Aquí, presentamos un método para investigar la morfogénesis de neuritas en explantes retinianos de ratón postnatales mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Describimos un enfoque para el etiquetado disperso y la adquisición de tipos de células retinianas y sus procesos finos utilizando vectores de virus adenoasociados recombinantes que expresan proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre.
Descubrir los mecanismos que modelan los cenadores dendríticos requiere métodos para visualizar, visualizar y analizar las dendritas durante el desarrollo. La retina de ratón es un potente sistema modelo para la investigación de mecanismos específicos del tipo celular de morfogénesis neuronal y conectividad. La organización y composición de los subtipos de retina están bien definidas, y las herramientas genéticas están disponibles para acceder a tipos específicos durante el desarrollo. Muchos tipos de células de la retina también restringen sus dendritas y / o axones a capas estrechas, lo que facilita las imágenes de lapso de tiempo. Los cultivos de explantes de retina de ratón son adecuados para la obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía confocal o multifotónica, pero faltan métodos optimizados para la dinámica de las dendritas de imágenes con resolución temporal y estructural. Aquí se presenta un método para etiquetar e visualizar escasamente el desarrollo de poblaciones específicas de retina marcadas por el sistema Cre-Lox. Los virus adenoasociados (AVA) disponibles comercialmente utilizados aquí expresaron proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre. La administración intraocular de AAV en ratones neonatales produce un marcado fluorescente de tipos de células objetivo a los 4-5 días después de la inyección (dpi). Las señales fluorescentes de membrana son detectables por imágenes confocales y resuelven estructuras y dinámicas de ramas finas. Los videos de alta calidad que abarcan de 2 a 4 h se adquieren a partir de imágenes de montajes planos de retina perfundidos con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado (aCSF). También se proporciona una tubería de postprocesamiento de imágenes para la deconvolución y la corrección de deriva tridimensional (3D). Este protocolo se puede utilizar para capturar varios comportamientos celulares en la retina intacta y para identificar nuevos factores que controlan la morfogénesis de la neurita. Muchas estrategias de desarrollo aprendidas en la retina serán relevantes para comprender la formación de circuitos neuronales en otras partes del sistema nervioso central.
Las dendritas de las neuronas de la retina forman patrones intrincados, pero específicos, que influyen en su función dentro de los circuitos neuronales. En la retina de los vertebrados, diversos tipos de células ganglionares retinianas (RGC) e interneuronas de células amacrinas tienen morfologías dendríticas únicas que difieren en tamaño del cenador, ubicación, longitud de la rama y densidad1. Durante el desarrollo postnatal, las RGC y las células amacrinas extienden procesos dendríticos exuberantes en un neuropil llamado capa plexiforme interna (IPL), donde reciben entradas de células bipolares que transmiten señales fotorreceptoras2. Según lo capturado por imágenes de lapso de tiempo de poblaciones retinianas marcadas fluorescentemente en larvas de pollitos o peces cebra, la morfogénesis de dendritas es altamente dinámica3,4,5. En cuestión de días, los cenadores dendríticos se expanden, remodelan y ramifican a subcapas estrechas de la IPL, donde hacen sinapsis con socios seleccionados. Los cenadores exhiben diferentes dinámicas estructurales a lo largo del desarrollo, con cambios en las tasas relativas de adición, retracción y estabilización de ramas. Las dendritas amacrinas y RGC también exhiben diferentes comportamientos de crecimiento y remodelación que podrían reflejar la arborización específica del tipo. Sin embargo, estos estudios rastrearon amplias poblaciones de amacrina o RGC y se centraron en la orientación laminar, que es solo un aspecto de la morfología.
Los mecanismos que producen la vasta diversidad morfológica observada a través de los subtipos de retina son poco conocidos. El objetivo de este grupo fue desarrollar un método para capturar la dinámica de las dendritas y la remodelación del cenador de subtipos retinianos definidos en ratones. La identificación de mecanismos específicos del tipo de célula de patrón de dendritas requiere métodos para visualizar y medir el comportamiento de las dendritas de las células de interés. Los cultivos organotípicos de retinas de ratón son adecuados para estudios de imágenes de células vivas que utilizan microscopía confocal o multifotónica. Las retinas en desarrollo se diseccionan y se montan en un explante plano que puede ser fotografiado durante varias horas en una cámara de grabación o cultivado durante unos días con efectos limitados en el circuito6,7. Las neuronas retinianas vivas pueden ser marcadas por una variedad de técnicas, incluyendo el llenado de tinte por electrodos, electroporación, entrega biolística de partículas recubiertas con colorantes lipofílicos o plásmidos que codifican proteínas fluorescentes (por ejemplo, Gene Gun), así como etiquetas celulares codificadas genéticamente7,8,9,10 . Sin embargo, estos enfoques son ineficientes para la dinámica de las dendritas por imágenes de subtipos específicos de retina. Por ejemplo, los métodos de llenado de colorantes son de bajo rendimiento y requieren aparatos de electrofisiología y etiquetas genéticas adicionales para dirigirse de manera confiable a las células de interés. Además, las fuertes señales de fluorescencia en el soma pueden oscurecer las dendritas cercanas.
Los métodos de administración de genes biolísticos pueden etiquetar simultáneamente docenas de células, pero los pasos que involucran la entrega de partículas a alta presión y la incubación nocturna de retina aislada pueden comprometer la fisiología celular y el crecimiento dendrítico. Este artículo propone que se pueden emplear herramientas genéticas recientes para capturar la dinámica temprana de las dendritas con el tipo de célula y la resolución estructural, dados los siguientes criterios experimentales. Primero, para resolver las ramas finas y los filopodios que dominan los cenadores en desarrollo, el método debe etiquetar las neuronas con proteínas brillantes y fluorescentes que llenan los procesos en todo el cenador. El etiquetado de fluorescencia no debe desvanecerse debido al fotoblanqueo durante el período de obtención de imágenes. Se han generado y comparado una variedad de variantes de proteínas fluorescentes para la idoneidad de las imágenes in vivo/ex vivo11 basadas en el brillo y la fotoestabilidad. En segundo lugar, las proteínas fluorescentes (PFX) deben expresarse en niveles suficientemente altos en la etapa más temprana de la morfogénesis de la dendrita, de modo que no se pierda la estrecha ventana de desarrollo. En los análisis de puntos de tiempo estáticos en la retina del ratón, el desarrollo de dendritas ocurre durante la primera semana postnatal e incluye fases de crecimiento, remodelación y estabilización10,12,13,14,15. En tercer lugar, el método debe conducir a un etiquetado selectivo o a una mayor probabilidad de etiquetado de la subpoblación neuronal de interés. En cuarto lugar, el etiquetado de la subpoblación objetivo debe ser lo suficientemente escaso como para que se pueda identificar y rastrear todo el cenador neuronal. Aunque los subtipos RGC y amacrina pueden distinguirse por sus características morfológicas maduras y patrones de estratificación de IPL16,17,18,19,20, el desafío es identificar subtipos durante el desarrollo basados en estructuras inmaduras. Esta tarea se ve facilitada por la expansión de herramientas transgénicas para etiquetar tipos específicos de células de la retina durante el desarrollo.
Las líneas de ratón transgénicos y knock-in en las que la expresión celular y temporal de proteínas fluorescentes o Cre está determinada por elementos reguladores de genes son ampliamente utilizadas para estudiar tipos de células retinianas13,21,22,23. Las observaciones clave sobre los patrones específicos de subtipo de desarrollo de dendritas provienen de estudios de retinas de ratones transgénicos en puntos de tiempo estáticos10,14,24,25. El sistema Cre-Lox, en particular, permite una exquisita manipulación genética y monitoreo de subtipos utilizando una variedad de reporteros, sensores y activadores optogenéticos dependientes de la recombinasa. Estas herramientas han llevado a descubrimientos de programas moleculares específicos de subtipos y propiedades funcionales que subyacen al ensamblaje del circuito retiniano26,27,28,29,30. Sin embargo, aún no se han aprovechado para estudiar la dinámica de las dendritas específicas del subtipo en la retina del ratón. El etiquetado de baja densidad se puede lograr combinando líneas de ratón Cre con transgenes introducidos por electroporación o por AAV recombinantes. Si está disponible, también se pueden usar líneas de Cre inducibles por tamoxifeno o estrategias genéticas interseccionales. Finalmente, la célula debe ser etiquetada de una manera mínimamente invasiva y fotografiada utilizando parámetros de adquisición para no comprometer el tejido o interferir con la función celular requerida para la morfogénesis de la dendrita.
Aquí se presenta un método para aplicar herramientas transgénicas y microscopía confocal para investigar la dinámica de las dendritas en explantes de retina de ratones vivos. Las líneas de ratón transgénico Cre se han combinado con vectores AAV que expresan proteínas fluorescentes tras la recombinación de Cre, lo que permite un etiquetado escaso de las células de la retina de interés. Los AAV disponibles comercialmente se administran a la retina neonatal mediante inyecciones intravítreas. Este artículo demuestra que los AAV producen una expresión fluorescente significativamente alta y específica del tipo celular en 4 dpi, lo que permite el acceso a los puntos de tiempo postnatales. Para ilustrar este enfoque, la interneurona colinérgica “starburst” amacrina fue marcada mediante la administración de Brainbow AAV en ratones neonatales que expresan el transgén de colina acetiltransferasa (ChAT)-ribosoma interno (IRES)-Cre, que es activo en la retina postnatal temprana31,32. Las células amacrinas starburst desarrollan una morfología estereotipada y radial del cenador que está formada por la autoevitabilidad de las dendritas mediada por las protocadherinas agrupadas33,34. Este artículo muestra que la resolución de las dendritas y filopodias de estallido estelar se mejora significativamente mediante XFP a la membrana plasmática con la adición del motivo CAAX que sufre farnesilación, como se utiliza para los AAV de Brainbow31. Finalmente, se han determinado los protocolos de imágenes de lapso de tiempo y post-procesamiento que producen imágenes de alta calidad susceptibles de reconstrucción de dendritas y cuantificación morfométrica. Este protocolo se puede utilizar para identificar factores que controlan la morfogénesis de las dendritas y para capturar varios comportamientos celulares en la retina intacta.
Este video muestra una tubería experimental que utiliza las herramientas genéticas existentes para obtener imágenes de la dinámica de las dendritas del desarrollo de las neuronas de la retina con imágenes en vivo confocales. También se han demostrado las inyecciones intraoculares de AAV dependientes de Cre que codifican proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana en ratones neonatales. Las células individuales de poblaciones genéticamente dirigidas están brillantemente etiquetadas tan pronto como 4-5 dpi. S…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Madison Gray por darme una mano cuando no tenía ninguna. Esta investigación fue apoyada por una beca de descubrimiento de NSERC (RGPIN-2016-06128), una beca Sloan en neurociencia y una cátedra de investigación de Canadá Nivel 2 (a J.L.L). S. Ing-Esteves fue apoyado por el Programa de Investigación de Ciencias de la Visión y las Becas de Postgrado-Doctorado de NSERC.
Addgene viral prep #45185-AAV9 | |||
Addgene viral prep #45186-AAV9 | |||
Dissection tools | |||
Cellulose filter paper | Whatman | 1001-070 | |
Dumont #5 fine forceps | FST | 11252-20 | Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection |
Dumont forceps | VWR | 82027-426 | |
Fine Scissors | FST | 14058-09 | |
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size | Millipore | HABG01 300 | |
Petri Dish, 50 × 15 mm | VWR | 470313-352 | |
Polyethylene disposable transfer pipette | VWR | 470225-034 | |
Round tip paint brush, size 3/0 | Conventional art supply store | Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting | |
Surgical Scissors | FST | 14007-14 | |
Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
Live-imaging incubation system | |||
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' | Warner Instruments | 64-0755 | |
Dual channel heater controller, Model TC-344C | Warner Instruments | 64-2401 | |
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective | Leica | 15506374 | |
Heater controller cable | Warner Instruments | CC-28 | |
Large bath incubation chamber with slice support | Warner Instruments | RC-27L | |
MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) | Warner Instruments | PM-6D | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Sample anchor (Harps) | Warner Instruments | 64-0260 | Sample anchor must be compatible with incubation chamber |
Sloflo In-line Solution Heater | Warner Instruments | SF-28 | |
Neonatal Injections | |||
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle | Hamilton Company | 80314 | |
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm) | WPI World Precision Instruments | TW100-4 | |
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) | Sigma-Aldrich | V001229 | |
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF | Penn Vector Core | AV-9-PV2453 | Addgene Plasmid #45185 |
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF |
Penn Vector Core | AV-9-PV2454 | Addgene Plasmid #45186 |
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line | The Jackson Laboratory | 6410 | |
Fast Green FCF Dye content ≥85 % | Sigma-Aldrich | F7252-25G | |
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Green tattoo paste | Ketchum MFG Co | 329A | |
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | 806552 | |
Pneumatic PicoPump | WPI World Precision Instruments | PV-820 | |
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents | |||
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Carbogen (5% CO2, 95% O2) | AirGas | X02OX95C2003102 | Supplier may vary depending on region |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HEPES, Free Acid | Bio Basic | HB0264 | |
Hydrochloric acid solution, 1 N | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
pH-Test strips (6.0-7.7) | VWR | BDH35317.604 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
Software | |||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Open source |