Summary
Basert på en hepatitt B-virus (HBV)-avledet peptidmatrise, kan HBV-spesifikke CD4 T-celleresponser evalueres parallelt med identifisering av HBV-spesifikke CD4 T-celle epitoper.
Abstract
CD4 T-celler spiller viktige roller i patogenesen av kronisk hepatitt B. Som en allsidig cellepopulasjon har CD4 T-celler blitt klassifisert som distinkte funksjonelle delsett basert på cytokinene de utskilte: for eksempel IFN-γ for CD4 T-hjelper 1 celler, IL-4 og IL-13 for CD4 T-hjelper 2 celler, IL-21 for CD4 T follikulære hjelpeceller og IL-17 for CD4 T-hjelper 17 celler. Analyse av hepatitt B-virus (HBV)-spesifikke CD4 T-celler basert på cytokinsekresjon etter HBV-avledet peptidstimulering kunne gi informasjon ikke bare om omfanget av HBV-spesifikk CD4 T-cellerespons, men også om funksjonelle delsett av HBV-spesifikke CD4 T-celler. Nye tilnærminger, som transkripsjon og metabolomikkanalyse, kan gi mer detaljert funksjonell informasjon om HBV-spesifikke CD4 T-celler. Disse tilnærmingene krever vanligvis isolering av levedyktige HBV-spesifikke CD4 T-celler basert på peptid-store histokompatibilitetskompleks-II-multimere, mens informasjonen om HBV-spesifikke CD4 T-celle epitoper for tiden er begrenset. Basert på en HBV-avledet peptidmatrise er det utviklet en metode for å evaluere HBV-spesifikke CD4 T-celleresponser og identifisere HBV-spesifikke CD4 T-celle epitoper samtidig ved hjelp av perifere blodmonykleære celler prøver fra kroniske HBV-infeksjonspasienter.
Introduction
For tiden er det 3 hovedtilnærminger for å analysere antigenspesifikke T-celler. Den første tilnærmingen er basert på samspillet mellom T-cellereseptoren og peptidet (epitop). Antigenspesifikke T-celler kan være direkte farget med peptid-store histokompatibilitetskompleks (MHC) multimere. Fordelen med denne metoden er at den kan oppnå levedyktige antigenspesifikke T-celler, egnet for nedstrøms transkripsjons-/metabolomikkanalyse. En begrensning av denne metoden er at den ikke kunne gi informasjon om hele T-celleresponsen til et bestemt antigen, da det krever validerte epitoppepeptider mens antall identifiserte epitoper for et bestemt antigen er begrenset for nå. Sammenlignet med hepatitt B-virus (HBV)-spesifikke CD8 T-celle epitoper, er færre HBV-spesifikke CD4 T-celle epitoper identifisert1,2, noe som gjorde denne metoden mindre anvendelig for analyse av HBV-spesifikke CD4 T-celler for tiden.
Den andre tilnærmingen er basert på oppregulering av en rekke aktiveringsinduserte markører etter antigenpeptidstimulering3. De ofte brukte markørene inkluderer CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Denne metoden har nå blitt brukt til å analysere antigenspesifikke T-celleresponser hos vaksinerte personer5,6, Human immunsvikt Virusinfeksjonspasienter7, og Alvorlig akutt respiratorisk syndrom Coronavirus 2 infeksjonspasienter8,9. I motsetning til peptid-MHC multimers basert analyse, er denne metoden ikke begrenset av validerte epitoper og kan oppnå levedyktige celler for nedstrømsanalyse. En begrensning av denne metoden er at den ikke kunne gi informasjon om cytokinprofilen til antigenspesifikke T-celler. Uttrykket av disse aktiveringsinduserte markørene av noen aktiverte antigen-ikke-spesifikke celler kan også bidra til bakgrunnssignalene i analysen, noe som kan være et problem, spesielt når målantigenspesifikke T-celler er sjeldne. For øyeblikket er det begrenset anvendelse av denne metoden på HBV-spesifikke CD4 T-celler4. Hvorvidt denne metoden kan brukes til å analysere HBV-spesifikke CD4 T-celler på en pålitelig måte, trenger videre undersøkelser.
Den tredje tilnærmingen er basert på cytokinsekresjon etter antigenpeptidstimulering. I likhet med aktiveringsindusert markørbasert analyse er denne metoden ikke begrenset av validerte epitoper. Denne metoden kan direkte avsløre cytokinprofilen til antigenspesifikke T-celler. Følsomheten til denne metoden er lavere enn den aktiveringsinduserte markørbaserte metoden, da den er avhengig av cytokinsekresjon av antigenspesifikke T-celler, og antall cytokiner som testes er vanligvis begrenset. For tiden er denne metoden mye brukt i analyse av HBV-spesifikke T-celler. Som cytokin utskiller HBV-spesifikke T-celler kunne knapt oppdages ved direkte ex vivo peptid stimulering10,11, cytokin profilen av HBV-spesifikke T-celler analyseres vanligvis etter 10-dagers in vitro peptid stimulert ekspansjon12,13,14,15,16. Arrangement av peptidbassenger i matriseform har blitt brukt for å lette identifisering av antigenspesifikke epitoper17,18. Med kombinasjonen av peptidmatrise og cytokinsekresjonsanalyse er det utviklet en metode for å evaluere HBV-spesifikke CD4 T-celleresponser og identifisere HBV-spesifikke CD4 T-celle epitoper samtidig16. I denne protokollen er detaljene for denne metoden beskrevet. HBV kjerneantigen er valgt som et eksempel på demonstrasjon i denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient som inngår i studien. Studieprotokollen er i samsvar med de etiske retningslinjene i Helsinkideklarasjonen fra 1975, noe som gjenspeiles i en forhåndsgodkjenning fra den medisinske etikkkomiteen ved Southwest Hospital.
1. Design av HBV-avledet peptidmatrise
- Last ned aminosyresekvenser av HBV-kjerneantigenet fra NCBI-databaser (GenBank: AFY98989.1).
- Kjøp HBV kjerneantigenavledede peptider (et panel med 35 15-mer peptider overlappende med 10 rester, renhet > 90%, 4 mg / peptid) fra en peptidsyntesetjenesteleverandør.
- Sett opp en firkantet 6×6 peptidmatrise med hver posisjon i matrisen som bare inneholder 1 peptid. Det er 12 peptid bassenger: 6 rad peptid bassenger og 6 kolonne peptid bassenger, 5-6 peptider i hvert basseng16. Radpeptidbassengene og kolonnepeptidbassengene i matrisen representerer 2 separate formasjoner av HBV-kjerneantigen.
- For 3/4 av de kjøpte peptidene blander du peptider i samme rad/kolonne i matrisen i 12 separate peptidbassenger ved å oppløse dem sammen i dimetylsulfoksid (DMSO) (2 μg/μL for hvert peptid). Oppbevars ved -80 °C for analyse av HBV-spesifikke CD4 T-celleresponser.
- Løs opp resten av peptidene separat (10 μg/μL) og oppbevar ved -80 °C for epitopidentifikasjon.
2. Isolering av perifere mononukleære celler i blodet (PBMCer)
- Prøve 5 ml venøst blod fra kroniske HBV-infeksjonspasienter.
MERK: Blodvolumet bør grovt anslås i henhold til antall peptidbassenger pluss 1 bakgrunnskontroll og 1 positiv kontroll. Analyse av 1 peptidbasseng trenger 3 x 105 PBMCer. I gjennomsnitt kan 1 x 106 PBMCer fås fra 1 ml blod. - Isoler PBMCer fra blod ved hjelp av Ficoll tetthet gradient sentrifugering (800 × g, 20 min) og kryopreservere isolerte PBMCer i flytende nitrogen til senere bruk.
- Bruk en Pasteur pipette for å samle granulocytter mellom det klare Ficoll-laget og det røde blodcellelaget. Trekk ut genomisk DNA fra granulocytter ved hjelp av et genomisk DNA-rensesett i henhold til produsentens protokoll.
- Send DNA-prøven til genotyping tjenesteleverandører for å bestemme HLA-DRB1 genotype.
3. In Vitro-utvidelse av PBMCer ved hjelp av en HBV peptidmatrise
- Tine PBMCer.
- Varm RPMI 1640 supplert med 1:10.000 benzonase (25 U/ml) til 37 °C i et vannbad.
MERK: Benzonase bidrar til å begrense celle klumping under opptining. Hver prøve vil kreve 20 ml RPMI 1640 med benzonase. Beregn mengden som trengs for å tine alle prøver, og lag en separat aliquot av medier (37 °C) med 1:10 000 Benzonase (25 U/ml). Tin ikke mer enn 5 prøver om gangen. - Fjern prøver fra flytende nitrogen og tin raskt frosne hetteglass i et vannbad (37 °C).
- Overfør den opptinte cellefjæringen til et 15 ml sentrifugerør. Tilsett 1 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) dråpevis til røret. Tilsett sakte 6 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) i sentrifugerøret, skyll kryonalen med ytterligere 2 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) for å hente alle cellene. Fortsett med resten av prøvene så raskt som mulig.
MERK: Langsom fortynning av kryopreserverte prøver er nøkkelen til å opprettholde levedyktigheten til opptinte celler. - Sentrifuge (400 × g, 10 min), fjern supernatanten og løsne pelletsen ved å trykke på røret.
- Resuspend pellet forsiktig i 1 ml varm Benzonase RPMI 1640. Bland forsiktig, og filtrer celler gjennom en 70 μm cellesil om nødvendig (dvs. hvis det finnes synlig klump).
- Aliquot en 10 μL suspensjon og fortynnet i Dulbecco fosfat-bufret saltvann (DPBS), legge Trypan blå (0,04%), belastning på et hemocytometer, vent i 1 min, og telle antall levedyktige celler (klare celler).
- Tilsett 9 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) i røret, sentrifuge (400 × g, 10 min), fjern supernatanten og løsne pelletsen ved å trykke på røret.
- Varm RPMI 1640 supplert med 1:10.000 benzonase (25 U/ml) til 37 °C i et vannbad.
- Resuspend PBMCer i RPMI 1640 supplert med 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyminitt, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin og 10 % humant AB-serum (komplett kulturmedium). Juster celletettheten til 1,5 x 106 celler/ml. Plate PBMCer i 96-brønnsplater (flat bunn) med en tetthet på 3 x 105 celler / brønn.
- Tilsett HBV-avledede peptidbassenger (2 μg/ml for hvert enkelt peptid) i hver brønn. For brønner med bakgrunnskontroll og positiv kontroll, tilsett samme mengde løsningsmiddel (DMSO, 1 μL/ml). Tilsett 10 U/ml IL-2 og 10 ng/ml IL-7. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2.
- På dag 3 supplerer du kulturmedium med 50 U/ml IL-2 og 10 ng/ml IL-7.
MERK: I løpet av dag 1 til dag 3 vil ingen åpenbar T-celleproliferasjon bli observert. Det totale celletallet vil vanligvis reduseres med 1/3 til 1/2, på grunn av dødsfallet til ikke-T-celler som B-celler, NK-celler, NKT-celler og monocytter. - På dag 7 erstatter du halvparten av kulturmediet med ferske medier som inneholder peptider (4 μg/ml), IL-2 (100 U/ml) og IL-7 (20 ng/ml).
MERK: For å unngå å forstyrre cellene i bunnen, pipette ca 90 μL kulturmedium forsiktig fra toppen av mediet. I løpet av dag 3 til dag 7 vil robust T-celleproliferasjon bli observert, og spredning av T-celler samles vanligvis for å danne klynger. - På dag 10, forsiktig pipette cellekultur i hver brønn 7-9 ganger for å disaggregate celleklynger, telle antall levedyktige celler, og overføre 2×105 celler i hver brønn til en 96 brønnplate (rund bunn) for HBV-spesifikk CD4 T-celleresponsanalyse.
- Fortsett å dyrke resten av cellene for epitopidentifikasjon på dag 12, juster volumet av kulturmedium til 100 μL (kaste bort overdreven medium) og supplere kulturen med 100 μL fersk komplett kulturmedium som inneholder peptider (4 μg/ml), IL-2 (100 U/ml) og IL-7 (20 ng/ml).
MERK: I løpet av dag 7 til dag 10 fortsetter T-cellene å spre seg kraftig. Bytt ut kulturmediet som i trinn 3.5 hvis mediet blir gult. Generelt vil cellenummeret overstige 6×105 på dag 10. Hver brønn viser vanligvis lignende cellenummer, teller cellenummer i 3 brønner og bruker gjennomsnittsverdien som et estimat av cellenummer for alle brønnene.
4. Analyse av HBV-spesifikke CD4 T-celleresponser ved intracellulær strømningscytometri
- Stimulerende PBMCer med peptidbassenger
- For cellene som overføres til 96 brønnplaten (rund bunn), vask 3 ganger i en plate (550 × g, 3 min). Bruk 200 μL medium for hver vask (RPMI 1640 for de første 2 vaskene, komplett kulturmedium for siste vask). Kast supernatantene.
MERK: Fjerning av gjenværende cytokiner i kulturen ved gjentatt vasking kan effektivt redusere bakgrunnen i intracellulær strømningscytometrianalyse. - For hver brønn av celler stimulert med et bestemt peptidbasseng, tilsett 200 μL komplett kulturmedium supplert med de samme peptidbassengene (2 μg / ml for hvert enkelt peptid). For brønnen av bakgrunnskontroll, legg til komplett kulturmedium supplert med 1 μL / ml DMSO. For brønnen av positiv kontroll, legge til komplett kultur medium supplert med 1 μL / ml DMSO, 150 ng / ml phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), og 1 μmol / L av ionomycin.
MERK: Høy dose DMSO vil blokkere cytokinsekresjonen av T-celler (mest signifikant for TNF-α). Dose av DMSO høyere enn 5 μL/ml anbefales ikke. Vanligvis overstiger dosen av DMSO i vårt eksperiment ikke 1 μL / ml. - Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 6 timer.
- Etter 1 h inkubasjon, legg monensin (1,37 μg / ml) til kulturen.
- For cellene som overføres til 96 brønnplaten (rund bunn), vask 3 ganger i en plate (550 × g, 3 min). Bruk 200 μL medium for hver vask (RPMI 1640 for de første 2 vaskene, komplett kulturmedium for siste vask). Kast supernatantene.
- Flowcytometri
- Etter 6 timers inkubasjon. Fjern supernatant etter sentrifugering (550 × g, 3 min), vask cellene én gang med 200 μL DPBS (550 × g, 3 min), flekkoverflatemarkører (CD3, CD4 og CD8) og levedyktighetsmarkør (ved hjelp av Fixable Viability Dye) i et 4 °C kjøleskap i 30 minutter.
- Vask en gang med 200 μL DPBS (550 × g, 3 min). Fikser og permeabiliser celler, og flekk intracellulære cytokiner (TNF-α og IFN-γ) i et 4 °C kjøleskap i 45 minutter.
- Etter den endelige vasken i intracellulær farging, resuspend celler i 150 μL av strømning cytometri buffer (DPBS + 0,5% BSA).
- Innhente strømningscytometridata på et strømningscytometer.
- Analyse av strømningscytometriresultater
- Definisjon av positiv brønn: Vurder en så vel som positiv hvis den har en frekvens av cytokin utskiller T-celler minst to ganger av bakgrunnskontrollen godt (Figur 1).
- I følge følgende formel beregner du svarprosenten for hver cytokin analysert (figur 2):
MERK: Radpeptidbassenget og kolonnepeptidbassengene i matrisen representerer 2 forskjellige formasjoner av HBV-kjerneantigen, slik at den endelige responsraten skal deles på 2.
5. Identifisering av HBV-spesifikke HLA-DR Restricted CD4 T-celle Epitopes
- Tine og opprettholde allogene B lymfoblastoide cellelinjer (BLCLer) i T-75 kolbe (5-20 ×106 celler, 20 ml komplett kulturmedium).
MERK: For å garantere god tilstand av BLCLer, bør dette trinnet initieres 2 uker før opptining av pasientens PBMCer. BLCLer må være homozygote i HLA-DRB1 allele. Ifølge genotypingsresultatet bør pasientene dele samme HLA-DRB1-allele som BLCLer. - Screening av kandidatpeptider for identifikasjon (Figur 3)
- I følge T-celleresponsraten på dag 10, kan du sile ut 2 peptidbassenger med høyest responsrate (1 rad peptidbasseng og 1 kolonne peptidbasseng).
- Sett peptidet i de 2 bassengene som en kandidatpeptid hvis det andre peptidbassenget som inneholder dette peptidet også viser et positivt resultat i T-celleresponsanalyse. Bruk PBMCene som er utvidet med det andre peptidbassenget for epitopidentifikasjon senere.
- Pulserende BLCLer med peptid
- På dag 12 teller du antall levedyktige BLCLer, overfører celler til 15 ml sentrifugerør, sentrifuge (350 × g, 10 min) og fjerner supernatanten. Resuspend cellepellet i komplett kulturmedium, og aliquot BLCLer til en 96-brønns plate (rund bunn) ved 4×104 celler / brønn i 80 μL komplett kulturmedium.
- Tilsett et enkelt peptid (10 μg/ml), inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 2 timer. Sett 2 bakgrunnskontroll: peptid pulserende med HLA-DR-blokkering (forbehandling med anti-HLA-DR (10 μg / ml) i 1 time); DMSO (1 μL/ml) pulserende. Det endelige volumet av komplett kulturmedium i hver brønn er 100 μL.
- Tilsett mitomycin C (100 μg/ml), inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time.
- Vask 3 ganger med 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) i en plate for å fjerne upulset peptid og mitomycin C. For den første vasken, supplere inkubasjonskulturen med 100 μL RPMI 1640.
- Resuspend celler i 120 μL av komplett kultur medium.
- Stimulerende PBMCer med peptidpulserte BLCLer.
- På dag 12 overfører du PBMCer til en 96-brønnsplate (rund bunn).
- Fjern supernatanten etter sentrifugering (550 × g, 3 min) i en tallerken, vask to ganger med 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) i en tallerken.
MERK: Fjerning av gjenværende cytokiner og peptider i kulturen ved gjentatt vask er det viktigste trinnet for å redusere bakgrunnen i intracellulær strømningscytometrianalyse. Spesielt for gjenværende peptider vil det binde seg til BLCLer og øke bakgrunnen betydelig. - Resuspend PBMCs på hver brønn med 210 μL komplett kulturmedium.
- For brønnen av PBMCer valgt for epitopidentifikasjon, bland aliquot (70 μL hver) med peptidpulserte BLCLer (3 brønner, inkludert 2 bakgrunnskontroller).
MERK: På dag 12 vil antall peptidbassenger utvidet PBMC vanligvis nå til over 5-7×105 per brønn, så forholdet mellom PBMCer / BLCLer er omtrent 6/1 til 4/1. - Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 6 timer.
- Etter 1 h inkubasjon, legg monensin (1,37 μg / ml) til kulturen. Det endelige volumet av komplett kulturmedium i hver brønn er 200 μL.
- Flowcytometri
- Gjenta de samme operasjonene som i trinn 4.2.
- Analyse av strømningscytometriresultater
- Kontroller et peptid som en HLA-DR-begrenset CD4 T-celler epitop hvis PBMCer inkuberes med dette peptid pulserte BLCLer viser en frekvens av cytokin utskillende CD4 T-celler minst to ganger av PBMC inkubert med bakgrunnskontroller (peptid pulserende med HLA-DR pre-blokkering; DMSO pulserende) (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hyppigheten av cytokin som utskiller CD4 T-celler beregnes som summen av både enkeltprodusenter og dobbeltprodusenter. Som vist i figur 1er frekvensen av TNF-α utskillelse av CD4 T-celler og frekvensen av IFN-γ utskillelse av CD4 T-celler i bakgrunnskontroll (DMSO) henholdsvis 0,154 % og 0,013 %. Frekvensen av TNF-α utskillelse av CD4 T-celler og frekvensen av IFN-γ utskillelse av CD4 T-celler som er spesifikke for peptidbassenget Core11, er henholdsvis 0,206 og 0,017, slik at både TNF-α utskillelse av CD4 T-cellerespons og IFN-γ utskillelse av CD4 T-cellerespons for dette peptidbassenget anses som negativ. Frekvensen av TNF-α utskillelse av CD4 T-celler og frekvensen av IFN-γ utskillelse av CD4 T-celler som er spesifikke for peptidbassenget Core09, er henholdsvis 2,715 % og 0,973 %, så både TNF-α utskillelse av CD4 T-cellerespons og IFN-γ som utskiller CD4 T-cellerespons for dette peptidbassenget, anses som positivt.
Som vist i figur 2,er positive brønner indikert med grå bakgrunn. Ved beregning av HBV kjernespesifikk TNF-α utskillelse av CD4 T-celle responsrate, bør data fra peptidbassenger Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 og Core10 inkluderes. Ved beregning av HBV kjernespesifikk IFN-γ utskillelse av CD4 T-celle responsrate, er data fra peptidbassenger Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 og Core10 inkludert.
Som vist i figur 3,er kandidatpeptider for epitopidentifikasjon indikert i rødt. Core01 har den høyeste svarprosenten for både TNF-α som skiller ut CD4 T-celler og IFN-γ som skiller ut CD4 T-celler i kolonnepeptidbassenger. Peptider C1-15, C31-45, C61-75 og C91-105 i dette peptidbassenget er satt som kandidatpeptider, da radpeptidbassengene som inneholder disse peptidene også viser positive resultater i T-cellerespons. PBMCene utvidet med peptidbassengene Core07, Core08, Core09 og Core10 brukes til epitopidentifikasjon av peptider C1-15, C31-45, C61-75 og C91-105. Core09 har den høyeste svarprosenten for både TNF-α som skiller ut CD4 T-celler og IFN-γ som skiller ut CD4 T-celler i radpeptidbassenger. Peptider C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 og C86-100 i dette peptidbassenget er satt som kandidatpeptider, da kolonnepeptidbassengene som inneholder disse peptidene også viser positivt resultat i T-cellerespons. PBMCene utvidet med peptidbassengene Core01, Core02, Core03, Core04, Core05 og Core06 brukes til epitopidentifikasjon av peptider C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 og C86-100.
Som vist i figur 4, for peptidbassenget Core08 utvidede PBMCer, etter stimulering med peptid C31-45 pulserte BLCLer, frekvensen av TNF-α utskille CD4 T-celler og frekvensen av IFN-γ utskille CD4 T-celler er henholdsvis 0,995% og 0,131%, som er mer enn 2 ganger høyere enn bakgrunnskontroller (peptid C31-45 pulserte BLCLer med HLA-DR pre-blokkering, DMSO pulserte BLCLer). Dermed er peptid C31-45 verifisert som en HLA-DR begrenset CD4 T-celle epitop. For peptidbassenget Core10 utvidede PBMCer, etter stimulering med peptid C91-105 pulserte BLCLer, er frekvensen av TNF-α utskillelse av CD4 T-celler og frekvensen av IFN-γ utskillelse av CD4 T-celler henholdsvis 0,221% og 0,000% som ikke overstiger de 2 gangene med bakgrunnskontroller (peptid C91-45 pulserte BLCLer med HLA-DR pre-blocking, DMSO pulset BLCLs), så peptid C91-105 er ikke verifisert som HLA-DR begrenset CD4 T-celle epitop.
Figur 1: Flow cytometridemonstrasjon av TNF-α/IFN-γ utskille CD4 T-celler i peptidbassenger utvidet PBMC etter stimulert med sine respektive peptidbassenger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Demonstrasjon av analysen HBV kjernespesifikk TNF-α/IFN-γ utskiller CD4 T-celler. TNF/DMSO og IFN-Ƴ/DMSO indikerer forholdet mellom frekvensene til TNF-α/IFN-γ utskillelse av CD4 T-celler i hver brønn i peptidbassenget stimulerte PBMCer delt på frekvensen av TNF-α/IFN-γ som utskiller CD4 T-celler i brønnen til DMSO-kontroll. Grå bakgrunn indikerer brønner med positiv CD4 T-cellerespons dømt ved sammenligning med bakgrunnskontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Demonstrasjon av screening av kandidatpeptider for epitopidentifikasjon. TNF/DMSO og IFN-Ƴ/DMSO indikerer forholdet mellom frekvensene til TNF-α/IFN-γ utskillelse av CD4 T-celler i hver brønn i peptidbassenget stimulerte PBMCer delt på frekvensen av TNF-α/IFN-γ som utskiller CD4 T-celler i brønnen til DMSO-kontroll. Grå bakgrunn indikerer brønner med positiv CD4 T-cellerespons dømt ved sammenligning med bakgrunnskontroll. Peptider i rødt indikerer kandidatpeptider i henhold til screeningkriteriene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Strømningscytometridemonstrasjon av epitopidentifikasjonsresultater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trinnene i denne protokollen er oppført som følger: 1) nok PBMCer med høy levedyktighet til å starte PBMCs-utvidelse; 2) passende miljø for PBMCs utvidelse; og 3) fullstendig fjerning av gjenværende peptidbassenger i PBMCs kultur før epitopidentifikasjon.
All analysen i denne protokollen avhenger av den robuste spredningen av CD4 T-celler. Generelt vil antall PBMCer etter 10-dagers utvidelse være 2-3 ganger det opprinnelige tallet. Cellenummeret og levedyktigheten til PBMCer er to nøkkelfaktorer i PBMCs-utvidelsen. Hvis formålet bare er å analysere HBV-spesifikke CD4 T-celler uten epitopidentifikasjon, er det rimelig å redusere det opprinnelige PBMCs-nummeret, spesielt når volumet av blodprøve er begrenset. Selv om det etter vår erfaring knapt kunne oppnås vellykket PBMCs-utvidelse hvis startnummeret på PBMCer er under 1,5 ×105 celler / godt. Når du bruker ferske PBMCer for utvidelse, vil ikke celle levedyktigheten være et problem. Mens du bruker kryopreserverte PBMCer for utvidelse, bør kryopreservering og opptining av PBMCer utføres svært nøye for å opprettholde levedyktigheten til PBMCer.
I funksjonell analyse av HBV-spesifikke T-celler brukes IL-12 vanligvis i PBMCs-utvidelse for å forbedre funksjonen til CD8 T-celler. Siden IL-12 kan fremkalle differensiering av CD4 T-celler mot CD4 T follikulære hjelpeceller, bør denne cytokinen unngås i funksjonell analyse av HBV-spesifikke CD4 T-celler. I vår protokoll er bare IL-2 (for T-celleutvidelse) og IL-7 (for T-celleoverlevelse) supplert for å opprettholde den funksjonelle profilen til HBV-spesifikke CD4 T-celler under ekspansjon så intakt som mulig. Vi har testet 5 cytokiner for funksjonell analyse av HBV-spesifikke CD4 T-celler: TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 og IL-21. I våre analyserte prøver er TNF-α og IFN-γ 2 store cytokiner utskilt av HBV-spesifikke CD4 T-celler16. Ved analyse av den funksjonelle profilen til HBV-spesifikke CD4 T-celler, anbefales det å teste så mange som mulig cytokiner for å få detaljert funksjonell profilinformasjon. Mens du er i epitopidentifikasjon, anbefales det å analysere bare TNF-α og IFN-γ, for økonomisk vurdering.
Nok HBV-spesifikke CD4 T-celler er avgjørende for vellykket epitopidentifikasjon, så epitopidentifikasjon bør vurderes hos pasienter med høy HBV-spesifikk CD4 T-cellerespons, for eksempel hepatitt B-fakkelpasienter (sterk HBV-spesifikk TNF-α utskillelse av CD4 T-cellerespons) og pasienter med viral clearance (sterk HBV-spesifikk IFN-γ CD4 T-cellerespons)16 . Det er svært viktig å fjerne gjenværende peptider i peptidbassenget utvidet PBMCs ved gjentatt vask før inkubering av disse cellene med BLCLer for epitopidentifikasjon. De resterende peptidene vil binde seg til DMSO-pulserte BLCLer, aktivere peptidspesifikke CD4 T-celler, herved øke bakgrunnen i stor grad.
Noen HBV-antigen har variable sekvenser i forskjellige HBV-genotyper (f.eks. HBV overflateantigen). En løsning er å forhåndsbekrefte de spesifikke HBV genotypene hos pasienter og designe HBV genotype-spesifikke peptidbassenger for pasienter med forskjellige HBV-genotyper. Mens HBV-genotypen ikke er målbar hos pasienter med lav HBV-virusbelastning (f.eks. HBeAg-negative pasienter med regelmessig anti-viral behandling), er løsningen i dette scenariet å blande peptider fra forskjellige HBV-genotyper sammen i de samme peptidbassengene, som vi gjorde i en tidligere studie16. En ulempe med denne blandingsstrategien er at epitop kan identifiseres som et peptidpar, men ikke et enkelt peptid, da noen posisjoner i peptidmatrisen inneholder et peptidpar i samme fragment av antigenet.
En stor ulempe med denne metoden er den tidkrevende 10-dagers PBMCs-utvidelsen. For tiden kunne ex vivo-analyse av cytokinsekresjon ikke oppdage HBV-spesifikke CD4 T-celler på en pålitelig måte. Ved hjelp av peptid pulset allogene BLCLer som stimulatorer vanligvis oppdaget mer peptid-spesifikke CD4 T celler i peptid utvidet PBMCs, sammenlignet med bare stimulerende med peptider16. Det er verdt å undersøke om bruk av peptid pulserte autologe B-celler som antigenpresentasjonsceller kan bidra til å på en pålitelig måte oppdage HBV-spesifikke CD4 T-celler ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) og Chinese Key
Prosjekt spesialisert for smittsomme sykdommer (2018ZX10723203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
- Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
- Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
- Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
- Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
- Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
- Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
- Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
- Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
- Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
- de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
- Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
- Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).
