Summary
Basierend auf einer von hepatitis-B-Virus (HBV) abgeleiteten Peptidmatrix konnten HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen parallel zur Identifizierung von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Epitopen ausgewertet werden.
Abstract
CD4-T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der chronischen Hepatitis B. Als vielseitige Zellpopulation wurden CD4-T-Zellen basierend auf den zytokinen, die sie sezernierten, als unterschiedliche funktionelle Untergruppen klassifiziert: zum Beispiel IFN-γ für CD4 T-Helfer-1-Zellen, IL-4 und IL-13 für CD4-T-Helfer-2-Zellen, IL-21 für CD4-T-Follikel-Helferzellen und IL-17 für CD4-T-Helfer 17-Zellen. Die Analyse von Hepatitis-B-Virus (HBV)-spezifischen CD4-T-Zellen auf der Grundlage der Zytokinsekretion nach HBV-abgeleiteter Peptidstimulation könnte nicht nur Aufschluss über das Ausmaß der HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktion geben, sondern auch über die funktionellen Untergruppen von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen. Neuartige Ansätze wie Transkriptomik und Metabolomik-Analyse könnten detailliertere funktionelle Informationen über HBV-spezifische CD4-T-Zellen liefern. Diese Ansätze erfordern in der Regel die Isolierung lebensfähiger HBV-spezifischer CD4-T-Zellen auf der Grundlage von Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex-II-Multimeren, während derzeit die Informationen über HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope begrenzt sind. Basierend auf einer HBV-abgeleiteten Peptidmatrix wurde eine Methode entwickelt, um HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen zu bewerten und HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope gleichzeitig unter Verwendung peripherer mononukleärer Blutzellproben von chronischen HBV-Infektionspatienten zu identifizieren.
Introduction
Derzeit gibt es 3 Hauptansätze zur Analyse antigenspezifischer T-Zellen. Der erste Ansatz basiert auf der Interaktion zwischen dem T-Zell-Rezeptor und dem Peptid (Epitop). Antigenspezifische T-Zellen könnten direkt mit Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Multimeren gefärbt werden. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie lebensfähige antigenspezifische T-Zellen erhalten könnte, die sich für die nachgelagerte Transkriptomik/Metabolomik-Analyse eignen. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie keine Informationen über die gesamte T-Zell-Reaktion auf ein bestimmtes Antigen liefern konnte, da sie validierte Epitoppeptide erfordert, während die Anzahl der identifizierten Epitope für ein bestimmtes Antigen vorerst begrenzt ist. Im Vergleich zu Hepatitis-B-Virus (HBV)-spezifischen CD8-T-Zell-Epitopen wurden weniger HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope identifiziert1,2, was diese Methode für die Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen derzeit weniger anwendbar macht.
Der zweite Ansatz basiert auf der Hochregulierung einer Reihe von aktivierungsinduzierten Markern nach Antigenpeptidstimulation3. Zu den häufig verwendeten Markern gehören CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Diese Methode wurde nun verwendet, um antigenspezifische T-Zell-Reaktionen bei geimpften Personen5,6, Human Immunodeficiency Virus Infektion Patienten7und Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infektion Patienten8,9zu analysieren. Im Gegensatz zum Peptid-MHC-Multimer-basierten Assay ist diese Methode nicht durch validierte Epitope eingeschränkt und könnte lebensfähige Zellen für die nachgelagerte Analyse erhalten. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie keine Informationen über das Zytokinprofil antigenspezifischer T-Zellen liefern konnte. Auch die Expression dieser aktivierungsinduzierten Marker durch einige aktivierte Antigen-unspezifische Zellen könnte zu den Hintergrundsignalen in der Analyse beitragen, was ein Problem darstellen könnte, insbesondere wenn die Zielantigen-spezifischen T-Zellen selten sind. Derzeit gibt es eine begrenzte Anwendung dieser Methode auf HBV-spezifische CD4-T-Zellen4. Ob diese Methode genutzt werden kann, um HBV-spezifische CD4-T-Zellen zuverlässig zu analysieren, bedarf weiterer Untersuchungen.
Der dritte Ansatz basiert auf der Zytokinsekretion nach Antigenpeptidstimulation. Wie die aktivierungsinduzierte markerbasierte Analyse ist diese Methode nicht durch validierte Epitope eingeschränkt. Diese Methode könnte das Zytokinprofil von antigenspezifischen T-Zellen direkt aufdecken. Die Sensitivität dieser Methode ist geringer als die aktivierungsinduzierte markerbasierte Methode, da sie auf der Zytokinsekretion antigenspezifischer T-Zellen beruht und die Anzahl der getesteten Zytokine in der Regel begrenzt ist. Derzeit wird diese Methode häufig in der Analyse von HBV-spezifischen T-Zellen eingesetzt. Da Zytokin-sezernierende HBV-spezifische T-Zellen durch direkte ex vivo Peptidstimulation kaum nachgewiesen werdenkonnten10,11, wird das Zytokinprofil von HBV-spezifischen T-Zellen in der Regel nach 10-tägiger in vitro peptidstimulierender Expansion analysiert12,13,14,15,16. Die Anordnung von Peptidpools in Matrixform wurde verwendet, um die Identifizierung antigenspezifischer Epitope zu erleichtern17,18. Mit der Kombination von Peptidmatrix und Zytokinsekretionsanalyse wurde eine Methode entwickelt, um HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen zu bewerten und HBV-spezifische CD4-T-Zell-Epitope gleichzeitig zu identifizieren16. In diesem Protokoll werden die Details dieser Methode beschrieben. HBV-Kernantigen wird in diesem Protokoll als Beispiel für die Demonstration ausgewählt.
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Protocol
Von jedem patienten, der in die Studie eingeschlossen wurde, wurde eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung eingeholt. Das Studienprotokoll entspricht den ethischen Richtlinien der Deklaration von Helsinki von 1975, was sich in der a priori Genehmigung durch die medizinische Ethikkommission des Southwest Hospital widerspiegelt.
1. Design der HBV-abgeleiteten Peptidmatrix
- Laden Sie Aminosäuresequenzen des HBV-Kernantigens aus NCBI-Datenbanken herunter (GenBank: AFY98989.1).
- Kaufen Sie HBV-Kernantigen-abgeleitete Peptide (ein Panel von 35 15-mer-Peptiden, die sich um 10 Rückstände überlappen, Reinheit > 90%, 4 mg / Peptid) von einem Peptidsynthese-Dienstleister.
- Richten Sie eine quadratische 6×6-Peptidmatrix ein, wobei jede Position in der Matrix nur 1 Peptid enthält. Es gibt 12 Peptidpools: 6 Reihenpeptidpools und 6 Säulenpeptidpools, 5-6 Peptide in jedem Pool16. Die Zeilenpeptidpools und die Säulenpeptidpools in der Matrix stellen 2 separate Formationen des HBV-Kernantigens dar.
- Für 3/4 der gekauften Peptide mischen Sie Peptide in derselben Reihe/Spalte der Matrix in 12 separate Peptidpools, indem Sie sie zusammen in Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen (2 μg/μL für jedes Peptid). Bei -80 °C für die Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen lagern.
- Den Rest der Peptide separat auflösen (10 μg/μL) und bei -80 °C zur Epitopidentifikation lagern.
2. Isolierung peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs)
- Probenahme von 5 ml venösem Blut von Patienten mit chronischer HBV-Infektion.
HINWEIS: Das Blutvolumen sollte grob nach der Anzahl der Peptidpools plus 1 Hintergrundkontrolle und 1 Positivkontrolle geschätzt werden. Die Analyse von 1 Peptidpool benötigt 3 x 105 PBMCs. Im Durchschnitt konnten 1 x10 6 PBMCs aus 1 ml Blut gewonnen werden. - Isolieren Sie PBMCs aus dem Blut mit Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation (800 × g, 20 min) und kryokonservieren Sie isolierte PBMCs in flüssigem Stickstoff für die spätere Verwendung.
- Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um Granulozyten zwischen der klaren Ficoll-Schicht und der roten Blutkörperchenschicht zu sammeln. Extrahieren Sie genomische DNA aus Granulozyten mit einem genomischen DNA-Reinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Senden Sie die DNA-Probe an Genotypisierungsdienstleister, um den HLA-DRB1-Genotyp zu bestimmen.
3. In-vitro-Expansion von PBMCs mit einer HBV-Peptidmatrix
- PBMCs auftauen.
- Warme RPMI 1640 ergänzt mit 1:10.000 Benzonase (25 U/ml) bis 37 °C im Wasserbad.
HINWEIS: Benzonase hilft, die Zellklumpung während des Auftauens zu begrenzen. Jede Probe benötigt 20 ml RPMI 1640 mit Benzonase. Berechnen Sie die Menge, die zum Auftauen aller Proben benötigt wird, und bereiten Sie ein separates Aliquot von Medien (37 °C) mit 1:10.000 Benzonase (25 U / ml) vor. Tauen Sie nicht mehr als 5 Proben gleichzeitig auf. - Proben aus flüssigem Stickstoff entnehmen und gefrorene Fläschchen in einem Wasserbad (37 °C) schnell auftauen.
- Die aufgetaute Zellsuspension in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen. 1 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) tropfenweise in das Röhrchen geben. Langsam 6 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) in das Zentrifugenröhrchen geben, Kryovial mit weiteren 2 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) abspülen, um alle Zellen abzurufen. Fahren Sie so schnell wie möglich mit den restlichen Proben fort.
HINWEIS: Die langsame Verdünnung von kryokonservierten Proben ist der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit aufgetauter Zellen. - Zentrifuge (400 × g, 10 min), entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet durch Klopfen des Rohres.
- Das Pellet vorsichtig in 1 ml warmer Benzonase RPMI 1640 wieder aufkehren. Mischen Sie vorsichtig und filtern Sie die Zellen bei Bedarf durch ein 70 μm-Zellsieb (d. H. Wenn ein sichtbarer Klumpen vorhanden ist).
- Aliquotieren Sie eine 10 μL-Suspension und verdünnen Sie sie in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS), fügen Sie Trypanblau (0,04%) hinzu, laden Sie es auf ein Hämozytometer, warten Sie 1 Minute und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen (klare Zellen).
- 9 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) in das Röhrchen geben, zentrifugieren (400 × g, 10 min), den Überstand entfernen und das Pellet durch Klopfen des Röhrchens lösen.
- Warme RPMI 1640 ergänzt mit 1:10.000 Benzonase (25 U/ml) bis 37 °C im Wasserbad.
- Resuspend PBMCs in RPMI 1640 ergänzt mit 25 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10% humanem AB-Serum (vollständiges Kulturmedium). Passen Sie die Zelldichte auf 1,5 x 106 Zellen/ml an. Platten-PBMCs in 96-Well-Platten (flacher Boden) mit einer Dichte von 3 x 105 Zellen/Well.
- Fügen Sie HBV-abgeleitete Peptidpools (2 μg / ml für jedes einzelne Peptid) zu jeder Vertiefung hinzu. Für Vertiefungen der Hintergrundkontrolle und Positivkontrolle fügen Sie die gleiche Menge Lösungsmittel (DMSO, 1 μL / ml) hinzu. Fügen Sie 10 U/ml IL-2 und 10 ng/ml IL-7 hinzu. Bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
- Ergänzen Sie an Tag 3 das Kulturmedium mit 50 U/ml IL-2 und 10 ng/ml IL-7.
HINWEIS: Von Tag 1 bis Tag 3 wird keine offensichtliche T-Zell-Proliferation beobachtet. Die Gesamtzellzahl nimmt normalerweise um 1/3 bis 1/2 ab, da Nicht-T-Zellen wie B-Zellen, NK-Zellen, NKT-Zellen und Monozyten abstreichen. - Ersetzen Sie an Tag 7 die Hälfte des Kulturmediums durch frisches Medium, das Peptide (4 μg/ml), IL-2 (100 U/ml) und IL-7 (20 ng/ml) enthält.
HINWEIS: Um eine Störung der Zellen an der Unterseite zu vermeiden, pipetetten Sie etwa 90 μL Kulturmedium vorsichtig von der Oberseite des Mediums. Während Tag 3 bis Tag 7 wird eine robuste T-Zellproliferation beobachtet, und proliferierende T-Zellen aggregieren sich normalerweise zu Clustern. - Am Tag 10 die Zellkultur in jeder Vertiefung 7-9 Mal vorsichtig pipetten, um Zellcluster zu disaggregieren, die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu zählen und 2×105 Zellen in jeder Vertiefung auf eine 96-Well-Platte (runder Boden) für die HBV-spezifische CD4-T-Zell-Antwortanalyse zu übertragen.
- Setzen Sie die Kultivierung der übrigen Zellen zur Epitopidentifizierung am Tag 12 fort, stellen Sie das Volumen des Kulturmediums auf 100 μL ein (verwerfen Sie übermäßiges Medium) und ergänzen Sie die Kultur mit 100 μL frischem vollständigem Kulturmedium, das Peptide (4 μg / ml), IL-2 (100 U / ml) und IL-7 (20 ng / ml) enthält.
HINWEIS: Während Tag 7 bis Tag 10 vermehren sich die T-Zellen weiterhin kräftig. Ersetzen Sie das Kulturmedium wie in Schritt 3.5, wenn das Medium gelb wird. Im Allgemeinen überschreitet die Zellzahl 6×105 am Tag 10. Jede Vertiefung zeigt normalerweise eine ähnliche Zellzahl, zählt die Zellzahl in 3 Vertiefungen und verwendet den Durchschnittswert als Schätzung der Zellzahl für alle Vertiefungen.
4. Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen mittels intrazellulärer Durchflusszytometrie
- Stimulierung von PBMCs mit Peptidpools
- Für die auf die 96-Well-Platte (runder Boden) übertragenen Zellen 3 mal in einer Platte waschen (550 × g, 3 min). Verwenden Sie 200 μL Medium für jede Wäsche (RPMI 1640 für die ersten 2 Waschgänge, vollständiges Kulturmedium für die letzte Wäsche). Verwerfen Sie die Überstände.
HINWEIS: Die Entfernung von Restzytokinen in der Kultur durch wiederholtes Waschen könnte den Hintergrund in der intrazellulären Durchflusszytometrie-Analyse effektiv verringern. - Fügen Sie für jede Zellbohrung, die mit einem spezifischen Peptidpool stimuliert wird, 200 μL vollständiges Kulturmedium hinzu, das mit den gleichen Peptidpools ergänzt wird (2 μg / ml für jedes einzelne Peptid). Für die Hintergrundkontrolle fügen Sie ein komplettes Kulturmedium hinzu, das mit 1 μL / ml DMSO ergänzt wird. Für die Positivkontrolle fügen Sie ein komplettes Kulturmedium hinzu, das mit 1 μL / ml DMSO, 150 ng / ml Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) und 1 μmol / L Ionomycin ergänzt wird.
HINWEIS: Eine hohe Dosis DMSO blockiert die Zytokinsekretion von T-Zellen (am wichtigsten für TNF-α). Eine Dosis von DMSO über 5 μL/ml wird nicht empfohlen. Im Allgemeinen überschreitet die Dosis von DMSO in unserem Experiment 1 μL / ml nicht. - Bei 37 °C und 5% CO 2 für6 h inkubieren.
- Nach 1 h Inkubation Wird Monensin (1,37 μg/ml) in die Kultur geben.
- Für die auf die 96-Well-Platte (runder Boden) übertragenen Zellen 3 mal in einer Platte waschen (550 × g, 3 min). Verwenden Sie 200 μL Medium für jede Wäsche (RPMI 1640 für die ersten 2 Waschgänge, vollständiges Kulturmedium für die letzte Wäsche). Verwerfen Sie die Überstände.
- Durchflusszytometrie
- Nach 6 h Inkubation. Überstand nach Zentrifugation (550 × g, 3 min), Waschen sie die Zellen einmal mit 200 μL DPBS (550 × g, 3 min), Fleckenoberflächenmarkern (CD3, CD4 und CD8) und Lebensfähigkeitsmarker (mit Fixable Viability Dye) in einem 4 °C Kühlschrank für 30 min.
- Einmal mit 200 μL DPBS (550 × g, 3 min) waschen. Fixieren und permeabilisieren Sie Zellen und färben Sie intrazelluläre Zytokine (TNF-α und IFN-γ) in einem 4 °C Kühlschrank für 45 min.
- Nach der abschließenden Wäsche in der intrazellulären Färbung werden die Zellen in 150 μL Durchflusszytometriepuffer (DPBS + 0,5% BSA) resuspendiert.
- Erfassen Sie Durchflusszytometriedaten auf einem Durchflusszytometer.
- Analyse der Ergebnisse der Durchflusszytometrie
- Definition des positiven Brunnens: Betrachten Sie einen Brunnen als positiv, wenn er eine Häufigkeit von Zytokin-sezernierenden T-Zellen mindestens das Zweifache der Hintergrundkontrollbohrung aufwies (Abbildung 1).
- Berechnen Sie nach der folgenden Formel die Ansprechrate für jedes analysierte Zytokin (Abbildung 2):
HINWEIS: Der Zeilenpeptidpool und die Säulenpeptidpools in der Matrix repräsentieren 2 verschiedene Formationen des HBV-Kernantigens, daher sollte die endgültige Ansprechrate durch 2 geteilt werden.
5. Identifizierung von HBV-spezifischen HLA-DR-beschränkten CD4-T-Zell-Epitopen
- Auftauen und Pflegen allogener B-lymphoblastoider Zelllinien (BLCLs) im T-75-Kolben (5-20 ×106 Zellen, 20 ml vollständiges Kulturmedium).
HINWEIS: Um den guten Zustand der BLCLs zu gewährleisten, sollte dieser Schritt 2 Wochen vor dem Auftauen der PBMCs der Patienten eingeleitet werden. BLCLs müssen im HLA-DRB1-Allel homozygot sein. Gemäß dem Genotypisierungsergebnis sollten patienten das gleiche HLA-DRB1-Allel wie BLCLs teilen. - Screening von Kandidatenpeptiden zur Identifizierung (Abbildung 3)
- Gemäß den Ergebnissen der T-Zell-Antwortrate am Tag 10 sollten 2 Peptidpools mit der höchsten Ansprechrate (1-Reihen-Peptidpool und 1-Säulen-Peptidpool) untersucht werden.
- Setzen Sie das Peptid in diesen 2 Pools als Kandidatenpeptid, wenn der andere Peptidpool, der dieses Peptid enthält, auch ein positives Ergebnis in der T-Zell-Antwortanalyse zeigt. Verwenden Sie die PBMCs, die mit dem anderen Peptidpool erweitert wurden, um später Epitope zu identifizieren.
- Pulsierende BLCLs mit Peptid
- Zählen Sie an Tag 12 die Anzahl der lebensfähigen BLCLs, übertragen Sie die Zellen auf 15 ml Zentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie (350 × g, 10 min) und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in vollständigem Kulturmedium und aliquot BLCLs auf eine 96-Well-Platte (runder Boden) bei 4×104 Zellen/Vertiefung in 80 μL vollständigem Kulturmedium.
- Ein einzelnes Peptid (10 μg/ml) hinzufügen, bei 37 °C und 5% CO2 für 2 h inkubieren. Set 2 Hintergrundkontrolle: Peptidpulsing mit HLA-DR-Blockierung (Vorbehandlung mit Anti-HLA-DR (10 μg/ml) für 1 h); DMSO (1 μL/ml) pulsierend. Das Endvolumen des vollständigen Kulturmediums in jeder Vertiefung beträgt 100 μL.
- Mitomycin C (100 μg/ml) hinzufügen, bei 37 °C und 5% CO2 für 1 h inkubieren.
- 3 mal mit 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in einer Platte waschen, um ungepulstes Peptid und Mitomycin C zu entfernen. Für die erste Wäsche die Inkubationskultur mit 100 μL RPMI 1640 ergänzen.
- Resuspend Zellen in 120 μL vollständigem Kulturmedium.
- Stimulation von PBMCs mit peptidgepulsten BLCLs.
- An Tag 12 PBMCs auf eine 96-Well-Platte (runder Boden) übertragen.
- Den Überstand nach der Zentrifugation (550 × g, 3 min) in einer Platte entfernen, zweimal mit 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in einer Platte waschen.
HINWEIS: Die Entfernung von Restzytokinen und Peptiden in der Kultur durch wiederholtes Waschen ist der Schlüsselschritt, um den Hintergrund in der intrazellulären Durchflusszytometrie-Analyse zu verringern. Besonders bei Restpeptiden bindet es an BLCLs und erhöht den Hintergrund deutlich. - Resuspend PBMCs an jeder Vertiefung mit 210 μL vollständigem Kulturmedium.
- Für den Brunnen von PBMCs, die für die Epitopidentifikation ausgewählt wurden, mischen Sie das Aliquot (jeweils 70 μL) mit peptidgepulsten BLCLs (3 Vertiefungen, einschließlich 2 Hintergrundkontrollen).
HINWEIS: An Tag 12 erreicht die Anzahl der expandierten PBMCs in Peptidpools normalerweise über 5-7×105 pro Vertiefung, so dass das Verhältnis von PBMCs / BLCLs etwa 6/1 zu 4/1 beträgt. - Bei 37 °C und 5% CO 2 für6 h inkubieren.
- Nach 1 h Inkubation Wird Monensin (1,37 μg/ml) in die Kultur geben. Das endende Volumen des vollständigen Kulturmediums in jeder Vertiefung beträgt 200 μL.
- Durchflusszytometrie
- Wiederholen Sie die gleichen Vorgänge wie in Schritt 4.2.
- Analyse der Ergebnisse der Durchflusszytometrie
- Überprüfung eines Peptids als HLA-DR-beschränktes CD4-T-Zell-Epitop, wenn PBMCs, die mit diesem Peptid gepulst wurden, gepulste BLCLs eine Häufigkeit von Zytokin-sezernierenden CD4-T-Zellen zeigen, die mindestens das Zweifache der pbMCs aufweisen, die mit Hintergrundkontrollen inkubiert wurden (Peptidpulsing mit HLA-DR-Vorblockierung; DMSO pulsierend) (Abbildung 4).
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Representative Results
Die Häufigkeit der Zytokin-sezernierenden CD4-T-Zellen wird als Summe von Einzelproduzenten und Doppelproduzenten berechnet. Wie in Abbildung 1gezeigt, betragen die Häufigkeit von TNF-α sezernierenden CD4-T-Zellen und die Häufigkeit von IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen in der Hintergrundkontrolle (DMSO) 0,154% bzw. 0,013%. Die Häufigkeit der TNF-α sezernierenden CD4-T-Zellen und die Häufigkeit der IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen, die für den Peptidpool Core11 spezifisch sind, betragen 0,206 bzw. 0,017, so dass sowohl TNF-α sezernierende CD4-T-Zellantwort als auch IFN-γ SEZERNierende CD4-T-Zellantwort für diesen Peptidpool als negativ angesehen werden. Die Häufigkeit der TNF-α sezernierenden CD4-T-Zellen und die Häufigkeit der IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen, die für den Peptidpool Core09 spezifisch sind, betragen 2,715% bzw. 0,973%, so dass sowohl TNF-α sezernierende CD4-T-Zellantwort als auch IFN-γ SEZERNierende CD4-T-Zell-Antwort für diesen Peptidpool als positiv angesehen werden.
Wie in Abbildung 2gezeigt, sind positive Vertiefungen mit grauem Hintergrund dargestellt. Bei der Berechnung der HBV-kernspezifischen TNF-α sezernierenden CD4-T-Zell-Antwortrate sollten Daten der Peptidpools Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 und Core10 einbezogen werden. Bei der Berechnung der HBV-kernspezifischen IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zell-Antwortrate werden Daten der Peptidpools Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 und Core10 einbezogen.
Wie in Abbildung 3gezeigt, sind Kandidatenpeptide zur Epitopidentifizierung rot dargestellt. Core01 hat die höchste Ansprechrate sowohl für TNF-α die SEZERNierung von CD4-T-Zellen als auch für IFN-γ die Sekretion von CD4-T-Zellen in Säulenpeptidpools. Die Peptide C1-15, C31-45, C61-75 und C91-105 in diesem Peptidpool sind als Kandidatenpeptide festgelegt, da die Reihenpeptidpools, die diese Peptide enthalten, auch positive Ergebnisse bei der T-Zell-Reaktion zeigen. Die mit den Peptidpools Core07, Core08, Core09 und Core10 erweiterten PBMCs werden zur Epitopidentifizierung der Peptide C1-15, C31-45, C61-75 und C91-105 verwendet. Core09 hat die höchste Ansprechrate sowohl für TNF-α sezernierende CD4-T-Zellen als auch IFN-γ sezernierende CD4-T-Zellen in Reihenpeptidpools. Die Peptide C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 und C86-100 in diesem Peptidpool werden als Kandidatenpeptide festgelegt, da die Säulenpeptidpools, die diese Peptide enthalten, auch ein positives Ergebnis bei der T-Zell-Reaktion zeigen. Die mit den Peptidpools Core01, Core02, Core03, Core04, Core05 und Core06 erweiterten PBMCs werden zur Epitopidentifizierung der Peptide C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 bzw. C86-100 verwendet.
Wie in Abbildung 4gezeigt, sind für peptidpool Core08 expandierte PBMCs nach Stimulation mit gepulsten BLCLs des Peptids C31-45 die Häufigkeit von TNF-α sezernierenden CD4-T-Zellen und die Häufigkeit von IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen 0,995% bzw. 0,131%, was mehr als 2-mal höher ist als die Hintergrundkontrollen (Peptid C31-45 gepulste BLCLs mit HLA-DR-Vorblockierung, DMSO gepulste BLCLs). Somit ist das Peptid C31-45 als HLA-DR-beschränktes CD4-T-Zell-Epitop nachgewiesen. Für Peptidpool Core10 expandierte PBMCs nach Stimulation mit Peptid C91-105 gepulsten BLCLs, die Häufigkeit von TNF-α sezernierenden CD4 T-Zellen und die Häufigkeit von IFN-γ sezernierenden CD4 T-Zellen betragen 0,221% bzw. 0,000%, die die 2-fachen Hintergrundkontrollen (Peptid C91-45 gepulste BLCLs mit HLA-DR-Pre-Blocking, DMSO-gepulste BLCLs) nicht überschreiten, so dass Peptid C91-105 nicht als HLA-DR-beschränktes CD4-T-Zell-Epitop verifiziert ist.
Abbildung 1: Durchflusszytometrie-Demonstration von TNF-α/IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen in Peptidpools expandierten PBMCs nach Stimulation mit ihren jeweiligen Peptidpools. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Demonstration der Analyse HBV-kernspezifischer TNF-α/IFN-γ sezernierende CD4-T-Zellen. Die TNF/DMSO- und IFN-Ƴ/DMSO-Verhältnisse der Frequenzen von TNF-α/IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen in jeder Vertiefung von Peptidpool-stimulierten PBMCs geteilt durch die Häufigkeit von TNF-α/IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen in der Vertiefung der DMSO-Kontrolle. Grauer Hintergrund zeigt Vertiefungen mit positiver CD4-T-Zell-Reaktion an, die im Vergleich zur Hintergrundkontrolle beurteilt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Demonstration des Screenings von Kandidatenpeptiden zur Epitopidentifizierung. Die TNF/DMSO- und IFN-Ƴ/DMSO-Verhältnisse der Frequenzen von TNF-α/IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen in jeder Vertiefung von Peptidpool-stimulierten PBMCs geteilt durch die Häufigkeit von TNF-α/IFN-γ sezernierenden CD4-T-Zellen in der Vertiefung der DMSO-Kontrolle. Grauer Hintergrund zeigt Vertiefungen mit positiver CD4-T-Zell-Reaktion an, die im Vergleich zur Hintergrundkontrolle beurteilt wird. Peptide in Rot zeigen Kandidatenpeptide gemäß den Screening-Kriterien an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Durchflusszytometrie Demonstration der Ergebnisse der Epitopidentifikation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die kritischsten Schritte in diesem Protokoll sind wie folgt aufgeführt: 1) genügend PBMCs mit hoher Lebensfähigkeit, um die PBMCs-Expansion zu starten; 2) geeignete Umgebung für die Erweiterung von PBMCs; und 3) vollständige Entfernung von restenPtidpools in PBMCs-Kultur vor der Epitopidentifizierung.
Die gesamte Analyse in diesem Protokoll hängt von der robusten Proliferation von CD4-T-Zellen ab. Im Allgemeinen ist die Anzahl der PBMCs nach 10-tägiger Erweiterung das 2-3-fache der ursprünglichen Anzahl. Die Zellzahl und die Lebensfähigkeit von PBMCs sind 2 Schlüsselfaktoren bei der Expansion von PBMCs. Wenn der Zweck nur darin besteht, HBV-spezifische CD4-T-Zellen ohne Epitopidentifikation zu analysieren, ist es sinnvoll, die anfängliche PBMCs-Anzahl zu reduzieren, insbesondere wenn das Volumen der Blutprobe begrenzt ist. Während nach unserer Erfahrung eine erfolgreiche PBMCs-Expansion kaum erreicht werden konnte, wenn die Startzahl der PBMCs unter 1,5×105 Zellen / Well liegt. Bei der Verwendung von frischen PBMCs für die Expansion ist die Zelllebensfähigkeit kein Problem. Bei der Verwendung von kryokonservierten PBMCs zur Expansion sollte die Kryokonservierung und das Auftauen von PBMCs sehr sorgfältig durchgeführt werden, um die Lebensfähigkeit von PBMCs zu erhalten.
In der Funktionellen Analyse von HBV-spezifischen T-Zellen wird IL-12 normalerweise in der PBMCs-Expansion verwendet, um die Funktion von CD8-T-Zellen zu verbessern. Da IL-12 eine Differenzierung von CD4-T-Zellen in Richtung CD4-T-Follikel-Helferzellen induzieren könnte, sollte dieses Zytokin bei der funktionellen Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen vermieden werden. In unserem Protokoll werden nur IL-2 (für T-Zell-Expansion) und IL-7 (für T-Zell-Überleben) ergänzt, um das Funktionelle Profil von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen während der Expansion so intakt wie möglich zu halten. Wir haben 5 Zytokine für die funktionelle Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen getestet: TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 und IL-21. In unseren analysierten Proben sind TNF-α und IFN-γ 2 Hauptzytokine, die von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen sezerniert werden16. Bei der Analyse des funktionellen Profils von HBV-spezifischen CD4-T-Zellen wird empfohlen, so viele zytokine wie möglich zu testen, um die detaillierten funktionellen Profilinformationen zu erhalten. Bei der Epitopidentifikation wird empfohlen, nur TNF-α und IFN-γ aus wirtschaftlichen Gründen zu analysieren.
Genügend HBV-spezifische CD4-T-Zellen sind für eine erfolgreiche Epitopidentifizierung von entscheidender Bedeutung, daher sollte die Epitopidentifizierung bei Patienten mit hoher HBV-spezifischer CD4-T-Zell-Reaktion in Betracht gezogen werden, z. B. bei Hepatitis-B-Flare-Patienten (starke HBV-spezifische TNF-α sezernierende CD4-T-Zell-Reaktion) und Patienten mit viraler Clearance (starke HBV-spezifische IFN-γ CD4-T-Zell-Reaktion)16 . Es ist sehr wichtig, Restpeptide im Peptidpool expandierte PBMCs durch wiederholtes Waschen zu entfernen, bevor diese Zellen mit BLCLs zur Epitopidentifikation inkubiert werden. Die Restpeptide binden an DMSO gepulste BLCLs, aktivieren peptidspezifische CD4-T-Zellen und vergrößern dabei den Hintergrund in hohem Maße.
Einige HBV-Antigene haben variable Sequenzen in verschiedenen HBV-Genotypen (z. B. HBV-Oberflächenantigen). Eine Lösung besteht darin, die spezifischen HBV-Genotypen bei Patienten vorzubestimmen und HBV-Genotyp-spezifische Peptidpools für Patienten mit unterschiedlichen HBV-Genotypen zu entwerfen. Während der HBV-Genotyp bei Patienten mit niedrigen HBV-Viruslasten (z. B. HBeAg-negative Patienten mit regelmäßiger antiviraler Behandlung) nicht messbar ist, besteht die Lösung in diesem Szenario darin, Peptide aus verschiedenen HBV-Genotypen in dieselben Peptidpools zu mischen, wie wir es in einer früheren Studie getan haben16. Ein Nachteil dieser Mischungsstrategie ist, dass Epitop als Peptidpaar, aber nicht als einzelnes Peptid identifiziert werden kann, da einige Positionen in der Peptidmatrix ein Peptidpaar im selben Fragment des Antigens enthalten.
Ein großer Nachteil bei dieser Methode ist die zeitaufwändige 10-Tage-PBMCs-Erweiterung. Derzeit konnte die Ex-vivo-Analyse der Zytokinsekretion HBV-spezifische CD4-T-Zellen nicht zuverlässig nachweisen. Die Verwendung von peptidgepulsten allogenen BLCLs als Stimulatoren detektierte in der Regel mehr peptidspezifische CD4-T-Zellen in peptiddehnten PBMCs, verglichen mit der einfachen Stimulation mit Peptiden16. Es lohnt sich zu untersuchen, ob die Verwendung von peptidgepulsten autologen B-Zellen als Antigenpräsentationszellen helfen könnte, HBV-spezifische CD4-T-Zellen ex vivo zuverlässig nachzuweisen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81930061), der Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) und Chinese Key unterstützt.
Projekt spezialisiert auf Infektionskrankheiten (2018ZX10723203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
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