Summary
Sulla base di una matrice peptidica derivata dal virus dell'epatite B (HBV), le risposte delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV potrebbero essere valutate in parallelo con l'identificazione di epitopi di cellule T CD4 specifiche per HBV.
Abstract
Le cellule T CD4 svolgono un ruolo importante nella patogenesi dell'epatite B cronica. Come popolazione cellulare versatile, le cellule T CD4 sono state classificate come sottoinsiemi funzionali distinti in base alle citochine che hanno secreto: ad esempio, IFN-γ per le cellule CD4 T helper 1, IL-4 e IL-13 per le cellule CD4 T helper 2, IL-21 per le cellule helper follicolari CD4 T e IL-17 per le cellule CD4 T helper 17. L'analisi delle cellule T CD4 specifiche del virus dell'epatite B (HBV) sulla base della secrezione di citochine dopo la stimolazione dei peptidi derivati dall'HBV potrebbe fornire informazioni non solo sull'entità della risposta delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV, ma anche sui sottoinsiemi funzionali delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV. Nuovi approcci, come la trascrittomica e l'analisi metabolomica, potrebbero fornire informazioni funzionali più dettagliate sulle cellule T CD4 specifiche dell'HBV. Questi approcci di solito richiedono l'isolamento di cellule T CD4 vitali specifiche per HBV basate su multimeri del complesso II di istocompatibilità peptidico-maggiore, mentre attualmente le informazioni sugli epitopi delle cellule T CD4 specifiche per HBV sono limitate. Sulla base di una matrice peptidica derivata dall'HBV, è stato sviluppato un metodo per valutare le risposte delle cellule T CD4 specifiche per l'HBV e identificare gli epitopi delle cellule T CD4 specifici dell'HBV utilizzando contemporaneamente campioni di cellule mononucleate del sangue periferico da pazienti con infezione cronica da HBV.
Introduction
Attualmente, ci sono 3 approcci principali per analizzare le cellule T antigene-specifiche. Il primo approccio si basa sull'interazione tra il recettore delle cellule T e il peptide (epitopo). Le cellule T antigene-specifiche potrebbero essere direttamente colorate con multimeri del complesso di istocompatibilità peptidico maggiore (MHC). Il vantaggio di questo metodo è che potrebbe ottenere cellule T antigene-specifiche vitali, adatte per l'analisi trascrittomica/metabolomica a valle. Una limitazione di questo metodo è che non potrebbe fornire informazioni sull'intera risposta delle cellule T a un antigene specifico, in quanto richiede peptidi epitopi convalidati mentre il numero di epitopi identificati per un antigene specifico è limitato per ora. Rispetto agli epitopi delle cellule T CD8 specifici del virus dell'epatite B (HBV), sono stati identificati meno epitopi delle cellule T CD4 specifici dell'HBV1,2,il che ha reso questo metodo meno applicabile per l'analisi delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV attualmente.
Il secondo approccio si basa sulla sovraregolazione di una serie di marcatori indotti dall'attivazione dopo stimolazione peptidica antigenica3. I marcatori comunemente usati includono CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Questo metodo è stato ora utilizzato per analizzare le risposte antigene-specifiche delle cellule T in individui vaccinati5,6, pazienticon infezione da virus dell'immunodeficienza umana 7 epazienticon infezione da sindrome respiratoria acuta grave da Coronavirus2 8,9. A differenza del test basato su multimeri peptidi-MHC, questo metodo non è limitato da epitopi convalidati e potrebbe ottenere cellule vitali per l'analisi a valle. Una limitazione di questo metodo è che non è stato in grado di fornire informazioni sul profilo delle citochine delle cellule T antigene-specifiche. Inoltre, l'espressione di questi marcatori indotti dall'attivazione da parte di alcune cellule non specifiche dell'antigene attivato potrebbe contribuire ai segnali di fondo in analisi, il che potrebbe essere un problema soprattutto quando le cellule T antigene-specifiche target sono rare. Attualmente, c'è un'applicazione limitata di questo metodo sulle cellule T CD4 specifiche per HBV4. Se questo metodo possa essere utilizzato per analizzare le cellule T CD4 specifiche dell'HBV in modo affidabile richiede ulteriori indagini.
Il terzo approccio si basa sulla secrezione di citochine dopo la stimolazione del peptide antigenico. Come l'analisi basata su marcatori indotta dall'attivazione, questo metodo non è limitato da epitopi convalidati. Questo metodo potrebbe rivelare direttamente il profilo delle citochine delle cellule T antigene-specifiche. La sensibilità di questo metodo è inferiore al metodo basato su marcatori indotti dall'attivazione in quanto si basa sulla secrezione di citochine di cellule T antigene-specifiche e il numero di citochine testate è solitamente limitato. Attualmente, questo metodo è ampiamente utilizzato nell'analisi delle cellule T HBV-specifiche. Poiché le cellule T hbV-specifiche secernenti citochine difficilmente potrebbero essere rilevate mediante stimolazione peptidica diretta ex vivo10,11,il profilo delle citochine delle cellule T HBV-specifiche viene solitamente analizzato dopo 10 giorni di espansione stimolata dal peptide in vitro12,13,14,15,16. La disposizione dei pool peptidici in forma di matrice è stata utilizzata per facilitare l'identificazione degli epitopi antigene-specifici17,18. Con la combinazione di matrice peptidica e analisi della secrezione di citochine, è stato sviluppato un metodo per valutare le risposte delle cellule T CD4 specifiche per HBV e identificare contemporaneamente gli epitopi delle cellule T CD4 specifici dell'HBV16. In questo protocollo, vengono descritti i dettagli di questo metodo. L'antigene centrale HBV viene scelto come esempio di dimostrazione in questo protocollo.
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Protocol
Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun paziente incluso nello studio. Il protocollo di studio è conforme alle linee guida etiche della Dichiarazione di Helsinki del 1975, come riflesso nell'approvazione a priori da parte del comitato etico medico del Southwest Hospital.
1. Progettazione della matrice peptidica derivata dall'HBV
- Scarica le sequenze aminoacidiche dell'antigene del nucleo HBV dai database NCBI (GenBank: AFY98989.1).
- Acquista peptidi derivati dall'antigene centrale HBV (un pannello di 35 peptidi 15-mer sovrapposti da 10 residui, purezza > 90%, 4 mg / peptide) da un fornitore di servizi di sintesi peptidica.
- Impostare una matrice peptidica quadrata 6×6 con ogni posizione nella matrice contenente solo 1 peptide. Ci sono 12 pool di peptidi: 6 pool di peptidi di fila e 6 pool di peptidi a colonna, 5-6 peptidi in ogni pool16. I pool peptidici di riga e i pool peptidici di colonna nella matrice rappresentano 2 formazioni separate di antigene centrale HBV.
- Per 3/4 dei peptidi acquistati, mescolare i peptidi nella stessa riga / colonna della matrice in 12 pool peptidici separati sciogliendoli insieme in dimetilsolfossido (DMSO) (2 μg / μL per ciascun peptide). Conservare a -80 °C per l'analisi delle risposte delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV.
- Sciogliere il resto dei peptidi separatamente (10 μg/μL) e conservare a -80 °C per l'identificazione dell'epitopo.
2. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)
- Campione di 5 ml di sangue venoso da pazienti con infezione cronica da HBV.
NOTA: Il volume del sangue deve essere approssimativamente stimato in base al numero di pool peptidici più 1 controllo di fondo e 1 controllo positivo. L'analisi di 1 pool peptidico richiede 3 x10 5 PBMC. In media, 1 x 106 PBMC potrebbero essere ottenuti da 1 mL di sangue. - Isolare i PBMC dal sangue utilizzando la centrifugazione con gradiente di densità Ficoll (800 × g, 20 min) e crioconservare PBMC isolati in azoto liquido per un uso successivo.
- Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere i granulociti tra lo strato chiaro di Ficoll e lo strato di globuli rossi. Estrarre il DNA genomico dai granulociti utilizzando un kit di purificazione del DNA genomico secondo il protocollo del produttore.
- Inviare il campione di DNA ai fornitori di servizi di genotipizzazione per determinare il genotipo HLA-DRB1.
3. Espansione in vitro di PBMC utilizzando una matrice peptidica HBV
- Scongelare i PBMC.
- RPMI 1640 caldo integrato con 1:10.000 benzonasi (25 U/mL) a 37 °C a bagnomaria.
NOTA: La benzonasi aiuta a limitare l'aggregazione cellulare durante lo scongelamento. Ogni campione richiederà 20 ml di RPMI 1640 con benzonasi. Calcolare la quantità necessaria per scongelare tutti i campioni e preparare un'aliquota separata di mezzi (37 °C) con 1:10.000 benzonasi (25 U/mL). Scongelare non più di 5 campioni alla volta. - Rimuovere i campioni dall'azoto liquido e scongelare rapidamente i flaconcini congelati a bagnomaria (37 °C).
- Trasferire la sospensione cellulare scongelata in un tubo centrifugo da 15 ml. Aggiungere 1 mL di benzonasi RPMI 1640 (37 °C) a goccia al tubo. Aggiungere lentamente 6 mL di Benzonasi RPMI 1640 (37 °C) al tubo della centrifuga, sciacquare crioviale con altri 2 mL di Benzonasi RPMI 1640 (37 °C) per recuperare tutte le cellule. Continuare con il resto dei campioni il più rapidamente possibile.
NOTA: La lenta diluizione dei campioni crioconservati è la chiave per mantenere la vitalità delle cellule scongelate. - Centrifugare (400 × g, 10 min), rimuovere il surnatante e allentare il pellet picchiettando il tubo.
- Riaspentare delicatamente il pellet in 1 mL di benzonasi calda RPMI 1640. Mescolare delicatamente e filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 70 μm, se necessario (cioè se esiste un grumo visibile).
- Aliquotare una sospensione di 10 μL e diluire nella soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), aggiungere il blu di Tripano (0,04%), caricare su un emocitometro, attendere 1 minuto e contare il numero di cellule vitali (cellule chiare).
- Aggiungere 9 mL di benzonasi RPMI 1640 (37 °C) al tubo, centrifugare (400 × g, 10 min), rimuovere il surnatante e allentare il pellet picchiettando il tubo.
- RPMI 1640 caldo integrato con 1:10.000 benzonasi (25 U/mL) a 37 °C a bagnomaria.
- PBMC risospesi in RPMI 1640 integrati con 25 mM HEPES, 2 mM L-glutammina, 1 mM piruvato di sodio, 100 U/mL penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 10% di siero AB umano (terreno di coltura completo). Regolare la densità della cella a 1,5 x10 6 celle/ml. PBMC a piastre a piastra in piastre a 96 pozzetti (fondo piatto) ad una densità di 3 x 105 celle/pozzettino.
- Aggiungere pool peptidici derivati dall'HBV (2 μg/mL per ogni singolo peptide) a ciascun pozzetti. Per i pozzi di controllo di fondo e controllo positivo, aggiungere la stessa quantità di solvente (DMSO, 1 μL/mL). Aggiungere 10 U/mL IL-2 e 10 ng/mL IL-7. Incubare a 37 °C e 5% CO2.
- Al giorno 3, integrare il terreno di coltura con 50 U/ mL di IL-2 e 10 ng / mL di IL-7.
NOTA: Durante il giorno 1 al giorno 3, non si osserverà un'evidente proliferazione delle cellule T. Il numero totale di cellule di solito diminuisce da 1/3 a 1/2, a causa della morte di cellule non T come cellule B, cellule NK, cellule NKT e monociti. - Al giorno 7, sostituire metà del terreno di coltura con un mezzo fresco contenente peptidi (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) e IL-7 (20 ng/mL).
NOTA: Per evitare di disturbare le cellule nella parte inferiore, pipettare con attenzione circa 90 μL di terreno di coltura dalla parte superiore del mezzo. Durante il giorno 3 al giorno 7, si osserverà una robusta proliferazione delle cellule T e le cellule T proliferanti di solito si aggregano per formare cluster. - Al giorno 10, pipettare delicatamente la coltura cellulare in ciascun pozzetti 7-9 volte per disaggregare i cluster cellulari, contare il numero di cellule vitali e trasferire 2×105 cellule in ciascun pozzetti in una piastra a 96 pozzetti (fondo rotondo) per l'analisi della risposta delle cellule T CD4 specifiche per HBV.
- Continuare a coltivare il resto delle cellule per l'identificazione dell'epitopo al giorno 12, regolare il volume del terreno di coltura a 100 μL (scartando il mezzo eccessivo) e integrare la coltura con 100 μL di terreno di coltura completo fresco contenente peptidi (4 μg / mL), IL-2 (100 U / mL) e IL-7 (20 ng / mL).
NOTA: Durante il giorno 7 al giorno 10, le cellule T continuano a proliferare vigorosamente. Sostituire il terreno di coltura come nel passaggio 3.5 se il mezzo diventa giallo. In generale, il numero di cellulare supererà 6×105 al giorno 10. Ogni pozzo di solito mostra un numero di cella simile, conta il numero di celle in 3 pozzi e usa il valore medio come stima del numero di celle per tutti i pozzi.
4. Analisi delle risposte delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV mediante citometria a flusso intracellulare
- PBMC stimolanti con pool peptidici
- Per le celle trasferite alla piastra a 96 pozzetti (fondo rotondo), lavare 3 volte in una piastra (550 × g, 3 min). Utilizzare 200 μL di terreno per ogni lavaggio (RPMI 1640 per i primi 2 lavaggi, terreno di coltura completo per l'ultimo lavaggio). Scartare i supernatanti.
NOTA: La rimozione delle citochine residue nella coltura mediante lavaggio ripetuto potrebbe ridurre efficacemente il background nell'analisi citometrica a flusso intracellulare. - Per ogni pozzettino di cellule stimolate con uno specifico pool peptidico, aggiungere 200 μL di terreno di coltura completo integrato con gli stessi pool peptidici (2 μg/mL per ogni singolo peptide). Per il pozzo di controllo dello sfondo, aggiungere un terreno di coltura completo integrato con 1 μL/mL di DMSO. Per il pozzo di controllo positivo, aggiungere un terreno di coltura completo integrato con 1 μL / mL di DMSO, 150 ng / mL di phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) e 1 μmol / L di ionomicina.
NOTA: Alte dosi di DMSO bloccheranno la secrezione di citochine delle cellule T (più significativa per il TNF-α). La dose di DMSO superiore a 5 μL/mL non è raccomandata. Generalmente, la dose di DMSO nel nostro esperimento non supera 1 μL / mL. - Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 6 ore.
- Dopo 1 ora di incubazione, aggiungere Monensin (1,37 μg/mL) alla coltura.
- Per le celle trasferite alla piastra a 96 pozzetti (fondo rotondo), lavare 3 volte in una piastra (550 × g, 3 min). Utilizzare 200 μL di terreno per ogni lavaggio (RPMI 1640 per i primi 2 lavaggi, terreno di coltura completo per l'ultimo lavaggio). Scartare i supernatanti.
- Citometria a flusso
- Dopo 6 ore di incubazione. Rimuovere il surnatante dopo centrifugazione (550 × g, 3 min), lavare le celle una volta con 200 μL di DPBS (550 × g, 3 min), marcatori di superficie (CD3, CD4 e CD8) e marcatore di vitalità (utilizzando Fixable Viability Dye) in frigorifero a 4 °C per 30 min.
- Lavare una volta con 200 μL di DPBS (550 × g, 3 min). Fissare e permeabilizzare le cellule e macchiare le citochine intracellulari (TNF-α e IFN-γ) in frigorifero a 4 °C per 45 min.
- Dopo il lavaggio finale nella colorazione intracellulare, risusependare le cellule in 150 μL di tampone citometrico a flusso (DPBS + 0,5% BSA).
- Acquisire dati di citometria a flusso su un citometro a flusso.
- Analisi dei risultati della citometria a flusso
- Definizione di pozzo positivo: considerare un bene come positivo se ha una frequenza di citochine che secernono cellule T almeno due volte del pozzo di controllo di fondo (Figura 1).
- Secondo la seguente formula, calcolare il tasso di risposta per ogni citochina analizzata (Figura 2):
NOTA: Il pool peptidico di riga e i pool peptidici di colonna nella matrice rappresentano 2 formazioni distinte di antigene del nucleo dell'HBV, quindi il tasso di risposta finale deve essere diviso per 2.
5. Identificazione degli epitopi a cellule T CD4 con HLA-DR Restricted HV-specific
- Scongelare e mantenere le linee cellulari linfoblastoidi B allogeniche (GLCL) nel matraccio T-75 (5-20 ×106 cellule, 20 ml di terreno di coltura completo).
NOTA: Per garantire il buono stato dei GLCL, questa fase deve essere iniziata 2 settimane prima dello scongelamento delle PBMC dei pazienti. Le BCLC devono essere omozigoti nell'allele HLA-DRB1. Secondo il risultato della genotipizzazione, i pazienti devono condividere lo stesso allele HLA-DRB1 dei GLCL. - Screening dei peptidi candidati per l'identificazione (Figura 3)
- Secondo i risultati del tasso di risposta delle cellule T al giorno 10, escludere 2 pool di peptidi con il più alto tasso di risposta (pool peptidico a 1 riga e pool peptidico a 1 colonna).
- Impostare il peptide in quei 2 pool come peptide candidato se anche l'altro pool peptidico contenente questo peptide mostra un risultato positivo nell'analisi della risposta delle cellule T. Utilizzare i PBMC espansi con l'altro pool peptidico per l'identificazione dell'epitopo in un secondo momento.
- GLCL pulsanti con peptide
- Al giorno 12, contare il numero di GLCL vitali, trasferire le celle in tubi centrifughi da 15 ml, centrifugare (350 × g, 10 min) e rimuovere il surnatante. Risuscisciare il pellet cellulare in un terreno di coltura completo e aliquotal in una piastra a 96 pozzetti (fondo tondo) a 4×104 celle / pozzetti in un terreno di coltura completo da 80 μL.
- Aggiungere un singolo peptide (10 μg/mL), incubare a 37 °C e 5% CO2 per 2 ore. Set 2 controllo di fondo: pulsazione peptidica con blocco HLA-DR (pretrattamento con anti-HLA-DR (10 μg/mL) per 1 h); DMSO (1 μL/mL) pulsante. Il volume finale del terreno di coltura completo in ciascun pozzo è di 100 μL.
- Aggiungere mitomicina C (100 μg/mL), incubare a 37 °C e 5% CO2 per 1 ora.
- Lavare 3 volte con 200 μL di RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in una piastra per rimuovere il peptide non pulsato e la mitomicina C. Per il primo lavaggio, integrare la coltura di incubazione con 100 μL di RPMI 1640.
- Cellule di ripresa in 120 μL di terreno di coltura completo.
- PBMC stimolanti con GLCL pulsati peptidici.
- Al giorno 12, trasferire i PBMC su una piastra a 96 pozzetti (fondo tondo).
- Rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione (550 × g, 3 min) in un piatto, un lavaggio due volte con 200 μL di RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in una piastra.
NOTA: La rimozione di citochine e peptidi residui in coltura mediante lavaggio ripetuto è il passo chiave per ridurre il background nell'analisi della citometria a flusso intracellulare. Soprattutto per i peptidi residui, si legherà ai GLCL e aumenterà significativamente lo sfondo. - Sospend PBMC in ogni pozzo con 210 μL di terreno di coltura completo.
- Per il pozzo di PBMC scelto per l'identificazione degli epitopi, mescolare l'aliquota (70 μL ciascuna) con GLCL pulsati peptidici (3 pozzetti, inclusi 2 controlli di fondo).
NOTA: Al giorno 12, il numero di POOL peptidici espansi PBMC di solito raggiunge oltre 5-7×105 per pozzetti, quindi il rapporto tra PBMC / BLCL è di circa 6/1 a 4/1. - Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 6 ore.
- Dopo 1 ora di incubazione, aggiungere Monensin (1,37 μg/mL) alla coltura. Il volume finale del terreno di coltura completo in ciascun pozzo è di 200 μL.
- Citometria a flusso
- Ripetere le stesse operazioni del passaggio 4.2.
- Analisi dei risultati della citometria a flusso
- Verificare un peptide come epitopo delle cellule T CD4 limitato HLA-DR se le PBMC incubate con questo peptide pulsato BLCL mostrano una frequenza di cellule T CD4 secernenti citochine almeno due volte delle PBMC incubate con controlli di fondo (peptide pulsante con pre-blocco HLA-DR; DMSO pulsante) (Figura 4).
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Representative Results
La frequenza delle cellule T CD4 che secernono citochine è calcolata come la somma sia dei singoli produttori che dei doppi produttori. Come dimostrato nella Figura 1, la frequenza delle cellule T4 secernenti TNF-α e la frequenza delle cellule T CD4 secernenti IFN-γ nel controllo di fondo (DMSO) sono rispettivamente dello 0,154% e dello 0,013%. La frequenza delle cellule T CD4 secernenti TNF-α e la frequenza delle cellule T CD4 secernenti IFN-γ specifiche per il pool peptidico Core11 sono rispettivamente 0,206 e 0,017, quindi sia la risposta delle cellule T CD4 secernenti T α T che la risposta delle cellule T CD4 secernenti IFN-γ per questo pool peptidico sono considerati negativi. La frequenza delle cellule T CD4 secernenti TNF-α e la frequenza delle cellule T CD4 secernenti IFN-γ specifiche per il pool peptidico Core09 sono rispettivamente del 2,715% e dello 0,973%, quindi sia la risposta delle cellule T CD4 secernenti T α T che la risposta delle cellule T CD4 secernenti IFN-γ per questo pool peptidico sono considerati positivi.
Come dimostrato nella Figura 2, i pozzeli positivi sono indicati con sfondo grigio. Quando si calcola il TNF-α che secerne il tasso di risposta delle cellule T CD4, devono essere inclusi i dati dei pool peptidici Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 e Core10. Quando si calcola il tasso di risposta delle cellule T DELLE cellule T CD4 specifico γ del nucleo HBV, sono inclusi i dati dei pool peptidici Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 e Core10.
Come dimostrato nella Figura 3,i peptidi candidati per l'identificazione degli epitopi sono indicati in rosso. Core01 ha il più alto tasso di risposta sia per le cellule T T T che secernono Tnf-α che secernono cellule T che secernono IFN e IFN-γ in pool peptidici di colonna. I peptidi C1-15, C31-45, C61-75 e C91-105 in questo pool peptidico sono impostati come peptidi candidati poiché i pool peptidici di fila contenenti tali peptidi mostrano anche risultati positivi nella risposta delle cellule T. I PBMC espansi con i pool peptidici Core07, Core08, Core09 e Core10 sono utilizzati per l'identificazione degli epitopi dei peptidi C1-15, C31-45, C61-75 e C91-105, rispettivamente. Core09 ha il più alto tasso di risposta sia per le cellule T T4 secernenti T che secernono T α T secernono IFN-γ in pool peptidici di fila. I peptidi C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 e C86-100 in questo pool peptidico sono impostati come peptidi candidati poiché i pool peptidici di colonna contenenti tali peptidi mostrano anche un risultato positivo nella risposta delle cellule T. I PBMC espansi con i pool peptidici Core01, Core02, Core03, Core04, Core05 e Core06 sono utilizzati per l'identificazione degli epitopi dei peptidi C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 e C86-100, rispettivamente.
Come dimostrato nella Figura 4, per i PBMC espansi core08 del pool peptidico, dopo la stimolazione con GLCL pulsati del peptide C31-45, la frequenza delle cellule T CD4 secernenti T4 del TNF-α e la frequenza delle cellule T CD4 secernenti IFN-γ sono rispettivamente dello 0,995% e dello 0,131%, che sono più di 2 volte superiori ai controlli di fondo (VLCL pulsati del peptide C31-45 con pre-blocco HLA-DR, DMSO BLCL pulsati). Pertanto, il peptide C31-45 è verificato come un epitopo delle cellule T CD4 limitato HLA-DR. Per i PBMC espansi core10 del pool peptidico, dopo la stimolazione con il peptide C91-105 BCL pulsati, la frequenza delle cellule T CD4 secernenti T4 α T e la frequenza delle cellule T CD4 secernenti IFN-γ sono rispettivamente dello 0,221% e dello 0,000%, che non superano i 2 tempi dei controlli di fondo (peptide C91-45 BCL pulsati con pre-blocco HLA-DR, GLCL pulsati DMSO), quindi il peptide C91-105 non è verificato come epitopo delle cellule T CD4 limitato HLA-DR.
Figura 1: Dimostrazione della citometria a flusso di TNF-α/IFN-γ che secernono cellule T CD4 in pool peptidici PBMC espansi dopo essere stimolati con i rispettivi pool peptidici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dimostrazione dell'analisi hbV core-specific TNF-α/IFN-γ secernendo cellule T CD4. Il TNF/DMSO e l'IFN-Ƴ/DMSO indicano i rapporti delle frequenze delle cellule T TNF-α/IFN-γ secernenti in ciascun pozzettino di PBMC stimolate dal pool peptidico diviso per la frequenza di TNF-α/IFN-γ che secernono cellule T CD4 nel pozzo di controllo DMSO. Lo sfondo grigio indica pozzi con risposta positiva delle cellule T CD4 giudicata rispetto al controllo dello sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dimostrazione dello screening di peptidi candidati per l'identificazione degli epitopi. Il TNF/DMSO e l'IFN-Ƴ/DMSO indicano i rapporti delle frequenze delle cellule T TNF-α/IFN-γ secernenti in ciascun pozzettino di PBMC stimolate dal pool peptidico diviso per la frequenza di TNF-α/IFN-γ che secernono cellule T CD4 nel pozzo di controllo DMSO. Lo sfondo grigio indica pozzi con risposta positiva delle cellule T CD4 giudicata rispetto al controllo dello sfondo. I peptidi in rosso indicano i peptidi candidati secondo i criteri di screening. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Dimostrazione della citometria a flusso dei risultati dell'identificazione degli epitopi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I passaggi più critici in questo protocollo sono elencati come segue: 1) abbastanza PBMC di alta redditività per avviare l'espansione dei PBMC; 2) ambiente appropriato per l'espansione dei PBMC; e 3) rimozione completa dei pool peptidici residui nella coltura di PBMC prima dell'identificazione dell'epitopo.
Tutte le analisi in questo protocollo dipendono dalla robusta proliferazione delle cellule T CD4. In generale, il numero di PBMC dopo l'espansione di 10 giorni sarà 2-3 volte superiore al numero iniziale. Il numero di cellule e la vitalità dei PBMC sono 2 fattori chiave nell'espansione dei PBMC. Se lo scopo è solo quello di analizzare le cellule T CD4 specifiche dell'HBV senza identificazione dell'epitopo, è ragionevole ridurre il numero iniziale di PBMC, specialmente quando il volume del campione di sangue è limitato. Mentre, nella nostra esperienza, l'espansione di successo dei PBMC potrebbe a malapena essere ottenuta se il numero iniziale di PBMC è inferiore a 1,5×105 celle / pozze. Quando si utilizzano PBMC freschi per l'espansione, la vitalità cellulare non sarà un problema. Mentre si utilizzano PBMC crioconservati per l'espansione, la crioconservazione e lo scongelamento dei PBMC devono essere condotti con molta attenzione per mantenere la vitalità dei PBMC.
Nell'analisi funzionale delle cellule T HBV-specifiche, IL-12 viene solitamente utilizzato nell'espansione delle PBMC per migliorare la funzione delle cellule T CD8. Poiché IL-12 potrebbe indurre la differenziazione delle cellule T CD4 verso le cellule helper follicolari CD4 T, questa citochina deve essere evitata nell'analisi funzionale delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV. Nel nostro protocollo, solo IL-2 (per l'espansione delle cellule T) e IL-7 (per la sopravvivenza delle cellule T) sono integrati per mantenere il profilo funzionale delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV durante l'espansione il più intatto possibile. Abbiamo testato 5 citochine per l'analisi funzionale di cellule T CD4 specifiche per HBV: TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 e IL-21. Nei nostri campioni analizzati, TNF-α e IFN-γ sono 2 citochine principali secrete da cellule T CD4 specifiche per HBV16. Nell'analizzare il profilo funzionale delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV, si raccomanda di testare il maggior numero possibile di citochine per ottenere le informazioni dettagliate sul profilo funzionale. Durante l'identificazione dell'epitopo, si raccomanda di analizzare solo TNF-α e IFN-γ, per considerazione economica.
Un numero sufficiente di cellule T CD4 hbV-specifiche sono vitali per il successo dell'identificazione dell'epitopo, quindi l'identificazione dell'epitopo deve essere presa in considerazione nei pazienti con elevata risposta delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV, come i pazienti con riacutizzazione dell'epatite B (forte α risposta delle cellule T T T del T DEL T del T del T dell'HBV specifico dell'HBV (forte risposta delle cellule T dell'IFN-γ CD4 specifica dell'HBV)16 . È molto importante rimuovere i peptidi residui nel pool peptidico espanso PBMC mediante lavaggio ripetuto prima di incubare queste cellule con GLCL per l'identificazione dell'epitopo. I peptidi residui si legano ai GLCL pulsati DMSO, attivano le cellule T CD4 specifiche del peptide, quindi aumentano il fondo in larga misura.
Alcuni antigeni HBV hanno sequenze variabili in diversi genotipi di HBV (ad esempio, antigene di superficie HBV). Una soluzione consiste nel predeterminare i genotipi specifici dell'HBV nei pazienti e progettare pool peptidici specifici per il genotipo dell'HBV per i pazienti con genotipi di HBV diversi. Mentre il genotipo dell'HBV non è misurabile nei pazienti con basse cariche virali dell'HBV (ad esempio, pazienti HBeAg negativi con trattamento antivirale regolare), in questo scenario, la soluzione è quella di mescolare peptidi di diversi genotipi di HBV insieme negli stessi pool peptidici, come abbiamo fatto in uno studio precedente16. Uno svantaggio di questa strategia di miscela è che l'epitopo potrebbe essere identificato come una coppia di peptidi ma non un singolo peptide, poiché alcune posizioni nella matrice dei peptidi contengono una coppia peptidica nello stesso frammento dell'antigene.
Uno dei principali svantaggi di questo metodo è l'espansione dei PBMC di 10 giorni che richiede tempo. Attualmente, l'analisi ex vivo della secrezione di citochine non è stata in grado di rilevare le cellule T CD4 specifiche dell'HBV in modo affidabile. L'uso di GLCL allogenici pulsati peptidici come stimolatori di solito rileva più cellule T CD4 peptidiche specifiche nelle PBMC espanse peptidiche, rispetto alla semplice stimolazione con peptidi16. Vale la pena indagare se l'uso di cellule B autologhe pulsate peptidiche come cellule di presentazione dell'antigene potrebbe aiutare a rilevare in modo affidabile le cellule T CD4 specifiche dell'HBV ex vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (81930061), dalla Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) e dalla Chinese Key
Progetto Specializzato in Malattie Infettive (2018ZX10723203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
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