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Immunology and Infection

एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण और एलएएल-डीआर-प्रतिबंधित सीडी 4 टी-सेल एपिटोप्स की पहचान पेप्टाइड मैट्रिक्स के आधार पर

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/62387
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

Summary

हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) -व्युत्पन्न पेप्टाइड मैट्रिक्स के आधार पर, एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल एपिटोप्स की पहचान के साथ समानांतर रूप से किया जा सकता है।

Abstract

सीडी 4 टी कोशिकाएं क्रोनिक हेपेटाइटिस बी के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। एक बहुमुखी कोशिका आबादी के रूप में, सीडी 4 टी कोशिकाओं को उनके द्वारा स्रावित साइटोकिन्स के आधार पर अलग-अलग कार्यात्मक सबसेट के रूप में वर्गीकृत किया गया है: उदाहरण के लिए, सीडी 4 टी हेल्पर 1 कोशिकाओं के लिए आईएफएन-γ, सीडी 4 टी हेल्पर 2 कोशिकाओं के लिए आईएल-4 और आईएल-13, सीडी 4 टी कूप सहायक कोशिकाओं के लिए आईएल-21, और सीडी 4 टी हेल्प 17 सेल के लिए आईएल-17। हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) का विश्लेषण- एचबीवी-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स उत्तेजना के बाद साइटोकिन स्राव पर आधारित विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाएं न केवल एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रिया के परिमाण के बारे में बल्कि एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं के कार्यात्मक सबसेट के बारे में भी जानकारी प्रदान कर सकती हैं। ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण जैसे उपन्यास दृष्टिकोण, एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं के बारे में अधिक विस्तृत कार्यात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इन दृष्टिकोणों को आमतौर पर पेप्टाइड-मेजर हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स-II मल्टीमर्स के आधार पर व्यवहार्य एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिका कोशिकाओं के अलगाव की आवश्यकता होती है, जबकि वर्तमान में एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल एपिटोप्स के बारे में जानकारी सीमित है। एचबीवी-व्युत्पन्न पेप्टाइड मैट्रिक्स के आधार पर, एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने और क्रोनिक एचबीवी संक्रमण रोगियों से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के नमूनों का उपयोग करके एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल एपिटोप्स की पहचान करने के लिए एक विधि विकसित की गई है ।

Introduction

वर्तमान में, एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए 3 मुख्य दृष्टिकोण हैं। पहला दृष्टिकोण टी-सेल रिसेप्टर और पेप्टाइड (एपिटोप) के बीच बातचीत पर आधारित है। एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को पेप्टाइड-मेजर हिस्टोकंपैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) मल्टीमर्स से सीधे दाग लगाया जा सकता है। इस विधि का लाभ यह है कि यह व्यवहार्य एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को प्राप्त कर सकता है, जो डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्टोमिक्स/मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण के लिए उपयुक्त है । इस विधि की एक सीमा यह है कि यह एक विशिष्ट एंटीजन के लिए पूरे टी-सेल प्रतिक्रिया के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सकता है, क्योंकि इसके लिए मान्य एपिटोप पेप्टाइड्स की आवश्यकता होती है जबकि एक विशिष्ट एंटीजन के लिए पहचाने गए एपिटोप की संख्या अभी के लिए सीमित है। हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) की तुलना में विशिष्ट सीडी 8 टी-सेल एपिटोप्स, कम एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल एपिटोप की पहचान की गई है1,2,जिसने वर्तमान में एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए इस विधि को कम लागू किया ।

दूसरा दृष्टिकोण एंटीजन पेप्टाइड उत्तेजना3के बाद सक्रियण-प्रेरित मार्कर की एक श्रृंखला के उपनियमन पर आधारित है। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले मार्कर में CD69, CD25, OX40, CD40L, पीडी-एल1, 4-1BB4शामिल हैं । इस विधि का उपयोग अब टीका लगाए गए व्यक्तियों 5,6,ह्यूमन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस संक्रमणरोगियों 7औरगंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 संक्रमण रोगियों8,9में एंटीजन-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए किया गया है। पेप्टाइड-एमएचसी मल्टीमर्स आधारित परख के विपरीत, यह विधि मान्य एपिटोप द्वारा प्रतिबंधित नहीं है और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए व्यवहार्य कोशिकाएं प्राप्त कर सकती है। इस विधि की एक सीमा यह है कि यह एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के साइटोकिन प्रोफाइल के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सका। इसके अलावा, कुछ सक्रिय एंटीजन-गैर-विशिष्ट कोशिकाओं द्वारा इन सक्रिय-प्रेरित मार्कर की अभिव्यक्ति विश्लेषण में पृष्ठभूमि संकेतों में योगदान दे सकती है, जो एक समस्या हो सकती है, खासकर जब लक्ष्य एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाएं दुर्लभ हों। वर्तमान में, एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं4पर इस विधि का सीमित अनुप्रयोग है। क्या इस विधि का उपयोग एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं का विश्वसनीय तरीके से विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, आगे की जांच की आवश्यकता है।

तीसरा दृष्टिकोण एंटीजन पेप्टाइड उत्तेजना के बाद साइटोकिन स्राव पर आधारित है। सक्रियण-प्रेरित मार्कर-आधारित विश्लेषण की तरह, यह विधि मान्य एपिटोप द्वारा प्रतिबंधित नहीं है। यह विधि सीधे एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के साइटोकिन प्रोफ़ाइल को प्रकट कर सकती है। इस विधि की संवेदनशीलता सक्रियण-प्रेरित मार्कर-आधारित विधि से कम है क्योंकि यह एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के साइटोकिन स्राव पर निर्भर करती है और परीक्षण किए गए साइटोकिन्स की संख्या आमतौर पर सीमित होती है। वर्तमान में, इस विधि का व्यापक रूप से एचबीवी-विशिष्ट टी कोशिकाओं के विश्लेषण में उपयोग किया जाता है। चूंकि साइटोकिन स्राव एचबीवी-विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता प्रत्यक्ष पूर्व वीवो पेप्टाइड उत्तेजना10, 11द्वारा शायद ही लगाया जा सकता है, एचबीवी-विशिष्ट टी कोशिकाओं की साइटोकिन प्रोफाइल का विश्लेषण आमतौर पर 10 दिन के बाद इन विट्रो पेप्टाइड उत्तेजित विस्तार12,13,14,15, 16से कियाजाताहै। मैट्रिक्स रूप में पेप्टाइड पूल की व्यवस्था का उपयोग एंटीजन-विशिष्ट एपिटोप्स17, 18की पहचान को सुगम बनाने के लिए किया गया है। पेप्टाइड मैट्रिक्स और साइटोकिन स्राव विश्लेषण के संयोजन के साथ, एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने और एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल एपिटोप्स को एक साथ16की पहचान करने के लिए एक विधि विकसित की गई है। इस प्रोटोकॉल में, इस विधि का विवरण वर्णित है। एचबीवी कोर एंटीजन को इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन के उदाहरण के रूप में चुना जाता है।

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Protocol

अध्ययन में शामिल प्रत्येक रोगी से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी । अध्ययन प्रोटोकॉल हेलसिंकी की १९७५ घोषणा के नैतिक दिशा निर्देशों के अनुरूप है के रूप में दक्षिण पश्चिम अस्पताल की चिकित्सा नैतिकता समिति द्वारा एक प्राथमिकताओं की मंजूरी में परिलक्षित होता है ।

1. एचबीवी-व्युत्पन्न पेप्टाइड मैट्रिक्स का डिजाइन

  1. एनसीबीआई डेटाबेस (जेनबैंक: AFY98989.1) से एचबीवी कोर एंटीजन के अमीनो एसिड दृश्यों को डाउनलोड करें।
  2. एक पेप्टाइड संश्लेषण सेवा प्रदाता से एचबीवी कोर एंटीजन व्युत्पन्न पेप्टाइड्स (35 15-मेर पेप्टाइड्स का एक पैनल 10 अवशेषों, शुद्धता > 90%, 4 मिलीग्राम/पेप्टाइड) द्वारा ओवरलैपिंग करता है।
  3. मैट्रिक्स में प्रत्येक स्थिति के साथ एक वर्ग 6×6 पेप्टाइड मैट्रिक्स स्थापित करें जिसमें केवल 1 पेप्टाइड होता है। 12 पेप्टाइड पूल हैं: 6 पंक्ति पेप्टाइड पूल और 6 कॉलम पेप्टाइड पूल, प्रत्येक पूल16 में 5-6पेप्टाइड्स। मैट्रिक्स में पंक्ति पेप्टाइड पूल और कॉलम पेप्टाइड पूल एचबीवी कोर एंटीजन के 2 अलग-अलग संरचनाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  4. खरीदे गए पेप्टाइड्स के 3/4 के लिए, मैट्रिक्स की एक ही पंक्ति/कॉलम में पेप्टाइड्स को 12 अलग पेप्टाइड पूल में मिलाकर डिमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) (प्रत्येक पेप्टाइड के लिए 2 माइक्रोन/माइक्रोल) में एक साथ भंग करके । एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. पेप्टाइड्स के बाकी अलग से भंग (10 μg/μL) और epitope पहचान के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव (पीबीएमएमसी)

  1. क्रोनिक एचबीवी इंफेक्शन के मरीजों से वेनस ब्लड का 5 एमएल सैंपल लिया।
    नोट: रक्त की मात्रा मोटे तौर पर पेप्टाइड पूल प्लस 1 पृष्ठभूमि नियंत्रण और 1 सकारात्मक नियंत्रण की संख्या के अनुसार अनुमान लगाया जाना चाहिए । 1 पेप्टाइड पूल के विश्लेषण के लिए 3 x 105 पीबीएमसी की आवश्यकता है। औसतन, 1 x 106 पीबीएमसी रक्त के 1 मिलील से प्राप्त किया जा सकता है।
  2. बाद में उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में फिकोल घनत्व ढाल अपकेंद्रितरण (800 × जी, 20 मिनट) और क्रायोप्रिजर्वेड अलग पीबीएमसी का उपयोग करके रक्त से पीबीएमसी को अलग करें।
  3. स्पष्ट फिकोल परत और लाल रक्त कोशिका परत के बीच ग्रैनुलोसाइट्स एकत्र करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार जीनोमिक डीएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके ग्रेनुलोसाइट्स से जीनोमिक डीएनए निकालें।
  4. एचएलए-DRB1 जीनोटाइप निर्धारित करने के लिए जेनोटाइपिंग सेवा प्रदाताओं को डीएनए नमूना भेजें।

3. एचबीवी पेप्टाइड मैट्रिक्स का उपयोग करके पीबीएमसी का इन विट्रो विस्तार

  1. गल पीबीएमसी।
    1. गर्म RPMI 1640 एक पानी स्नान में 1:10,000 बेंजोनास (25 यू/एमएल) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस के साथ पूरक।
      नोट: बेंजोनाज़ विगलन के दौरान सेल झुरमुट को सीमित करने में मदद करता है। प्रत्येक नमूने को बेंजोनेज के साथ आरपीएमआई 1640 के 20 एमएल की आवश्यकता होगी। सभी नमूनों को पिघलाने के लिए आवश्यक राशि की गणना करें, और 1:10,000 बेंजोनास (25 यू/एमएल) के साथ मीडिया (37 डिग्री सेल्सियस) का एक अलग एलिकोट तैयार करें। एक बार में 5 से अधिक नमूने नहीं गल ।
    2. तरल नाइट्रोजन से नमूने निकालें और पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में फ्रोजन शीशियों को जल्दी से पिघला दें।
    3. गल सेल निलंबन को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब में बेंजोनास आरपीएमआई 1640 (37 डिग्री सेल्सियस) ड्रॉपवाइज का 1 एमसीएल जोड़ें। धीरे-धीरे सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बेंजोनास आरपीएमआई 1640 (37 डिग्री सेल्सियस) के 6 एमएल जोड़ें, सभी कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करने के लिए बेंजोनास आरपीएमआई 1640 (37 डिग्री सेल्सियस) के एक और 2 एमएल के साथ क्रायोवियल कुल्ला। जितनी जल्दी हो सके बाकी नमूनों को जारी रखें।
      नोट: क्रायोप्रेयरेय किए गए नमूनों की धीमी गति से कमजोर पड़ने से गल कोशिकाओं की व्यवहार्यता बनाए रखने की कुंजी है।
    4. सेंट्रलाइज (400 × जी, 10 मिनट), सुपरनेट निकालें, और ट्यूब को टैप करके गोली को ढीला करें।
    5. धीरे-धीरे गर्म बेंजोनास आरपीएमआई 1640 के 1 एमएल में गोली को फिर से रीसल्पेंड करें। यदि आवश्यक हो तो 70 माइक्रोन सेल छन्नी के माध्यम से धीरे-धीरे मिलाएं, और कोशिकाओं को फ़िल्टर करें (यानी, यदि कोई दृश्यमान झुरमुट मौजूद है)।
    6. दुलबेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीपीबीएस) में 10 माइक्रोन निलंबन और पतला, ट्राइपन ब्लू (0.04%), एक हीमोसाइटोमीटर पर लोड जोड़ें, 1 मिनट की प्रतीक्षा करें, और व्यवहार्य कोशिकाओं (स्पष्ट कोशिकाओं) की संख्या गिनें।
    7. ट्यूब में बेंजोनास आरपीएमआई 1640 (37 डिग्री सेल्सियस) के 9 एमएल जोड़ें, सेंट्रलाइज (400 × जी, 10 मिनट), सुपरनैंट को हटा दें, और ट्यूब को टैप करके गोली को ढीला करें।
  2. आरएमआई 1640 में रिस्पन पीबीएमसी 25 एमएम एचईपीई, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 1 एमएम सोडियम पाइरुवेट, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमामाइसिन और 10% ह्यूमन एबी सीरम (कंप्लीट कल्चर मीडियम) के साथ सप्लीमेंट किया गया। सेल घनत्व को 1.5 x 106 कोशिकाओं/एमएल में समायोजित करें। 3 x 10 5 कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक घनत्व पर ९६-अच्छीतरह से प्लेटों (फ्लैट नीचे) में प्लेट PBMCs ।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से एचबीवी व्युत्पन्न पेप्टाइड पूल (प्रत्येक एक पेप्टाइड के लिए 2 μg/mL) जोड़ें। पृष्ठभूमि नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के कुओं के लिए, सॉल्वेंट (DMSO, 1 μL/mL) की एक ही राशि जोड़ें । 10 यू/एमएल आईएल-2 और 10 एनजी/एमएल आईएल-7 जोड़ें । 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट ।
  4. 3 दिन में, आईएल-2 के ५० यू/एमएल और आईएल-7 के 10 एनजी/एमएल के साथ पूरक संस्कृति माध्यम ।
    नोट: 1 दिन से 3 दिन के दौरान, कोई स्पष्ट टी सेल प्रसार मनाया जाएगा । बी कोशिकाओं, एनके कोशिकाओं, एनकेसी कोशिकाओं और मोनोसाइट्स जैसी गैर-टी कोशिकाओं की मृत्यु के कारण कुल सेल संख्या आमतौर पर 1/3 से 1/2 तक कम हो जाएगी।
  5. 7 दिन में, पेप्टाइड्स (4 μg/mL), आईएल-2 (१०० यू/एमएल), और आईएल-7 (20 एनजी/एमएल) युक्त ताजा माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम के आधे की जगह ।
    नोट: नीचे की कोशिकाओं को परेशान करने से बचने के लिए, माध्यम के ऊपर से सावधानीपूर्वक संस्कृति माध्यम के बारे में 90 माइक्रोन के बारे में पिपेट करें। 3 से दिन 7 के दौरान, मजबूत टी-सेल प्रसार देखा जाएगा, और टी-कोशिकाओं को आमतौर पर क्लस्टर बनाने के लिए कुल प्रसार करना होगा।
  6. 10 दिन में, धीरे-धीरे सेल समूहों को अलग करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 7-9 बार में पिपेट सेल संस्कृति, व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनती, और प्रत्येक अच्छी तरह से 2×105 कोशिकाओं को एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट (राउंड बॉटम) में स्थानांतरित करें।
  7. 12 दिन में एपिटोप पहचान के लिए कोशिकाओं के बाकी खेती जारी रखें, संस्कृति माध्यम की मात्रा को १०० μL (अत्यधिक माध्यम को त्यागने) के लिए समायोजित करें, और पेप्टाइड्स (4 μg/mL), आईएल-2 (१०० यू/एमएल), और आईएल-7 (20 ng/mL) युक्त ताजा पूर्ण संस्कृति माध्यम के १०० माइक्रोन के साथ संस्कृति के पूरक ।
    नोट: दिन 7 से 10 दिन के दौरान, टी कोशिकाओं को तेजी से प्रसार जारी है । यदि माध्यम पीला हो जाता है तो संस्कृति माध्यम को चरण 3.5 में बदलें। सामान्य तौर पर, सेल संख्या 10 दिन में 6×105 से अधिक हो जाएगी। प्रत्येक अच्छी तरह से आम तौर पर इसी तरह की सेल संख्या से पता चलता है, 3 कुओं में सेल संख्या गिनती और सभी कुओं के लिए सेल संख्या का अनुमान के रूप में औसत मूल्य का उपयोग करें ।

4. इंट्रासेलुलर फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण

  1. पेप्टाइड पूल के साथ पीबीएमसी उत्तेजक
    1. 96 अच्छी तरह से प्लेट (गोल नीचे) में स्थानांतरित कोशिकाओं के लिए, एक प्लेट (550 × जी, 3 मिनट) में 3 बार धोएं। प्रत्येक धोने के लिए माध्यम के 200 μL का उपयोग करें (पहले 2 वॉश के लिए आरपीएमआई 1640, अंतिम धोने के लिए पूर्ण संस्कृति माध्यम)। सुपरनेटेंट को छोड़ दें।
      नोट: बार-बार धोने से संस्कृति में अवशिष्ट साइटोकिन्स को हटाने से इंट्रासेलुलर प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में पृष्ठभूमि को प्रभावी ढंग से कम किया जा सकता है।
    2. एक विशिष्ट पेप्टाइड पूल के साथ उत्तेजित कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं के लिए, एक ही पेप्टाइड पूल (प्रत्येक पेप्टाइड के लिए 2 माइक्रोन/एमएल) के साथ पूरक पूर्ण संस्कृति माध्यम के 200 μL जोड़ें। पृष्ठभूमि नियंत्रण के लिए, DMSO के 1 μL/एमएल के साथ पूर्ण संस्कृति माध्यम पूरक जोड़ें । सकारात्मक नियंत्रण के लिए, DMSO के 1 μL/mL के साथ पूर्ण संस्कृति माध्यम पूरक जोड़ें, १५० एनजी/फीरोल के 12-myristate 13-एसीटेट (PMA), और 1 μmol/ionomycin के एल ।
      नोट: DMSO की उच्च खुराक टी कोशिकाओं के साइटोकिन स्राव को अवरुद्ध करेगी (टीएनएफ-α के लिए सबसे महत्वपूर्ण)। 5 माइक्रोन/एमएल से अधिक डीएमएसओ की खुराक की सिफारिश नहीं की जाती है। आम तौर पर, हमारे प्रयोग में DMSO की खुराक 1 μL/एमएल से अधिक नहीं है ।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और 6 घंटे के लिए 5% सीओ2।
    4. इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद, संस्कृति के लिए Monensin (१.३७ μg/mL) जोड़ें ।
  2. फ्लो साइटोमेट्री
    1. इनक्यूबेशन के 6 घंटे के बाद। अपकेंद्रित्र के बाद सुपरनेट निकालें (550 × जी, 3 मिनट), 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में डीपीबीएस (550 × जी, 3 मिनट), दाग सतह मार्कर (सीडी 3, सीडी 4, और सीडी 8) और व्यवहार्यता मार्कर (फिक्सेबल वायबिलिटी डाई का उपयोग करके) के 200 माइक्रोल के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं।
    2. डीपीबीएस (550 × जी, 3 मिनट) के 200 माइक्रोल के साथ एक बार धोएं। 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में कोशिकाओं को स्थिर और पार कर लें, और इंट्रासेलुलर साइटोकिन्स (टीएनएफ-α और आईएफएन-γ) को दाग दें।
    3. इंट्रासेलुलर स्टेनिंग में अंतिम धोने के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री बफर (डीपीबीएस + 0.5% बीएसए) के 150 माइक्रोल में कोशिकाओं को फिर से ढर्रेष्ण करें।
    4. फ्लो साइटोमीटर पर फ्लो साइटोमेट्री डेटा प्राप्त करें।
  3. प्रवाह साइटोमेट्री परिणामों का विश्लेषण
    1. सकारात्मक अच्छी तरह से परिभाषा: एक अच्छी तरह से सकारात्मक विचार करें यदि इसमें पृष्ठभूमि नियंत्रण के कम से कम दो बार टी कोशिकाओं को स्रावित करने वाली साइटोकिन की आवृत्ति है(चित्र 1)।
    2. निम्नलिखित सूत्र के अनुसार, प्रत्येक साइटोकिन विश्लेषण के लिए प्रतिक्रिया दर की गणना करें(चित्र 2):
      Equation 1
      नोट: पंक्ति पेप्टाइड पूल और मैट्रिक्स में कॉलम पेप्टाइड पूल एचबीवी कोर एंटीजन के 2 अलग संरचनाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, इसलिए अंतिम प्रतिक्रिया दर को 2 से विभाजित किया जाना चाहिए।

5. एचबीवी-विशिष्ट एचएलए-डीआर प्रतिबंधित सीडी 4 टी-सेल एपिटोप्स की पहचान

  1. टी-75 फ्लास्क (5-20 ×106 कोशिकाओं, पूर्ण संस्कृति माध्यम के 20 एमएल) में एलोजेनिक बी लिम्फोब्लास्टोइड सेल लाइनों (बीएलसीएलएस) को गल और बनाए रखें।
    नोट: BLCLs की अच्छी स्थिति की गारंटी के लिए, यह कदम रोगियों के पीबीएमसी के विगलन से 2 सप्ताह पहले शुरू किया जाना चाहिए । BLCLs HLA-DRB1 allele में homozygous होना चाहिए । जेनोटीपिंग रिजल्ट के मुताबिक, मरीजों को बीएलसीएलएस के रूप में एक ही एचएलए-DRB1 एलील साझा करना चाहिए ।
  2. पहचान के लिए उम्मीदवार पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग(चित्र 3)
    1. 10 दिन में टी-सेल रिस्पांस रेट के परिणामों के अनुसार, उच्चतम प्रतिक्रिया दर (1 पंक्ति पेप्टाइड पूल और 1 कॉलम पेप्टाइड पूल) के साथ 2 पेप्टाइड पूल स्क्रीन करें।
    2. एक उम्मीदवार पेप्टाइड के रूप में उन 2 पूलों में पेप्टाइड सेट करें यदि इस पेप्टाइड युक्त अन्य पेप्टाइड पूल टी-सेल प्रतिक्रिया विश्लेषण में सकारात्मक परिणाम भी दिखाता है। बाद में एपिटोप पहचान के लिए अन्य पेप्टाइड पूल के साथ विस्तारित पीबीएमसी का उपयोग करें।
  3. पेप्टाइड के साथ स्पंदन बीएलएलएस
    1. 12 दिन में, व्यवहार्य बीएलसीएल की संख्या गिनें, कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब, सेंट्रलाइज (350 × जी, 10 मिनट) में स्थानांतरित करें और सुपरनैक्टेंट को हटा दें। पूरी संस्कृति माध्यम में सेल गोली को फिर से खर्च करें, और एलिकोट बीएलसीएलएस को 4×104 कोशिकाओं पर 96-वेल प्लेट (राउंड बॉटम) में/
    2. एक पेप्टाइड (10 माइक्रोग्राम/एमएल), 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और 2 घंटे के लिए 5% सीओ2 जोड़ें। सेट 2 पृष्ठभूमि नियंत्रण: एचएलए-डीआर ब्लॉकिंग के साथ पेप्टाइड स्पंदन (1 घंटे के लिए एंटी-एचएलए-डीआर (10 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ प्रीट्रीटमेंट); डीएमएसओ (1 μL/mL) स्पंदन । प्रत्येक कुएं में पूर्ण संस्कृति माध्यम की अंतिम मात्रा 100 माइक्रोन है।
    3. माइटोमाइसिन सी (100 माइक्रोग्राम/एमएल), 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 जोड़ें।
    4. संयुक्त राष्ट्र-स्पंदित पेप्टाइड और माइटोमाइसिन सी को हटाने के लिए एक प्लेट में आरपीएमआई 1640 (550 × जी, 3 मिनट) के 200 माइक्रोन के साथ 3 बार धोएं। पहले धोने के लिए, इनक्यूबेशन संस्कृति को आरपीएमआई 1640 के 100 माइक्रोन के साथ पूरक करें।
    5. पूर्ण संस्कृति माध्यम के 120 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से पेंड करें।
  4. पेप्टाइड स्पंदित बीएलसीएल के साथ पीबीएमसी को उत्तेजित करना।
    1. 12 दिन में, पीबीएमसी को 96-अच्छी प्लेट (गोल बॉटम) में स्थानांतरित करें।
    2. एक प्लेट में अपकेंद्रित्र (550 × जी, 3 मिनट) के बाद सुपरनेट निकालें, एक प्लेट में आरपीएमआई 1640 (550 × जी, 3 मिनट) के 200 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं।
      नोट: बार-बार धोने से संस्कृति में अवशिष्ट साइटोकिन्स और पेप्टाइड्स को हटाना इंट्रासेलुलर प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में पृष्ठभूमि को कम करने के लिए महत्वपूर्ण कदम है। विशेष रूप से अवशिष्ट पेप्टाइड्स के लिए, यह बीएलसीएलएस से बांधेगा और पृष्ठभूमि में काफी वृद्धि करेगा।
    3. पूर्ण संस्कृति माध्यम के 210 माइक्रोन के साथ प्रत्येक कुएं पर पीबीएमसी को फिर से पेंड करें।
    4. एपिटोप पहचान के लिए चुने गए पीबीएमसी के कुएं के लिए, पेप्टाइड स्पंदित बीएलसी (2 पृष्ठभूमि नियंत्रण सहित 3 कुओं) के साथ एलिकोट (70 माइक्रोन प्रत्येक) मिलाएं।
      नोट: 12 दिन में, पेप्टाइड पूल विस्तारित पीबीएमसी की संख्या आमतौर पर 5-7×10 5 प्रति अच्छीतरह से ऊपर तक पहुंच जाएगी, इसलिए पीबीएमसी/बीएलसी का अनुपात लगभग 6/1 से 4/1 है ।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और 6 घंटे के लिए 5% सीओ2।
    6. इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद, संस्कृति के लिए Monensin (१.३७ μg/mL) जोड़ें । प्रत्येक कुएं में पूर्ण संस्कृति माध्यम की अंतिम मात्रा 200 माइक्रोन है।
  5. फ्लो साइटोमेट्री
    1. चरण 4.2 में समान संचालन दोहराएं।
  6. प्रवाह साइटोमेट्री परिणामों का विश्लेषण
    1. एक पेप्टाइड को एचएलए-डीआर प्रतिबंधित सीडी 4 टी-कोशिकाओं के रूप में सत्यापित करें, यदि पीबीएमसी इस पेप्टाइड स्पंदित बीएलसी के साथ इनक्यूबेटेड है, तो सीडी 4 टी कोशिकाओं को कम से कम दो बार पृष्ठभूमि नियंत्रण (एचएलए-डीआर प्री-ब्लॉकिंग के साथ पेप्टाइड स्पंदन) के साथ छेड़छाड़ की गई साइटोकिन स्रावित की आवृत्ति दिखाती है; डीएमएसओ स्पंदन)(चित्रा 4)।

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Representative Results

साइटोकिन स्राव सीडी 4 टी कोशिकाओं की आवृत्ति की गणना एकल उत्पादकों और दोहरे उत्पादकों दोनों के योग के रूप में की जाती है। जैसा कि चित्रा 1में प्रदर्शित किया गया है, टीएनएफ-α की आवृत्ति सीडी 4 टी कोशिकाओं को स्रावित करती है और पृष्ठभूमि नियंत्रण (डीएमएसओ) में सीडी 4 टी कोशिकाओं को स्रावित करने वाले आईएफएन-γ की आवृत्ति क्रमशः 0.154% और 0.013% है। टीएनएफ-α स्राव सीडी 4 टी कोशिकाओं की आवृत्ति और पेप्टाइड पूल Core11 के लिए विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं को स्राव करने वाले आईएफएन-γ की आवृत्ति क्रमशः 0.206 और 0.017 हैं, इसलिए टीएनएफ-α गुप्त सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रिया और इस पेप्टाइड पूल के लिए सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रिया का स्राव करने वाले आईएफएन-γ को नकारात्मक माना जाता है। टीएनएफ-α स्राव सीडी 4 टी कोशिकाओं की आवृत्ति और पेप्टाइड पूल Core09 के लिए विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं को स्राव करने वाले आईएफएन-γ स्राव की आवृत्ति क्रमशः 2.715% और 0.973% हैं, इसलिए टीएनएफ-α दोनों सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रिया स्राव और इस γ लिए सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रिया को सकारात्मक माना जाता है।

जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है, सकारात्मक कुओं को ग्रे पृष्ठभूमि के साथ इंगित किया जाता है। सीडी 4 टी-सेल रिस्पांस रेट को स्रावित करते हुए एचबीवी कोर-विशिष्ट टीएनएफ-α की गणना करते समय पेप्टाइड पूल Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 और Core10 के डेटा को शामिल किया जाना चाहिए। सीडी 4 टी-सेल रिस्पांस रेट को स्रावित करते हुए एचबीवी कोर-विशिष्ट आईएफएन-γ की गणना करते समय पेप्टाइड पूल Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 और Core10 के डेटा शामिल हैं।

जैसा कि चित्र 3में प्रदर्शित किया गया है, एपिटोप पहचान के लिए उम्मीदवार पेप्टाइड्स लाल रंग में इंगित किए गए हैं। Core01 दोनों TNF-α सीडी 4 टी कोशिकाओं और IFN-γ कॉलम पेप्टाइड पूल में सीडी 4 टी कोशिकाओं का स्राव के लिए उच्चतम प्रतिक्रिया दर है । पेप्टाइड्स C1-15, C31-45, C61-75, और C91-105 इस पेप्टाइड पूल में उम्मीदवार पेप्टाइड के रूप में सेट कर रहे हैं क्योंकि उन पेप्टाइड्स युक्त पंक्ति पेप्टाइड पूल भी टी-सेल प्रतिक्रिया में सकारात्मक परिणाम दिखाता है । पेप्टाइड पूल Core07, Core08, Core09, और Core10 के साथ विस्तारित पीबीएमसी का उपयोग क्रमशः पेप्टाइड्स सी1-15, सी 31-45, सी61-75 और सी 91-105 की एपिटोप पहचान के लिए किया जाता है। Core09 दोनों TNF-α सीडी 4 टी कोशिकाओं और IFN-γ पंक्ति पेप्टाइड पूल में सीडी 4 टी कोशिकाओं का स्राव के लिए उच्चतम प्रतिक्रिया दर है । पेप्टाइड्स C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95, और C86-100 इस पेप्टाइड पूल में उम्मीदवार पेप्टाइड के रूप में सेट कर रहे हैं क्योंकि उन पेप्टाइड्स वाले कॉलम पेप्टाइड पूल भी टी-सेल प्रतिक्रिया में सकारात्मक परिणाम दिखाते हैं । पेप्टाइड पूल Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, और Core06 के साथ विस्तारित पीबीएमसी क्रमशः पेप्टाइड्स C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 और C86-100, की epitope पहचान के लिए उपयोग किया जाता है ।

जैसा कि चित्रा 4में प्रदर्शित किया गया है, पेप्टाइड पूल कोर08 के लिए पीबीएमसी का विस्तार किया गया, पेप्टाइड C31-45 स्पंदित बीएलसीएल के साथ उत्तेजना के बाद, टीएनएफ-α स्राव सीडी 4 टी कोशिकाओं की आवृत्ति और आईएफएन-γ स्राव सीडी 4 टी कोशिकाओं की आवृत्ति क्रमशः 0.995% और 0.131% हैं, जो पृष्ठभूमि नियंत्रण से 2 गुना अधिक अधिक हैं (पेप्टाइड C31-45 पल्स बीएलएस एचएलए-डीआर प्री-ब्लॉकिंग के साथ, डीएमएसओ स्पंदित बीएलसीएल) । इस प्रकार, पेप्टाइड C31-45 एक एचएलए-DR प्रतिबंधित सीडी 4 टी सेल epitope के रूप में सत्यापित किया जाता है । पेप्टाइड पूल Core10 के लिए विस्तारित पीबीएमसी, पेप्टाइड C91-105 स्पंदित BLCLs के साथ उत्तेजना के बाद, टीएनएफ-α की आवृत्ति सीडी 4 टी कोशिकाओं का स्राव और आईएफएन-γ स्राव सीडी 4 टी कोशिकाओं की आवृत्ति क्रमशः 0.221% और 0.000% हैं, जो पृष्ठभूमि नियंत्रण के 2 गुना से अधिक नहीं है (पेप्टाइड C91-45 ब्लड्ड बीएलसीएल एचएलए-डीआर प्री-ब्लॉकिंग, डीएमएसओ स्पंदित बीएलसीएल के साथ), इसलिए पेप्टाइड C91-105 को एचएलए-डीआर प्रतिबंधित सीडी 4 टी-सेल एपिटॉप के रूप में सत्यापित नहीं किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1:पेप्टाइड पूल में सीडी 4 टी कोशिकाओं को स्रावित करने वाले टीएनएफ-α/आईएफएन-γ के फ्लो साइटोमेट्री प्रदर्शन ने अपने संबंधित पेप्टाइड पूल के साथ उत्तेजित होने के बाद पीबीएमसी का विस्तार किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:विश्लेषण का प्रदर्शन एचबीवी कोर-विशिष्ट टीएनएफ-α/IFN-γ सीडी 4 टी कोशिकाओं का स्राव । टीएनएफ/डीएमएसओ और आईएफएन-Ƴ/डीएमएसओ ने डीएमएसओ नियंत्रण के कुएं में सीडी 4 टी कोशिकाओं को टीएनएफ-α/आईएफएन-γ स्रावित सीडी 4 टी कोशिकाओं की आवृत्ति से विभाजित पीबीएमसी को प्रेरित करते हुए टीएनएफ-α/आईएफएन-γ की आवृत्तियों के अनुपात को इंगित किया है । ग्रे पृष्ठभूमि पृष्ठभूमि नियंत्रण के साथ तुलना द्वारा ंयाय सकारात्मक सीडी 4 टी सेल प्रतिक्रिया के साथ कुओं को इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:एपिटोप पहचान के लिए उम्मीदवार पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग का प्रदर्शन । टीएनएफ/डीएमएसओ और आईएफएन-Ƴ/डीएमएसओ ने डीएमएसओ नियंत्रण के कुएं में सीडी 4 टी कोशिकाओं को टीएनएफ-α/आईएफएन-γ स्रावित सीडी 4 टी कोशिकाओं की आवृत्ति से विभाजित पीबीएमसी को प्रेरित करते हुए टीएनएफ-α/आईएफएन-γ की आवृत्तियों के अनुपात को इंगित किया है । ग्रे पृष्ठभूमि पृष्ठभूमि नियंत्रण के साथ तुलना द्वारा ंयाय सकारात्मक सीडी 4 टी सेल प्रतिक्रिया के साथ कुओं को इंगित करता है । लाल रंग में पेप्टाइड्स स्क्रीनिंग मापदंड के अनुसार उम्मीदवार पेप्टाइड्स का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एपिटोप पहचान परिणामों का प्रवाह साइटोमेट्री प्रदर्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम इस प्रकार सूचीबद्ध हैं: 1) पीबीएमसी विस्तार शुरू करने के लिए उच्च व्यवहार्यता के पर्याप्त पीबीएमसी; 2) पीबीएमसी विस्तार के लिए उपयुक्त वातावरण; और 3) एपिटोप पहचान से पहले पीबीएमसी संस्कृति में अवशिष्ट पेप्टाइड पूल को पूरी तरह से हटाना।

इस प्रोटोकॉल में सभी विश्लेषण सीडी 4 टी कोशिकाओं के मजबूत प्रसार पर निर्भर करता है। सामान्य तौर पर 10 दिन के विस्तार के बाद पीबीएमसी की संख्या शुरुआती संख्या का 2-3 गुना होगी। पीबीएमसी विस्तार में सेल नंबर और पीबीएमसी की व्यवहार्यता 2 प्रमुख कारक हैं। यदि उद्देश्य केवल epitope पहचान के बिना एचबीवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए है, यह प्रारंभिक PBMCs संख्या को कम करने के लिए उचित है, खासकर जब रक्त नमूने की मात्रा सीमित है । जबकि, हमारे अनुभव में, सफल पीबीएमसी विस्तार मुश्किल से प्राप्त किया जा सकता है अगर पीबीएमसी की शुरुआत संख्या १.५×105 कोशिकाओं/ विस्तार के लिए नए सिरे से पीबीएमसी का उपयोग करते समय, सेल व्यवहार्यता एक समस्या नहीं होगी। जबकि विस्तार के लिए क्रायोप्रीप्रर्वीवित पीबीएमसी का उपयोग करते समय, पीबीएमसी की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए पीबीएमसी का क्रायोप्रिजर्वेशन और विगलन बहुत सावधानीपूर्वक आयोजित किया जाना चाहिए।

एचबीवी-विशिष्ट टी कोशिकाओं के कार्यात्मक विश्लेषण में, आईएल-12 का उपयोग आमतौर पर सीडी 8 टी कोशिकाओं के कार्य को बढ़ाने के लिए पीबीएमसी विस्तार में किया जाता है। चूंकि आईएल-12 सीडी 4 टी कूप सहायक कोशिकाओं की ओर सीडी 4 टी कोशिकाओं के विभेदन को प्रेरित कर सकता है, इसलिए एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं के कार्यात्मक विश्लेषण में इस साइटोकिन से बचा जाना चाहिए। हमारे प्रोटोकॉल में, केवल आईएल-2 (टी-सेल विस्तार के लिए) और आईएल-7 (टी-सेल अस्तित्व के लिए) विस्तार के दौरान एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं के कार्यात्मक प्रोफ़ाइल को यथासंभव बरकरार रखने के लिए पूरक हैं। टीएनएफ-α, आईएफएन-γ, आईएल-4, आईएल-17 और आईएल-21: हमने एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए 5 साइटोकिन्स का परीक्षण किया है। हमारे विश्लेषण नमूनों में, टीएनएफ-α और आईएफएन-γ एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा स्रावित 2 प्रमुख साइटोकिन्स हैं16। एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं के कार्यात्मक प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करने में, विस्तृत कार्यात्मक प्रोफ़ाइल जानकारी प्राप्त करने के लिए यथासंभव अधिक से अधिक साइटोकिन्स का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। जबकि एपीटोप पहचान में, आर्थिक विचार के लिए केवल टीएनएफ-α और आईएफएन-γ का विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।

पर्याप्त एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाएं सफल एपिटोप पहचान के लिए महत्वपूर्ण हैं, इसलिए उच्च एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रिया वाले रोगियों में एपिटोप पहचान पर विचार किया जाना चाहिए, जैसे हेपेटाइटिस बी भड़कना रोगियों (मजबूत एचबीवी-विशिष्ट TNF-α सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रिया का स्राव) और वायरल क्लीयरेंस (मजबूत एचबीवी-विशिष्ट IFN-γ CD4 टी-सेल प्रतिक्रिया)166 . एपिटोप पहचान के लिए बीएलसीएल के साथ इन कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग करने से पहले बार-बार धोने से पेप्टाइड पूल विस्तारित पीबीएमसी में अवशिष्ट पेप्टाइड्स को हटाना बहुत महत्वपूर्ण है। अवशिष्ट पेप्टाइड्स डीएमएसओ स्पंदित बीएलसीएलएस को बांधेंगे, पेप्टाइड-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं को सक्रिय करेंगे, इसके द्वारा पृष्ठभूमि को काफी हद तक बढ़ाया जाएगा।

कुछ एचबीवी एंटीजन में विभिन्न एचबीवी जीनोटाइप (जैसे, एचबीवी सतह एंटीजन) में परिवर्तनीय दृश्य होते हैं। एक समाधान रोगियों में विशिष्ट एचबीवी जीनोटाइप को पूर्व-निर्धारित करना और विभिन्न एचबीवी जीनोटाइप वाले रोगियों के लिए एचबीवी जीनोटाइप-विशिष्ट पेप्टाइड पूल डिजाइन करना है। जबकि एचबीवी जीनोटाइप कम एचबीवी वायरल लोड (जैसे, नियमित रूप से एंटी-वायरल उपचार के साथ HBeAg नकारात्मक रोगियों) वाले रोगियों में संयुक्त राष्ट्र-औसत दर्जे का है, इस परिदृश्य में, समाधान विभिन्न एचबीवी जीनोटाइप से पेप्टाइड्स को एक ही पेप्टाइड पूल में एक साथ मिलाना है, जैसा कि हमने पिछले अध्ययन16में किया था। इस मिश्रण रणनीति की एक कमी यह है कि एपिटोप को पेप्टाइड जोड़ी के रूप में पहचाना जा सकता है लेकिन एक भी पेप्टाइड नहीं, क्योंकि पेप्टाइड्स मैट्रिक्स में कुछ पदों पर एंटीजन के एक ही टुकड़े में पेप्टाइड जोड़ी होती है।

इस विधि में एक बड़ी खामी समय लेने वाली 10 दिवसीय पीबीएमसी विस्तार है। वर्तमान में, साइटोकिन स्राव के पूर्व वीवो विश्लेषण एक विश्वसनीय तरीके से एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं का पता नहीं लगा सका। पेप्टाइड स्पंदित एलोजेनिक बीएलसीएल का उपयोग करना क्योंकि उत्तेजक आमतौर पर पेप्टाइड में अधिक पेप्टाइड-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं का पता लगाया जाता है, जो पेप्टाइड्स16के साथ उत्तेजक की तुलना में पीबीएमसी का विस्तार करता है। यह जांच के लायक है कि एंटीजन प्रस्तुति कोशिकाओं के रूप में पेप्टाइड स्पंदित ऑटोलॉगस बी कोशिकाओं का उपयोग करने से एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं को पूर्व वीवो का मज़बूती से पता लगाने में मदद मिल सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (81930061), चोंगकिंग नेचुरल साइंस फाउंडेशन (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) और चीनी कुंजी द्वारा समर्थित किया गया था।
संक्रामक रोगों के लिए विशेष परियोजना (2018ZX10723203)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin Bovine V (BSA) Beyotime ST023
APC-conjugated Anti-human TNF-α eBioscience 17-7349-82 Keep protected from light
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Limit cell clumping
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09126 HLA-DRB1*0803 homozygote
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09121 HLA-DRB1*1202 homozygote
Cell Culture Flask (T75) Corning 430641
Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) Corning 3599 Flat bottom
Cell Culture Plate (96-well, round bottom) Corning 3799 Round bottom
Cell Strainer Corning CLS431751 Pore size 70 μm, white, sterile
Centrifuge Tube (15 mL) KIRGEN KG2611 Sterile
Centrifuge Tube (50 mL) Corning 430829 Sterile
Centrifuge, Refrigerated Eppendorf 5804R
Centrifuge, Refrigerated Thermo ST16R
Centrifuge, Refrigerated Thermo Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) BD Biosciences 562574 Prepare solution before use
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 Keep at room temperature to prevent crystallization
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave.
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-03
Filter Tips (0.5-10) Kirgen KG5131 Sterile
Filter Tips (100-1000) Kirgen KG5333 Sterile
Filter Tips (1-200) Kirgen KG5233 Sterile
FITC-conjugated Anti-human CD4 BioLegend 300506 Keep protected from light
Fixable Viability Dye eFluor780 eBioscience 65-0865-14 Keep protected from light
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD Biosciences 554724 Protein Transport Inhibitor
Haemocytometer Brand 718620
HBV Core Antigen Derived Peptides ChinaPeptides
HEPES Gibco 15630080 100 ml
Human Serum AB Gemini Bio-Products 100-51 100 ml
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
KCl Sangon Biotech A100395-0500
KH2PO4 Sangon Biotech A100781-0500
LSRFortessa Flow Cytometer BD
L-glutamine Gibco 25030081 100 ml
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Corning MCT-150-C Autoclaved sterilization before using
Microplate Shakers Scientific Industries MicroPlate Genie
Mitomycin C Roche 10107409001
Na2HPO4.7H2O Sangon Biotech A100348-0500
NaCl Sangon Biotech A100241-0500
PCR Tubes (0.2 mL) Kirgen KG2331
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 BioLegend 300914 Keep protected from light
PE-conjugated Anti-human IFN-γ eBioscience 12-7319-42 Keep protected from light
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122 100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 eBioscience 45-0037-42 Keep protected from light
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585
Recombinant Human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant Human IL-7 PeproTech 200-07
RPMI Medium 1640 Gibco C11875500BT 500 ml
Sodium pyruvate,100mM Gibco 15360070
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR BioLegend 307648
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1125

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References

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एचबीवी-विशिष्ट सीडी 4 टी-सेल प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण और एलएएल-डीआर-प्रतिबंधित सीडी 4 टी-सेल एपिटोप्स की पहचान पेप्टाइड मैट्रिक्स के आधार पर
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Xiao, J., Wan, X., Wang, H., Deng, G. Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix. J. Vis. Exp. (176), e62387, doi:10.3791/62387 (2021).

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