Summary
Baseret på en hepatitis B-virus (HBV)-afledt peptidmatrix kan HBV-specifikke CD4 T-celleresponser evalueres parallelt med identifikation af HBV-specifikke CD4 T-celle epitoper.
Abstract
CD4 T-celler spiller en vigtig rolle i patogenesen af kronisk hepatitis B. Som en alsidig cellepopulation er CD4 T-celler blevet klassificeret som forskellige funktionelle delmængder baseret på de cytokiner, de udskilles: for eksempel IFN-γ til CD4 T-hjælper 1 celler, IL-4 og IL-13 til CD4 T-hjælper 2 celler, IL-21 til CD4 T follikulære hjælperceller og IL-17 til CD4 T-hjælper 17 celler. Analyse af hepatitis B-virus (HBV)-specifikke CD4 T-celler baseret på cytokinsekretion efter HBV-afledt peptider stimulation kunne give oplysninger ikke kun om størrelsen af HBV-specifikke CD4 T-celle respons, men også om de funktionelle delmængder af HBV-specifikke CD4 T-celler. Nye tilgange, såsom transcriptomics og metabolomics analyse, kunne give mere detaljerede funktionelle oplysninger om HBV-specifikke CD4 T-celler. Disse tilgange kræver normalt isolering af levedygtige HBV-specifikke CD4 T-celler baseret på peptid-større histokompatibilitet kompleks-II multimers, mens der i øjeblikket oplysninger om HBV-specifikke CD4 T-celle epitoper er begrænset. Baseret på en HBV-afledt peptidmatrix er der udviklet en metode til at evaluere HBV-specifikke CD4 T-celleresponser og identificere HBV-specifikke CD4 T-celle epitoper samtidigt ved hjælp af perifere blodmonnukleare celler prøver fra kroniske HBV-infektionspatienter.
Introduction
I øjeblikket er der 3 hovedmetoder til at analysere antigenspecifikke T-celler. Den første tilgang er baseret på samspillet mellem T-celle receptor og peptid (epitop). Antigen-specifikke T-celler kunne være direkte plettet med peptid-større histokompatibilitet kompleks (MHC) multimers. Fordelen ved denne metode er, at den kan opnå levedygtige antigenspecifikke T-celler, der er egnet til downstream transcriptomics/metabolomics-analyse. En begrænsning af denne metode er, at det ikke kunne give oplysninger om hele T-celleresponset på et bestemt antigen, da det kræver validerede epitop peptider, mens antallet af identificerede epitoper for et bestemt antigen er begrænset for nu. Sammenlignet med hepatitis B-virus (HBV)-specifikke CD8 T-celle epitoper, færre HBV-specifikke CD4 T-celle epitoper er blevet identificeret1,2, hvilket gjorde denne metode mindre anvendelig til analyse af HBV-specifikke CD4 T-celler i øjeblikket.
Den anden tilgang er baseret på upregulation af en række aktivering-inducerede markører efter antigen peptid stimulation3. De almindeligt anvendte markører omfatter CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Denne metode er nu blevet brugt til at analysere antigen-specifikke T-celle svar hos vaccinerede personer5,6, Human Immundefekt Virus infektion patienter7,og svær akut respiratorisk syndrom Coronavirus 2 infektion patienter8,9. I modsætning til peptid-MHC multimers baseret assay, denne metode er ikke begrænset af validerede epitoper og kunne opnå levedygtige celler til downstream analyse. En begrænsning af denne metode er, at den ikke kunne give oplysninger om cytokinprofilen af antigenspecifikke T-celler. Desuden kan udtrykket af disse aktiveringsinducerede markører af nogle aktiverede antigen-ikke-specifikke celler bidrage til baggrundssignalerne i analysen, hvilket kan være et problem, især når målantigenspecifikke T-celler er sjældne. I øjeblikket er der begrænset anvendelse af denne metode på HBV-specifikke CD4 T-celler4. Hvorvidt denne metode kan udnyttes til at analysere HBV-specifikke CD4 T-celler på en pålidelig måde, skal undersøges nærmere.
Den tredje tilgang er baseret på cytokin sekretion efter antigen peptid stimulation. Ligesom aktivering-induceret markør-baseret analyse, denne metode er ikke begrænset af validerede epitoper. Denne metode kunne direkte afsløre cytokin profil af antigen-specifikke T-celler. Følsomheden af denne metode er lavere end den aktiveringsinducerede markørbaserede metode, da den er afhængig af cytokinsekretionen af antigenspecifikke T-celler, og antallet af testede cytokiner er normalt begrænset. I øjeblikket er denne metode meget udbredt i analysen af HBV-specifikke T-celler. Da cytokin, der udskiller HBV-specifikke T-celler, næppe kunne påvises ved direkte ex vivo peptidsstimulering10,11, analyseres cytokinprofilen af HBV-specifikke T-celler normalt efter 10-dages in vitro peptid stimuleret ekspansion12,13,14,15,16. Arrangement af peptid puljer i en matrix form er blevet udnyttet til at lette identifikationen af antigen-specifikke epitoper17,18. Med kombinationen af peptidmatrix og cytokinsekretionanalyse er der udviklet en metode til at evaluere HBV-specifikke CD4 T-celleresponser og identificere HBV-specifikke CD4 T-celle epitoper samtidigt16. I denne protokol beskrives detaljerne i denne metode. HBV-kerneantigen er valgt som et eksempel på demonstration i denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra hver patient, der indgik i undersøgelsen. Undersøgelsesprotokollen er i overensstemmelse med de etiske retningslinjer i Helsinki-erklæringen fra 1975, hvilket afspejles i en forhåndsgodkendelse fra den medicinske etiske komité på Southwest Hospital.
1. Design af den HBV-afledte peptidmatrix
- Download aminosyresekvenser af HBV-kerneantigen fra NCBI-databaser (GenBank: AFY98989.1).
- Køb HBV kerneantigen afledte peptider (et panel af 35 15-mer peptider overlappende med 10 rester, renhed > 90%, 4 mg /peptid) fra en peptid syntese serviceudbyder.
- Opret en firkantet 6×6 peptid matrix med hver position i matrixen, der kun indeholder 1 peptid. Der er 12 peptid pools: 6 række peptid pools og 6 kolonne peptid puljer, 5-6 peptider i hver pool16. Rækken peptid puljer og kolonnen peptid puljer i matrix repræsenterer 2 separate formationer af HBV kerne antigen.
- For 3/4 af de købte peptider blandes peptider i samme række/kolonne i matrixen i 12 separate peptidpuljer ved at opløse dem sammen i dimethylsulfoxid (DMSO) (2 μg/μL for hvert peptid). Opbevares ved -80 °C til analyse af HBV-specifikke CD4 T-celleresponser.
- Resten af peptiderne opløses separat (10 μg/μL) og opbevares ved -80 °C til identifikation af epitop.
2. Isolering af perifere blodmonnukleare celler (PBPC'er)
- Prøve 5 mL venøst blod fra kroniske HBV-infektionspatienter.
BEMÆRK: Blodmængden skal estimeres groft i henhold til antallet af peptidpuljer plus 1 baggrundskontrol og 1 positiv kontrol. Analyse af 1 peptid pool har brug for 3 x 105 PBMCs. I gennemsnit kunne 1 x 106 PBMCs fås fra 1 mL blod. - Isoler PBMCs fra blod ved hjælp af Ficoll density gradient centrifugation (800 × g, 20 min) og kryopreserve isolerede PBMCs i flydende nitrogen til senere brug.
- Brug en Pasteur pipette til at indsamle granulocytter mellem det klare Ficoll-lag og det røde blodlegemerlag. Uddrag genomisk DNA fra granulocytter ved hjælp af et genomisk DNA-rensningssæt i henhold til producentens protokol.
- Send DNA-prøven til genotyping-tjenesteudbydere for at bestemme HLA-DRB1-genotypen.
3. In Vitro Udvidelse af PBMCs ved hjælp af en HBV Peptid Matrix
- Optø PBIC'er.
- Varm RPMI 1640 suppleret med 1:10.000 benzonase (25 U/mL) til 37 °C i et vandbad.
BEMÆRK: Benzonase hjælper med at begrænse celleklumpning under optøning. Hver prøve vil kræve 20 mL RPMI 1640 med benzonase. Beregn den mængde, der er nødvendig for at optø alle prøver, og forbered en separat underholdsbidrag (37 °C) med 1:10.000 Benzonase (25 U/mL). Tø højst 5 prøver ad gangen. - Prøver udtages fra flydende nitrogen, og optø hurtigt frosne hætteglas i et vandbad (37 °C).
- Overfør den optøede celleaffjedring til et 15 mL centrifugerør. Der tilsættes 1 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) dråbevis til røret. Tilsæt langsomt 6 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) til centrifugerøret, skyl kryovialt med yderligere 2 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) for at hente alle celler. Fortsæt med resten af prøverne så hurtigt som muligt.
BEMÆRK: Langsom fortynding af kryopreserverede prøver er nøglen til at opretholde levedygtigheden af optøede celler. - Centrifuge (400 × g, 10 min), fjern supernatanten og løsn pelleten ved at trykke på røret.
- Forsigtigt genbruge pellet i 1 mL varm Benzonase RPMI 1640. Bland forsigtigt, og filtrer celler gennem en 70 μm celle si, hvis det er nødvendigt (dvs. hvis nogen synlig klump eksisterer).
- Aliquot en 10 μL suspension og fortyndes i Dulbecco's fosfat-buffered saltvand (DPBS), tilsæt Trypan blå (0,04%), belastning på et hæmocytometer, vente i 1 min, og tælle antallet af levedygtige celler (klare celler).
- Der tilsættes 9 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) til røret, centrifugen (400 × g, 10 min), fjern supernatanten, og løs pelleten ved at trykke på røret.
- Varm RPMI 1640 suppleret med 1:10.000 benzonase (25 U/mL) til 37 °C i et vandbad.
- Resuspend PBMCs i RPMI 1640 suppleret med 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin og 10% human AB serum (komplet kulturmedium). Juster celletætheden til 1,5 x 106 celler/mL. Plade PBMCs i 96-brønd plader (flad bund) med en densitet på 3 x 105 celler / brønd.
- Tilsæt HBV afledte peptidpuljer (2 μg/mL for hver enkelt peptid) til hver brønd. Ved brønde med baggrundskontrol og positiv kontrol tilsættes den samme mængde opløsningsmiddel (DMSO, 1 μL/mL). Tilføj 10 U/mL IL-2 og 10 ng/mL IL-7. Inkuberes ved 37 °C og 5% CO2.
- På dag 3 supplere kultur medium med 50 U/mL il-2 og 10 ng/mL af IL-7.
BEMÆRK: I løbet af dag 1 til dag 3 vil der ikke blive observeret nogen åbenlys T-cellespredning. Det samlede celletal vil normalt falde med 1/3 til 1/2, på grund af død ikke-T-celler såsom B-celler, NK-celler, NKT celler, og monocytter. - På dag 7 skal halvdelen af kulturmediet erstattes med frisk medium indeholdende peptider (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) og IL-7 (20 ng/mL).
BEMÆRK: For at undgå at forstyrre cellerne i bunden, pipette omkring 90 μL af kultur medium omhyggeligt fra toppen af mediet. I løbet af dag 3 til dag 7, robust T-celle spredning vil blive observeret, og formering T-celler normalt samles til at danne klynger. - På dag 10, forsigtigt pipette cellekultur i hver brønd 7-9 gange for at opdele celle klynger, tælle antallet af levedygtige celler, og overføre 2×105 celler i hver brønd til en 96 brønd plade (rund bund) for HBV-specifikke CD4 T-celle respons analyse.
- Fortsæt med at dyrke resten af cellerne til identifikation af epitop på dag 12, juster mængden af kulturmedium til 100 μL (kassér overdreven medium), og suppler kulturen med 100 μL frisk komplet kulturmedium indeholdende peptider (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) og IL-7 (20 ng/mL).
BEMÆRK: I løbet af dag 7 til dag 10 fortsætter T-cellerne med at formere sig kraftigt. Udskift kulturmediet som i trin 3.5, hvis mediet bliver gult. Generelt vil celletallet overstige 6×105 på dag 10. Hver brønd viser normalt lignende cellenummer, tæller celletal i 3 brønde og bruger den gennemsnitlige værdi som et skøn over cellenummer for alle brønde.
4. Analyse af HBV-specifikke CD4 T-Cell-respons ved intracellulær flowcytometri
- Stimulering af PBMCs med peptid pools
- For cellerne overført til 96 brøndpladen (rund bund), vask 3 gange i en plade (550 × g, 3 min). Brug 200 μL medium til hver vask (RPMI 1640 til de første 2 vaske, komplet kulturmedium til den sidste vask). Kassér supernatanterne.
BEMÆRK: Fjernelse af resterende cytokiner i kulturen ved gentagen vask kan effektivt mindske baggrunden i intracellulær flowcytometrianalyse. - For hver brønd af celler stimuleret med en bestemt peptid pool, tilføje 200 μL af komplet kultur medium suppleret med de samme peptid puljer (2 μg/mL for hver enkelt peptid). For brønden af baggrundskontrol tilsættes komplet kulturmedium suppleret med 1 μL/mL DMSO. For brønden af positiv kontrol tilsættes komplet kulturmedium suppleret med 1 μL/ml DMSO, 150 ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) og 1 μmol/L ionomycin.
BEMÆRK: Høj dosis af DMSO vil blokere cytokin sekretion af T-celler (mest signifikant for TNF-α). Dosis af DMSO højere end 5 μL/mL anbefales ikke. Generelt overstiger dosis af DMSO i vores eksperiment ikke 1 μL/mL. - Inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 6 timer.
- Efter 1 time inkubation tilsættes Monensin (1,37 μg/mL) til kulturen.
- For cellerne overført til 96 brøndpladen (rund bund), vask 3 gange i en plade (550 × g, 3 min). Brug 200 μL medium til hver vask (RPMI 1640 til de første 2 vaske, komplet kulturmedium til den sidste vask). Kassér supernatanterne.
- Flowcytometri
- Efter 6 timers inkubation. Fjern supernatant efter centrifugering (550 × g, 3 min), vask cellerne én gang med 200 μL DPBS (550 × g, 3 min), pletoverflademarkører (CD3, CD4 og CD8) og levedygtighedsmarkør (ved hjælp af Fixable Viability Dye) i et køleskab på 4 °C i 30 min.
- Vask én gang med 200 μL DPBS (550 × g, 3 min). Fikserings- og permeabilisere celler og plet intracellulære cytokiner (TNF-α og IFN-γ) i et 4 °C køleskab i 45 min.
- Efter den endelige vask i intracellulær farvning skal celler genbruges i 150 μL flowcytometribuffer (DPBS + 0,5% BSA).
- Indhent flowcytometridata på et flowcytometer.
- Analyse af flowcytometriresultater
- Definition af positiv brønd: Overvej en såvel som positiv, hvis den har en frekvens af cytokin, der udskiller T-celler mindst to gange af baggrundskontrollen godt (Figur 1).
- I henhold til følgende formel beregnes svarhastigheden for hver cytokin, der analyseres (Figur 2):
BEMÆRK: Rækken peptid pool og kolonnen peptid puljer i matrix repræsenterer 2 forskellige formationer af HBV kerne antigen, så den endelige responsrate bør divideres med 2.
5. Identifikation af HBV-specifikke HLA-DR-begrænsede CD4 T-celle epitoper
- Optø og vedligeholde allogen B lymfoblastoid cellelinjer (BLCLs) i T-75 kolbe (5-20 ×106 celler, 20 mL af komplet kultur medium).
BEMÆRK: For at sikre blcl'ernes gode tilstand bør dette trin påbegyndes 2 uger før optøning af patienternes PBPC'er. BLCLs skal være homozygode i HLA-DRB1 allel. Ifølge genotyping-resultatet bør patienterne dele den samme HLA-DRB1 allel som BLCLs. - Screening af kandidat peptider til identifikation (Figur 3)
- Ifølge T-celle responsrate resultater på dag 10, skærmen ud 2 peptid puljer med den højeste responsrate (1 række peptid pool og 1 kolonne peptid pool).
- Indstil peptid i disse 2 puljer som en kandidat peptid, hvis den anden peptid pool, der indeholder denne peptid viser også et positivt resultat i T-celle respons analyse. Brug PBMCs udvidet med den anden peptid pool for epitop identifikation senere.
- Pulserende BLCLs med peptid
- På dag 12 tælles antallet af levedygtige BLCL'er, overfør celler til 15 mL centrifugerør, centrifuge (350 × g, 10 min) og fjern supernatanten. Resuspend celle pellet i komplet kultur medium, og aliquot BLCLs til en 96-brønd plade (rund bund) på 4×104 celler / godt i 80 μL komplet kultur medium.
- Der tilsættes et enkelt peptid (10 μg/mL), inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 2 timer. Sæt 2 baggrundskontrol: peptid pulserende med HLA-DR blokering (forbehandling med anti-HLA-DR (10 μg/mL) i 1 time); DMSO (1 μL/mL) pulserende. Det sidste volumen af komplet kulturmedium i hver brønd er 100 μL.
- Tilsættes mitomycin C (100 μg/mL), inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 1 time.
- Vask 3 gange med 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) i en plade for at fjerne u pulserende peptid og mitomycin C. Ved den første vask suppleres inkubationskulturen med 100 μL RPMI 1640.
- Resuspend celler i 120 μL af komplet kultur medium.
- Stimulerende PBMCs med peptid pulserende BLCLs.
- På dag 12 overføres PBPC'er til en 96-brønds plade (rund bund).
- Supernatanten efter centrifugering (550 × g, 3 min) i en plade, en vask to gange med 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) i en plade.
BEMÆRK: Fjernelse af resterende cytokiner og peptider i kulturen ved gentagen vask er det vigtigste skridt til at reducere baggrunden i intracellulær flowcytometrianalyse. Især for resterende peptider, vil det binde sig til BLCLs og øge baggrunden betydeligt. - Resuspend PBMCs ved hver brønd med 210 μL af komplet kulturmedium.
- For brønden af PBMCs valgt til epitop identifikation, bland aliquot (70 μL hver) med peptid pulserende BLCLs (3 brønde, herunder 2 baggrundskontroller).
BEMÆRK: På dag 12 vil antallet af peptidpuljer udvidet PBMCs normalt nå op på over 5-7×105 pr. Brønd, så forholdet mellem PBMCs / BLCLs er omkring 6/1 til 4/1. - Inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 6 timer.
- Efter 1 time inkubation tilsættes Monensin (1,37 μg/mL) til kulturen. Det sidste volumen af komplet kulturmedium i hver brønd er 200 μL.
- Flowcytometri
- Gentag de samme handlinger som i trin 4.2.
- Analyse af flowcytometriresultater
- Kontroller en peptid som en HLA-DR-begrænset CD4 T-celler epitope, hvis PBPC'er inkuberet med denne peptid pulserende BLCLs viser en hyppighed af cytokin udskille CD4 T-celler mindst to gange af PBMCs inkuberet med baggrundskontroller (peptid pulserende med HLA-DR pre-blokering; DMSO pulserende) (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hyppigheden af cytokin, der udskiller CD4 T-celler, beregnes som summen af både enkeltproducenter og dobbeltproducenter. Som det fremgår af figur 1, er hyppigheden af TNF-α udskillelse af CD4 T-celler og hyppigheden af IFN-γ udskillende CD4 T-celler i baggrundskontrol (DMSO) henholdsvis 0,154% og 0,013%. Hyppigheden af TNF-α udskille CD4 T-celler og hyppigheden af IFN-γ udskille CD4 T-celler, der er specifikke for peptid pool Core11 er henholdsvis 0,206 og 0,017, så både TNF-α udskille CD4 T-cellerespons og IFN-γ udskille CD4 T-cellerespons for denne peptidpulje betragtes som negativ. Hyppigheden af TNF-α udskille CD4 T-celler og hyppigheden af IFN-γ udskille CD4 T-celler, der er specifikke for peptid pool Core09 er henholdsvis 2,715% og 0,973%, så både TNF-α udskille CD4 T-cellerespons og IFN-γ udskille CD4 T-cellerespons for denne peptid pool betragtes som positive.
Som det fremgår af figur 2, er positive brønde angivet med grå baggrund. Ved beregning af HBV's kernespecifikke TNF-α udskiller CD4 T-celleresponsrate, bør data om peptidpuljer Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 og Core10 medtages. Ved beregning af HBV-kernespecifik IFN-γ udskiller CD4 T-celleresponsrate, medtages data fra peptidpuljer Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 og Core10.
Som det fremgår af figur 3,er kandidat peptider til epitop identifikation angivet med rødt. Core01 har den højeste svarprocent for både TNF-α udskille CD4 T-celler og IFN-γ udskille CD4 T-celler i kolonne peptid pools. Peptider C1-15, C31-45, C61-75, og C91-105 i denne peptid pool er indstillet som kandidat peptider som rækken peptid puljer, der indeholder disse peptider viser også positive resultater i T-celle respons. PBMCs udvidet med peptid puljer Core07, Core08, Core09, og Core10 bruges til epitop identifikation af peptider C1-15, C31-45, C61-75, og C91-105, henholdsvis. Core09 har den højeste svarprocent for både TNF-α udskille CD4 T-celler og IFN-γ udskille CD4 T-celler i række peptid pools. Peptider C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95, og C86-100 i denne peptid pool er indstillet som kandidat peptider som kolonnen peptid puljer, der indeholder disse peptider viser også positivt resultat i T-celle respons. PBMCs udvidet med peptid puljer Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, og Core06 bruges til epitop identifikation af peptider C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 og C86-100, henholdsvis.
Som det fremgår af figur 4, er hyppigheden af TNF-α, der udskiller CD4 T-celler og hyppigheden af IFN-γ udskillende CD4 T-celler, henholdsvis 0,995 % og 0,131 % for peptidpuljen, hvilket udskiller CD4 T-celler og hyppigheden af IFN-γ udskillende CD4 T-celler er henholdsvis 0,995 % og 0,131 %, hvilket er mere end 2 gange højere end baggrundskontroller (peptid C31-45 pulserende BLCLs med HLA-DR pre-blocking, DMSO pulserede BLCLs). Således er peptid C31-45 verificeret som en HLA-DR begrænset CD4 T-celle epitop. For peptid pool Core10 udvidet PBMCs, efter stimulering med peptid C91-105 pulserende BLCLs, hyppigheden af TNF-α udskille CD4 T-celler og hyppigheden af IFN-γ udskilleNDE CD4 T-celler er henholdsvis 0,221% og 0,000%, som ikke overstiger de 2 gange baggrundskontrol (peptid C91-45 pulserede BLCLs med HLA-DR pre-blocking, DMSO pulserede BLCLs), så peptid C91-105 er ikke verificeret som HLA-DR begrænset CD4 T-epitop.
Figur 1: Flowcytometri demonstration af TNF-α/IFN-γ udskille CD4 T-celler i peptid pools udvidet PBMCs efter stimuleret med deres respektive peptid puljer.
Figur 2: Demonstration af analysen HBV's kernespecifikke TNF-α/IFN-γ udskillelse af CD4 T-celler. TNF/DMSO og IFN-Ƴ/DMSO angiver forholdet mellem frekvenserne for TNF-α/IFN-γ udskillende CD4 T-celler i hver brønd af peptidpulje stimuleret PBMCs divideret med hyppigheden af TNF-α/IFN-γ udskille CD4 T-celler i brønden af DMSO kontrol. Grå baggrund indikerer brønde med positiv CD4 T-celle respons bedømt i forhold til baggrundskontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Demonstration af screening af kandidat peptider til identifikation af epitope. TNF/DMSO og IFN-Ƴ/DMSO angiver forholdet mellem frekvenserne for TNF-α/IFN-γ udskillende CD4 T-celler i hver brønd af peptidpulje stimuleret PBMCs divideret med hyppigheden af TNF-α/IFN-γ udskille CD4 T-celler i brønden af DMSO kontrol. Grå baggrund indikerer brønde med positiv CD4 T-celle respons bedømt i forhold til baggrundskontrol. Peptider i rødt angiver kandidat peptider i henhold til screening kriterier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Flowcytometridemonstration af epitopidentifikationsresultater. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trin i denne protokol er angivet som følger: 1) nok PBPC'er med høj levedygtighed til at starte PBMCs-udvidelse; 2) passende miljø for udvidelse af pbmcs og 3) fuldstændig fjernelse af resterende peptidpuljer i PBMCs-kulturen før epitopidentifikation.
Al analyse i denne protokol afhænger af den robuste spredning af CD4 T-celler. Generelt vil antallet af PBMCs efter 10-dages udvidelse være 2-3 gange af det oprindelige antal. Cellenummeret og levedygtigheden af PBMCs er 2 nøglefaktorer i PBMCs ekspansion. Hvis formålet kun er at analysere HBV-specifikke CD4 T-celler uden epitopidentifikation, er det rimeligt at reducere det oprindelige PBPC-nummer, især når mængden af blodprøve er begrænset. Mens det er vores erfaring, at vellykket PBMCs-udvidelse næppe kunne opnås, hvis startnummeret af PBMCs er under 1,5×105 celler / godt. Når du bruger friske PBMCs til ekspansion, vil celle levedygtigheden ikke være et problem. Mens når du bruger cryopreserved PBMCs til ekspansion, kryopræservering og optøning af PBMCs bør udføres meget omhyggeligt for at opretholde levedygtigheden af PBMCs.
I funktionel analyse af HBV-specifikke T-celler bruges IL-12 normalt i PBMCs-udvidelse for at forbedre funktionen af CD8 T-celler. Da IL-12 kan fremkalde differentiering af CD4 T-celler i forhold til CD4 T follikulære hjælperceller, bør denne cytokin undgås i funktionel analyse af HBV-specifikke CD4 T-celler. I vores protokol suppleres kun IL-2 (til T-celleudvidelse) og IL-7 (for T-celle overlevelse) for at opretholde den funktionelle profil af HBV-specifikke CD4 T-celler under udvidelsen så intakt som muligt. Vi har testet 5 cytokiner til funktionel analyse af HBV-specifikke CD4 T-celler: TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 og IL-21. I vores analyserede prøver, TNF-α og IFN-γ er 2 store cytokiner udskilles af HBV-specifikke CD4 T-celler16. Ved analyse af den funktionelle profil af HBV-specifikke CD4 T-celler anbefales det at teste så mange som muligt cytokiner for at få de detaljerede funktionelle profiloplysninger. Mens der i epitop identifikation, Anbefales det at analysere kun TNF-α og IFN-γ, til økonomisk overvejelse.
Nok HBV-specifikke CD4 T-celler er afgørende for vellykket identifikation af epitoper, så identifikation af epitop bør overvejes hos patienter med høj HBV-specifik CD4 T-cellerespons, såsom hepatitis B-flare-patienter (stærk HBV-specifik TNF-α udskillende CD4 T-cellerespons) og patienter med viral clearance (stærk HBV-specifik IFN-γ CD4 T-cellerespons)16 . Det er meget vigtigt at fjerne resterende peptider i peptidpuljen udvidet PBMCs ved gentagen vask, før inkubation af disse celler med BLCLs til epitop identifikation. De resterende peptider vil binde sig til DMSO pulserende BLCLs, aktivere peptid-specifikke CD4 T-celler, hermed øge baggrunden i vid udstrækning.
Nogle HBV-antigen har variable sekvenser i forskellige HBV-genotyper (f.eks. HBV-overfladeantigen). En løsning er at på forhånd bestemme de specifikke HBV-genotyper hos patienter og designe HBV-genotypespecifikke peptidpuljer til patienter med forskellige HBV-genotyper. Mens HBV-genotypen er umålelig hos patienter med lave HBV-virusbelastninger (f.eks. HBeAg-negative patienter med regelmæssig anti-viral behandling), er løsningen i dette scenario at blande peptider fra forskellige HBV-genotyper sammen i de samme peptidpuljer, som vi gjorde i en tidligere undersøgelse16. En ulempe ved denne blanding strategi er, at epitope kan identificeres som en peptid par, men ikke en enkelt peptid, som nogle positioner i peptider matrix indeholder en peptid par i samme fragment af antigen.
En stor ulempe ved denne metode er den tidskrævende 10-dages PBMCs udvidelse. I øjeblikket kunne ex vivo-analyse af cytokinsekretion ikke registrere HBV-specifikke CD4 T-celler på en pålidelig måde. Brug peptid pulserende allogene BLCLs som stimulatorer normalt opdaget mere peptid-specifikke CD4 T-celler i peptid udvidet PBMCs, sammenlignet med blot stimulerende med peptider16. Det er værd at undersøge, om brug af peptid pulserende autologe B-celler som antigen præsentation celler kunne bidrage til pålideligt at opdage HBV-specifikke CD4 T-celler ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) og kinesisk Key
Projekt specialiseret i infektionssygdomme (2018ZX10723203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
- Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
- Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
- Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
- Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
- Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
- Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
- Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
- Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
- Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
- de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
- Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
- Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).
