Summary
Com base em uma matriz de peptídeos derivadas do vírus da hepatite B (HBV), as respostas de células T CD4 específicas do HBV poderiam ser avaliadas em paralelo com a identificação de epítopos de células T CD4 específicas do HBV.
Abstract
As células CD4 T desempenham papéis importantes na patogênese da hepatite crônica B. Como uma população celular versátil, as células CD4 T foram classificadas como subconjuntos funcionais distintos com base nas citocinas que secretaram: por exemplo, IFN-γ para células auxiliares CD4 T 1, IL-4 e IL-13 para cd4 T helper 2 células, IL-21 para células auxiliares foliculares CD4 T e IL-17 para células auxiliares CD4 T 17. A análise das células CD4 T específicas do vírus da hepatite B (HBV) baseadas na secreção de citocinas após a estimulação de peptídeos derivados do HBV poderia fornecer informações não apenas sobre a magnitude da resposta cd4 t-cell específica do HBV, mas também sobre os subconjuntos funcionais das células CD4 T específicas do HBV. Novas abordagens, como transcrição e análise de metabolômica, poderiam fornecer informações funcionais mais detalhadas sobre células CD4 T específicas do HBV. Essas abordagens geralmente requerem isolamento de células CD4 T específicas do HBV viáveis com base em multimers complexos de histocompatibilidade de peptídeos-maior-ii, enquanto atualmente as informações sobre epítopos de células T CD4 específicas do HBV são limitadas. Baseado em uma matriz de peptídeos derivadas do HBV, um método foi desenvolvido para avaliar as respostas de células T CD4 específicas do HBV e identificar epítopos de células T específicas do HBV simultaneamente usando amostras de células mononucleares de sangue periféricos de pacientes crônicos de infecção por HBV.
Introduction
Atualmente, existem 3 abordagens principais para analisar células T específicas de antígeno. A primeira abordagem é baseada na interação entre o receptor de células T e o peptídeo (epítope). As células T específicas de antígenos podem ser diretamente manchadas com multimers complexos de histocompatibilidade (MHC) de peptídeos. A vantagem deste método é que ele poderia obter células T viáveis específicas de antígeno, adequadas para análise de transcrição/metabolômica a jusante. Uma limitação deste método é que ele não poderia fornecer informações sobre toda a resposta de células T a um antígeno específico, pois requer peptídeos de epítope validados enquanto o número de epítopos identificados para um antígeno específico é limitado por enquanto. Em comparação com os epítopos de células T CD8 específicas do vírus da hepatite B (HBV), foram identificados menos epítopos de células T específicas do HBV, foram identificados simptos de células T específicas do HBVatualmente.
A segunda abordagem baseia-se na regulação de uma série de marcadores induzidos por ativação após a estimulação do peptídeo de antígeno3. Os marcadores comumente usados incluem CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Este método tem sido usado agora para analisar respostas de células T específicas de antígeno em indivíduos vacinados5,6, pacientes com infecção por vírus da imunodeficiência humana7, e síndrome respiratória aguda grave Coronavirus 2 pacientes infecção8,9. Ao contrário do ensaio baseado em multimers peptídeo-MHC, este método não é restrito por epítopos validados e poderia obter células viáveis para análise a jusante. Uma limitação deste método é que ele não poderia fornecer informações sobre o perfil citocina de células T específicas de antígeno. Além disso, a expressão desses marcadores induzidos por ativação por algumas células não específicas de antígeno ativado pode contribuir para os sinais de fundo na análise, o que pode ser um problema especialmente quando as células T específicas de antígeno alvo são raras. Atualmente, há uma aplicação limitada deste método em células CD4 T específicas do HBV4. Se esse método poderia ser utilizado para analisar células CD4 T específicas do HBV de forma confiável, precisa de uma investigação mais aprofundada.
A terceira abordagem é baseada na secreção de citocinas após a estimulação do peptídeo de antígeno. Como a análise baseada em marcadores induzidos por ativação, este método não é restrito por epítopos validados. Este método poderia revelar diretamente o perfil de citocinas de células T específicas de antígeno. A sensibilidade deste método é menor do que o método baseado em marcador induzido por ativação, pois se baseia na secreção de citocinas de células T específicas de antígeno e o número de citocinas testadas é geralmente limitado. Atualmente, este método é amplamente utilizado na análise de células T específicas do HBV. Como citocinas que secretam células T específicas do HBV dificilmente poderiam ser detectadas pela estimulação direta de peptídeo ex vivo10,11, o perfil citocina das células T específicas do HBV é geralmente analisado após 10 dias de expansão estimulada por peptídeo in vitro12,13,14,15,16. O arranjo de piscinas de peptídeos em forma matricial tem sido utilizado para facilitar a identificação de epítopos específicos de antígeno17,18. Com a combinação de matriz de peptídeos e análise de secreção de citocinas, um método foi desenvolvido para avaliar as respostas específicas das células T CD4 específicas do HBV e identificar epítopos de células T específicas do HBV simultaneamente16. Neste protocolo, os detalhes deste método são descritos. O antígeno núcleo HBV é escolhido como um exemplo de demonstração neste protocolo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente incluído no estudo. O protocolo de estudo está de acordo com as diretrizes éticas da Declaração de Helsinque de 1975, refletida na aprovação de a priori pelo comitê de ética médica do Hospital Southwest.
1. Projeto da matriz de peptídeos derivadas do HBV
- Baixe sequências de aminoácidos do antígeno principal HBV dos bancos de dados NCBI (GenBank: AFY98989.1).
- Compre peptídeos derivados de antígeno do núcleo HBV (um painel de 35 peptídeos de 15-mer sobrepostos por 10 resíduos, pureza > 90%, 4 mg/peptídeo) de um provedor de serviços de síntese de peptídeos.
- Configure uma matriz de peptídeos quadrada de 6×6 com cada posição na matriz contendo apenas 1 peptídeo. Há 12 piscinas de peptídeos: 6 piscinas de peptídeos de linha e 6 piscinas de peptídeos de coluna, 5-6 peptídeos em cada piscina16. As piscinas de peptídeos de linha e as piscinas de peptídeos da coluna na matriz representam 2 formações separadas de antígeno do núcleo HBV.
- Para 3/4 dos peptídeos adquiridos, misture peptídeos na mesma linha/coluna da matriz em 12 piscinas de peptídeos separadas, dissolvendo-os juntos em sulfóxido de dimetila (DMSO) (2 μg/μL para cada peptídeo). Armazene a -80 °C para análise das respostas de células T CD4 específicas do HBV.
- Dissolva o resto dos peptídeos separadamente (10 μg/μL) e armazene a -80 °C para identificação de epítope.
2. Isolamento de células mononucleares de sangue periféricos (PBMCs)
- Amostra de 5 mL de sangue venoso de pacientes crônicos de infecção por HBV.
NOTA: O volume sanguíneo deve ser aproximadamente estimado de acordo com o número de piscinas de peptídeos mais 1 controle de fundo e 1 controle positivo. A análise de 1 piscina de peptídeos precisa de 3 x 105 PBMCs. Em média, 1 x 106 PBMCs poderiam ser obtidos a partir de 1 mL de sangue. - Isole os PBMCs do sangue usando centrifugação gradiente de densidade ficoll (800 × g, 20 min) e criopreserve PBMCs isolados em nitrogênio líquido para uso posterior.
- Use uma pipeta Pasteur para coletar granulócitos entre a camada clara de Ficoll e a camada de glóbulos vermelhos. Extrair DNA genômico de granulócitos usando um kit de purificação de DNA genômico de acordo com o protocolo do fabricante.
- Envie a amostra de DNA para provedores de serviços de genotipo para determinar o genótipo HLA-DRB1.
3. Expansão in vitro de PBMCs usando uma matriz de peptídeo HBV
- Descongele pbmcs.
- RPMI quente 1640 suplementado com 1:10.000 benzonase (25 U/mL) a 37 °C em um banho de água.
NOTA: A benzonase ajuda a limitar o agrupamento celular durante o descongelamento. Cada amostra exigirá 20 mL de RPMI 1640 com benzonase. Calcule a quantidade necessária para descongelar todas as amostras e prepare uma alíquota separada de mídia (37 °C) com 1:10.000 Benzonase (25 U/mL). Descongele não mais do que 5 amostras de cada vez. - Remova amostras de nitrogênio líquido e descongele rapidamente frascos congelados em banho-maria (37 °C).
- Transfira a suspensão da célula descongelada para um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicione 1 mL de Benzonase RPMI 1640 (37 °C) dropwise ao tubo. Adicione lentamente 6 mL de Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ao tubo centrífuga, enxágue criovial com mais 2 mL de Benzonase RPMI 1640 (37 °C) para recuperar todas as células. Continue com o resto das amostras o mais rápido possível.
NOTA: A diluição lenta das amostras criopreservadas é a chave para manter a viabilidade das células descongeladas. - Centrífuga (400 × g, 10 min), remova o sobrenante e solte a pelota tocando no tubo.
- Levemente resuspenque a pelota em 1 mL de Benzonase RPMI 1640 quente. Misture suavemente e filtre células através de um coador de células de 70 μm, se necessário (ou seja, se houver alguma aglomeração visível).
- Aliquot uma suspensão de 10 μL e diluir na solução salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco, adicionar azul Trypan (0,04%), carregar em um hemocitómetro, esperar por 1 min e contar o número de células viáveis (células claras).
- Adicione 9 mL de Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ao tubo, centrífuga (400 × g, 10 min), retire o sobrenante e solte a pelota tocando o tubo.
- RPMI quente 1640 suplementado com 1:10.000 benzonase (25 U/mL) a 37 °C em um banho de água.
- PbMCs de resuspend em RPMI 1640 suplementados com HEPES de 25 mM, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 100 penicilina U/mL, 100 μg/mL estreptomicina e 10% soro AB humano (meio de cultura completa). Ajuste a densidade celular para 1,5 x 106 células/mL. Placa PBMCs em placas de 96 poços (fundo plano) a uma densidade de 3 x 105 células/bem.
- Adicione piscinas de peptídeos derivadas do HBV (2 μg/mL para cada peptídeo único) a cada poço. Para poços de controle de fundo e controle positivo, adicione a mesma quantidade de solvente (DMSO, 1 μL/mL). Adicione 10 U/mL IL-2 e 10 ng/mL IL-7. Incubar a 37 °C e 5% de CO2.
- No dia 3, suplemento cultura média com 50 U/mL de IL-2 e 10 ng/mL de IL-7.
NOTA: Durante o dia 1º ao dia 3, não será observada nenhuma proliferação óbvia de células T. O número total de células geralmente diminuirá em 1/3 a 1/2, devido à morte de células não-T, como células B, células NK, células NKT e monócitos. - No dia 7, substitua metade do meio de cultura por peptídeos frescos (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) e IL-7 (20 ng/mL).
NOTA: Para evitar perturbar as células na parte inferior, pipeta cerca de 90 μL de cultura média cuidadosamente a partir do topo do meio. Durante o dia 3 ao dia 7, será observada uma proliferação robusta de células T, e as células T proliferadas geralmente se agregam para formar aglomerados. - No dia 10, suavemente pipeta cultura celular em cada poço 7-9 vezes para desagregar aglomerados celulares, contar o número de células viáveis e transferir 2×105 células em cada poço para uma placa de 96 poços (fundo redondo) para análise de resposta cd4 t-cell específica do HBV.
- Continue esculpindo o resto das células para identificação de epítope no dia 12, ajuste o volume de cultura média para 100 μL (descartando meio excessivo) e cultura de suplemento com 100 μL de meio de cultura completa fresco contendo peptídeos (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) e IL-7 (20 ng/mL).
NOTA: Durante o dia 7 ao dia 10, as células T continuam se proliferando vigorosamente. Substitua o meio de cultura como na etapa 3.5 se o meio ficar amarelo. Em geral, o número de celular excederá 6×105 no dia 10. Cada poço geralmente mostra número de celular semelhante, conta número de célula em 3 poços e usa o valor médio como uma estimativa do número de celular para todos os poços.
4. Análise das respostas cd4 t-cell específicas do HBV por citometria de fluxo intracelular
- Estimulando PBMCs com piscinas de peptídeos
- Para as células transferidas para a placa 96 bem (fundo redondo), lave 3 vezes em uma placa (550 × g, 3 min). Use 200 μL de meio para cada lavagem (RPMI 1640 para as primeiras 2 lavagens, meio de cultura completa para a última lavagem). Descarte os supernantes.
NOTA: A remoção de citocinas residuais na cultura por lavagem repetida poderia efetivamente diminuir o fundo na análise da citometria de fluxo intracelular. - Para cada poço de células estimuladas com uma piscina específica de peptídeos, adicione 200 μL de cultura completa complementada com as mesmas piscinas de peptídeos (2 μg/mL para cada peptídeo único). Para o bem de controle de fundo, adicione meio de cultura completa complementado com 1 μL/mL de DMSO. Para o bem de controle positivo, adicione meio de cultura completa suplementado com 1 μL/mL de DMSO, 150 ng/mL de phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) e 1 μmol/L de ionomicina.
NOTA: A alta dose de DMSO bloqueará a secreção de citocinas das células T (mais significativa para TNF-α). Não é recomendada a dose de DMSO superior a 5 μL/mL. Geralmente, a dose de DMSO em nosso experimento não excede 1 μL/mL. - Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 6 h.
- Após 1 h de incubação, adicione Monensin (1,37 μg/mL) à cultura.
- Para as células transferidas para a placa 96 bem (fundo redondo), lave 3 vezes em uma placa (550 × g, 3 min). Use 200 μL de meio para cada lavagem (RPMI 1640 para as primeiras 2 lavagens, meio de cultura completa para a última lavagem). Descarte os supernantes.
- Citometria de fluxo
- Depois de 6h de incubação. Remova as células supernacantes após centrifugação (550 × g, 3 min), lave células uma vez com 200 μL de DPBS (550 × g, 3 min), marcadores de superfície de manchas (CD3, CD4 e CD8) e marcador de viabilidade (usando Corante de Vibilidade Fixável) em uma geladeira de 4 °C por 30 minutos.
- Lave uma vez com 200 μL de DPBS (550 × g, 3 min). Fixar e permeabilize células, e manchar citocinas intracelulares (TNF-α e IFN-γ) em uma geladeira de 4 °C por 45 min.
- Após a lavagem final em coloração intracelular, resuspendam células em 150 μL de tampão de citometria de fluxo (DPBS + 0,5% BSA).
- Adquira dados de citometria de fluxo em um citómetro de fluxo.
- Análise dos resultados da citometria de fluxo
- Definição de bem positivo: considere um bem positivo se tiver uma frequência de citocinas secretando células T pelo menos duas vezes do bem controle de fundo(Figura 1).
- De acordo com a fórmula a seguir, calcule a taxa de resposta para cada citocina analisada (Figura 2):
NOTA: A piscina de peptídeos de linha e as piscinas de peptídeos da coluna na matriz representam 2 formações distintas de antígeno do núcleo HBV, de modo que a taxa de resposta final deve ser dividida por 2.
5. Identificação de Epítopos de células T T restritos HLA-DR específicos do HBV
- Descongele e mantenha linhas alergênicas de células linfobladas (BLCLs) em frasco T-75 (5-20×10 6 células, 20 mL de meio de cultura completa).
NOTA: Para garantir o bom estado dos BLCLs, esta etapa deve ser iniciada 2 semanas antes do descongelamento dos PBMCs dos pacientes. De acordo com o resultado genotipagem, os pacientes devem compartilhar o mesmo alelo HLA-DRB1 que os BLCLs. - Triagem de peptídeos candidatos para identificação (Figura 3)
- De acordo com os resultados da taxa de resposta de células T no dia 10, tela 2 piscinas de peptídeos com a maior taxa de resposta (piscina de peptídeo de 1 linha e piscina de peptídeo de 1 coluna).
- Coloque o peptídeo nessas 2 piscinas como peptídeo candidato se a outra piscina de peptídeos contendo este peptídeo também mostrar um resultado positivo na análise de resposta de células T. Use os PBMCs expandidos com a outra piscina de peptídeos para identificação de epítope posteriormente.
- Pulsando BLCLs com peptídeos
- No dia 12, conte o número de BLCLs viáveis, transfira células para tubos de centrífugas de 15 mL, centrífuga (350 × g, 10 min) e remova o supernante. Resuspenque a pelota celular em meio de cultura completa, e alíquota bLCLs para uma placa de 96 poços (fundo redondo) a 4×104 células/bem em 80 μL meio de cultura completa.
- Adicione um único peptídeo (10 μg/mL), incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 2 h. Definir 2 controle de fundo: pulsação de peptídeo com bloqueio HLA-DR (pré-tratamento com anti-HLA-DR (10 μg/mL) por 1 h); Pulsação DMSO (1 μL/mL). O volume final de cultura completa em cada poço é de 100 μL.
- Adicionar mitomicina C (100 μg/mL), incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 1h.
- Lave 3 vezes com 200 μL de RPMI 1640 (550 × g, 3 min) em uma placa para remover peptídeo não pulsado e mitomicina C. Para a primeira lavagem, suplemente a cultura de incubação com 100 μL de RPMI 1640.
- Células resuspend em 120 μL de meio de cultura completa.
- Estimulando PBMCs com BLCLs pulsados com peptídeos.
- No dia 12, transfira os PBMCs para uma placa de 96 poços (fundo redondo).
- Remova o supernatante após a centrifugação (550 × g, 3 min) em uma placa, uma lavagem duas vezes com 200 μL de RPMI 1640 (550 × g, 3 min) em uma placa.
NOTA: A remoção de citocinas residuais e peptídeos na cultura por lavagem repetida é o passo fundamental para diminuir o fundo na análise da citometria de fluxo intracelular. Especialmente para peptídeos residuais, ele se ligará aos BLCLs e aumentará significativamente o fundo. - Resuspend PBMCs em cada poço com 210 μL de meio de cultura completa.
- Para o poço de PBMCs escolhidos para identificação de epítope, misture a alíquota (70 μL cada) com BLCLs pulsadas com peptídeos (3 poços, incluindo 2 controles de fundo).
NOTA: No dia 12, o número de pbmcs expandidos de peptídeos geralmente atingirá acima de 5-7×105 por poço, de modo que a proporção de PBMCs/BLCLs é de cerca de 6/1 a 4/1. - Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 6 h.
- Após 1 h de incubação, adicione Monensin (1,37 μg/mL) à cultura. O volume final de cultura completa em cada poço é de 200 μL.
- Citometria de fluxo
- Repita as mesmas operações da etapa 4.2.
- Análise dos resultados da citometria de fluxo
- Verifique um peptídeo como um epítope de células T cd4 restritas HLA-DR se os PBMCs incubados com este peptídeo pulsado BLCLs mostram uma frequência de citocinas secretando células CD4 T pelo menos duas vezes dos PBMCs incubados com controles de fundo (peptídeo pulsando com pré-bloqueio HLA-DR; DMSO pulsando) (Figura 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A frequência de citocinas secretando células CD4 T são calculadas como a soma de produtores individuais e produtores duplos. Como demonstrado na Figura 1,a frequência de células T4 T secretantes de TN α F e a frequência de células T DE Γ de IFN em controle de fundo (DMSO) são de 0,154% e 0,013%, respectivamente. A frequência de células CD4 T secretantes T α TNF e a frequência de células CD4 T secretas ifn-γ específicas para o pool de peptídeos Core11 são 0,206 e 0,017, respectivamente, de modo que tanto tnf-α secreta resposta CD4 T-cell e IFN-γ secreta resposta CD4 T-cell para este peptão de pept. A frequência de células TBF-α secretando e a frequência de células CD4 T secretantes ifn-γ específicas para o pool de peptídeos Core09 são 2.715% e 0,973% respectivamente, então tanto o TNF-α que secreta a resposta de células T CD4 quanto γ a resposta secreta do CD4 T-cell para este pool de peptídeos são considerados positivos.
Como demonstrado na Figura 2,os poços positivos são indicados com fundo cinza. Ao calcular o TNF-α secretor da taxa de resposta de células T CD4, devem ser incluídos dados das piscinas de peptídeos Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 e Core10. Ao calcular o ifn-γ do núcleo DO HBV secretando a taxa de resposta de células T CD4, estão incluídos dados de piscinas de peptídeos Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 e Core10.
Conforme demonstrado na Figura 3,os peptídeos candidatos para identificação de epítope são indicados em vermelho. O Core01 tem a maior taxa de resposta tanto para células CD4 T α TnF e células CD4 T secretantes ifn-γ em piscinas de peptídeos de coluna. Peptídeos C1-15, C31-45, C61-75 e C91-105 nesta piscina de peptídeos são definidos como peptídeos candidatos, pois as piscinas de peptídeos de linha contendo esses peptídeos também mostram resultados positivos na resposta de células T. Os PBMCs expandidos com as piscinas de peptídeos Core07, Core08, Core09 e Core10 são usados para identificação de peptídeos C1-15, C31-45, C61-75 e C91-105, respectivamente. O Core09 tem a maior taxa de resposta tanto para células CD4 T secretas T α TNf quanto para células CD4 T secretantes ifn-γ secretando células CD4 T em piscinas de peptídeos em linha. Peptídeos C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 e C86-100 nesta piscina de peptídeos são definidos como peptídeos candidatos, pois as piscinas de peptídeos contendo esses peptídeos também mostram resultado positivo na resposta de células T. Os PBMCs expandidos com as piscinas de peptídeos Core01, Core02, Core03, Core04, Core05 e Core06 são usados para identificação de peptídeos C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 e C86-100, respectivamente.
Como demonstrado na Figura 4, para pool de peptídeos Core08 expandiu PBMCs, após estimulação com BLCLs pulsados de peptídeos C31-45, a frequência de células T CD4 secretadas T α T e a frequência de células CD4 T secretantes ifn-γ são 0,995% e 0,131% respectivamente, que são mais de 2 vezes maiores do que os controles de fundo (BLCLs pulsados peptídeos C31-45 com pré-bloqueio HLA-DR, BLCLs pulsados DMSO). Assim, o peptídeo C31-45 é verificado como um epítope de célula T CD4 restrito HLA-DR. Para o pool de peptídeos Core10 expandiu PBMCs, após estimulação com BLCLs pulsados C91-105 de peptídeos, a frequência de células T T de TNF-α secretas e a frequência de células CD4 T secretantes if γ n são 0,221% e 0,000% respectivamente, que não excedem as 2 vezes de controles de fundo (BLCLs pulsados de peptídeo c91-45 com pré-bloqueio HLA-DR, BLCLs pulsados DMSO), de modo que o peptídeo C91-105 não é verificado como epítope de célula T-célula T restrito HLA-DR.
Figura 1: Demonstração de citometria de fluxo de TNF-α/IFN-γ secretando células CD4 T em piscinas de peptídeos expandiu PBMCs após estimulado com suas respectivas piscinas de peptídeos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Demonstração da análise HBV principal-específico TNF-α/IFN-γ secretando células CD4 T. O TNF/DMSO e o IFN-0/DMSO indicam as proporções das frequências de células TNF-α/IFN-γ secretando células T cd4 em cada poço de piscina de peptídeos estimulados PBMCs divididos pela frequência de TNF-α/IFN-γ secretando células T CD4 no poço do controle DMSO. O fundo cinza indica poços com resposta positiva da célula T CD4 julgada por comparação com o controle de fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Demonstração da triagem de peptídeos candidatos para identificação de epítope. O TNF/DMSO e o IFN-0/DMSO indicam as proporções das frequências de células TNF-α/IFN-γ secretando células T cd4 em cada poço de piscina de peptídeos estimulados PBMCs divididos pela frequência de TNF-α/IFN-γ secretando células T CD4 no poço do controle DMSO. O fundo cinza indica poços com resposta positiva da célula T CD4 julgada por comparação com o controle de fundo. Peptídeos em vermelho indicam peptídeos candidatos de acordo com os critérios de triagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Demonstração da citometria de fluxo dos resultados de identificação de epítope. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
As etapas mais críticas deste protocolo estão listadas da seguinte forma: 1) PBMCs suficientes de alta viabilidade para iniciar a expansão dos PBMCs; 2) ambiente adequado para expansão de PBMCs; e 3) remoção completa de piscinas de peptídeos residuais na cultura pbmcs antes da identificação do epítope.
Toda a análise neste protocolo depende da proliferação robusta das células CD4 T. Em geral, o número de PBMCs após a expansão de 10 dias será de 2 a 3 vezes o número inicial. O número do celular e a viabilidade dos PBMCs são 2 fatores-chave na expansão dos PBMCs. Se o objetivo é apenas analisar células T CD4 específicas do HBV sem identificação de epítope, é razoável reduzir o número inicial de PBMCs, especialmente quando o volume da amostra de sangue é limitado. Enquanto, em nossa experiência, a expansão bem-sucedida dos PBMCs mal poderia ser obtida se o número inicial de PBMCs estivesse abaixo de 1,5×105 células/bem. Ao usar PBMCs frescos para expansão, a viabilidade celular não será um problema. Enquanto ao utilizar PBMCs criopreservados para expansão, a criopreservação e o descongelamento dos PBMCs devem ser conduzidos com muito cuidado para manter a viabilidade dos PBMCs.
Na análise funcional das células T específicas do HBV, o IL-12 é geralmente usado na expansão de PBMCs para melhorar a função das células CD8 T. Como o IL-12 poderia induzir a diferenciação das células CD4 T em relação às células auxiliares foliculares CD4 T, essa citocina deve ser evitada na análise funcional das células CD4 T específicas do HBV. Em nosso protocolo, apenas IL-2 (para expansão de células T) e IL-7 (para sobrevivência de células T) são complementados para manter o perfil funcional das células CD4 T específicas do HBV durante a expansão o mais intacta possível. Testamos 5 citocinas para análise funcional de células CD4 T específicas do HBV: TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 e IL-21. Em nossas amostras analisadas, tnf-α e IFN-γ são 2 citocinas principais secretadas por células CD4 T específicas do HBV16. Ao analisar o perfil funcional das células CD4 T específicas do HBV, recomenda-se testar o máximo possível de citocinas para obter as informações detalhadas do perfil funcional. Ainda na identificação de epítopes, recomenda-se analisar apenas o TNF-α e o IFN-γ, para consideração econômica.
Células T CD4 específicas específicas do HBV são vitais para uma identificação bem-sucedida de epítope, por isso a identificação de epítope deve ser considerada em pacientes com alta resposta de células T T específicas do HBV, como pacientes com inflamação de hepatite B (TNF-α secretamente resposta de células T cd4) e pacientes com folga viral (forte ifn-γ resposta de células T do HBV)16 . É muito importante remover peptídeos residuais na piscina de peptídeos expandidos PBMCs por lavagem repetida antes de incubar essas células com BLCLs para identificação de epítope. Os peptídeos residuais se ligarão aos BLCLs pulsados do DMSO, ativarão células CD4 T específicas do peptídeo, aumentarão o fundo em grande medida.
Alguns antígenos HBV têm sequências variáveis em diferentes genótipos HBV (por exemplo, antígeno de superfície HBV). Uma solução é pré-determinar os genótipos hbv específicos em pacientes e projetar piscinas de peptídeos específicas do genótipo HBV para pacientes com diferentes genótipos hbv. Embora o genótipo HBV seja anti mensurável em pacientes com baixas cargas virais HBV (por exemplo, pacientes negativos de HBeAg com tratamento antiviral regular), neste cenário, a solução é misturar peptídeos de diferentes genótipos HBV juntos nas mesmas piscinas de peptídeos, como fizemos em um estudo anterior16. Uma desvantagem dessa estratégia de mistura é que o epítope pode ser identificado como um par de peptídeos, mas não um único peptídeo, pois algumas posições na matriz de peptídeos contêm um par de peptídeos no mesmo fragmento do antígeno.
Uma grande desvantagem neste método é a expansão demorada de 10 dias dos PBMCs. Atualmente, a análise ex vivo da secreção de citocinas não foi possível detectar células CD4 T específicas do HBV de forma confiável. Usando BLCLs aogenínicos pulsados de peptídeos, os estimuladores geralmente detectam células CD4 T mais específicas do peptídeo em PBMCs expandidos de peptídeos, em comparação com simplesmente estimular com peptídeos16. Vale a pena investigar se o uso de células B autólogas pulsadas com peptídeos como células de apresentação de antígenos poderia ajudar a detectar de forma confiável as células CD4 T específicas do HBV ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) e Chave Chinesa
Projeto Especializado em Doenças Infecciosas (2018ZX10723203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
- Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
- Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
- Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
- Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
- Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
- Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
- Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
- Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
- Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
- de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
- Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
- Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).
