Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Анализ HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификация HLA-DR-ограниченных CD4 Т-клеточных эпитопов на основе пептидной матрицы

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/62387
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

Summary

Основываясь на пептидной матрице, полученной из вируса гепатита В (HBV), HBV-специфические CD4 Т-клеточные ответы могут быть оценены параллельно с идентификацией HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов.

Abstract

CD4 Т-клетки играют важную роль в патогенезе хронического гепатита В. Как универсальная клеточная популяция, CD4 Т-клетки были классифицированы как отдельные функциональные подмножества на основе цитокинов, которые они секретировали: например, IFN-γ для CD4 T-хелперных клеток 1, IL-4 и IL-13 для CD4 T-хелперных клеток 2, IL-21 для CD4 T фолликулярных хелперных клеток и IL-17 для CD4 T хелперов 17 клеток. Анализ специфических CD4 Т-клеток вируса гепатита В (HBV) на основе секреции цитокинов после стимуляции пептидов, полученных из HBV, может предоставить информацию не только о величине HBV-специфического ответа CD4 T-клеток, но и о функциональных подмножествах HBV-специфических CD4 Т-клеток. Новые подходы, такие как транскриптомика и метаболомический анализ, могут предоставить более подробную функциональную информацию о HBV-специфических CD4 Т-клетках. Эти подходы обычно требуют выделения жизнеспособных HBV-специфических CD4 Т-клеток на основе пептидно-основных мультимеров гистосовместимости комплекса II, в то время как в настоящее время информация об HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопах ограничена. На основе пептидной матрицы, полученной из HBV, был разработан метод для оценки HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификации HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов одновременно с использованием образцов мононуклеарных клеток периферической крови у пациентов с хронической инфекцией HBV.

Introduction

В настоящее время существует 3 основных подхода к анализу антиген-специфических Т-клеток. Первый подход основан на взаимодействии между Т-клеточным рецептором и пептидом (эпитопом). Антиген-специфические Т-клетки могут быть непосредственно окрашены мультимерами пептидно-большого комплекса гистосовместимости (MHC). Преимущество этого метода заключается в том, что он может получить жизнеспособные антиген-специфические Т-клетки, подходящие для последующего анализа транскриптомики / метаболомики. Ограничение этого метода заключается в том, что он не может предоставить информацию о реакции всей Т-клетки на специфический антиген, поскольку он требует проверенных эпитопных пептидов, в то время как количество идентифицированных эпитопов для конкретного антигена на данный момент ограничено. По сравнению с cd8-клеточными эпитопами CD8,специфичными для вируса гепатита В (HBV), было идентифицировано меньше HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов1,2,что сделало этот метод менее применимым для анализа HBV-специфических CD4 Т-клеток в настоящее время.

Второй подход основан на апрегуляции серии индуцированных активацией маркеров после стимуляции антигеннымпептидом 3. Обычно используемые маркеры включают CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Этот метод в настоящее время используется для анализа антиген-специфических Т-клеточных ответов у вакцинированных лиц5,6,пациентов с вирусной инфекцией иммунодефицита человека7и тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 с инфекцией8,9. В отличие от мультимерного анализа на основе пептида-MHC, этот метод не ограничен валидируемыми эпитопами и может получить жизнеспособные клетки для последующего анализа. Ограничением этого метода является то, что он не может предоставить информацию о цитокиновом профиле антиген-специфических Т-клеток. Кроме того, экспрессия этих маркеров, индуцированных активацией, некоторыми активированными антиген-неспецифическими клетками может способствовать фоновым сигналам в анализе, что может быть проблемой, особенно когда целевые антиген-специфические Т-клетки редки. В настоящее время применение этого метода на HBV-специфических CD4 Т-клетках4ограничено. Может ли этот метод быть использован для надежного анализа HBV-специфических CD4 Т-клеток, требует дальнейшего изучения.

Третий подход основан на секреции цитокинов после стимуляции антигенным пептидом. Как и анализ на основе маркеров, индуцированный активацией, этот метод не ограничен валидированными эпитопами. Этот метод может непосредственно выявить цитокиновый профиль антиген-специфических Т-клеток. Чувствительность этого метода ниже, чем метода, индуцированного активацией маркера, поскольку он опирается на секрецию цитокинов антиген-специфических Т-клеток, а количество тестируемых цитокинов обычно ограничено. В настоящее время этот метод широко используется при анализе HBV-специфических Т-клеток. Поскольку цитокины, секретируемые HBV-специфическими Т-клетками, вряд ли могут быть обнаружены путем прямой пептидной стимуляции ex vivo10,11,цитокиновый профиль HBV-специфических Т-клеток обычно анализируется после 10-дневного ин-витида in vitro, стимулированного расширением12,13,14,15,16. Расположение пептидных пулов в матричной форме было использовано для облегчения идентификации антиген-специфических эпитопов17,18. С комбинацией пептидной матрицы и анализа цитокиновой секреции был разработан метод оценки HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификации HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов одновременно16. В этом протоколе подробно описаны данные метода. Основной антиген HBV выбран в качестве примера демонстрации в этом протоколе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Письменное информированное согласие было получено от каждого пациента, включенного в исследование. Протокол исследования соответствует этическим принципам Хельсинкской декларации 1975 года, что отражено в априорном одобрении комитетом по медицинской этике Юго-Западной больницы.

1. Проектирование пептидной матрицы, полученной из HBV

  1. Загрузите аминокислотные последовательности основного антигена HBV из баз данных NCBI (GenBank: AFY98989.1).
  2. Приобретите пептиды, полученные из основного антигена HBV (панель из 35 15-мерных пептидов, перекрывающихся 10 остатками, чистота > 90%, 4 мг / пептид) у поставщика услуг по синтезу пептидов.
  3. Установите квадратную пептидную матрицу 6×6 с каждым положением в матрице, содержащей только 1 пептид. Имеется 12 пептидных пулов: 6 рядных пептидных бассейнов и 6 колонных пептидных бассейнов, по 5-6 пептидов в каждомпуле по 16. Рядные пептидные пулы и колонные пептидные пулы в матрице представляют собой 2 отдельных образования основного антигена HBV.
  4. Для 3/4 приобретенных пептидов смешайте пептиды в одном ряду/столбце матрицы в 12 отдельных пулов пептидов, растворив их вместе в диметилсульфоксиде (ДМСО) (2 мкг/мкл для каждого пептида). Хранить при -80 °C для анализа HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций.
  5. Остальные пептиды растворяют отдельно (10 мкг/мкл) и хранят при -80 °C для идентификации эпитопа.

2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (ПБМК)

  1. Забор 5 мл венозной крови у пациентов с хронической инфекцией HBV.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем крови должен быть приблизительно оценен в соответствии с количеством пептидных пулов плюс 1 фоновый контроль и 1 положительный контроль. Для анализа 1 пептидного пула необходимо 3 х 105 МПК. В среднем, 1 х10 6 PBMCs могут быть получены из 1 мл крови.
  2. Изолируйте НБМК из крови с помощью центрифугирования градиента плотности Фиколла (800 × г, 20 мин) и криоконсервируйте изолированные МПК в жидком азоте для последующего использования.
  3. Используйте пипетку Пастера для сбора гранулоцитов между прозрачным слоем Фиколла и слоем эритроцитов. Извлеките геномную ДНК из гранулоцитов с помощью набора для очистки геномной ДНК в соответствии с протоколом производителя.
  4. Отправьте образец ДНК поставщикам услуг генотипирования для определения генотипа HLA-DRB1.

3. Расширение PBMC in vitro с использованием пептидной матрицы HBV

  1. Оттаивать НБМК.
    1. Теплый RPMI 1640 дополнен 1:10 000 бензоназой (25 Ед/мл) до 37 °C на водяной бане.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бензоназа помогает ограничить слипание клеток во время оттаивания. Для каждого образца потребуется 20 мл RPMI 1640 с бензоназой. Рассчитайте количество, необходимое для размораживания всех образцов, и подготовьте отдельную аликвоту среды (37 °C) с 1:10 000 бензоназой (25 Ед/мл). Размораживать не более 5 образцов за один раз.
    2. Извлеките образцы из жидкого азота и быстро разморозите замороженные флаконы на водяной бане (37 °C).
    3. Перенесите размороженный клеточный суспензию в центрифужную трубку 15 мл. Добавьте 1 мл бензоназы RPMI 1640 (37 °C) по каплям в пробирку. Медленно добавьте 6 мл бензоназы RPMI 1640 (37 °C) в трубку центрифуги, промыть криовиал еще 2 мл бензоназы RPMI 1640 (37 °C), чтобы извлечь все клетки. Продолжайте работу с остальными образцами как можно быстрее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Медленное разбавление криоконсервированных образцов является ключом к поддержанию жизнеспособности размороженных клеток.
    4. Центрифуга (400 × г, 10 мин), удалите супернатант и ослабьте гранулу, постукивая по трубке.
    5. Аккуратно повторно суспендируйте гранулы в 1 мл теплой бензоназы RPMI 1640. Осторожно перемешайте и фильтруйте клетки через 70-мкм клеточный сетчатый фильтр, если это необходимо (т. Е. Если есть какой-либо видимый сгусток).
    6. Aliquot 10 мкл суспензии и разбавить в фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco (DPBS), добавить трипан синий (0,04%), загрузить на гемоцитометр, подождать 1 мин и подсчитать количество жизнеспособных клеток (прозрачных клеток).
    7. Добавьте 9 мл бензоназы RPMI 1640 (37 °C) в трубку, центрифугу (400 × г, 10 мин), удалите супернатант и ослабьте гранулу, постукивая по трубке.
  2. Повторное суспендирование PBMCs в RPMI 1640 с добавлением 25 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% сыворотки AB человека (полная культуральная среда). Отрегулируйте плотность ячеек до 1,5 x 106 ячеек/мл. Плитные НБМК в 96-скважинных плитах (с плоским дном) при плотности 3 х 105 ячеек/скважина.
  3. Добавьте пулы пептидов, полученных из HBV (2 мкг/мл на каждый отдельный пептид) в каждую скважину. Для скважин фонового контроля и положительного контроля добавляют одинаковое количество растворителя (ДМСО, 1 мкл/мл). Добавить 10 ЕД/мл ИЛ-2 и 10 нг/мл Ил-7. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2.
  4. На 3-й день добавляйте культуральная среда 50 Ед/мл ИЛ-2 и 10 нг/мл ИЛ-7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение дня с 1 по 3 день не будет наблюдаться явной пролиферации Т-клеток. Общее количество клеток обычно уменьшается на 1/3-1/2 из-за гибели не-Т-клеток, таких как В-клетки, NK-клетки, NKT-клетки и моноциты.
  5. На 7-й день заменить половину культуральной среды свежей средой, содержащей пептиды (4 мкг/мл), IL-2 (100 Ед/мл) и IL-7 (20 нг/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы не потревожить клетки внизу, пипетку около 90 мкл питательной среды осторожно от верхней части среды. В течение 3-7 дня будет наблюдаться устойчивая пролиферация Т-клеток, и пролиферация Т-клеток обычно агрегируется, образуя кластеры.
  6. На 10-й день осторожно пипетку культивируют клеточную культуру в каждой скважине 7-9 раз, чтобы дезагрегировать кластеры клеток, подсчитать количество жизнеспособных клеток и перенести 2×105 клеток в каждой скважине на пластину из 96 скважин (круглое дно) для hbV-специфического анализа ответа CD4 Т-клеток.
  7. Продолжить культивирование остальных клеток для идентификации эпитопа на 12-й день, скорректировать объем питательной среды до 100 мкл (выбросив избыточную среду) и дополнить культуру 100 мкл свежей полной культуральной среды, содержащей пептиды (4 мкг/мл), IL-2 (100 Ед/мл) и IL-7 (20 нг/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение дня с 7 по 10 день Т-клетки продолжают энергично размножаться. Замените питательную среду, как по состоянию на шаге 3.5, если среда желтеет. В целом, номер ячейки превысит 6×105 на 10 день. Каждая скважина обычно показывает одинаковое количество ячеек, подсчитывает номер ячейки в 3 скважинах и использует среднее значение в качестве оценки номера ячейки для всех скважин.

4. Анализ HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций внутриклеточной проточной цитометрией

  1. Стимуляция НБМК с помощью пептидных пулов
    1. Для клеток, перенесенных на плиту 96 скважин (круглое дно), промыть 3 раза в пластине (550 × г, 3 мин). Используйте 200 мкл среды для каждой стирки (RPMI 1640 для первых 2 промывок, полная питательная среда для последней промывки). Выбросьте супернатанты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление остаточных цитокинов в культуре путем повторной промывки может эффективно снизить фон при внутриклеточном проточном цитометрии.
    2. Для каждой скважины клеток, стимулируемых определенным пептидным пулом, добавляют 200 мкл полной питательной среды, дополненной теми же пулами пептидов (2 мкг/мл для каждого отдельного пептида). Для фонового контроля добавьте полную питательную среду, дополненную 1 мкл/мл ДМСО. Для хорошего контроля добавляют полную культурально-среду, дополненную 1 мкл/мл ДМСО, 150 нг/мл форбола 12-миристата 13-ацетата (ПМА) и 1 мкмоль/л иономицина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая доза ДМСО блокирует секрецию цитокинов Т-клеток (наиболее значимая для TNF-α). Доза ДМСО выше 5 мкл/мл не рекомендуется. Как правило, доза ДМСО в нашем эксперименте не превышает 1 мкл/мл.
    3. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 6 ч.
    4. После 1 ч инкубации добавляют в культуру Моненсин (1,37 мкг/мл).
  2. Проточная цитометрия
    1. Через 6 ч инкубации. Удалите супернатант после центрифугирования (550 × г, 3 мин), промыть ячейки один раз 200 мкл DPBS (550 × г, 3 мин), маркерами поверхности пятна (CD3, CD4 и CD8) и маркером жизнеспособности (с использованием fixable Viability Dye) в холодильнике с температурой 4 °C в течение 30 минут.
    2. Промыть однократно 200 мкл DPBS (550 × г, 3 мин). Фиксируют и проникают клетки, окрашивают внутриклеточные цитокины (TNF-α и IFN-γ) в холодильнике с 4 °C в течение 45 мин.
    3. После окончательной промывки во внутриклеточном окрашивание повторно суспендирует клетки в 150 мкл буфера проточной цитометрии (DPBS + 0,5% BSA).
    4. Получение данных проточной цитометрии на проточном цитометре.
  3. Анализ результатов проточной цитометрии
    1. Определение положительного ямки: считать скважину положительной, если она имеет частоту цитокинов, секретировывающих Т-клетки не менее чем в два раза от фоновой контрольной скважины(рисунок 1).
    2. Согласно следующей формуле, рассчитайте частоту ответа для каждого анализируемого цитокина(рисунок 2):
      Equation 1
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пул пептидов ряда и пулы пептидов столбцов в матрице представляют собой 2 различных образования основного антигена HBV, поэтому конечная скорость ответа должна быть разделена на 2.

5. Идентификация HBV-специфических HLA-DR ограниченных CD4 Т-клеточных эпитопов

  1. Оттаивать и поддерживать аллогенные линии В-лимфобластоидных клеток (БЛКЛ) в колбе Т-75 (5-20 ×106 клеток, 20 мл полной питательной среды).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы гарантировать хорошее состояние БЛКЛ, этот этап должен быть начат за 2 недели до размораживания PBMC пациентов. LCL должны быть гомозиготными в аллеле HLA-DRB1. Согласно результату генотипирования, пациенты должны иметь тот же аллель HLA-DRB1, что и LCL.
  2. Скрининг пептидов-кандидатов для идентификации (Рисунок 3)
    1. Согласно результатам скорости ответа Т-клеток на 10-й день, отсейте 2 пула пептидов с самой высокой скоростью ответа (1-рядный пептидный пул и 1-колонный пул пептидов).
    2. Установите пептид в эти 2 пула в качестве пептида-кандидата, если другой пул пептидов, содержащий этот пептид, также показывает положительный результат в анализе ответа Т-клеток. Используйте НБМК, расширенные с другим пулом пептидов, для идентификации эпитопов позже.
  3. Пульсирующая БЛКГ с пептидом
    1. На 12-й день подсчитывают количество жизнеспособных БЛКЛ, переносят клетки в 15 мл центрифужных трубок, центрифугу (350 × г, 10 мин) и удаляют супернатант. Повторно суспендировать клеточную гранулу в полной культуральной среде и аликвотные LCL на 96-скважинную пластину (круглое дно) при 4×104 клетках/скважине в 80 мкл полной культуральной среде.
    2. Добавляют один пептид (10 мкг/мл), инкубируют при 37 °C и 5% CO2 в течение 2 ч. Набор 2 фоновых контроля: пульсация пептида с блокировкой HLA-DR (предварительная обработка анти-HLA-DR (10 мкг/мл) в течение 1 ч); ДМСО (1 мкл/мл) пульсирует. Конечный объем полной питательной среды в каждой скважине составляет 100 мкл.
    3. Добавляют митомицин С (100 мкг/мл), инкубируют при 37 °C и 5%CO2 в течение 1 ч.
    4. Промыть 3 раза по 200 мкл RPMI 1640 (550 × г, 3 мин) в пластине для удаления непопульсного пептида и митомицина С. Для первой промывки дополнив инкубационную культуру 100 мкл RPMI 1640.
    5. Повторное суспендирование клеток в 120 мкл полной питательной среды.
  4. Стимуляция МПК с помощью пептидных импульсных БЛКЛ.
    1. На 12-й день перенесите НБМК на плиту из 96 скважин (круглое дно).
    2. Удаляют супернатант после центрифугирования (550 × г, 3 мин) в пластине, дважды промывая 200 мкл RPMI 1640 (550 × г, 3 мин) в тарелке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление остаточных цитокинов и пептидов в культуре путем повторной промывки является ключевым этапом для снижения фона при внутриклеточном проточном цитометрии. Особенно для остаточных пептидов он будет связываться с LCL и значительно увеличивать фон.
    3. Повторное суспендование НБМК в каждой скважине с 210 мкл полной питательной среды.
    4. Для скважины НБМК, выбранной для идентификации эпитопов, смешайте аликвоту (по 70 мкл каждая) с пептидными импульсными БЛКЛ (3 скважины, включая 2 фоновых контрольных).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На 12-й день количество пептидных пулов расширенных МПК обычно достигает более 5-7×105 на скважину, поэтому соотношение НБМК/БЛК составляет около 6/1 к 4/1.
    5. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 6 ч.
    6. После 1 ч инкубации добавляют в культуру Моненсин (1,37 мкг/мл). Конечный объем полной питательной среды в каждой скважине составляет 200 мкл.
  5. Проточная цитометрия
    1. Повторите те же операции, что и на шаге 4.2.
  6. Анализ результатов проточной цитометрии
    1. Проверить пептид как HLA-DR ограниченный CD4 Т-клетки эпитопа, если PBMCs, инкубированные с этим пептидом импульсными LCL, показывают частоту цитокинов, секретирующих CD4 Т-клетки, по крайней мере, в два раза превышающую частоту PBMCs, инкубированных с фоновыми контрольными элементами (пептид пульсирует с предварительной блокировкой HLA-DR; DMSO пульсирующая)(Рисунок 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Частота цитокинов, секретировывающих CD4 Т-клеток, рассчитывается как сумма как одиночных продуцентов, так и двойных продуцентов. Как показано на рисунке 1,частота TNF-α секретирования CD4 Т-клеток и частота IFN-γ секретирования CD4 Т-клеток в фоновом контроле (DMSO) составляют 0,154% и 0,013% соответственно. Частота TNF-α секретирования CD4 Т-клеток и частота IFN-γ секретирования CD4 Т-клеток, специфичных для пула пептидов Core11, составляют 0,206 и 0,017 соответственно, поэтому как TNF-α секретировка ОТВЕТА CD4 Т-клеток, так и IFN-γ секретировка CD4 Т-клеточного ответа для этого пула пептидов считаются отрицательными. Частота TNF-α секретирования CD4 Т-клеток и частота IFN-γ секретирования CD4 Т-клеток, специфичных для пула пептидов Core09, составляют 2,715% и 0,973% соответственно, поэтому как TNF-α секретировка CD4 Т-клеточного ответа, так и IFN-γ секретировка CD4 Т-клеточного ответа для этого пула пептидов считаются положительными.

Как показано на рисунке 2,положительные скважины обозначены серым фоном. При расчете частоты ответа CD4 T-клеток, специфичных α для ядра HBV, должны быть включены данные пулов пептидов Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 и Core10. При расчете частоты ответа CD4 Т-клеток, специфичных γ для ядра HBV, включается частота ответа Т-клеток CD4, данные пулов пептидов Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 и Core10.

Как показано на рисунке 3,пептиды-кандидаты для идентификации эпитопов обозначены красным цветом. Core01 имеет самую высокую частоту ответа как для TNF-α секретировки CD4 Т-клеток, так и для IFN-γ секретируя CD4 Т-клетки в пулах пептидов колонки. Пептиды C1-15, C31-45, C61-75 и C91-105 в этом пептидном пуле установлены в качестве пептидов-кандидатов, поскольку рядные пептидные пулы, содержащие эти пептиды, также показывают положительные результаты в ответе Т-клеток. НБМК, расширенные пулами пептидов Core07, Core08, Core09 и Core10, используются для эпитопной идентификации пептидов C1-15, C31-45, C61-75 и C91-105 соответственно. Core09 имеет самую высокую частоту ответа как для TNF-α секретируя CD4 Т-клетки, так и для IFN-γ секретируя CD4 Т-клетки в рядных пептидных пулах. Пептиды C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 и C86-100 в этом пептидном пуле установлены в качестве пептидов-кандидатов, поскольку пулы пептидов колонки, содержащие эти пептиды, также показывают положительный результат в ответе Т-клеток. НБМК, дополненные пулами пептидов Core01, Core02, Core03, Core04, Core05 и Core06, используются для эпитопной идентификации пептидов C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 и C86-100 соответственно.

Как показано на рисунке 4,для пептидного пула Core08 расширенных PBMCs, после стимуляции пептидом C31-45 импульсными LCL частота TNF-α секретирующих CD4 Т-клеток и частота IFN-γ секретирующих CD4 Т-клеток составляют 0,995% и 0,131% соответственно, что более чем в 2 раза выше, чем фоновые контрольные (пептид C31-45 импульсные LCL с предварительной блокировкой HLA-DR, DMSO импульсные LCL). Таким образом, пептид C31-45 проверен как HLA-DR ограниченный CD4 Т-клеточный эпитоп. Для пептидного пула Core10 расширенных PBMCs, после стимуляции пептидом C91-105 импульсными BLCL частота TNF-α секретирующих CD4 Т-клеток и частота IFN-γ секретирующих CD4 Т-клеток составляют 0,221% и 0,000% соответственно, что не превышает 2 раза фоновых контролей (пептид C91-45 импульсные BLCL с предварительной блокировкой HLA-DR, DMSO импульсные LCL), поэтому пептид C91-105 не проверен как HLA-DR ограниченный CD4 T-клеточный эпитоп.

Figure 1
Рисунок 1:Демонстрация проточной цитометрии TNF-α/IFN-γ секретирование CD4 Т-клеток в пептидных пулах расширенных PBMC после стимуляции их соответствующими пулами пептидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Демонстрация анализа HBV ядра специфических TNF-α/IFN-γ секретирование CD4 Т-клеток. TNF/DMSO и IFN-Ƴ/DMSO указывают на соотношения частот TNF-α/IFN-γ секретировки CD4 Т-клеток в каждой скважине пептидного пула стимулируемых PBMCs, разделенных на частоту TNF-α/IFN-γ секретировки CD4 Т-клеток в скважине контроля DMSO. Серый фон указывает на скважины с положительным ответом CD4 Т-клеток, о чем можно судить по сравнению с фоновым контролем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Демонстрация скрининга пептидов-кандидатов для идентификации эпитопов. TNF/DMSO и IFN-Ƴ/DMSO указывают на соотношения частот TNF-α/IFN-γ секретировки CD4 Т-клеток в каждой скважине пептидного пула стимулируемых PBMCs, разделенных на частоту TNF-α/IFN-γ секретировки CD4 Т-клеток в скважине контроля DMSO. Серый фон указывает на скважины с положительным ответом CD4 Т-клеток, о чем можно судить по сравнению с фоновым контролем. Пептиды красного цвета указывают на пептиды-кандидаты в соответствии с критериями скрининга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Демонстрация результатов идентификации эпитопов проточной цитометрией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наиболее важные шаги в этом протоколе перечислены следующим образом: 1) достаточное количество НБК высокой жизнеспособности для начала расширения НБК; 2) подходящая среда для расширения НБМК; и 3) полное удаление остаточных пептидных пулов в культуре PBMCs до идентификации эпитопа.

Весь анализ в этом протоколе зависит от надежной пролиферации CD4 Т-клеток. В целом, количество НБМК после 10-дневного расширения будет в 2-3 раза больше начального числа. Количество ячеек и жизнеспособность PBMC являются 2 ключевыми факторами расширения PBMC. Если цель состоит только в анализе HBV-специфических CD4 Т-клеток без идентификации эпитопа, разумно уменьшить исходное количество PBMCs, особенно когда объем образца крови ограничен. В то время как, по нашему опыту, успешное расширение НБМК едва ли может быть получено, если стартовое число НБМК ниже 1,5×105 ячеек / колодец. При использовании свежих НБМК для расширения жизнеспособность клеток не будет проблемой. В то время как при использовании криоконсервируемых НБМК для расширения криоконсервация и размораживание НБМК должны проводиться очень осторожно для поддержания жизнеспособности НБМК.

В функциональном анализе HBV-специфических Т-клеток IL-12 обычно используется при расширении НБМК для усиления функции CD8 Т-клеток. Поскольку IL-12 может индуцировать дифференцировку CD4 Т-клеток в сторону CD4 Т-фолликулярных хелперных клеток, этот цитокин следует избегать при функциональном анализе HBV-специфических CD4 Т-клеток. В нашем протоколе только IL-2 (для расширения Т-клеток) и IL-7 (для выживания Т-клеток) дополняются для поддержания функционального профиля HBV-специфических CD4 Т-клеток во время расширения как можно более неповрежденными. Мы протестировали 5 цитокинов для функционального анализа HBV-специфических CD4 Т-клеток: TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 и IL-21. В наших проанализированных образцах TNF-α и IFN-γ являются 2 основными цитокинами, секретируемыми HBV-специфическими CD4 Т-клетками16. При анализе функционального профиля HBV-специфических CD4 Т-клеток рекомендуется протестировать как можно больше цитокинов для получения подробной информации о функциональном профиле. В то время как при идентификации эпитопов рекомендуется анализировать только TNF-α и IFN-γ, для экономических соображений.

Достаточное количество HBV-специфических CD4 Т-клеток жизненно важно для успешной идентификации эпитопа, поэтому эпитопную идентификацию следует рассматривать у пациентов с высоким HBV-специфическим ответом CD4 Т-клеток, таких как пациенты с вспышкой гепатита В (сильный HBV-специфический TNF-α секретирующий CD4 Т-клеточный ответ) и пациенты с вирусным клиренсом (сильный HBV-специфический IFN-γ CD4 Т-клеточный ответ)16 . Очень важно удалить остаточные пептиды из пептидного пула расширенных МПК путем повторной промывки перед инкубацией этих клеток с LCL для идентификации эпитопов. Остаточные пептиды будут связываться с ДМСО импульсными БЛЦГ, активировать пептид-специфические CD4 Т-клетки, тем самым значительно увеличивая фон.

Некоторые антигены HBV имеют переменные последовательности в различных генотипах HBV (например, поверхностный антиген HBV). Решение состоит в том, чтобы предварительно определить специфические генотипы HBV у пациентов и разработать пулы пептидов, специфичные для генотипа HBV, для пациентов с различными генотипами HBV. Хотя генотип HBV неизмерим у пациентов с низкой вирусной нагрузкой HBV (например, у пациентов с отрицательным HBeAg с регулярным противовирусным лечением), в этом сценарии решение состоит в том, чтобы смешать пептиды из разных генотипов HBV вместе в одни и те же пептидные пулы, как мы сделали в предыдущем исследовании16. Недостатком этой стратегии смешения является то, что эпитоп может быть идентифицирован как пептидная пара, но не как один пептид, поскольку некоторые позиции в матрице пептидов содержат пептидную пару в том же фрагменте антигена.

Основным недостатком этого метода является трудоемкое 10-дневное расширение НБК. В настоящее время анализ ex vivo секреции цитокинов не может надежно обнаружить HBV-специфические CD4 Т-клетки. Использование пептидных импульсных аллогенных LCL в качестве стимуляторов обычно обнаруживало больше пептид-специфических CD4 Т-клеток в пептидных расширенных PBMCs, по сравнению с простым стимулированием пептидами16. Стоит изучить, может ли использование пептидных импульсных аутологичных В-клеток в качестве антигенных презентационных клеток помочь надежно обнаружить HBV-специфические CD4 Т-клетки ex vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81930061), Фондом естественных наук Чунцина (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) и Китайским ключом.
Специализированный проект по инфекционным заболеваниям (2018ZX10723203).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin Bovine V (BSA) Beyotime ST023
APC-conjugated Anti-human TNF-α eBioscience 17-7349-82 Keep protected from light
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Limit cell clumping
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09126 HLA-DRB1*0803 homozygote
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09121 HLA-DRB1*1202 homozygote
Cell Culture Flask (T75) Corning 430641
Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) Corning 3599 Flat bottom
Cell Culture Plate (96-well, round bottom) Corning 3799 Round bottom
Cell Strainer Corning CLS431751 Pore size 70 μm, white, sterile
Centrifuge Tube (15 mL) KIRGEN KG2611 Sterile
Centrifuge Tube (50 mL) Corning 430829 Sterile
Centrifuge, Refrigerated Eppendorf 5804R
Centrifuge, Refrigerated Thermo ST16R
Centrifuge, Refrigerated Thermo Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) BD Biosciences 562574 Prepare solution before use
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 Keep at room temperature to prevent crystallization
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave.
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-03
Filter Tips (0.5-10) Kirgen KG5131 Sterile
Filter Tips (100-1000) Kirgen KG5333 Sterile
Filter Tips (1-200) Kirgen KG5233 Sterile
FITC-conjugated Anti-human CD4 BioLegend 300506 Keep protected from light
Fixable Viability Dye eFluor780 eBioscience 65-0865-14 Keep protected from light
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD Biosciences 554724 Protein Transport Inhibitor
Haemocytometer Brand 718620
HBV Core Antigen Derived Peptides ChinaPeptides
HEPES Gibco 15630080 100 ml
Human Serum AB Gemini Bio-Products 100-51 100 ml
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
KCl Sangon Biotech A100395-0500
KH2PO4 Sangon Biotech A100781-0500
LSRFortessa Flow Cytometer BD
L-glutamine Gibco 25030081 100 ml
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Corning MCT-150-C Autoclaved sterilization before using
Microplate Shakers Scientific Industries MicroPlate Genie
Mitomycin C Roche 10107409001
Na2HPO4.7H2O Sangon Biotech A100348-0500
NaCl Sangon Biotech A100241-0500
PCR Tubes (0.2 mL) Kirgen KG2331
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 BioLegend 300914 Keep protected from light
PE-conjugated Anti-human IFN-γ eBioscience 12-7319-42 Keep protected from light
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122 100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 eBioscience 45-0037-42 Keep protected from light
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585
Recombinant Human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant Human IL-7 PeproTech 200-07
RPMI Medium 1640 Gibco C11875500BT 500 ml
Sodium pyruvate,100mM Gibco 15360070
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR BioLegend 307648
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1125

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
  2. Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
  3. Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
  4. Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
  5. Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
  6. Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
  7. Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
  8. Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
  9. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
  10. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
  11. Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
  12. Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
  13. Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
  14. de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
  15. Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
  16. Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
  17. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  18. Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 176 вирус гепатита В CD4 Т-клеточный ответ эпитоп
Анализ HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификация HLA-DR-ограниченных CD4 Т-клеточных эпитопов на основе пептидной матрицы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, J., Wan, X., Wang, H., Deng,… More

Xiao, J., Wan, X., Wang, H., Deng, G. Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix. J. Vis. Exp. (176), e62387, doi:10.3791/62387 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter