Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحليل استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV وتحديد HLA-DR-CD4 المقيدة CD4 T-Cell Epitopes استنادا إلى مصفوفة الببتيد

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/62387
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

Summary

واستنادا إلى مصفوفة الببتيد المشتقة من فيروس التهاب الكبد B، يمكن تقييم استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة بفيروس التهاب الكبد B بالتوازي مع تحديد الخلايا التائية CD4 الخاصة بفيروس التهاب الكبد B.

Abstract

تلعب خلايا CD4 T أدوارا مهمة في مسببات الأمراض لالتهاب الكبد B المزمن. كمحتوى خلايا متعددة الاستخدامات، تم تصنيف خلايا CD4 T كفئات فرعية وظيفية متميزة استنادا إلى السيتوكينات التي يفرزونها: على سبيل المثال، IFN-γ لخلايا المساعد CD4 T 1، IL-4 و IL-13 لخلايا المساعد CD4 T 2، وIL-21 لخلايا المساعد الجريبي CD4 T، وIL-17 لخلايا المساعد CD4 T. تحليل فيروس التهاب الكبد B (HBV) محددة CD4 الخلايا التائية على أساس إفراز السيتوكين بعد تحفيز الببتيدات المشتقة من HBV يمكن أن توفر معلومات ليس فقط حول حجم HBV محددة CD4 استجابة الخلايا التائية ولكن أيضا حول المجموعات الفرعية الوظيفية من خلايا CD4 T الخاصة HBV. ويمكن للنهج الجديدة، مثل علم النسخ وتحليل علم الأيض، أن توفر معلومات وظيفية أكثر تفصيلا عن خلايا CD4 T الخاصة ب HBV. تتطلب هذه النهج عادة عزل خلايا CD4 T الخاصة ب HBV القابلة للتطبيق استنادا إلى متعددات الخلايا التائية المعقدة II ذات الهستيد الرئيسية بالببتيد ، في حين أن المعلومات حول epitopes CD4 T-cell الخاصة ب HBV محدودة حاليا. استنادا إلى مصفوفة الببتيد المشتقة من HBV ، تم تطوير طريقة لتقييم استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV وتحديد الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV في وقت واحد باستخدام عينات خلايا الدم الأحادية الطرفية من مرضى عدوى HBV المزمنة.

Introduction

حاليا، هناك 3 النهج الرئيسية لتحليل الخلايا التائية المستضد محددة. ويستند النهج الأول على التفاعل بين مستقبلات الخلايا التائية والببتيد (epitope). يمكن أن تكون الخلايا التائية الخاصة بالمضاد ملطخة مباشرة بمتعددات مجمع توافق الهستوباتية الرئيسية للببتيد (MHC). ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن الحصول على خلايا T مستضد محددة قابلة للحياة، ومناسبة لتحليل النسخ المصب / المستقلب. أحد قيود هذه الطريقة هو أنه لا يمكن أن يوفر معلومات حول استجابة الخلايا التائية الكاملة لمستضد معين ، لأنه يتطلب ببتيدات الظهارة المعتمدة في حين أن عدد الأسطح المحددة لمستضد معين محدود في الوقت الحالي. بالمقارنة مع فيروس التهاب الكبد B (HBV) محددة CD8 تي الخلية epitopes, وقد تم تحديد أقل HBV محددة CD4 تي الخلية epitopes1,2, مما جعل هذه الطريقة أقل قابلية للتطبيق لتحليل خلايا CD4 T الخاصة HBV حاليا.

ويستند النهج الثاني على upregulation من سلسلة من علامات التنشيط الناجمة بعد تحفيز الببتيد مستضد3. وتشمل العلامات الشائعة الاستخدام CD69، CD25، OX40، CD40L، PD-L1، 4-1BB4. وقد استخدمت هذه الطريقة الآن لتحليل استجابات الخلايا التائية الخاصة بالمضاد في الأفراد الملقحين5،6 ،مرضىعدوى فيروس نقص المناعة البشرية7، وفيروس كورونافيروس الالتهاب الرئوي الحاد الوخيم 2 مرضىالعدوى 8،9. على عكس المقايسة المستندة إلى الببتيد-MHC ، لا يتم تقييد هذه الطريقة عن طريق epitopes المعتمدة ويمكن الحصول على خلايا قابلة للحياة لتحليل المصب. وهناك قيود على هذا الأسلوب هو أنه لا يمكن توفير معلومات حول ملف تعريف السيتوكين من الخلايا التائية الخاصة مستضد. أيضا، التعبير عن هذه العلامات الناجمة عن التنشيط من قبل بعض الخلايا المنشطة مستضد غير محددة قد تسهم في إشارات الخلفية في التحليل، والتي يمكن أن تكون مشكلة خاصة عندما تكون الخلايا التائية المستهدفة مستضد محددة نادرة. حاليا، هناك تطبيق محدود من هذا الأسلوب على خلايا CD4 T CD4 الخاصة HBV4. ما إذا كان يمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل خلايا CD4 T الخاصة ب HBV بطريقة موثوقة تحتاج إلى مزيد من التحقيق.

ويستند النهج الثالث على إفراز السيتوكين بعد تحفيز الببتيد مستضد. مثل التحليل القائم على علامة التنشيط الناجمة، لا يتم تقييد هذه الطريقة من قبل epitopes التحقق من صحتها. يمكن أن تكشف هذه الطريقة مباشرة عن ملف تعريف السيتوكين للخلايا التائية الخاصة بالمضاد. حساسية هذه الطريقة أقل من الطريقة القائمة على علامة التنشيط الناجمة لأنها تعتمد على إفراز السيتوكين من الخلايا التائية الخاصة بالمضاد وعدد السيتوكينات التي تم اختبارها عادة ما تكون محدودة. حاليا، يتم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع في تحليل الخلايا التائية الخاصة بفيروس التهاب الكبد B. كما السيتوكين إفراز خلايا T HBV محددة لا يكاد يمكن الكشف عنها عن طريق التحفيز المباشر الببتيد السابق فيفو10,11, يتم تحليل ملامح السيتوكين من الخلايا التائية HBV محددة عادة بعد 10 يوما في الببتيد المختبر حفز التوسع12,13,14,15,16. وقد استخدم ترتيب برك الببتيد في شكل مصفوفة لتسهيل تحديد epitopes مستضد محددة17،18. مع الجمع بين مصفوفة الببتيد وتحليل إفراز السيتوكين، تم تطوير طريقة لتقييم استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV وتحديد الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV في وقت واحد16. في هذا البروتوكول، يتم وصف تفاصيل هذا الأسلوب. يتم اختيار مستضد HBV الأساسية كمثال على مظاهرة في هذا البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مريض مدرج في الدراسة. يتوافق بروتوكول الدراسة مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية لإعلان هلسنكي لعام 1975 كما هو مبين في موافقة مسبقة من لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى ساوث ويست.

1. تصميم مصفوفة الببتيد المشتقة من HBV

  1. تحميل تسلسل الأحماض الأمينية من مستضد HBV الأساسية من قواعد بيانات NCBI (جينبانك: AFY98989.1).
  2. شراء مستضد HBV الأساسية المستمدة الببتيدات (لوحة من 35 15 مير الببتيدات متداخلة من قبل 10 بقايا, نقاء > 90٪, 4 ملغ/الببتيد) من مزود خدمة توليف الببتيد.
  3. إعداد مصفوفة الببتيد مربع 6×6 مع كل موقف في المصفوفة التي تحتوي على الببتيد 1 فقط. هناك 12 برك الببتيد: 6 برك الببتيد الصف و 6 برك الببتيد العمود، 5-6 الببتيدات في كل بركة16. تمثل برك الببتيد الصف وبرك الببتيد العمود في المصفوفة تشكيلين منفصلين من مستضد HBV الأساسي.
  4. ل3/4 من الببتيدات المشتراة، مزيج الببتيدات في نفس الصف / العمود من المصفوفة في 12 برك الببتيد منفصلة عن طريق حلها معا في كبريتيد ثنائي ميثيل (DMSO) (2 ميكروغرام / ميكرولتر لكل الببتيد). تخزين في -80 درجة مئوية لتحليل استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV.
  5. حل بقية الببتيدات بشكل منفصل (10 ميكروغرام / ميكرولتر) وتخزينها في -80 درجة مئوية لتحديد epitope.

2. عزل خلايا الدم المحيطي أحادية النوى (PBMCs)

  1. عينة 5 مل من الدم الوريدي من مرضى عدوى فيروس التهاب الكبد B المزمن.
    ملاحظة: ينبغي تقدير حجم الدم تقريبا وفقا لعدد من برك الببتيد بالإضافة إلى 1 التحكم الخلفية و 1 السيطرة الإيجابية. تحليل 1 تجمع الببتيد يحتاج 3 × 105 PBMCs. في المتوسط، يمكن الحصول على 1 ×10 6 PBMCs من 1 مل من الدم.
  2. عزل PBMCs من الدم باستخدام الطرد المركزي التدرج كثافة Ficoll (800 × غرام، 20 دقيقة) والتبريد PBMCs معزولة في النيتروجين السائل لاستخدامها في وقت لاحق.
  3. استخدام ماصة باستور لجمع المحببات بين طبقة فيكول واضحة وطبقة خلايا الدم الحمراء. استخراج الحمض النووي الجينومي من الخلايا الحبيبية باستخدام عدة تنقية الحمض النووي الجينومي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. أرسل عينة الحمض النووي إلى مقدمي خدمات الكتابة الجينية لتحديد النمط الجيني HLA-DRB1.

3. في المختبر توسيع PBMCs باستخدام مصفوفة الببتيد HBV

  1. تذوب PBMCs.
    1. دافئ RPMI 1640 تكملها مع 1:10,000 البنزوناز (25 U/mL) إلى 37 °C في حمام مائي.
      ملاحظة: يساعد البنزوناز على الحد من تكتل الخلايا أثناء ذوبان الجليد. كل عينة سوف تتطلب 20 مل من RPMI 1640 مع البنزوناز. حساب المبلغ اللازم لإذابة جميع العينات، وإعداد aliquot منفصلة من وسائل الإعلام (37 درجة مئوية) مع 1:10،000 بنزوناسي (25 U/mL). لا تذوب أكثر من 5 عينات في وقت واحد.
    2. إزالة عينات من النيتروجين السائل وتذوب بسرعة قوارير المجمدة في حمام مائي (37 درجة مئوية).
    3. نقل تعليق الخلية المذاب إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. إضافة 1 مل من بنزوناسي RPMI 1640 (37 درجة مئوية) دروبية إلى الأنبوب. أضف ببطء 6 مل من بنزوناسي RPMI 1640 (37 درجة مئوية) إلى أنبوب الطرد المركزي ، شطف cryovial مع آخر 2 مل من بنزوناسي RPMI 1640 (37 درجة مئوية) لاسترداد جميع الخلايا. تابع باقي العينات في أسرع وقت ممكن.
      ملاحظة: التخفيف البطيء للعينات المبردة هو المفتاح للحفاظ على صلاحية الخلايا المذابة.
    4. الطرد المركزي (400 × غرام، 10 دقيقة)، وإزالة supernatant، وتخفيف بيليه عن طريق النقر على الأنبوب.
    5. إعادة إنفاق بيليه بلطف في 1 مل من البنزينزونا الدافئة RPMI 1640. اخلط الخلايا برفق، وتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرومتر إذا لزم الأمر (أي إذا كان هناك أي كتلة مرئية).
    6. Aliquot تعليق 10 ميكرولتر وتمييع في المالحة الفوسفات المخزنة بالفوسفات في دولبيكو (DPBS)، إضافة تريبان الأزرق (0.04٪)، وتحميل على مقياس الدم، والانتظار لمدة 1 دقيقة، وعدد الخلايا قابلة للحياة (خلايا واضحة).
    7. إضافة 9 مل من بنزوناسي RPMI 1640 (37 درجة مئوية) إلى الأنبوب، والطرد المركزي (400 × غرام، 10 دقيقة)، وإزالة supernatant، وتخفيف بيليه عن طريق النقر على الأنبوب.
  2. ريسوسبند PBMCs في RPMI 1640 تكملها مع 25 MM HEPES, 2 mM L-الجلوتامين, 1 mM الصوديوم بيروفاتي, 100 U/mL البنسلين, 100 ميكروغرام / مل streptomycin, و 10٪ مصل AB الإنسان (متوسط الثقافة الكاملة). ضبط كثافة الخلية إلى 1.5 × 106 خلايا / مل. لوحة PBMCs في لوحات 96 جيدا (أسفل شقة) في كثافة 3 × 105 خلايا / جيدا.
  3. إضافة مجمعات الببتيد المشتقة من HBV (2 ميكروغرام / مل لكل ببتيد واحد) إلى كل بئر. بالنسبة للتحكم في الخلفية والتحكم الإيجابي، أضف نفس كمية المذيبات (DMSO، 1 ميكرولتر/مل). إضافة 10 U/mL IL-2 و 10 نانوغرام/مل IL-7. حضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  4. في اليوم 3، تكملة الثقافة المتوسطة مع 50 U/mL من IL-2 و 10 نانوغرام / مل من IL-7.
    ملاحظة: خلال اليوم 1 إلى اليوم 3، لن يلاحظ انتشار واضح للخلايا التائية. عادة ما ينخفض إجمالي عدد الخلايا بنسبة 1/3 إلى 1/2 ، بسبب وفاة الخلايا غير التائية مثل الخلايا B وخلايا NK وخلايا NKT والخلايا الأحادية.
  5. في اليوم السابع، استبدل نصف الوسط الثقافي بوسط طازج يحتوي على الببتيدات (4 ميكروغرام/مل)، وIL-2 (100 U/mL)، وIL-7 (20 نانوغرام/مل).
    ملاحظة: لتجنب إزعاج الخلايا في الجزء السفلي، ماصة حوالي 90 ميكرولتر من الثقافة المتوسطة بعناية من أعلى الوسط. وخلال اليوم الثالث إلى اليوم السابع، سيلاحظ انتشار قوي للخلايا التائية، وعادة ما تتجمع الخلايا التائية المنتشرة لتشكيل مجموعات.
  6. في اليوم 10، بلطف ماصة خلية الثقافة في كل بئر 7-9 مرات لتصنيف مجموعات الخلايا، عد عدد الخلايا قابلة للحياة، ونقل 2×105 خلايا في كل بئر إلى لوحة بئر 96 (القاع الجولة) لتحليل استجابة CD4 T-الخلية الخاصة HBV.
  7. مواصلة زراعة بقية الخلايا لتحديد epitope في اليوم 12، وضبط حجم الثقافة المتوسطة إلى 100 ميكرولتر (التخلص من المتوسطة المفرطة)، وتكملة الثقافة مع 100 ميكرولتر من المتوسطة ثقافة كاملة جديدة تحتوي على الببتيدات (4 ميكروغرام / مل)، IL-2 (100 U/mL)، وIL-7 (20 نانوغرام / مل).
    ملاحظة: خلال اليوم 7 إلى اليوم 10، تستمر الخلايا التائية في الانتشار بقوة. استبدل الوسط الموروث كما في الخطوة 3.5 إذا تحول الوسط إلى اللون الأصفر. بشكل عام، سوف يتجاوز عدد الخلايا 6×105 في اليوم 10. كل بئر عادة ما يظهر عدد خلايا مماثلة، عد عدد الخلايا في 3 آبار واستخدام متوسط القيمة كتقدير لعدد الخلية لجميع الآبار.

4. تحليل استجابات CD4 T-Cell الخاصة ب HBV عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. تحفيز PBMCs مع برك الببتيد
    1. للخلايا المنقولة إلى لوحة البئر 96 (القاع المستدير)، اغسل 3 مرات في طبق (550 × غرام، 3 دقائق). استخدام 200 ميكرولتر من المتوسطة لكل غسل (RPMI 1640 لأول 2 يغسل، وسط ثقافة كاملة لغسل الماضي). تجاهل الحشرات الخارقة.
      ملاحظة: إزالة السيتوكينات المتبقية في الثقافة عن طريق الغسيل المتكرر يمكن أن تقلل بشكل فعال من الخلفية في تحليل قياس الخلايا التدفق داخل الخلايا.
    2. لكل بئر من الخلايا التي يتم تحفيزها مع بركة ببتيد محددة ، أضف 200 ميكرولتر من متوسط الثقافة الكاملة المكملة بنفس برك الببتيد (2 ميكروغرام / مل لكل ببتيد واحد). للحصول على بئر التحكم في الخلفية، أضف وسيط ثقافة كاملة مكملا ب 1 ميكرولتر/مل من DMSO. كذلك من السيطرة الإيجابية, إضافة ثقافة كاملة المتوسطة تستكمل مع 1 ميكرولتر / مل من DMSO, 150 نانوغرام / مل من phorbol 12-myristate 13-خلات (PMA), و 1 ميكرومول / لتر من أيونوميسين.
      ملاحظة: جرعة عالية من DMSO سوف تمنع إفراز السيتوكين من الخلايا التائية (الأكثر أهمية ل TNF-α). لا ينصح بجرعة DMSO أعلى من 5 ميكرولتر / مل. عموما، جرعة DMSO في تجربتنا لا تتجاوز 1 ميكرولتر / مل.
    3. حضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 6 ساعة.
    4. بعد 1 ساعة من الحضانة، أضف Monensin (1.37 ميكروغرام/مل) إلى الثقافة.
  2. قياس التدفق الخلوي
    1. بعد 6 ساعة من الحضانة. إزالة supernatant بعد الطرد المركزي (550 × غرام، 3 دقائق)، وغسل الخلايا مرة واحدة مع 200 ميكروغرام من DPBS (550 × غرام، 3 دقائق)، وعلامات سطح وصمة عار (CD3، CD4، وCD8) وعلامة الجدوى (باستخدام صبغة الجدوى قابلة للإصلاح) في ثلاجة 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. يغسل مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من DPBS (550 × غرام، 3 دقائق). تثبيت الخلايا و permeabilize، وصمة عار السيتوكينات داخل الخلايا (TNF-α وIFN-γ) في ثلاجة 4 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
    3. بعد الغسل النهائي في تلطيخ داخل الخلايا، إعادة الإنفاق الخلايا في 150 ميكرولتر من تدفق التخزين المؤقت للخلايا (DPBS + 0.5٪ BSA).
    4. الحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي على مقياس التدفق الخلوي.
  3. تحليل نتائج قياس التدفق الخلوي
    1. تعريف إيجابي جيدا: النظر في كذلك إيجابية إذا كان لديه تردد السيتوكين إفراز الخلايا التائية مرتين على الأقل من التحكم في الخلفية جيدا (الشكل 1).
    2. وفقا للصيغة التالية، حساب معدل الاستجابة لكل السيتوكين تحليل(الشكل 2):
      Equation 1
      ملاحظة: تجمع الببتيد الصف وبرك الببتيد العمود في المصفوفة تمثل تشكيلين متميزين من مستضد HBV الأساسية، لذلك ينبغي تقسيم معدل الاستجابة النهائية من قبل 2.

5. تحديد HBV محددة HLA-DR المقيد CD4 تي الخلية Epitopes

  1. تذوب وتحافظ على خطوط الخلايا الليمفاوية B (BLCLs) في قارورة T-75 (5-20 ×106 خلايا ، 20 مل من متوسط الثقافة الكامل).
    ملاحظة: لضمان الحالة الجيدة للBLCLs، يجب أن تبدأ هذه الخطوة قبل أسبوعين من ذوبان الجليد من PBMCs المرضى. وفقا لنتيجة الإبادة الجماعية ، يجب على المرضى مشاركة نفس أليل HLA-DRB1 مثل BLCLs.
  2. فحص الببتيدات المرشحة لتحديد الهوية (الشكل 3)
    1. وفقا لنتائج معدل استجابة الخلايا التائية في اليوم 10 ، قم بفحص برك الببتيد 2 مع أعلى معدل استجابة (تجمع الببتيد الصف 1 وتجمع الببتيد عمود واحد).
    2. تعيين الببتيد في تلك برك 2 كبتيد مرشح إذا كان تجمع الببتيد الأخرى التي تحتوي على هذا الببتيد يظهر أيضا نتيجة إيجابية في تحليل استجابة الخلايا التائية. استخدام PBMCs الموسعة مع تجمع الببتيد الأخرى لتحديد epitope في وقت لاحق.
  3. النابض BLCLs مع الببتيد
    1. في اليوم 12، عد عدد BLCLs قابلة للحياة، ونقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي 15 مل، والطرد المركزي (350 × غرام، 10 دقيقة) وإزالة supernatant. Resuspend بيليه الخلية في المتوسط ثقافة كاملة، وaliquot BLCLs إلى لوحة 96 جيدا (القاع الجولة) في 4×104 خلايا / جيدا في 80 ميكرولتر متوسطة الثقافة الكاملة.
    2. إضافة الببتيد واحد (10 ميكروغرام / مل)، واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 2 ساعة. تعيين 2 التحكم الخلفية: الببتيد النابض مع HLA-DR حجب (المعالجة المسبقة مع المضادة HLA-DR (10 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة)؛ DMSO (1 ميكرولتر / مل) النابض. الحجم النهائي للوسط الثقافي الكامل في كل بئر هو 100 ميكرولتر.
    3. أضف المتومايسين C (100 ميكروغرام/مل)، واحتضن عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2 لمدة ساعة واحدة.
    4. غسل 3 مرات مع 200 ميكرولتر من RPMI 1640 (550 × غرام، 3 دقائق) في لوحة لإزالة الببتيد غير النابض والميتاميسين C. للغسيل الأول، تكمل ثقافة الحضانة مع 100 ميكرولتر من RPMI 1640.
    5. Resuspend الخلايا في 120 ميكرولتر من المتوسطة ثقافة كاملة.
  4. تحفيز PBMCs مع الببتيد نبض BLCLs.
    1. في اليوم 12، نقل PBMCs إلى لوحة 96 جيدا (القاع الجولة).
    2. إزالة supernatant بعد الطرد المركزي (550 × غرام، 3 دقائق) في لوحة، وغسل مرتين مع 200 ميكروغرام من RPMI 1640 (550 × غرام، 3 دقائق) في لوحة.
      ملاحظة: إزالة السيتوكينات والببتيدات المتبقية في الثقافة عن طريق الغسيل المتكرر هي الخطوة الرئيسية لتقليل الخلفية في تحليل قياس الخلايا التدفق داخل الخلايا. خاصة بالنسبة للببتيدات المتبقية ، فإنه سيتم ربط BLCLs وزيادة كبيرة في الخلفية.
    3. إعادة الإنفاق PBMCs في كل بئر مع 210 ميكرولتر من المتوسطة ثقافة كاملة.
    4. لبخير PBMCs التي تم اختيارها لتحديد epitope، مزيج aliquot (70 ميكرولتر لكل منهما) مع الببتيد نبض BLCLs (3 آبار، بما في ذلك 2 عناصر التحكم الخلفية).
      ملاحظة: في اليوم 12، سيصل عدد برك الببتيد الموسعة PBMCs عادة إلى ما يزيد عن 5-7×105 لكل بئر، وبالتالي فإن نسبة PBMCs/BLCLs حوالي 6/1 إلى 4/1.
    5. حضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 6 ساعة.
    6. بعد 1 ساعة من الحضانة، أضف Monensin (1.37 ميكروغرام/مل) إلى الثقافة. الحجم النهائي للوسط الثقافي الكامل في كل بئر هو 200 ميكرولتر.
  5. قياس التدفق الخلوي
    1. كرر نفس العمليات كما في الخطوة 4.2.
  6. تحليل نتائج قياس التدفق الخلوي
    1. تحقق من الببتيد باعتباره HLA-DR المقيد CD4 T-cells epitope إذا أظهرت PBMCs المحتضنة مع هذه الببتيد نبض BLCLs تردد السيتوكين إفراز خلايا CD4 T مرتين على الأقل من PBMCs المحتضنة مع عناصر التحكم الخلفية (الببتيد النابض مع HLA-DR قبل حجب; DMSO النابض) (الشكل 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم حساب وتيرة السيتوكين إفراز خلايا CD4 T كمجموع كل من المنتجين واحد والمنتجين مزدوجة. كما هو موضح في الشكل 1، فإن وتيرة TNF-α التي تفرز خلايا CD4 T وتواتر الخلايا التائية CD4 γ التي تفرزها IFN في التحكم في الخلفية (DMSO) هي 0.154٪ و 0.013٪ على التوالي. تردد TNF-α إفراز خلايا CD4 T وتواتر IFN-γ إفراز خلايا CD4 T محددة لتجمع الببتيد Core11 هي 0.206 و 0.017 على التوالي، لذلك تعتبر كل من TNF-α إفراز CD4 استجابة الخلية التائية وIFN-γ إفراز CD4 T-الخلية استجابة لهذا التجمع الببتيد سلبية. تردد TNF-α إفراز خلايا CD4 T وتواتر IFN-γ إفراز خلايا CD4 T محددة لتجمع الببتيد Core09 هي 2.715٪ و 0.973٪ على التوالي، لذلك تعتبر كل من TNF-α إفراز CD4 استجابة الخلية التائية وIFN-γ إفراز CD4 استجابة الخلية التائية لهذا التجمع الببتيد إيجابية.

كما هو موضح في الشكل 2، يشار إلى الآبار الإيجابية ذات الخلفية الرمادية. عند حساب HBV الأساسية محددة TNF-α إفراز CD4 معدل استجابة الخلايا التائية، والبيانات من برك الببتيد Core01، Core02، Core04، Core05، Core06، Core07، Core08، Core09، وCore10 ينبغي أن تدرج. عند حساب HBV الأساسية محددة IFN-γ إفراز CD4 معدل استجابة الخلايا التائية، يتم تضمين بيانات برك الببتيد Core01، Core02، Core03، Core04، Core05، Core06، Core07، Core08، Core09، وCore10.

كما هو موضح في الشكل 3، يشار إلى الببتيدات المرشحة لتحديد الظهارة باللون الأحمر. Core01 لديه أعلى معدل استجابة لكل من TNF-α إفراز خلايا CD4 T وIFN-γ إفراز خلايا CD4 T في برك الببتيد العمود. يتم تعيين الببتيدات C1-15، C31-45، C61-75، و C91-105 في هذا التجمع الببتيد والببتيدات المرشح كما برك الببتيد الصف التي تحتوي على تلك الببتيدات يظهر أيضا نتائج إيجابية في استجابة الخلايا التائية. وتستخدم PBMCs الموسعة مع برك الببتيد Core07، Core08، Core09، وCore10 لتحديد epitope من الببتيدات C1-15، C31-45، C61-75، وC91-105، على التوالي. Core09 لديه أعلى معدل استجابة لكل من TNF-α إفراز خلايا CD4 T وIFN-γ إفراز خلايا CD4 T في برك الببتيد الصف. الببتيدات C61-75، C66-80، C71-85، C76-90، C81-95، و C86-100 في هذا التجمع الببتيد يتم تعيين الببتيدات مرشح كما برك الببتيد العمود التي تحتوي على تلك الببتيدات يظهر أيضا نتيجة إيجابية في استجابة الخلايا التائية. وتستخدم PBMCs الموسعة مع برك الببتيد Core01، Core02، Core03، Core04، Core05، وCore06 لتحديد الببتيدات C61-75، C66-80، C71-85، C76-90، C81-95 و C86-100، على التوالي.

كما هو موضح في الشكل 4، للببتيد تجمع Core08 PBMCs الموسعة ، بعد التحفيز مع الببتيد C31-45 BLCLs نبضي ، تردد TNF-α تفرز خلايا CD4 T وتواتر IFN-γ تفرز خلايا CD4 T هي 0.995٪ و 0.131٪ على التوالي، والتي هي أكثر من 2 مرات أعلى من عناصر التحكم في الخلفية (الببتيد C31-45 BLCLs نبضي مع HLA-DR قبل حجب، DMSO نبض BLCLs). وهكذا، يتم التحقق من الببتيد C31-45 باعتبارها HLA-DR المقيد CD4 تي الخلية epitope. للببتيد تجمع Core10 PBMCs الموسعة، بعد التحفيز مع الببتيد C91-105 BLCLs نبضي، وتواتر TNF-α إفراز خلايا CD4 T وتواتر IFN-γ إفراز خلايا CD4 T هي 0.221٪ و 0.000٪ على التوالي، التي لا تتجاوز 2 مرات من عناصر التحكم الخلفية (الببتيد C91-45 BLCLs نبضي مع HLA-DR قبل حجب، DMSO نبض BLCLs)، لذلك لا يتم التحقق من الببتيد C91-105 كما HLA-DR المقيد CD4 تي الخلية epitope.

Figure 1
الشكل 1: تدفق بيان قياس الخلايا من TNF-α/IFN-γ إفراز خلايا CD4 T في برك الببتيد توسيع PBMCs بعد حفز مع برك الببتيد الخاصة بهم.

Figure 2
الشكل 2: عرض توضيحي للتحليل HBV الأساسية محددة TNF-α/IFN-γ إفراز خلايا CD4 T. وتشير TNF/DMSO وIFN-Ƴ/DMSO إلى نسب ترددات TNF-α/IFN-γ التي تفرز خلايا CD4 T في كل بئر من ببتيد تجمع PBMCs مقسوما على تردد TNF-α/IFN-γ التي تفرز خلايا CD4 T في بئر التحكم في DMSO. تشير الخلفية الرمادية إلى الآبار ذات الاستجابة الإيجابية للخلية التائية CD4 التي يتم الحكم عليها بالمقارنة مع التحكم في الخلفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: عرض من فحص الببتيدات المرشح لتحديد epitope. وتشير TNF/DMSO وIFN-Ƴ/DMSO إلى نسب ترددات TNF-α/IFN-γ التي تفرز خلايا CD4 T في كل بئر من ببتيد تجمع PBMCs مقسوما على تردد TNF-α/IFN-γ التي تفرز خلايا CD4 T في بئر التحكم في DMSO. تشير الخلفية الرمادية إلى الآبار ذات الاستجابة الإيجابية للخلية التائية CD4 التي يتم الحكم عليها بالمقارنة مع التحكم في الخلفية. الببتيدات باللون الأحمر تشير إلى الببتيدات المرشحة وفقا لمعايير الفحص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تدفق بيان قياس الخلايا من نتائج تحديد epitope. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وترد الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول على النحو التالي: 1) ما يكفي من مركبات PBMCs ذات الجدوى العالية لبدء توسيع PBMCs؛ (2) الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول؛ (2) الخطوات التي يمكن أن تكون ذات جدوى عالية لبدء توسعات PBMCs؛ (2) الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول. 2) البيئة المناسبة لتوسيع PBMCs؛ و 3) إزالة كاملة من برك الببتيد المتبقية في ثقافة PBMCs قبل تحديد epitope.

كل التحليل في هذا البروتوكول يعتمد على الانتشار القوي للخلايا التائية CD4. وبشكل عام، فإن عدد مركبات ثنائي الفينيل متعددة البروم بعد زيادة لمدة 10 أيام سيكون 2-3 أضعاف العدد الأولي. 11- إن عدد الخلايا وقدرة مركبات ثنائي الفينيل متعددة البروم على البقاء هما عاملان رئيسيان في توسيع مركبات ثنائي الفينيل متعددة البروم. إذا كان الغرض هو فقط لتحليل خلايا CD4 T الخاصة ب HBV دون تحديد الظهارة ، فمن المعقول تقليل عدد PBMCs الأولي ، خاصة عندما يكون حجم عينة الدم محدودا. وفي حين أنه، من خلال تجربتنا، لا يمكن الحصول على توسع ناجح في مركبات PBMCs إلا بالكاد إذا كان عدد مركبات PBMCs أقل من 1.5×105 خلايا/بئر. عند استخدام PBMCs جديدة للتوسع، فإن صلاحية الخلية لا يكون مشكلة. 10- وفي حين أنه عند استخدام مركبات PBMCS المبردة للتوسع، ينبغي إجراء حفظ التبريد وذوبان مركبات PBMCs بعناية فائقة للحفاظ على صلاحية مركبات PBMCs.

في التحليل الوظيفي للخلايا التائية الخاصة ب HBV ، يستخدم IL-12 عادة في توسع PBMCs لتعزيز وظيفة خلايا CD8 T. كما IL-12 يمكن أن تحفز التمايز من الخلايا التائية CD4 نحو خلايا المساعد الجريبي CD4 T, وينبغي تجنب هذا السيتوكين في التحليل الوظيفي للخلايا CD4 T الخاصة HBV. في بروتوكولنا، يتم استكمال IL-2 فقط (لتوسيع الخلايا التائية) وIL-7 (لبقاء الخلايا التائية) للحفاظ على الشخصية الوظيفية لخلايا CD4 T الخاصة ب HBV أثناء التوسع سليمة قدر الإمكان. لقد اختبرنا 5 السيتوكينات للتحليل الوظيفي للخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV: TNF-α، IFN-γ، IL-4، IL-17، وIL-21. في عينات تحليل لدينا، TNF-α وIFN-γ هي 2 السيتوكينات الرئيسية التي تفرزها خلايا CD4 T16الخاصة HBV . في تحليل الملف الوظيفي للخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV ، يوصى باختبار أكبر عدد ممكن من السيتوكينات للحصول على معلومات الملف الشخصي الوظيفية التفصيلية. بينما في تحديد epitope، فمن المستحسن لتحليل TNF-α وIFN-γ فقط، للنظر الاقتصادي.

ما يكفي من خلايا CD4 T الخاصة ب HBV أمر حيوي لتحديد الظهارة الناجح ، لذلك يجب النظر في تحديد epitope في المرضى الذين يعانون من استجابة عالية CD4 T-cell الخاصة ب HBV ، مثل مرضى التهاب الكبد B مضيئة (استجابة قوية TNF-α تفرز CD4 T-cell) والمرضى الذين لديهم إزالة فيروسية (استجابة قوية γ للخلايا التائية CD4 الخاصة بHBV)16 . من المهم جدا لإزالة الببتيدات المتبقية في تجمع الببتيد توسيع PBMCs عن طريق الغسيل المتكرر قبل احتضان هذه الخلايا مع BLCLs لتحديد الظهارة. سوف الببتيدات المتبقية ربط DMSO نبض BLCLs، وتنشيط خلايا CD4 T الببتيد محددة، وهنا زيادة الخلفية إلى حد كبير.

بعض مستضد HBV له تسلسلات متغيرة في أنماط جينية مختلفة من فيروس التهاب الكبد B (على سبيل المثال، مستضد سطح HBV). الحل هو تحديد الأنماط الجينية الخاصة بفيروس التهاب الكبد B في المرضى مسبقا وتصميم برك الببتيد الخاصة بالنمط الجيني HBV للمرضى الذين يعانون من أنماط جينية مختلفة من فيروس التهاب الكبد B. في حين أن النمط الجيني HBV غير قابل للقياس في المرضى الذين يعانون من انخفاض الأحمال الفيروسية HBV (على سبيل المثال ، المرضى السلبيين HBeAg الذين يعانون من العلاج المنتظم المضاد للفيروسات) ، في هذا السيناريو ، فإن الحل هو خلط الببتيدات من الأنماط الجينية المختلفة ل HBV معا في نفس برك الببتيد ، كما فعلنا في دراسة سابقة16. عيب في هذه الاستراتيجية الخليط هو أنه قد يتم تحديد epitope كزوج الببتيد ولكن ليس الببتيد واحد، كما تحتوي على بعض المواقف في مصفوفة الببتيدات زوج الببتيد في نفس الجزء من المستضد.

ومن العيوب الرئيسية في هذه الطريقة التوسع في مركبات PBMCs التي تستغرق وقتا طويلا لمدة 10 أيام. حاليا، تحليل الجسم الحي السابق من إفراز السيتوكين لا يمكن الكشف عن خلايا CD4 T الخاصة بفيروس التهاب الكبد B بطريقة موثوقة. باستخدام الببتيد نبض المركبات متعددة المركبات المفعول والمحفزات عادة ما اكتشفت أكثر الببتيد محددة CD4 T الخلايا في الببتيد PBMCs الموسعة, بالمقارنة مع تحفيز ببساطة مع الببتيدات16. ومن الجدير التحقيق في ما إذا كان استخدام الببتيد نبض الخلايا الذاتية B كخلايا عرض مستضد يمكن أن تساعد على الكشف موثوق بها HBV محددة CD4 T الخلايا السابقة فيفو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81930061) ومؤسسة تشونغتشينغ للعلوم الطبيعية (cstc2019jcyj-bshX0039 وcstc2019jcyj-zdxmX0004) والمفتاح الصيني
مشروع متخصص في الأمراض المعدية (2018ZX10723203).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin Bovine V (BSA) Beyotime ST023
APC-conjugated Anti-human TNF-α eBioscience 17-7349-82 Keep protected from light
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Limit cell clumping
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09126 HLA-DRB1*0803 homozygote
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09121 HLA-DRB1*1202 homozygote
Cell Culture Flask (T75) Corning 430641
Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) Corning 3599 Flat bottom
Cell Culture Plate (96-well, round bottom) Corning 3799 Round bottom
Cell Strainer Corning CLS431751 Pore size 70 μm, white, sterile
Centrifuge Tube (15 mL) KIRGEN KG2611 Sterile
Centrifuge Tube (50 mL) Corning 430829 Sterile
Centrifuge, Refrigerated Eppendorf 5804R
Centrifuge, Refrigerated Thermo ST16R
Centrifuge, Refrigerated Thermo Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) BD Biosciences 562574 Prepare solution before use
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 Keep at room temperature to prevent crystallization
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave.
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-03
Filter Tips (0.5-10) Kirgen KG5131 Sterile
Filter Tips (100-1000) Kirgen KG5333 Sterile
Filter Tips (1-200) Kirgen KG5233 Sterile
FITC-conjugated Anti-human CD4 BioLegend 300506 Keep protected from light
Fixable Viability Dye eFluor780 eBioscience 65-0865-14 Keep protected from light
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD Biosciences 554724 Protein Transport Inhibitor
Haemocytometer Brand 718620
HBV Core Antigen Derived Peptides ChinaPeptides
HEPES Gibco 15630080 100 ml
Human Serum AB Gemini Bio-Products 100-51 100 ml
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
KCl Sangon Biotech A100395-0500
KH2PO4 Sangon Biotech A100781-0500
LSRFortessa Flow Cytometer BD
L-glutamine Gibco 25030081 100 ml
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Corning MCT-150-C Autoclaved sterilization before using
Microplate Shakers Scientific Industries MicroPlate Genie
Mitomycin C Roche 10107409001
Na2HPO4.7H2O Sangon Biotech A100348-0500
NaCl Sangon Biotech A100241-0500
PCR Tubes (0.2 mL) Kirgen KG2331
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 BioLegend 300914 Keep protected from light
PE-conjugated Anti-human IFN-γ eBioscience 12-7319-42 Keep protected from light
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122 100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 eBioscience 45-0037-42 Keep protected from light
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585
Recombinant Human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant Human IL-7 PeproTech 200-07
RPMI Medium 1640 Gibco C11875500BT 500 ml
Sodium pyruvate,100mM Gibco 15360070
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR BioLegend 307648
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1125

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
  2. Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
  3. Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
  4. Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
  5. Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
  6. Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
  7. Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
  8. Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
  9. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
  10. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
  11. Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
  12. Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
  13. Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
  14. de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
  15. Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
  16. Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
  17. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  18. Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 176، فيروس التهاب الكبد B، CD4، استجابة الخلايا التائية، الظهارة
تحليل استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV وتحديد HLA-DR-CD4 المقيدة CD4 T-Cell Epitopes استنادا إلى مصفوفة الببتيد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, J., Wan, X., Wang, H., Deng,… More

Xiao, J., Wan, X., Wang, H., Deng, G. Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix. J. Vis. Exp. (176), e62387, doi:10.3791/62387 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter