Summary
Hepatit B virüsü (HBV) türevi peptit matrisi baz alınarak, HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtları HBV'ye özgü CD4 T hücreli epitopların tanımlanmasına paralel olarak değerlendirilebilir.
Abstract
CD4 T hücreleri kronik hepatit B patogenezinde önemli roller oynar. Çok yönlü bir hücre popülasyonu olarak, CD4 T hücreleri salgıladıkları sitokinlere göre farklı fonksiyonel alt kümeler olarak sınıflandırılmıştır: örneğin, CD4 T yardımcı 1 hücreleri için IFN-γ, CD4 T yardımcı 2 hücreleri için IL-4 ve IL-13, CD4 T foliküler yardımcı hücreler için IL-21 ve CD4 T yardımcı 17 hücre için IL-17. Hepatit B virüsüne (HBV) özgü CD4 T hücrelerinin HBV türevi peptit stimülasyonundan sonra sitokin salgısına dayalı analizi, sadece HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtının büyüklüğü hakkında değil, aynı zamanda HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin fonksiyonel alt kümeleri hakkında da bilgi sağlayabilir. Transkriptomik ve metabolomik analiz gibi yeni yaklaşımlar, HBV'ye özgü CD4 T hücreleri hakkında daha ayrıntılı işlevsel bilgiler sağlayabilir. Bu yaklaşımlar genellikle peptit majör histocompatibility complex-II multimers baz alınarak uygulanabilir HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin izolasyonunu gerektirirken, şu anda HBV'ye özgü CD4 T hücreli epitoplar hakkındaki bilgiler sınırlıdır. HBV türevi peptit matrisine dayanarak, kronik HBV enfeksiyonu hastalarından periferik kan mononükleer hücre örnekleri kullanılarak HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarını değerlendirmek ve HBV'ye özgü CD4 T hücre epitoplarını aynı anda tanımlamak için bir yöntem geliştirilmiştir.
Introduction
Şu anda antijene özgü T hücrelerini analiz etmek için 3 ana yaklaşım bulunmaktadır. İlk yaklaşım, T hücre reseptörü ile peptit (epitop) arasındaki etkileşime dayanır. Antijene özgü T hücreleri doğrudan peptit-majör histocompatibility complex (MHC) multimerleri ile boyanabilir. Bu yöntemin avantajı, aşağı akış transkriptomik / metabolomik analizi için uygun canlı antijene özgü T hücreleri elde etmenindir. Bu yöntemin bir sınırlaması, belirli bir antijen için tanımlanmış epitopların sayısı şimdilik sınırlıyken, doğrulanmış epitop peptitleri gerektirdiğinden, belirli bir antijene tüm T hücresi yanıtı hakkında bilgi sağlayamamış olmasıdır. Hepatit B virüsüne (HBV) özgü CD8 T hücreli epitoplarla karşılaştırıldığında, HBV'ye özgü CD4 T hücre epitopları1,2olaraktanımlanmıştır,bu da bu yöntemi şu anda HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin analizi için daha az uygulanabilir hale getirmiştir.
İkinci yaklaşım, antijen peptit stimülasyonundan sonra bir dizi aktivasyon kaynaklı belirtecin yukarı doğrulasyonuna dayanır3. Yaygın olarak kullanılan belirteçler CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4'leriiçerir. Bu yöntem artık aşılanmış bireylerde antijene özgü T hücre yanıtlarını analiz etmek için kullanılmıştır5,6, İnsan İmmün Yetmezlik Virüs enfeksiyonu hastaları7ve Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüs 2 enfeksiyon hastaları8,9. Peptit-MHC multimers bazlı testlerin aksine, bu yöntem doğrulanmış epitoplar tarafından kısıtlanmamıştır ve aşağı akış analizi için uygulanabilir hücreler elde edebilir. Bu yöntemin bir sınırlaması, antijene özgü T hücrelerinin sitokin profili hakkında bilgi sağlayamamasıdır. Ayrıca, bu aktivasyon kaynaklı belirteçlerin bazı aktif antijen içermeyen hücreler tarafından ifade edilmesi, analizdeki arka plan sinyallerine katkıda bulunabilir, bu da özellikle hedef antijene özgü T hücreleri nadir olduğunda bir sorun olabilir. Şu anda, bu yöntemin HBV'ye özgü CD4 T hücreleri4üzerinde sınırlı uygulanması vardır. Bu yöntemin HBV'ye özgü CD4 T hücrelerini güvenilir bir şekilde analiz etmek için kullanılıp kullanılamayacağı daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyar.
Üçüncü yaklaşım antijen peptit stimülasyonundan sonra sitokin salgısına dayanır. Aktivasyon kaynaklı işaret tabanlı analiz gibi, bu yöntem de doğrulanmış epitoplar tarafından kısıtlanmamıştır. Bu yöntem antijene özgü T hücrelerinin sitokin profilini doğrudan ortaya çıkardı. Bu yöntemin hassasiyeti, antijene özgü T hücrelerinin sitokin salgılanmasına dayandığı ve test edilen sitokin sayısı genellikle sınırlı olduğu için aktivasyon kaynaklı belirteç bazlı yöntemden daha düşüktür. Şu anda, bu yöntem HBV'ye özgü T hücrelerinin analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Sitokin salgılayan HBV'ye özgü T hücreleri doğrudan ex vivo peptid stimülasyonu ile neredeyse tespit edilemediğinden10,11, HBV'ye özgü T hücrelerinin sitokin profili genellikle 10 günlük in vitro peptidin uyarılmış genişlemesi12 , 13,14,15,16'dan sonra analiz edilir. Peptit havuzlarının matris formunda düzenlenmesi, antijene özgü epitopların tanımlanmasını kolaylaştırmak için kullanılmıştır17,18. Peptit matrisi ve sitokin salgı analizinin kombinasyonu ile HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarını değerlendirmek ve HBV'ye özgü CD4 T hücre epitoplarını aynı anda tanımlamak için bir yöntem geliştirilmiştir16. Bu protokolde, bu yöntemin ayrıntıları açıklanmıştır. HBV çekirdek antijeni bu protokolde bir gösteri örneği olarak seçilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışmaya dahil edilen her hastadan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Çalışma protokolü, Southwest Hastanesi tıp etik komitesinin önceden onayına yansıtıldığı şekilde 1975 Helsinki Bildirgesi'nin etik kurallarına uygundur.
1. HBV türevi peptit matrisinin tasarımı
- HBV çekirdek antijeninin amino asit dizilerini NCBI veritabanlarından indirin (GenBank: AFY98989.1).
- Bir peptit sentezi servis sağlayıcısından HBV çekirdek antijen türevi peptitler (10 kalıntı, saflık >% 90, 4 mg / peptit ile örtüşen 35 15-mer peptit paneli) satın alın.
- Matristeki her pozisyona sadece 1 peptit içeren kare 6×6 peptit matrisi kurun. 12 peptit havuzu vardır: 6 sıra peptit havuzu ve 6 sütunlu peptit havuzu, her havuzda 5-6 peptit16. Sıra peptit havuzları ve matristeki kolon peptit havuzları HBV çekirdek antijeninin 2 ayrı oluşumunu temsil eder.
- Satın alınan peptitlerin 3/4'ü için, matrisin aynı sırasındaki/sütunundaki peptitleri dimetil sülfit (DMSO) (her peptit için 2 μg/μL) içinde eriterek 12 ayrı peptit havuzuna karıştırın. HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarının analizi için -80 °C'de saklayın.
- Peptitlerin geri kalanını ayrı ayrı çözün (10 μg/μL) ve epitop tanımlaması için -80 °C'de saklayın.
2. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC' ler) izolasyonu
- Kronik HBV enfeksiyonu hastalarından 5 mL venöz kan örneği.
NOT: Kan hacmi peptit havuzlarının sayısı artı 1 arka plan kontrolü ve 1 pozitif kontrole göre kabaca tahmin edilmelidir. 1 peptit havuzunun analizi 3 x 105 PBMC'ye ihtiyaç duyar. Ortalama olarak, 1 mL kandan 1 x10 6 PBMC elde edilebilir. - Ficoll yoğunluk gradyan santrifüjleme (800 × g, 20 dk) ve daha sonra kullanılmak üzere sıvı nitrojende izole EDILMIŞ PBMC'leri kullanarak PBMC'leri kandan izole edin.
- Açık Ficoll tabakası ile kırmızı kan hücresi tabakası arasında granülosit toplamak için bir Pasteur pipet kullanın. Üreticinin protokolüne göre genomik DNA saflaştırma kiti kullanarak granülositlerden genomik DNA çıkarın.
- HLA-DRB1 genotipini belirlemek için DNA örneğini genotip servis sağlayıcılarına gönderin.
3. HBV Peptit Matrisi Kullanan PBMC'lerin In Vitro Genişlemesi
- PBMC'leri çözün.
- Sıcak RPMI 1640, bir su banyosunda 1:10.000 benzonaz (25 U/mL) ila 37 °C ile desteklenmiştir.
NOT: Benzonase, çözülme sırasında hücre topaklamayı sınırlamaya yardımcı olur. Her örnek benzonaz ile 20 mL RPMI 1640 gerektirecektir. Tüm örneklerin çözülmesi için gereken miktarı hesaplayın ve 1:10.000 Benzonaz (25 U/mL) ile ayrı bir ortam aliquot (37 °C) hazırlayın. Aynı anda en fazla 5 numuneyi çözün. - Sıvı azottan numuneleri çıkarın ve donmuş şişeleri bir su banyosunda (37 °C) hızla çözün.
- Çözülmüş hücre süspansiyonu 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 1 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) damla yönünde ekleyin. Santrifüj tüpüne yavaşça 6 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ekleyin, tüm hücreleri almak için diğer 2 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ile cryovial durulayın. Numunelerin geri kalanıyla mümkün olduğunca çabuk devam edin.
NOT: Kriyoprezserved örneklerin yavaş seyreltilmesi, çözülmüş hücrelerin canlılığını korumanın anahtarıdır. - Santrifüj (400 × g, 10 dk), süpernatantı çıkarın ve tüpe dokunarak peletı gevşetin.
- Peleti 1 mL sıcak Benzonase RPMI 1640'ta hafifçe yeniden bastırın. Yavaşça karıştırın ve gerekirse hücreleri 70 μm hücre süzgecinden (yani görünür bir küme varsa) filtreleyin.
- Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) 10 μL süspansiyon ve seyreltin, Trypan mavisi ekleyin (%0,04), hemositometreye yükleyin, 1 dakika bekleyin ve canlı hücrelerin sayısını (net hücreler) sayın.
- Tüpe 9 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ekleyin, santrifüj (400 × g, 10 dk), süpernatantı çıkarın ve boruya dokunarak peletin gevşeyin.
- Sıcak RPMI 1640, bir su banyosunda 1:10.000 benzonaz (25 U/mL) ila 37 °C ile desteklenmiştir.
- RPMI 1640'taki PBMC'leri 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve %10 insan AB serumu (tam kültür ortamı) ile desteklenmiştir. Hücre yoğunluğunu 1,5 x 106 hücre/mL'ye ayarlayın. 3 x 105 hücre/kuyu yoğunluğunda 96 kuyulu plakalarda (düz alt) PLAKA PBMC'leri.
- Her kuyuya HBV türevi peptit havuzları (her bir peptit için 2 μg/mL) ekleyin. Arka plan kontrolü ve pozitif kontrol kuyuları için aynı miktarda çözücü ekleyin (DMSO, 1 μL/mL). 10 U/mL IL-2 ve 10 ng/mL IL-7 ekleyin. 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatır.
- 3. günde, IL-2'nin 50 U/mL'si ve IL-7'nin 10 ng/mL'si ile kültür ortamını tamamlar.
NOT: 1- 3. gün arasında belirgin bir T hücre çoğalması gözlenmeyecektir. B hücreleri, NK hücreleri, NKT hücreleri ve monositler gibi T olmayan hücrelerin ölümü nedeniyle toplam hücre sayısı genellikle 1/3 ila 1/2 oranında azalacaktır. - 7. günde, kültür ortamının yarısını peptit (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) ve IL-7 (20 ng/mL) içeren taze ortamla değiştirin.
NOT: Alttaki hücreleri rahatsız etmemek için pipet yaklaşık 90 μL kültür ortamı ortamın üstünden dikkatlice ortalar. 3 günden 7. güne kadar sağlam T hücre çoğalması gözlenecek ve çoğalan T hücreleri genellikle kümeler oluşturmak için toplanır. - 10. günde, hücre kümelerini parçalamak, canlı hücre sayısını saymak ve HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıt analizi için her kuyuda 2×105 hücreyi 96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) aktarmak için her kuyudaki hücre kültürünü 7-9 kez hafifçe pipetleyin.
- 12. günde epitop tanımlaması için hücrelerin geri kalanını kültlü hale almaya devam edin, kültür ortamının hacmini 100 μL'ye ayarlayın (aşırı ortamı atma) ve peptitler (4 μg / mL), IL-2 (100 U / mL) ve IL-7 (20 ng / mL) içeren 100 μL taze tam kültür ortamı ile kültürü tamamlayın.
NOT: 7 günden 10. güne kadar T hücreleri kuvvetli bir şekilde çoğalmaya devam ediyor. Ortam sararırsa, 3.5. Genel olarak, hücre sayısı 10×da 6×105'i geçecektir. Her kuyu genellikle benzer hücre numarasını gösterir, 3 kuyuda hücre numarasını sayar ve ortalama değeri tüm kuyular için hücre sayısının tahmini olarak kullanır.
4. HBV'ye özgü CD4 T-Hücre yanıtlarının hücre içi akış sitometrisi ile analizi
- Peptit havuzları ile PBMC'leri uyarma
- 96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) aktarılan hücreler için, bir tabakta 3 kez yıkayın (550 × g, 3 dk). Her yıkama için 200 μL orta kullanın (ilk 2 yıkama için RPMI 1640, son yıkama için tam kültür ortamı). Üstünlükleri atın.
NOT: Kültürdeki artık sitokinlerin tekrar tekrar yıkanarak uzaklaştırılması hücre içi akış sitometrisi analizinde arka planı etkili bir şekilde azaltabilir. - Belirli bir peptit havuzu ile uyarılan her hücre kuyusu için, aynı peptit havuzları ile desteklenmiş 200 μL tam kültür ortamı ekleyin (her bir peptit için 2 μg / mL). Arka plan kontrolü kuyusu için, 1 μL / mL DMSO ile desteklenmiş tam kültür ortamı ekleyin. Pozitif kontrol kuyusu için, 1 μL / mL DMSO, 150 ng / mL phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) ve 1 μmol / L iyonomisitin ile desteklenmiş tam kültür ortamı ekleyin.
NOT: Yüksek dozda DMSO, T hücrelerinin sitokin salgısını engelleyecektir (en önemlisi TNF-α için). 5 μL/mL'den yüksek DMSO dozu önerilmez. Genel olarak, deneyimizdeki DMSO dozu 1 μL / mL'yi geçmez. - 37 °C'de kuluçkaya yatır ve 6 saat boyunca%5 CO 2.
- 1 saat kuluçkadan sonra, kültüre Monensin (1.37 μg / mL) ekleyin.
- 96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) aktarılan hücreler için, bir tabakta 3 kez yıkayın (550 × g, 3 dk). Her yıkama için 200 μL orta kullanın (ilk 2 yıkama için RPMI 1640, son yıkama için tam kültür ortamı). Üstünlükleri atın.
- Akış sitometrisi
- 6 saat kuluçkadan sonra. Santrifüjlemeden sonra (550 × g, 3 dk) süpernatantı çıkarın, hücreleri 200 μL DPBS (550 × g, 3 dk), leke yüzeyi işaretleyicileri (CD3, CD4 ve CD8) ve canlılık işaretleyicisiyle (Düzeltilebilir Canlılık Boyası kullanarak) 4 °C buzdolabında 30 dakika boyunca bir kez yıkayın.
- 200 μL DPBS (550 × g, 3 dk) ile bir kez yıkayın. Hücreleri sabitle ve permeabilize et ve hücre içi sitokinleri (TNF-α ve IFN-γ) 4 °C buzdolabında 45 dakika lekele.
- Hücre içi boyamada son yıkamadan sonra, hücreleri 150 μL akış sitomemetri tamponunda (DPBS +% 0,5 BSA) yeniden biriktirin.
- Akış sitometresinde akış sitomemetrisi verilerini alın.
- Akış sitometrisi sonuçlarının analizi
- Olumlu kuyunun tanımı: Arka plan kontrolünün en az iki katı kadar sitokin salgılayan bir sitokin sıklığına sahipse olumlu olarak düşünün(Şekil 1).
- Aşağıdaki formüle göre, analiz edilen her sitokin için yanıt oranını hesaplayın (Şekil 2):
NOT: Sıra peptit havuzu ve matristeki kolon peptit havuzları HBV çekirdek antijeninin 2 farklı oluşumunu temsil eder, bu nedenle nihai yanıt oranı 2'ye bölünmelidir.
5. HBV'ye özgü HLA-DR Kısıtlı CD4 T hücreli Epitopların Tanımlanması
- T-75 şişesinde (5-20 ×106 hücre, 20 mL tam kültür ortamında) allojenik B lenfoblastoid hücre hatlarını (BLCL' ler) çözün ve koruyun.
NOT: BLCL'lerin iyi durumunu garanti etmek için, bu adım hastaların PBMC'lerinin çözülmesinden 2 hafta önce başlatılmalıdır. Genotipleme sonucuna göre, hastalar BLCL'ler ile aynı HLA-DRB1 alelesini paylaşmalıdır. - Kimlik tespiti için aday peptitlerin taranır (Şekil 3)
- 10. gün T hücre yanıt oranı sonuçlarına göre, en yüksek yanıt oranına sahip 2 peptit havuzunu (1 sıra peptit havuzu ve 1 sütun peptit havuzu) tarayın.
- Bu peptidi içeren diğer peptit havuzu da T hücre yanıt analizinde olumlu bir sonuç gösteriyorsa, bu 2 havuzdaki peptidi aday peptit olarak ayarlayın. Daha sonra epitop tanımlaması için diğer peptit havuzuyla genişletilen PBMC'leri kullanın.
- Peptit ile zonklayan BLCL'ler
- 12. günde, uygulanabilir BLCL sayısını sayın, hücreleri 15 mL santrifüj tüplerine, santrifüje (350 × g, 10 dk) aktarın ve süpernatantı çıkarın. Hücre peletini tam kültür ortamında ve aliquot BLCL'leri 80 μL tam kültür ortamında 4×104 hücre / kuyuda 96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) yeniden biriktirin.
- Tek bir peptit (10 μg/ mL) ekleyin, 37 °C'de kuluçkaya yaslanın ve 2 saat boyunca%5 CO 2. Set 2 arka plan kontrolü: HLA-DR blokajı ile peptit titreşimi (1 saat boyunca anti-HLA-DR (10 μg / mL) ile ön işlem); DMSO (1 μL/mL) titreşim. Her kuyudaki tam kültür ortamının son hacmi 100 μL'dir.
- Mitomycin C (100 μg/mL) ekleyin, 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve 1 saat boyunca% 5 CO2 ekleyin.
- Darbesiz peptit ve mitomycin C'yi çıkarmak için bir plakada 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 dk) ile 3 kez yıkayın. İlk yıkama için kuluçka kültürünü 100 μL RPMI 1640 ile tamamlar.
- Hücreleri 120 μL tam kültür ortamında yeniden biriktirin.
- PEPTİt darbeli BLCL'lerle PBMC'leri uyarmak.
- 12. günde PBMC'leri 96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) aktarın.
- Bir tabakta santrifüjlemeden (550 × g, 3 dk) sonra süpernatantı çıkarın, bir tabakta 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 dk) ile iki kez yıkayın.
NOT: Kültürdeki artık sitokin ve peptitlerin tekrar tekrar yıkanarak uzaklaştırılması hücre içi akış sitotmetrisi analizinde arka planı azaltmak için anahtar adımdır. Özellikle artık peptitler için BLCL'lere bağlanır ve arka planı önemli ölçüde arttırır. - PBMC'leri her kuyuda 210 μL tam kültür ortamıyla yeniden kullanılabilir.
- Epitop tanımlama için seçilen PBMC'lerin kuyusu için, aliquot'u (her biri 70 μL) peptit darbeli BLCL'lerle (2 arka plan kontrolü dahil 3 kuyu) karıştırın.
NOT: 12. günde, genişletilmiş PBMC'lerin sayısı genellikle kuyu başına 5-7×105'in üzerine ulaşır, bu nedenle PBMC/BLCL'lerin oranı yaklaşık 6/1 ila 4/1'dir. - 37 °C'de kuluçkaya yatır ve 6 saat boyunca%5 CO 2.
- 1 saat kuluçkadan sonra, kültüre Monensin (1.37 μg / mL) ekleyin. Her kuyudaki tam kültür ortamının son hacmi 200 μL'dir.
- Akış sitometrisi
- 4.2. adımdakiyle aynı işlemleri yineleyin.
- Akış sitometrisi sonuçlarının analizi
- Bu peptit darbeli BLCC'lerle inkübe edilen PBMC'ler, arka plan kontrolleri ile inkübe edilen PBMC'lerin en az iki kez SITokin salgılayan CD4 T hücrelerinin bir frekansını gösteriyorsa, bir peptidi HLA-DR kısıtlı CD4 T hücreleri epitopu olarak doğrulayın (HLA-DR ön blokajı ile peptit titreşimi; DMSO titreşimi) (Şekil 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sitokin salgılayan CD4 T hücrelerinin sıklığı hem tek üreticilerin hem de çift üreticilerin toplamı olarak hesaplanır. Şekil 1'degösterildiği gibi, TNF-α CD4 T hücrelerini salgılama sıklığı ve arka plan kontrolünde (DMSO) CD4 T hücrelerini salgılayan IFN-γ sıklığı sırasıyla% 0.154 ve% 0.013'tür. TNF-α cd4 T hücrelerinin salgılanması sıklığı ve PEPTİT HAVUZU Core11'e özgü IFN-γ salgılayan CD4 T hücrelerinin sıklığı sırasıyla 0.206 ve 0.017'dir, bu nedenle hem TNF-α cd4 T hücre yanıtını salgılayan hem de BU peptit havuzu için CD4 T hücre yanıtı salgılayan IFN-γ negatif olarak kabul edilir. TNF-α CD4 T hücrelerini salgılama sıklığı ve PEPTİT HAVUZU Core09'a özgü IFN-γ salgılayan CD4 T hücrelerinin sıklığı sırasıyla %2.715 ve %0.973'tür, bu nedenle hem TNF-α salgılayan CD4 T hücre yanıtı hem de bu peptit havuzu için CD4 T hücre yanıtı salgılayan IFN-γ pozitif olarak kabul edilir.
Şekil 2'degösterildiği gibi, pozitif kuyular gri arka planla gösterilir. CD4 T hücre yanıt hızını salgılayan HBV çekirdeğine özgü TNF-α hesaplanırken, Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 ve Core10 peptid havuzlarının verileri dahil edilmelidir. CD4 T hücre yanıt hızını salgılayan HBV çekirdeğine özgü IFN-γ hesaplanırken, Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 ve Core10 peptid havuzlarının verileri dahil edilir.
Şekil 3'tegösterildiği gibi, epitop tanımlama için aday peptitler kırmızı ile belirtilir. Core01, hem TNF-α CD4 T hücreleri hem de SÜTUN peptit havuzlarındaki CD4 T hücrelerini salgılayan IFN-γ için en yüksek yanıt hızına sahiptir. Bu peptit havuzundaki Peptitler C1-15, C31-45, C61-75 ve C91-105, bu peptitleri içeren sıra peptit havuzları da T hücre yanıtında olumlu sonuçlar gösterdiği için aday peptitler olarak ayarlanır. Core07, Core08, Core09 ve Core10 peptit havuzları ile genişletilen PBMC'ler sırasıyla C1-15, C31-45, C61-75 ve C91-105 peptitlerinin epitop tanımlaması için kullanılır. Core09, hem TNF-α CD4 T hücrelerini salgılayan hem de SıRA peptit havuzlarındaki CD4 T hücrelerini salgılayan IFN-γ için en yüksek yanıt hızına sahiptir. Bu peptit havuzundaki Peptitler C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 ve C86-100, bu peptitleri içeren kolon peptit havuzları da T hücre yanıtında olumlu sonuç gösterdiği için aday peptitler olarak ayarlanır. Core01, Core02, Core03, Core04, Core05 ve Core06 peptit havuzları ile genişletilen PBMC'ler, sırasıyla C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 ve C86-100 peptitlerinin epitop tanımlaması için kullanılır.
Şekil 4'tegösterildiği gibi, peptit havuzu Core08 genişletilmiş PBMC'ler için, peptit C31-45 darbeli BLCL'lerle uyarılmadan sonra, TNF-α cd4 T hücrelerinin salgılanma sıklığı ve IFN-γ salgılanan CD4 T hücrelerinin frekansı, arka plan kontrollerinden 2 kat daha yüksek olan sırasıyla% 0.995 ve% 0.131'dir (HLA-DR ön engellemeli peptit C31-45 darbeli BLCL'ler, DMSO darbeli BLCL'ler). Böylece peptit C31-45, HLA-DR kısıtlı CD4 T hücreli epitop olarak doğrulanır. Peptit havuzu Core10 genişletilmiş PBMC'ler için, peptit C91-105 darbeli BLCL'ler ile uyarılmadan sonra, TNF-α CD4 T hücrelerini salgılama sıklığı ve IFN-γ salgılayan CD4 T hücrelerinin frekansı sırasıyla% 0.221 ve% 0.000'dir, arka plan kontrollerinin 2 katını geçmeyen (HLA-DR ön engellemeli peptit C91-45 darbeli BLCL'ler, DMSO darbeli BLCL'ler), bu nedenle peptit C91-105, HLA-DR kısıtlı CD4 T hücreli epitop olarak doğrulanmaz.
Şekil 1: Peptit havuzlarında CD4 T hücrelerini salgılayan TNF-α/IFN-γ akış sitometrisi gösterimi, ilgili peptit havuzları ile uyarıldıktan sonra PBMC'leri genişletti. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CD4 T hücrelerinin salgılanma γ HBV çekirdeğine özgü TNF-α/IFN-γ analizinin gösterimi. TNF/DMSO ve IFN-Ƴ/DMSO, peptit havuzunun her kuyusunda CD4 T hücrelerinin salgılanması α γ TNF/α/IFN-γ'ların DMSO kontrolünün kuyusundaki CD4 T hücrelerinin frekanslarına bölünen uyarılmış PBMC'lerin frekanslarını gösterir. Gri arka plan, arka plan kontrolü ile karşılaştırıldığında değerlendirilen pozitif CD4 T hücre yanıtına sahip kuyuları gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Epitop tanımlaması için aday peptitlerin taranır gösterimi. TNF/DMSO ve IFN-Ƴ/DMSO, peptit havuzunun her kuyusunda CD4 T hücrelerinin salgılanması α γ TNF/α/IFN-γ'ların DMSO kontrolünün kuyusundaki CD4 T hücrelerinin frekanslarına bölünen uyarılmış PBMC'lerin frekanslarını gösterir. Gri arka plan, arka plan kontrolü ile karşılaştırıldığında değerlendirilen pozitif CD4 T hücre yanıtına sahip kuyuları gösterir. Kırmızı peptitler tarama kriterlerine göre aday peptitleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Epitop tanımlama sonuçlarının akış sitometri gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokoldeki en kritik adımlar şu şekilde listelenmiştir: 1) PBMC genişlemesini başlatmak için yeterli yüksek uygulanabilirlik PBMC'leri; 2) PBMC genişlemesi için uygun ortam; ve 3) EPITOP TANıMLAMASINDAN ÖNCE PBMC kültüründe artık peptit havuzlarının tamamen çıkarılması.
Bu protokoldeki tüm analizler CD4 T hücrelerinin sağlam çoğalmasına bağlıdır. Genel olarak, 10 günlük genişlemeden sonra PBMC sayısı ilk sayının 2-3 katı olacaktır. PBMC'lerin hücre numarası ve uygulanabilirliği PBMC'lerin genişlemesinde 2 temel faktördür. Amaç sadece epitop tanımlaması olmadan HBV'ye özgü CD4 T hücrelerini analiz etmekse, özellikle kan örneğinin hacmi sınırlı olduğunda, ilk PBMC sayısını azaltmak mantıklıdır. Deneyimlerimize göre, PBMC'lerin başlangıç sayısı 1,5,105 hücrenin/kuyunun altındaysa× başarılı PBMC genişlemesi zar zor elde edilebilir. Genişletme için yeni PBMC'ler kullanırken, hücre canlılığı sorun olmayacaktır. Genişleme için kriyoprezervasyonlu PBMC'ler kullanırken, PBMC'lerin canlılığını korumak için PBMC'lerin kriyoprezervasyonu ve çözülmesi çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
HBV'ye özgü T hücrelerinin fonksiyonel analizinde IL-12 genellikle CD8 T hücrelerinin işlevini geliştirmek için PBMC genişlemesinde kullanılır. IL-12, CD4 T hücrelerinin CD4 T foliküler yardımcı hücrelere doğru farklılaşmasına neden olabileceğinden, HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin fonksiyonel analizinde bu sitokinden kaçınılmalıdır. Protokolümüzde, genişleme sırasında HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin fonksiyonel profilini mümkün olduğunca sağlam tutmak için yalnızca IL-2 (T hücre genişlemesi için) ve IL-7 (T hücre sağkalımında) desteklenmektedir. HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin fonksiyonel analizi için 5 sitokini test ettik: TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 ve IL-21. Analiz edilen örneklerimizde TNF-α ve IFN-γ HBV'ye özgü CD4 T hücreleri tarafından salgılanan 2 ana sitokindir16. HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin fonksiyonel profilini analiz ederken, ayrıntılı fonksiyonel profil bilgilerini elde etmek için mümkün olduğunca çok sitokin test edilir. Epitop tanımlamadayken, ekonomik değerlendirme için sadece TNF-α ve IFN-γ analiz edilmesi önerilir.
Başarılı epitop tanımlaması için yeterli HBV spesifik CD4 T hücresi hayati öneme sahiptir, bu nedenle hepatit B parlaması hastaları (cd4 T hücre yanıtı salgılayan güçlü HBV spesifik TNF-α) ve viral açıklığı olan hastalarda (güçlü HBV'ye özgü IFN-γ CD4 T-hücre yanıtı)16 gibi HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtı yüksek hastalarda epitop tanımlaması düşünülmelidir. . Peptit havuzunda kalan peptitlerin epitop tanımlaması için BLCL'lerle kuluçkaya yatırılmadan önce tekrarlanan yıkama ile PBMC'leri genişletmesi çok önemlidir. Artık peptitler DMSO darbeli BLCL'lere bağlanacak, peptide özgü CD4 T hücrelerini aktive edecek ve böylece arka planı büyük ölçüde artıracaktır.
Bazı HBV antijenleri farklı HBV genotiplerinde değişken dizilere sahiptir (örneğin, HBV yüzey antijeni). Bir çözüm, hastalardaki spesifik HBV genotiplerini önceden belirlemek ve farklı HBV genotipleri olan hastalar için HBV genotipine özgü peptit havuzları tasarlamaktır. HBV genotipi düşük HBV viral yükleri olan hastalarda ölçülemezken (örneğin, düzenli anti-viral tedaviye sahip HBeAg negatif hastalar), bu senaryoda, çözüm, önceki bir çalışmada yaptığımız gibi, farklı HBV genotiplerinden peptitleri aynı peptit havuzlarınakarıştırmaktır 16. Bu karışım stratejisinin bir dezavantajı, epitopun peptit çifti olarak tanımlanabileceği, ancak tek bir peptit olmadığıdır, çünkü peptit matrislerindeki bazı pozisyonlar antijenin aynı parçasında bir peptit çifti içerir.
Bu yöntemin önemli bir dezavantajı, zaman alan 10 günlük PBMC genişletmesidir. Şu anda, sitokin salgısının ex vivo analizi HBV'ye özgü CD4 T hücrelerini güvenilir bir şekilde tespit edemedi. Uyarıcı olarak peptit darbeli allogeneik BLCL'ler kullanarak genellikle peptit genişletilmiş PBMC'lerde daha fazla peptide özgü CD4 T hücresi tespit edildi, peptitlerle uyarmaya kıyasla16. Peptit darbeli otolog B hücrelerini antijen sunum hücreleri olarak kullanmanın HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin ex vivo'yu güvenilir bir şekilde tespit etmeye yardımcı olup olmadığını araştırmaya değer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81930061), Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) ve Chinese Key tarafından desteklenmiştir.
Enfeksiyon Hastalıkları için Uzmanlaşmış Proje (2018ZX10723203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
- Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
- Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
- Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
- Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
- Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
- Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
- Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
- Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
- Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
- de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
- Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
- Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).
