe på 600 μm diameter (figur 2A, bunn). Omtrent 0,23-0,45 μL AAV-oppløsning injiseres per øye. Blå oppløsning utenfor øyet indikerer at AAV ikke ble injisert i øyet. Blå oppløsning som lekker fra injeksjonsstedet indikerer at AAV kan ha lekket ut, noe som reduserer transfeksjonseffektiviteten.
  9. Trykk øyelokkene forsiktig sammen for å forsegle på nytt, og legg valpen på en oppvarmet pute. Når dyrene gjenoppretter en rosa farge og er responsive, overfør dem forsiktig tilbake til boligburet.
    MERK: Sørg for at det tas passende forholdsregler for å unngå for rask oppvarming av valpene.
  10. Gjenta injeksjonsprosedyren for de resterende dyrene i søppelet. Tillat minst 4-5 dager for viral transduksjon før du forestiller netthinnen.

Figure 2
Figur 2: Neonatale intraokulære injeksjoner. (A) Bakfylt mikropipette viser formen på pipettespissen når den er forseglet (øverst) og etter at spissen er forseglet (bunn, venstre). Pico-injeksjonstrykk på 6-8 psi og pulstid på 600-800 ms gir en 600 μm diameter dråpe (bunn, høyre). Skalastang = 1 mm.(B) Bedøvet P0-valp under 16x forstørrelse. Det smeltede øyelokkkrysset (hvitt) er spaltet åpent med en skarp 30 G nål. Skalastang = 2 mm. (C) Lett trykk påført øyet eksponerer hornhinnen; skalastang = 2 mm. Zoomet seksjon (rød) viser det lille hullet ved hornhinnen-sclera krysset (gul) opprettet med en 30 G nål; skalastang = 0,5 mm. (D) Tilbaketrekking av pipettespissen etter injeksjon (venstre). Fast Grønn fargestoff i AAV-oppløsningen fremstår som blågrå gjennom eleven (midten), sammenlignet med den lette elevfargen før injeksjon (høyre). Skalastang = 1 mm. (E) Etter 4 dager har øyelokket helbredet og smeltet igjen (venstre); skalastang = 2 mm. Ved enucleation er det helbredede injeksjonsstedet synlig (gult); skala bar = 1 mm. Legg merke til plasseringen av injeksjonsstedet ved grensen mellom hornhinnen og sclera. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Retinal disseksjoner for avbildningseksperiment

  1. Forbered retinal aCSF (119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2·6H2O, 2,5 mM CaCl2·2H2O, 1 mM NaH2PO4, 11 mM glukose og 20 mM 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES gratis syre)35. Om ønskelig, forberede og fryse 10x løsning; tine og fortynne til 1x etter behov.
  2. Oksygener retinal aCSF ved å boble med karbogen (95% O2, 5% CO2) i minst 15 min. Juster pH til 7,4. Oppbevares i en forseglet beholder til bruk for å sikre at aCSF forblir oksygenert.
    MERK: Netthinner krever en høy konsentrasjon av O2. Det er viktig å holde aCSF oksygenert gjennom hele eksperimentet.
  3. Bygg inn en Petri-tallerken med en diameter på 60 mm i en isbrett (mote en isbrett av labplast, for eksempel et pipettebokslokk), og legg den under et stereomikroskop. Fyll Petri-parabolen med oksygenert retinal aCSF.
  4. Euthanize mus P9 og yngre ved halshugging. Euthanize mus P10 og eldre ved isofluran induksjon, eller en alternativ metode godkjent under dyreprotokollen, etterfulgt av halshugging.
  5. Hvis øyelokkene er forseglet, kutt øyelokkklaffen for å eksponere øyet. Bruk tang til å enukle øynene, og overfør dem til kald retinal aCSF fra trinn 3.3.
  6. For å dissekere retinal koppen, under et stereomikroskop (forstørrelse 25x), stabilisere øyet ved å klemme synsnerven ved hjelp av en Dumont # 5 forcep (figur 3A).
  7. Stikk et hull i midten av hornhinnen med en 30 G nål, og sett deretter en spiss av mikroscissorene inn i hullet for å gjøre et snitt fra hullet til enden av hornhinnen. Gjenta for å lage 4 skiver i kardinalretningene, og lag 4 "klaffer" (figur 3A).
  8. Med to Dumont #5 tang, grip og trekk de to tilstøtende klaffene fra hverandre, forsiktig peeling sclera fra netthinnen. Gjenta med de resterende hornhinneklaffene, og fjern sclera fra netthinnen (figur 3B).
  9. Fjern linsen fra netthinnekoppen ved hjelp av tangene. Med mikroscissorer, gjør 4 radiale snitt fra kanten av netthinnen mot synsnerven, og skaper 4 like kronblad (figur 3B). Gjenta trinn 3.4-3.7 for det andre øyet.

4. Retinal flat-mount forberedelse

  1. Klargjør grå blandet cellulose ester (MCE) membranfilterskiver for montering. Hvis du bruker MCE-membranfiltre med stor diameter, skjærer du platen i kvadranter (omtrent 1 cm over). Plasser MCE-platen på midten av et større hvitt filterpapir (figur 3D).
    MERK: MCE-filtre er også tilgjengelige i plater med 1 cm diameter. MCE-filterskiven må være stor nok til å passe 1-2 netthinner, men liten nok til å passe inn i bildekammeret. Ettersom MCE-membraner holder en statisk ladning, minimerer du kontakt og håndtering av MCE-membranen.
  2. Håndtering av netthinner ved hjelp av to størrelse 3/0 pensler, vend en retinal kopp på en pensel med retinal ganglion celle side ned. Løft netthinnen forsiktig ut av aCSF, og pass på at vannspenningen ikke netthinnen (figur 3C).
  3. Mens du fortsatt holder penselen med netthinnen, bruker du en overføringspipette til å plassere en dråpe aCSF i midten av MCE-filterpapiret (figur 3C, høyre). Flyt netthinnen inn i dråpen av aCSF skapt av overflatespenningen. Bruk pensler til å plassere netthinnen RGC-siden opp i dråpen og til å brette ut de fire kronbladene.
  4. Når den er plassert, lager du en vannbro mellom penselen og hvitt filterpapir for å bryte overflatespenningen på dråpen.
    MERK: Når aCSF er ondt unna, vil netthinnen feste seg til MCE-filterpapiret (figur 3D,E). Flatmonterte netthinner kan håndteres ved å gripe MCE-platen med tang. Hvis aCSF-dråpen raskt transporterer bort før den danner en vannbro, kan dette tyde på at MCE-membranen ikke lades. Bruk en fersk MCE-membran, og minimer tiden mellom enuklering og avbildning ved å dissekere og flatmontering av netthinner umiddelbart før du flytter netthinner inn i bildekammeret.

Figure 3
Figur 3: Retinal disseksjon og flatmontering på blandede cellulosesterfiltermembraner. (A) Venstre, et enuklet øye stabiliseres ved å gripe synsnerven med Dumont #5 tang (venstre). Et lite hull opprettes i midten av hornhinnen ved hjelp av en 30 G nål (midten). Mikro-disseksjon saks brukes til å kutte hornhinnen i 4 like klaffer (høyre). Skalastang = 1 mm. (B) Dissekert netthinne med sclera skrelt av med to Dumont #5 tang (venstre) og med linsen fjernet (midten). Retina med 4 like kutt halvveis inn i netthinnen (høyre). Skalastang = 1 mm. (C) Håndtering av netthinnen med to fine pensler (størrelse 3/0, venstre). Retina flippet med retinal ganglion celler side ned på en pensel (midten) og løftet ut av aCSF, sørg for at vannspenningen ikke rive netthinnen (høyre). Skalastang = 2 mm. (D) Grå MCE-membranskive plassert på et hvitt filterpapir (venstre). En dråpe aCSF på MCE-platen (høyre). Skalastang = 1 cm. (E) Etter å ha flytende netthinnene i dråpen og plassert dem, lag en vannbro med det hvite filterpapiret for å transportere aCSF, trekke netthinnen på det ladede MCE-papiret (venstre); skala bar = 1 cm. Zoomet bilde av MCE membranen (rød) viser 2 netthinner montert med retinal ganglion celler side opp (høyre); skalastang = 2 mm. En netthinne er skissert i hvitt. Forkortelser: MCE = blandet cellulose ester; aCSF = kunstig cerebrospinalvæske. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Tidsforløp konfektavbildning av levende helmonterte netthinnepreparater

  1. Monter live-imaging inkubasjonskammeret for et oppreist konfikalt mikroskop som vist i figur 4.
    MERK: For inverterte konfektsystemer plasseres flatfester RGC-siden rett ned på glassbunndekslene på inkubasjonskammeret. Når netthinnene kommer i kontakt med dekslene, kan de ikke flyttes.
  2. Fyll kammeret med oksygenert aCSF, og slå på pumpen og temperaturregulatoren (temperatur 32-34 °C, strømningshastighet 1 ml/min). Ikke la temperaturen stige over 34 °C.
  3. For å overføre retinal flat-mount til perfusjonskammeret, stopp pumpen, og fjern aCSF som er i kammeret. Plasser MCE-platen med retinal flatbraketten i (tomt) inkubasjonskammeret.
  4. Plasser en prøvevekt på den flate braketten. for-våt vekten for å bryte overflatespenningen. Fyll kammeret med den oppvarmede aCSF, og sirkulere aCSF ved ~1 ml/min.
  5. Plasser nesestykket med det 25x vanndippingsmålet (numerisk blenderåpning 0,95) i bildekammeret. Skjerm for merkede celler av interesse ved hjelp av epifluorescerende lys (figur 4C).
  6. Juster bildevolumet for å fange opp dendrittiske egenskaper av interesse.
    MERK: Denne studien fanget den komplette dendritiske arbor på 1024 x 1024 piksler per ramme, z-trinn 1 μm og en bildefrekvens på 2 min mellom hver z-stack. Endelige bildestørrelser er ~100 μm x 100 μm x 20 μm.
  7. Hvis du vil justere laserkraften til en optimal innstilling, bruker du en oppslagstabell som identifiserer både overmettede og undermettede bildepunkter. Under skanningen justerer du laserkraften slik at ingen piksler er overmettet (dvs. med en intensitet på 255 eller høyere). Fortsett avbildningen så lenge som nødvendig, eller til det er en betydelig og påviselig nedgang i fluorescerende signal og økning i støy (vanligvis 2-4 t).
    MERK: Redusert laserkraft anbefales ettersom dekonvolusjonsalgoritmer fungerer optimalt når piksler fordeles over hele det dynamiske området. Pikselintensiteten må ikke overstige 254. empiriske analyser av nevritter viste at pikselverdier under 170 er ideelle for dekonvolusjon. Raske skannehastigheter (400-600 Hz) med linjegjennomsnitt (2-3) er å foretrekke fremfor enkle, langsommere skanninger av samme totale pikselboetid. Området med langvarig bildebehandling fotobleaches ofte, men andre explant seksjoner forblir levedyktige. Flere regioner i en flat montering kan avbildes, hver i 2-4 timer, med en total inkubasjonstid på 6 timer. Bildebehandlingsøkter over 6 timer er ikke systematisk testet. Neurittforringelse og blebbing er tegn på at explant levedyktigheten er avtagende.
  8. Etter avbildning, fest retinal flat-mounts og membranfilter med kaldt 4% paraformaldehyd i 1-2 timer ved 4 °C. Forsterk fluorescerende etiketter i de faste netthinnene ved immunhiistokjemi for videre analyser.
    MERK: Etteravbildningsfiksering er ikke mulig når du bruker en invertert konfekt; netthinner er ikke flyttbare uten å ødelegge vevet.

Figure 4
Figur 4: Oppsett av levende celleavbildning inkubasjonskammer. (A) Live-imaging inkubasjonsapparat som viser varme-, løsnings- og bildekomponenter. Dobbel varmeapparat inkluderer en oppvarmet inkubasjonskammerplattform (baksirkel med blå kontaktelektroder) og en in-line løsningsbereder. (B) Skjematisk diagram over 4A. Retinal flatfeste (rød) på MCE-membran (grå) er plassert i inkubasjonskammeret. Den in-line løsningsvarmeren er koblet til en løsningspumpe (ikke avbildet i 4A). Bildekammerdimensjoner gir et godt arbeidsområde for dyppet objektiv nese. (C) 25x syn en retinal explant injisert med 0,23-0,45 μL av 4 × 1012 GC/ml AAV fortynning; skala bar = 100 μm. Tett merking av celler omgir ofte synsnervehodet (stiplet linje, nederst til høyre); skala bar = 50 μm. Forkortelser: MCE = blandet cellulose ester; GC = genomkopier; mCherry = monomerisk kirsebær; eYFP = forbedret gult fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Bildedekonvolusjon og etterbehandling i ImageJ

  1. Importer bildeserien, del serien etter tid og farge hvis det er et flerfarget bilde. Kontroller at alle tidspoeng for én farge finnes i samme mappe.
    MERK: Import bio-formater hvis du bruker ImageJ (Bio-formater er automatisk inkludert i FIJI).
  2. Lag en teoretisk punktspredningsfunksjon (PSF) ved hjelp av ImageJ-plugin, Diffraksjon PSF 3D.
    MERK: Hver bildekanal krever sin egen PSF da fluorescerende proteinutslippsbølgelengde påvirker PSF.
  3. Bruk plugins | Makroer | Kjør for å utføre satsvis parallell iterativ dekonvolusjon for alle tidspunkter ved hjelp av den medfølgende makroen (tilleggsfil 1).
    MERK: Denne makroen kjører 25 gjentakelser av Wiener Filter Preconditioned Landweber (WPL) iterativ algoritme. Hver fargekanal må dekonvolvert separat.
  4. Slå sammen fargekanalene, og kompiler alle tidspunkter til en hyperstakk (bilde | Hyperstakker | Stabler til Hyperstack). Korriger 3D-driften ved hjelp av plugins-| Registrering | Riktig 3D Drift.
  5. Returnere bildet til en vanlig stakk (bilde | Hyperstakker | Hyperstakken som skal stables), og del tidspunktene (bilde- | Stabler | Verktøy | Stakksplitter). Bruk satsvis behandling til å opprette maksimal projeksjon for alle tidspoeng (prosess- | Satsvis | Makro | kjør("Z-prosjekt...", "projeksjon=[Maksimal intensitet]"); ).
  6. Importere bildesekvensen for tidsforløp (fil | Importere | Bildesekvens). Bruk konvensjonelle ImageJ-verktøy for ønsket analyse av dekonvolvert og postbehandlet todimensjonal (2D) video.
    MERK: Firedimensjonale (3D + tid) dekonvolverte og driftkorrigerte videoer kan sees på som en hyperstakk. Utelat det forrige trinnet for å opprettholde 3D-tidspunkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av protokollen ovenfor ble en høyoppløselig 3D-video av å utvikle stjerneskuddcelle dendritter anskaffet, dekonvolvert og korrigert for 3D-drift. Z-plane maksimale projeksjoner ble produsert for å lage 2D-videoer for analyse (Supplementary Video 1, Figur 5A). 3D-dekonvolusjon av hvert tidspunkt økte oppløsningen av fine filopodiaprojeksjoner (figur 5B, C). Fine filopodia fremspring er en funksjon av å utvikle retinal dendritter36 og bør være synlig under avbildning. AAV-transfeksjon vil gi variasjon i cellemerkingstetthet og fluorescensintensitet. Dermed kan du screene det merkede vevet for å velge celler med høye fluorescerende signaler for avbildning og produksjon av videoer av høy kvalitet. Det anbefales ikke å øke laserkraften for å oppdage svakt merkede celler, da det kan føre til rask fotobleaching og introdusere høy støy sammenlignet med signalet. Tilstrekkelig lyse celler er synlige innen 5 dpi. Ved 12 ppt og utover fører langvarige AAV-infeksjonsperioder ikke nødvendigvis til økt fluorescens av merkede celler (figur 5D).

Overdreven fluorescens og nevritt trengsel fra tett cellemerking påvirker bildekvaliteten og kan hindre encellede rekonstruksjoner. Optimalisering av AAV-fortynning og volum er nødvendig for å oppnå ønsket grad av isolerte og fluorescerende merkede arbors som er separerbare fra resten av målcellepopulasjonen. Her ble 9,2 × 108-1,8 × 109 virale GCer injisert per øye for å målrette stjerneskudd amacrine celler (0,23-0,45 μL AAV med en 4 × 1012 GC / ml titer). Fraværet av et fluorescerende signal kan gjenspeile en ineffektiv injeksjonsteknikk. Under injisering indikerer lekkasje av den blå AAV-oppløsningen fra injeksjonsstedet at viruset ikke leveres til netthinnen, eller at injeksjonsvolumet eller trykket er for høyt. Overflødig injeksjonsvolum eller trykk kan forårsake netthinneavløsning og/eller tap av okulært trykk, skade netthinnecellene og redusere cellemerkingseffektiviteten. Begge problemene kan løses med praksis og optimalisering av injeksjonsteknikken. Andre potensielle årsaker til mangel på signal inkluderer nedbrytning av AAVene fra feil lagring eller utilstrekkelig Cre-uttrykk fordi Cre-transgene ikke er aktiv i løpet av AAV-transfeksjonen.

Når videoer er dekonvolvert, kan dynamiske analyser, for eksempel beregning av graden av grentillegg, tilbaketrekning eller stabilisering, utføres. I tillegg kan konvensjonell statisk analyse utføres på hver tidsramme, inkludert nevronrekonstruksjon og morfometriske kvantifiseringer som total grenlengde, grenvinkler, grenrekkefølge eller antall terminalgrenpunkter. Resultatet av denne protokollen er en tidsserie med 3D-bildestakker med høy oppløsning. De fleste dynamiske 3D-nevrittvideoer kvantifiseres manuelt som en maksimal projeksjon ved hjelp av en bildevisualiseringsprogramvare med åpen kildekode, for eksempel ImageJ37. Et annet åpen kildekodeverktøy, Vaa3D38, er utviklet spesielt for visualisering av store volumer. Hvis videoer skal analyseres i 3D, anbefales bruk av en 3D + tidsvisualiserer som Vaa3D. ImageJ og Vaa3D gir direkte tilgang til pikslene eller voxels i bildet, men ofte opprettes nevronrekonstruksjoner ved å konvertere pikseldata til skjelettiserte trerekonstruksjoner. Automatiske eller halvautomatiske nevronrekonstruksjoner for enkelttidspunkter kan utføres med åpen kildekode39,40,41 og proprietær programvare. For å analysere tidsforløprekonstruksjoner må hvert punkt på rekonstruksjonen være knyttet til forrige og påfølgende tidspunkter. Å justere komplekse dendrittiske morfologier over tid, som kan kodes med opptil 500 datapunkter, er fortsatt et utfordrende problem. Mange verktøy er tilgjengelige, med ulike styrker og begrensninger, og de må velges ut for å passe til analysene som trengs for studien.

Figure 5
Figur 5: Representative resultater etter neonatal intraokulær injeksjon, tidsforløpavbildning og dekonvolusjon. (A) Maksimal projeksjon av dekonvolvert tidsforløpavbildningsserie (h:min) av P6-stjerneskudd amacrinecelle 5 dager etter AAV-injeksjon. Fin filopodia dynamikk kan nå analyseres ved hjelp av konvensjonelle ImageJ verktøy. Et område med dendrittisk raffinement (rød boks) og et område med dendritisk utvekst (grønn boks) er uthevet. (B, C) Enkel P6 stjerneskudd amacrine celle merket med membran-merket eYFP 5 dager postAAV injeksjon (dpi) viser lyse encellet merking. Skalastenger for øvre paneler = 50 μm; skalastenger for nedre paneler = 25 μm. Før (A) og etter (B) dekonvolusjon med ImageJ. Innsett (rød) viser deblurring som følge av vellykket dekonvolusjon. (D) P6 starburst amacrine celle 5dpi (venstre) sammenlignet med P12 starburst celle 11 dpi viser lignende nivåer av fluorescerende protein uttrykk. Økende AAV inkubasjonstider øker ikke fluorescerende signal. Fluorescerende signaler avtar ikke med lengre AAV-infeksjonsperioder. Identiske parametere for anskaffelse og etterbehandling ble brukt på begge bildene. Økt grentykkelse og varicositeter observert ved P12 er normale egenskaper ved modning av stjerneskuddceller og ikke en merkings- eller bildeartefakt. Skalastenger = 10 μm. Forkortelser: AAV = adeno-assosiert virus; eYFP = forbedret gult fluorescerende protein; dpi = dager etter infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Hensyn til cre-linjevalg og fluorescerende proteinlokalisering.

(A-D) Levende P11 retinal ganglion celler avbildet på 9 dpi av BBV injisert i Vglut2-iRES-Cre knock-in mus, der Cre er selektivt uttrykt i RGC befolkningen. (A) JAM-B RGC identifisert ved sin karakteristiske asymmetriske morfologi24. (BD) Distinkte RGC-undertyper som er forskjellige i deres dendrit stratifiseringsmønstre. (E) Bilde av live P11 starburst amacrine celle biolistically transfected med cytosolic mCherry og fanget med spinnende disk confocal på 512 x 512 piksler. Den cytosoliske XFP fører til høyt fluorescenssignal i soma i forhold til de fine dendritiske fremspringene. Ute av fokus lys fra soma forårsaker høy bakgrunnsfluorescens ved avbildning av små proksimale projeksjoner (innsettes i rød boks ovenfor er vist nedenfor). (F) Bilde av live P11 starburst amacrine celle transfektert med membran-målrettet eYFP og fanget av konfokal laser skanning på 1024 x 1024 piksler. Legg merke til den fluorescerende membranringen rundt soma, det forbedrede signal-til-støy-forholdet og kvaliteten på de fine projeksjonene proksimale til soma som produseres av membranmålrettede fluorescerende proteiner (innsett). Skalastenger = 50 μm og for nedre paneler av E og F = 5 μm. Forkortelser: IRES = internt ribosome oppføringssted; BBV = Brainbow adeno-assosiert virus; Vglut2 = vesikulær glutamattransportør 2; XFP = noe fluorescerende protein; eYFP = forbedret gult fluorescerende protein; mCherry = monomerisk kirsebær; RGC = retinal ganglion celler; JAM-B = kryssadhesjonsmolekyl B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende video 1: Time-lapse video av P6 utvikle starburst amacrine dendrites, 5 dager postinjection. Video tid-trinn er 2 min. Dekonvolusjon og 3D-driftkorrigering ble brukt ved hjelp av ImageJ. Toppgule bokser uthever områder med utvekst, og den nedre boksen skisserer en region med forbigående filopodia-utvekst, selvkontakt og tilbaketrekning. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsfil 1: ImageJ-makro for satsvis parallell iterativ dekonvolusjon. Makroen kjører 25 gjentakelser av den iterative algoritmen Wiener Filter Preconditioned Landweber (WPL). Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne videoen demonstrerer en eksperimentell rørledning som bruker eksisterende genetiske verktøy for å bilde dendrite dynamikken i å utvikle retinal neuroner med konfiskert live-imaging. Også demonstrert er intraokulære injeksjoner av Cre-avhengige AAVs koding membran-målrettede fluorescerende proteiner i neonatal mus. Enkeltceller av genetisk målrettede populasjoner er sterkt merket så tidlig som 4-5 dpi. Retinal flat-mounts ble forberedt for standard bildekamre for å utføre live-celle konfølende avbildning. Denne metoden produserer tidsforløpvideoer med høy oppløsning av enkeltceller og deres fine projeksjoner. Små projeksjoner løses og kvantifiseres ved hjelp av dekonvolusjons- og etterbehandlingsalgoritmer som er tilgjengelige gjennom programvare med åpen kildekode, inkludert ImageJ, Vaa3D og ShuTu, samt lisensiert programvare tilgjengelig fra Imaris og MBF Bioscience. Siden denne rørledningen er modulær, kan hver protokollseksjon endres for å passe til målene for studien. Disse modulære elementene diskuteres nedenfor og inkluderer: 1) Cre-line utvalg, 2) valg av fluorescerende protein og viral konstruksjon, 3) genleveringsmetoder og 4) bildemetode.

Denne teknikken bruker Cre transgene linjer for genetisk tilgang til retinal celle subpopulations. Cre må være aktiv postnatalt og uttrykkes over cellepopulasjonen på injeksjonstidspunktet for å øke sannsynligheten for virusinfeksjon og cellemerking. I denne rapporten ble ChAT-Cre brukt til å målrette mot stjerneskudd amacrine celler, og Vglut2-Cre linjen ble brukt til å målrette utviklingen av RGCs42,43 (Figur 6). Cre-avhengig AAV-injeksjon i Vglut2-IRES-Cre knock-in mus merket en rekke RGCer, inkludert krysset vedheft molekyl B celle (Figur 6A) og bi-stratifiserte RGCer (Figur 6B, C). Alternativt kan nye design av AAVer med syntetiske promotorer som driver celletypespeifikt uttrykk eliminere behovet for Cre-transgene linjer44. Et annet hensyn for effektiv og lysmerking egnet for levende bildebehandling er minimumstiden som kreves for transfeksjon og uttrykk, som kan variere avhengig av AAV-serotypen, tropismen og titer45. I disse studiene, da AAV-mediert merking krever minst 4-5 dpi for XFP-uttrykk, er denne metoden ikke egnet for tilgang til tidlige postnatale tidspunkter. For å fange tidlige tidspunkter (f.eks. P0-P4), kan intraokulære injeksjoner utføres i utero hos embryonale dyr, som gjort for i utero elektroporasjon46. I denne gruppens studier av starburst dendrite utvikling, ble det første sparsomme rekombinasjonsmønsteret til ChAT-Cre utnyttet til å merke enkeltstjerner amacrine celler ved P0-P4 ved hjelp av en mus transgen Cre reporter, Rosa-mTmG27. Til slutt kan denne AAV-retinal injeksjonsprotokollen brukes til å merke voksne cellepopulasjoner, basert på bekreftelsen av utholdenheten til fluorescerende merking 3 måneder etter injeksjon uten skadelige effekter på starburstcellemorfologi34.

Denne rørledningen gir også fleksibilitet i valg av viral konstruksjon. For å fange opp dendritdynamikk kan en rekke fluorescerende reporterproteiner brukes, inkludert proteiner som lokaliserer til spesifikke subcellulære strukturer, interesseproteiner eller rapporterer funksjonelle endringer som aktindynamikk (f.eks. LifeAct) og kalsiumsignaler (f.eks. GCaMP). Alle kommersielt tilgjengelige eller klonede AAV-vektorer kan brukes, og online verktøy som fpbase.org bør refereres til for lysstyrke og fotostabilitet. Her ble Brainbow virale vektorer som koder fluorescerende proteiner med et H-Ras farnesylation CAAX-motiv brukt til membranlokalisering. Tidlig i protokollutvikling ble cytosolisk lokalisering av XPFer funnet å være ikke ideell for å studere fin nevrittmorfologi, med overmetning av signaler fra soma og dårlig merking av fine grener (figur 6E). Til sammenligning ble membranrettede fluorescerende proteiner vist å merke og løse fine dendrittiske fremspring (figur 6E,F). En annen vurdering er størrelsen, designen og kompleksiteten til viruskonstruksjonen, noe som kan påvirke uttrykkstiden. For eksempel ble AAV-CAG-FLEx-mClover3-CAAX generert, noe som uttrykker en XFP på en Cre-avhengig måte. Denne konstruksjonen har en enklere design, og resulterer i effektivt uttrykk med 4 dpi. Sammen gjør de forskjellige alternativene for Cre-linjer, AAV-design og fluorescerende proteinreportere som er allment tilgjengelige fra depoter (f.eks. JAX, Addgene og Viral Vector Cores) denne rørledningen tilpasningsdyktig til en rekke studier av celletyper og utviklingsfenomener i netthinnen.

Selv om denne protokollen beskriver intraokulære AAV-injeksjoner, er andre genleveringsmetoder tilgjengelige som plasmidelektroporasjon46 og biolistisk genlevering (f.eks. genepistol)7. Elektroporasjon krever bruk av elektrisk puls, og biolistisk genlevering krever eks vivo-inkubasjon av retinal explants. AAV-merking er mindre invasiv enn begge disse metodene og tillater akutte preparater av netthinne utviser like før avbildning. Sammenlignet med biolistisk genlevering (figur 6E,F), resulterte AAV-injeksjoner i forbedret vevs levedyktighet som var bedre egnet for kontinuerlig oppkjøp som trengs for å spore nevrittdynamikk. Med riktig teknikk utgjør AAV-merking lite eller ingen skade på netthinnen, som dømt av vevets helse på tidspunktet for disseksjonen. Intravitreale injeksjoner infiserer hovedsakelig celler i ganglioncellelaget og det indre kjernefysiske laget, som RGC og amacrine celler. Mange dusinvis av stjerneskudd amacrine celler er vanligvis merket, med økt tetthet av merkede celler rundt synsnerven hodet (Figur 4C). Men med alle tre transfeksjonsmetodene er optisk nerveavbrudd uunngåelig for å oppnå retinal explants og vil føre til RGC degenerasjon. Til tross for at synsnerven kuttet, rapporterer studier om levedyktige retinal explants fra en rekke virveldyrmodeller i 36 timer og opptil 6 dager.

Til slutt har nytten av konfektmikroskopi for å fange dendritdynamikk blitt demonstrert. Vanligvis strekker en bildeøkt seg over 2-4 timer, og avsluttes før vevsforringelse eller nevrittblebbing observeres. Bildebehandlingsøkter på opptil 6 timer er utført; Den øvre grensen er imidlertid ikke systematisk testet. Områder kan bli fotobleaching på grunn av langvarig bildebehandling, men celler i andre synsfelt i utvisningen forblir levedyktige for levende bildebehandling. Denne metoden kan også utvides til multifoton- eller lysarkmikroskopi til bildet nevronal morfologi i dypere lag og større volumer. Multifotonavbildning er utført for å studere nevrittdynamikk i musenett og er bedre egnet til å studere celler i dypere netthinne lamina (f.eks. horisontale eller fotoreseptorceller)49. Nylig ble live-cell lightsheet mikroskopi brukt til å fange retinal angiogenese50, og tilbyr en ny avenue for live-imaging av morfogenese i hele netthinnen. Live-cell lightsheet mikroskopi kan brukes til å studere nevral krets montering i større skalaer, for eksempel axon-dendrite målretting. Flerfarget levende bildebehandling er en annen anvendelse av denne rørledningen som kan brukes til å undersøke cellecelleinteraksjoner, for eksempel påvirkning av nærliggende celler på dendritutvikling eller andre utviklingsfenomener som flislegging av retinale celler inkludert RGC-undertyper1, mikroglia og astrocytter.

Avslutningsvis er et utfordrende aspekt ved utviklingsstudier å få tilgang på disse kritiske tidspunktene. Denne protokollen gir en metode for å visualisere morfogenese som oppstår under et bestemt temporalt vindu. Rørledningen kombinerer eksisterende verktøy og teknikker for å genetisk målrette cellepopulasjoner og uttrykke membran-målrettede fluorescerende proteiner. Akutte retinal flatmonterte preparater opprettholder levedyktighet og fluorescerende signaler for levende celle konfektavbildning over flere timer. Forbigående og dynamiske aspekter ved dendritutvikling er fanget opp i 3D-videoer og er etterbehandlet ved hjelp av programvare med åpen kildekode. Muligheten til å fange 3D-videoer med høy oppløsning er avgjørende for å undersøke dynamiske utviklingsprosesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Madison Gray for at du ga meg en hånd da jeg ikke hadde noen. Denne forskningen ble støttet av et NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), et sloanstipend i nevrovitenskap og en Canada Research Chair Tier 2 (til J.L.L). S. Ing-Esteves ble støttet av Vision Science Research Program og NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Addgene viral prep #45185-AAV9
Addgene viral prep #45186-AAV9
Dissection tools
Cellulose filter paper Whatman 1001-070
Dumont #5 fine forceps FST 11252-20 Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection
Dumont forceps VWR 82027-426
Fine Scissors FST 14058-09
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size Millipore HABG01 300
Petri Dish, 50 × 15 mm VWR 470313-352
Polyethylene disposable transfer pipette VWR 470225-034
Round tip paint brush, size 3/0 Conventional art supply store Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting
Surgical Scissors FST 14007-14
Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge FST 15000-08
Live-imaging incubation system
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' Warner Instruments 64-0755
Dual channel heater controller, Model TC-344C Warner Instruments 64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective Leica 15506374
Heater controller cable Warner Instruments CC-28
Large bath incubation chamber with slice support Warner Instruments RC-27L
MPII Mini-Peristaltic Pump Harvard Apparatus 70-2027
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) Warner Instruments PM-6D
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump Harvard Apparatus 55-4148
Sample anchor (Harps) Warner Instruments 64-0260 Sample anchor must be compatible with incubation chamber
Sloflo In-line Solution Heater Warner Instruments SF-28
Neonatal Injections
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle Hamilton Company 80314
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) BD PrecisionGlide 305106
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)  WPI World Precision Instruments TW100-4
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) Sigma-Aldrich V001229 
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF Penn Vector Core AV-9-PV2453 Addgene Plasmid #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP
1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF		 Penn Vector Core AV-9-PV2454 Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line The Jackson Laboratory 6410
Fast Green FCF Dye content ≥85 % Sigma-Aldrich F7252-25G
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 Sutter Instrument Co. P-97
Green tattoo paste Ketchum MFG Co 329A
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich 806552
Pneumatic PicoPump WPI World Precision Instruments PV-820
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2) AirGas X02OX95C2003102 Supplier may vary depending on region
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES, Free Acid Bio Basic HB0264
Hydrochloric acid solution, 1 N Sigma-Aldrich H9892
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670
pH-Test strips (6.0-7.7) VWR BDH35317.604
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Sodium chloride (NaCl) Bio Basic DB0483
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich RDD007
Software
ImageJ National Institutes of Health (NIH) Open source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
  2. Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synaptic specificity and retinal circuit formation. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental biology. 10 (1), 379 (2021).
  3. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  4. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52 (4), 609-621 (2006).
  5. Wong, W. T., Faulkner-Jones, B. E., Sanes, J. R., Wong, R. O. Rapid dendritic remodeling in the developing retina: dependence on neurotransmission and reciprocal regulation by Rac and Rho. The Journal of Neuroscience. 20 (13), 5024-5036 (2000).
  6. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nature Protocols. 5 (7), 1347-1352 (2010).
  7. Morgan, J. L., Wong, R. O. L. Ballistic labeling with fluorescent dyes and indicators. Current Protocols in Neuroscience. 43 (1), 1-10 (2008).
  8. Nickerson, P. E. B., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Developmental Biology. 13, 24 (2013).
  9. Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. L. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
  10. Coombs, J. L., Van Der List, D., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells during postnatal development. The Journal of Comparative Neurology. 503 (6), 803-814 (2007).
  11. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  12. Stacy, R. C., Wong, R. O. L. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 456 (2), 154-166 (2003).
  13. Kay, J. N., et al. Retinal ganglion cells with distinct directional preferences differ in molecular identity, structure, and central projections. The Journal of Neuroscience. 31 (21), 7753-7762 (2011).
  14. Liu, J., Sanes, J. R. Cellular and molecular analysis of dendritic morphogenesis in a retinal cell type that senses color contrast and ventral motion. The Journal of Neuroscience. 37 (50), 12247-12262 (2017).
  15. Diao, L., Sun, W., Deng, Q., He, S. Development of the mouse retina: emerging morphological diversity of the ganglion cells. Journal of Neurobiology. 61 (2), 236-249 (2004).
  16. Coombs, J., vander List, D., Wang, G. Y., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells. Neuroscience. 140 (1), 123-136 (2006).
  17. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  18. Sümbül, U., et al. A genetic and computational approach to structurally classify neuronal types. Nature Communications. 5, 3512 (2014).
  19. Lin, B., Masland, R. H. Populations of wide-field amacrine cells in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 499 (5), 797-809 (2006).
  20. Macneil, M. A., Heussy, J. K., Dacheux, R. F., Raviola, E., Masland, R. H. The shapes and numbers of amacrine cells: Matching of photofilled with Golgi-stained cells in the rabbit retina and comparison with other mammalian species. Journal of Comparative Neurology. 413 (2), 305-326 (1999).
  21. Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
  22. Jo, A., Xu, J., Deniz, S., Cherian, S., DeVries, S. H., Zhu, Y. Intersectional strategies for targeting amacrine and ganglion cell types in the mouse retina. Frontiers in Neural Circuits. 12, 66 (2018).
  23. Siegert, S., et al. Genetic address book for retinal cell types. Nature Neuroscience. 12 (9), 1197-1204 (2009).
  24. Kim, I. -J., Zhang, Y., Meister, M., Sanes, J. R. Laminar restriction of retinal ganglion cell dendrites and axons: subtype-specific developmental patterns revealed with transgenic markers. The Journal of Neuroscience. 30 (4), 1452-1462 (2010).
  25. Peng, Y. -R., Tran, N. M., Krishnaswamy, A., Kostadinov, D., Martersteck, E. M., Sanes, J. R. Satb1 regulates contactin 5 to pattern dendrites of a mammalian retinal ganglion cell. Neuron. 95 (4), 869-883 (2017).
  26. Duan, X., Krishnaswamy, A., Dela Huerta, I., Sanes, J. R. Type II cadherins guide assembly of a direction-selective retinal circuit. Cell. 158 (4), 793-807 (2014).
  27. Ray, T. A., et al. Formation of retinal direction-selective circuitry initiated by starburst amacrine cell homotypic contact. eLife. 7, 34241 (2018).
  28. Krishnaswamy, A., Yamagata, M., Duan, X., Hong, Y. K., Sanes, J. R. Sidekick 2 directs formation of a retinal circuit that detects differential motion. Nature. 524 (7566), 466-470 (2015).
  29. Caval-Holme, F., Zhang, Y., Feller, M. B. Gap junction coupling shapes the encoding of light in the developing retina. Current Biology. 29 (23), 4024-4035 (2019).
  30. Lucas, J. A., Schmidt, T. M. Cellular properties of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells during postnatal development. Neural Development. 14 (1), 8 (2019).
  31. Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. 10 (6), 540-547 (2013).
  32. Rossi, J., et al. Melanocortin-4 receptors expressed by cholinergic neurons regulate energy balance and glucose homeostasis. Cell Metabolism. 13 (2), 195-204 (2011).
  33. Lefebvre, J. L., Kostadinov, D., Chen, W. V., Maniatis, T., Sanes, J. R. Protocadherins mediate dendritic self-avoidance in the mammalian nervous system. Nature. 488 (7412), 517-521 (2012).
  34. Ing-Esteves, S., et al. Combinatorial effects of alpha- and gamma-protocadherins on neuronal survival and dendritic self-avoidance. The Journal of Neuroscience. 38 (11), 2713-2729 (2018).
  35. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. L. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (1), (2013).
  36. Ramoa, A. S., Campbell, G., Shatz, C. J. Transient morphological features of identified ganglion cells in living fetal and neonatal retina. Science. 237 (4814), 522-525 (1987).
  37. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  38. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
  39. Cuntz, H., Forstner, F., Borst, A., Häusser, M. One rule to grow them all: a general theory of neuronal branching and its practical application. PLoS Computational Biology. 6 (8), 1000877 (2010).
  40. Xiao, H., Peng, H. APP2: automatic tracing of 3D neuron morphology based on hierarchical pruning of a gray-weighted image distance-tree. Bioinformatics. 29 (11), 1448-1454 (2013).
  41. Nanda, S., et al. Design and implementation of multi-signal and time-varying neural reconstructions. Scientific data. 5, 170207 (2018).
  42. Sherry, D. M., Wang, M. M., Bates, J., Frishman, L. J. Expression of vesicular glutamate transporter 1 in the mouse retina reveals temporal ordering in development of rod vs. cone and ON vs. OFF circuits. The Journal of Comparative Neurology. 465 (4), 480-498 (2003).
  43. Johnson, J., et al. Vesicular neurotransmitter transporter expression in developing postnatal rodent retina: GABA and glycine precede glutamate. The Journal of Neuroscience. 23 (2), 518-529 (2003).
  44. Jüttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
  45. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  46. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (31), e1333 (2009).
  47. Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e190 (2007).
  48. Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. The Journal of Comparative Neurology. 476 (3), 254-266 (2004).
  49. Huckfeldt, R. M., et al. Transient neurites of retinal horizontal cells exhibit columnar tiling via homotypic interactions. Nature Neuroscience. 12 (1), 35-43 (2009).
  50. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779 (2020).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 169 Levende celleavbildning morfogenese dendritutvikling intravitreale injeksjoner Cre-Lox Adeno-assosiert virus dekonvolusjon stjerneskudd amacrine celler
Tidsforløpavbildning av nevronal arborisering ved hjelp av sparsom adeno-assosiert virusmerking av genetisk målrettede retinalcellepopulasjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ing-Esteves, S., Lefebvre, J. L.… More

Ing-Esteves, S., Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (169), e62308, doi:10.3791/62308 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter