Summary
Baserat på en hepatit B-virus (HBV)-härledd peptidmatris kan HBV-specifika CD4 T-cellssvar utvärderas parallellt med identifiering av HBV-specifika CD4 T-cellsepotoper.
Abstract
CD4 T celler spelar viktiga roller i patogenesen vid kronisk hepatit B. Som en mångsidig cellpopulation har CD4 T-celler klassificerats som distinkta funktionella delmängder baserade på de cytokiner de utsöndrade: till exempel IFN-γ för CD4 T-hjälpare 1 celler, IL-4 och IL-13 för CD4 T-hjälpare 2 celler, IL-21 för CD4 T follikulära hjälpceller och IL-17 för CD4 T-hjälpare 17 celler. Analys av hepatit B-virus (HBV)-specifika CD4 T-celler baserade på cytokinutsöndring efter HBV- härledda peptider stimulering kunde ge information inte bara om omfattningen av HBV-specifika CD4 T-cells svar utan också om funktionella delmängder av HBV-specifika CD4 T celler. Nya metoder, såsom transkriptomik och metabolomikanalys, kan ge mer detaljerad funktionell information om HBV-specifika CD4 T-celler. Dessa metoder kräver vanligtvis isolering av livskraftiga HBV-specifika CD4 T-celler baserat på peptid-stora histocompatibility komplexa II multimers, medan för närvarande informationen om HBV-specifika CD4 T-cells epitopes är begränsad. Baserat på en HBV-härledd peptidmatris har en metod utvecklats för att utvärdera HBV-specifika CD4 T-cellssvar och identifiera HBV-specifika CD4 T-cellsepotoper samtidigt med hjälp av perifera blodmonukleära cellprover från kroniska HBV- infektionspatienter.
Introduction
För närvarande finns det 3 huvudmetoder för att analysera antigenspecifika T-celler. Det första tillvägagångssättet är baserat på interaktionen mellan T-cellsreceptorn och peptiden (epitopen). Antigen-specifika T celler kan vara direkt färgas med peptid-stora histocompatibility komplexa (MHC) multimers. Fördelen med denna metod är att den kan erhålla livskraftiga antigenspecifika T-celler, lämpliga för nedströms transkriptomik/metabolomikanalys. En begränsning av denna metod är att den inte kunde ge information om hela T-cellssvaret på ett specifikt antigen, eftersom det kräver validerade epitoppeptider medan antalet identifierade epitoper för ett specifikt antigen är begränsat för tillfället. Jämfört med hepatit B-virus (HBV)-specifika CD8 T-cellsepotoper har färre HBV-specifika CD4 T-cellsepotoper identifierats1,2, vilket gjorde denna metod mindre tillämplig för analys av HBV-specifika CD4 T-celler för närvarande.
Det andra tillvägagångssättet är baserat på uppreglering av en serie aktivering-inducerade markörer efter antigenpeptidstimulering3. De vanliga markörerna inkluderar CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Denna metod har nu använts för att analysera antigenspecifika T-cellssvar hos vaccinerade individer5,6, Human Immunodeficiency Virusinfektionspatienter7, och svår akut respiratorisk syndrom Coronavirus 2 infektionspatienter8,9. Till skillnad från den peptid-MHC multimers baserade analysen, är denna metod inte begränsad av validerade epitoper och kan erhålla livskraftiga celler för nedströms analys. En begränsning av denna metod är att den inte kunde ge information om cytokinprofilen för antigenspecifika T-celler. Uttrycket av dessa aktiveringsinducerade markörer av vissa aktiverade antigen-icke-specifika celler kan också bidra till bakgrundssignalerna i analysen, vilket kan vara ett problem, särskilt när de mål antigenspecifika T-cellerna är sällsynta. För närvarande finns det begränsad tillämpning av denna metod på HBV-specifika CD4 T-celler4. Huruvida denna metod kan användas för att analysera HBV-specifika CD4 T-celler på ett tillförlitligt sätt behöver ytterligare undersökning.
Det tredje tillvägagångssättet är baserat på cytokinsekretion efter antigenpeptidstimulering. Liksom aktiveringsinducerad markörbaserad analys begränsas denna metod inte av validerade epitoper. Denna metod kan direkt avslöja cytokin profilen för antigen-specifika T celler. Känsligheten för denna metod är lägre än den aktiveringsinducerade markörbaserade metoden eftersom den förlitar sig på cytokinsekretion av antigenspecifika T-celler och antalet cytokiner som testas är vanligtvis begränsat. För närvarande används denna metod ofta vid analys av HBV-specifika T-celler. Eftersom cytokin som utsöndrar HBV-specifika T-celler knappast kunde detekteras genom direkt ex vivopeptidstimulering10,11, analyseras cytokinprofilen för HBV-specifika T-celler vanligtvis efter 10-dagars in vitropeptid stimulerad expansion12,13,14,15,16. Arrangemang av peptidpooler i matrisform har använts för att underlätta identifiering av antigenspecifikaepitoper 17,18. Med kombinationen av peptidmatris och cytokinutsöndringsanalys har en metod utvecklats för att utvärdera HBV-specifika CD4 T-cellssvar och identifiera HBV-specifika CD4 T-cellsepotoper samtidigt16. I det här protokollet beskrivs detaljerna för den här metoden. HBV core antigen väljs som ett exempel på demonstration i detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje patient som ingick i studien. Studieprotokollet överensstämmer med de etiska riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen från 1975, vilket återspeglas i ett förhandsgodkännande från den medicinska etikkommittén vid Sydvästra sjukhuset.
1. Design av den HBV-härledda peptidmatrisen
- Ladda ner aminosyrasekvenser av HBV-kärnantigenet från NCBI-databaser (GenBank: AFY98989.1).
- Köp HBV-kärnantigen härledda peptider (en panel på 35 15-mer peptider överlappande med 10 rester, renhet > 90%, 4 mg/peptid) från en peptidsyntesleverantör.
- Ställ in en kvadratisk peptidmatris på 6×6 med varje position i matrisen som endast innehåller 1 peptid. Det finns 12 peptidpooler: peptidpooler med 6 rader och peptidpooler med 6 kolumner, 5-6 peptider i varje pool16. Radpeptidpoolerna och kolumnpeptidpoolerna i matrisen representerar 2 separata formationer av HBV-kärnantigen.
- För 3/4 av de inköpta peptiderna, blanda peptider i samma rad/kolumn i matrisen i 12 separata peptidpooler genom att lösa upp dem tillsammans i dimetylsulfoxid (DMSO) (2 μg/μL för varje peptid). Förvara vid -80 °C för analys av HBV-specifika CD4 T-cellssvar.
- Lös upp resten av peptiderna separat (10 μg/μL) och förvara vid -80 °C för epitopidentifiering.
2. Isolering av perifera blodmonukleära celler (PBMCs)
- Prov 5 ml venöst blod från kroniska HBV- infektionspatienter.
OBS: Blodvolymen bör uppskattas ungefär enligt antalet peptidpooler plus 1 bakgrundskontroll och 1 positiv kontroll. Analys av 1 peptid pool behöver 3 x 105 PBMCs. I genomsnitt kan 1 x 106 PBMCs erhållas från 1 ml blod. - Isolera PBMCs från blod med Ficoll densitet gradient centrifugering (800 × g, 20 min) och cryopreserve isolerade PBMCs i flytande kväve för senare användning.
- Använd en Pasteur-pipett för att samla granulocyter mellan det klara Ficoll-skiktet och det röda blodcellslagret. Extrahera genomiskt DNA från granulocyter med hjälp av ett genomiskt DNA-reningskit enligt tillverkarens protokoll.
- Skicka DNA-provet till genotypningsleverantörer för att fastställa genotypen HLA-DRB1.
3. In Vitro-expansion av PBMCs med hjälp av en HBV-peptidmatris
- Tina PBMCs.
- Varm RPMI 1640 kompletterad med 1:10.000 benzonase (25 U/mL) till 37 °C i ett vattenbad.
BENZONASE hjälper till att begränsa cellklumpning under upptining. Varje prov kräver 20 ml RPMI 1640 med benzonas. Beräkna den mängd som behövs för att tina upp alla prover och förbered en separat alikvot av media (37 °C) med 1:10 000 Benzonase (25 U/ml). Tina högst 5 prover åt gången. - Ta bort prover från flytande kväve och tina snabbt frysta injektionsflaskar i ett vattenbad (37 °C).
- Överför den tinade cellupphängningen till ett 15 ml centrifugeringsrör. Tillsätt 1 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) droppe i röret. Tillsätt långsamt 6 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) i centrifugröret, skölj kryovialen med ytterligare 2 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) för att hämta alla celler. Fortsätt med resten av proverna så snabbt som möjligt.
OBS: Långsam utspädning av kryopreserverade prover är nyckeln till att bibehålla livskraften hos tinade celler. - Centrifugera (400 × g, 10 min), ta bort supernatanten och lossa pelleten genom att knacka på röret.
- Återanvänd försiktigt pelleten i 1 ml varm Benzonase RPMI 1640. Blanda försiktigt och filtrera cellerna genom en cellsil på 70 μm om det behövs (dvs. om det finns någon synlig klump).
- Aliquot en 10 μL suspension och späd i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS), tillsätt Trypan blå (0,04%), ladda på en hemocytometer, vänta i 1 min och räkna antalet livskraftiga celler (klara celler).
- Tillsätt 9 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) i röret, centrifug (400 × g, 10 min), ta bort supernatanten och lossa pelleten genom att knacka på röret.
- Varm RPMI 1640 kompletterad med 1:10.000 benzonase (25 U/mL) till 37 °C i ett vattenbad.
- Återanvända PBMCs i RPMI 1640 kompletterat med 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin och 10% human AB serum (komplett odlingsmedium). Justera celltätheten till 1,5 x 106 celler/ml. Plätera PBMCs i 96-brunnsplattor (platt botten) med en densitet på 3 x 105 celler/brunn.
- Tillsätt HBV-härledda peptidpooler (2 μg/ml för varje enskild peptid) till varje brunn. För brunnar av bakgrundskontroll och positiv kontroll, tillsätt samma mängd lösningsmedel (DMSO, 1 μL/ml). Tillsätt 10 U/ml IL-2 och 10 ng/mL IL-7. Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2.
- Vid dag 3, komplettera kulturmedium med 50 U/ml IL-2 och 10 ng/mL IL-7.
OBS: Under dag 1 till dag 3 kommer ingen uppenbar T-cellsproliferation att observeras. Det totala cellnumret minskar vanligtvis med 1/3 till 1/2, på grund av döden av icke-T-celler som B-celler, NK-celler, NKT-celler och monocyter. - Vid dag 7, ersätt hälften av odlingsmediet med färskt medium som innehåller peptider (4 μg/ml), IL-2 (100 U/ml) och IL-7 (20 ng/ml).
OBS: För att undvika att störa cellerna i botten, pipett ca 90 μL odlingsmedium försiktigt från toppen av mediet. Under dag 3 till dag 7 kommer robust T-cellsproliferation att observeras, och prolifererande T-celler samlas vanligtvis för att bilda kluster. - På dag 10, försiktigt pipett cell kultur i varje brunn 7-9 gånger för att dela upp cell kluster, räkna antalet livskraftiga celler och överföra 2×105 celler i varje brunn till en 96 brunnsplatta (rund botten) för HBV-specifika CD4 T-cells svar analys.
- Fortsätt att odla resten av cellerna för epitopidentifiering dag 12, justera volymen av odlingsmedium till 100 μL (kassera överdrivet medium) och komplettera kulturen med 100 μL färskt komplett odlingsmedium som innehåller peptider (4 μg/ml), IL-2 (100 U/ml) och IL-7 (20 ng/ml).
OBS: Under dag 7 till dag 10 fortsätter T-cellerna att föröka sig kraftigt. Byt ut odlingsmediet som i steg 3.5 om mediet blir gult. I allmänhet kommer cellnumret att överstiga 6×105 dag 10. Varje brunn visar vanligtvis liknande cellnummer, räknar cellnummer i 3 brunnar och använder medelvärdet som en uppskattning av cellnummer för alla brunnar.
4. Analys av HBV-specifika CD4 T-Cells svar genom intracellulär flödescytometri
- Stimulera PBMCs med peptidpooler
- För de celler som överförs till 96 brunnsplattan (rund botten), tvätta 3 gånger i en tallrik (550 × g, 3 min). Använd 200 μL medium för varje tvätt (RPMI 1640 för de första 2 tvättar, komplett odlingsmedium för den sista tvätten). Kassera supernatanterna.
OBS: Avlägsnande av kvarvarande cytokiner i kulturen genom upprepad tvättning kan effektivt minska bakgrunden i intracellulära flöde cytometri analys. - För varje cellbrunn som stimuleras med en specifik peptidpool, tillsätt 200 μL komplett odlingsmedium kompletterat med samma peptidpooler (2 μg/ml för varje enskild peptid). För brunnen av bakgrundskontroll, lägg till komplett odlingsmedium kompletterat med 1 μL/ ml DMSO. För brunnen av positiv kontroll, tillsätt komplett odlingsmedium kompletterat med 1 μL/ml DMSO, 150 ng/ml phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) och 1 μmol/L jonomycin.
OBS: Hög dos dmso kommer att blockera cytokinsekretion av T-celler (mest signifikant för TNF-α). Dos av DMSO högre än 5 μL/ml rekommenderas inte. I allmänhet överstiger dosen av DMSO i vårt experiment inte 1 μL/ml. - Inkubera vid 37 °C och 5% CO2 i 6 timmar.
- Efter 1 timmes inkubation, tillsätt Monensin (1,37 μg/ml) till kulturen.
- För de celler som överförs till 96 brunnsplattan (rund botten), tvätta 3 gånger i en tallrik (550 × g, 3 min). Använd 200 μL medium för varje tvätt (RPMI 1640 för de första 2 tvättar, komplett odlingsmedium för den sista tvätten). Kassera supernatanterna.
- Flödescytometri
- Efter 6 h inkubation. Ta bort supernatant efter centrifugering (550 × g, 3 min), tvätta cellerna en gång med 200 μL DPBS (550 × g, 3 min), färgytemarkörer (CD3, CD4 och CD8) och livskraftsmarkör (med Fixable Viability Dye) i ett kylskåp på 4 °C i 30 minuter.
- Tvätta en gång med 200 μL DPBS (550 × g, 3 min). Fixera och permeabilisera celler och fläck intracellulära cytokiner (TNF-α och IFN-γ) i ett kylskåp på 4 °C i 45 minuter.
- Efter den slutliga tvätten i intracellulär färgning, återanvända celler i 150 μL flöde cytometri buffert (DPBS + 0,5% BSA).
- Införskaffa flödescytometridata på en flödescytometer.
- Analys av flödescytometriresultat
- Definition av positiv brunn: betrakta som positiv om den har en frekvens av cytokin som utsöndrar T-celler minst två gånger av bakgrundskontrollen väl (figur 1).
- Enligt följande formel, beräkna svarshastigheten för varje cytokin som analyseras (Figur 2):
OBS: Radpeptidpoolen och kolumnpeptidpoolerna i matrisen representerar 2 distinkta formationer av HBV-kärnantigen, så den slutliga svarsfrekvensen bör divideras med 2.
5. Identifiering av HBV-specifika HLA-DR-begränsade CD4 T-cellsepotoper
- Tina och underhåll allergiframkallande B-lymfoida cellinjer (BLCLs) i T-75 kolv (5-20 ×106 celler, 20 ml komplett odlingsmedium).
OBS: För att garantera BLCLs goda tillstånd bör detta steg initieras 2 veckor före upptining av patienternas PBMCs. BLCLs måste vara homozygous i HLA-DRB1 allel. Enligt genotypningsresultatet bör patienterna dela samma HLA-DRB1-allel som BLCLs. - Screening av kandidatpeptider för identifiering (figur 3)
- Enligt T-cellssvarsresultatet dag 10, skärma ut 2 peptidpooler med den högsta svarsfrekvensen (1 radpeptidpool och 1 kolumnpeptidpool).
- Ställ in peptiden i dessa 2 pooler som kandidatpeptid om den andra peptidpoolen som innehåller denna peptid också visar ett positivt resultat i T-cellsresponsanalys. Använd PBMCs expanderade med den andra peptidpoolen för epitopidentifiering senare.
- Pulserande BLCLs med peptid
- Vid dag 12, räkna antalet livskraftiga BLCLs, överför celler till 15 mL centrifugerör, centrifuger (350 × g, 10 min) och ta bort supernatanten. Återanvänd cellpelleten i komplett odlingsmedium och alikvot BLCLs till en 96-brunnsplatta (rund botten) vid 4×104 celler/brunn i 80 μL komplett odlingsmedium.
- Tillsätt en enda peptid (10 μg/ml), inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i 2 timmar. Ställ in 2 bakgrundskontroller: peptidpulserande med HLA-DR-blockering (förbehandling med anti-HLA-DR (10 μg/ml) i 1 timme); DMSO (1 μL/ml) pulserande. Den slutliga volymen av komplett odlingsmedium i varje brunn är 100 μL.
- Tillsätt mitomycin C (100 μg/ml), inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i 1 timme.
- Tvätta 3 gånger med 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) i en tallrik för att avlägsna opulsad peptid och mitomycin C. För den första tvätten, komplettera inkubationskulturen med 100 μL RPMI 1640.
- Återanvända celler i 120 μL komplett odlingsmedium.
- Stimulera PBMCs med peptid pulsade BLCLs.
- Vid dag 12 överför du PBMCs till en 96-brunnsplatta (rund botten).
- Ta bort supernatanten efter centrifugering (550 × g, 3 min) i en tallrik, en tvätt två gånger med 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) i en tallrik.
OBS: Avlägsnande av kvarvarande cytokiner och peptider i kulturen genom upprepad tvättning är det viktigaste steget för att minska bakgrunden i intracellulär flöde cytometri analys. Speciellt för restpeptider kommer det att binda till BLCLs och avsevärt öka bakgrunden. - Återanvänd PBMCs vid varje brunn med 210 μL komplett odlingsmedium.
- För brunnen hos PBMCs som valts för epitopidentifiering, blanda alikvoten (70 μL vardera) med peptidpulsade BLCLs (3 brunnar, inklusive 2 bakgrundskontroller).
OBS: På dag 12 kommer antalet peptidpooler som utökas PBMCs vanligtvis att nå över 5-7×105 per brunn, så förhållandet mellan PBMCs / BLCLs är ca 6/1 till 4/1. - Inkubera vid 37 °C och 5% CO2 i 6 timmar.
- Efter 1 timmes inkubation, tillsätt Monensin (1,37 μg/ml) till kulturen. Den slutliga volymen av komplett odlingsmedium i varje brunn är 200 μL.
- Flödescytometri
- Upprepa samma åtgärder som i steg 4.2.
- Analys av flödescytometriresultat
- Verifiera en peptid som en HLA-DR-begränsad CD4 T-cells epitop om PBMCs inkuberade med denna peptid pulsade BLCLs visar en frekvens av cytokin utsöndra CD4 T celler minst två gånger av PBMCs inkuberas med bakgrund kontroller (peptid pulserande med HLA-DR pre-blocking; DMSO pulserande) (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Frekvensen av cytokin som utsöndrar CD4 T-celler beräknas som summan av både enskilda producenter och dubbla producenter. Som framgår av figur 1är frekvensen av TNF-α som utsöndrar CD4 T-celler och frekvensen av IFN-γ som utsöndrar CD4 T-celler i bakgrundskontroll (DMSO) 0,154% respektive 0,013%. Frekvensen av TNF-α utsöndrar CD4 T-celler och frekvensen av IFN-γ utsöndrar CD4 T-celler som är specifika för peptidpool Core11 är 0,206 respektive 0,017, så både TNF-α som utsöndrar CD4 T-cellssvar respektive IFN-γ som utsöndrar CD4 T-cells svar för denna peptidpool anses vara negativa. Frekvensen av TNF-α utsöndrar CD4 T-celler och frekvensen av IFN-γ utsöndrar CD4 T-celler som är specifika för peptidpool Core09 är 2,715% respektive 0,973%, så både TNF-α som utsöndrar CD4 T-cellssvar respektive IFN-γ som utsöndrar CD4 T-cells svar för denna peptidpool anses vara positiva.
Som framgår av figur 2anges positiva brunnar med grå bakgrund. Vid beräkning av HBV kärnspecifika TNF-α utsöndrar CD4 T-cells svarsfrekvens, data om peptidpooler Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 och Core10 bör inkluderas. Vid beräkning av HBV kärnspecifika IFN-γ utsöndrar CD4 T-cells svarsfrekvens ingår data från peptidpoolerna Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 och Core10.
Som framgår av figur 3anges kandidatpeptider för epitopidentifiering i rött. Core01 har den högsta svarsfrekvensen för både TNF-α som utsöndrar CD4 T-celler och IFN-γ som utsöndrar CD4 T-celler i kolumnpeptidpooler. Peptiderna C1-15, C31-45, C61-75 och C91-105 i denna peptidpool är inställda som kandidatpeptider eftersom radpeptidpoolerna som innehåller dessa peptider också visar positiva resultat i T-cellsrespons. PBMCs expanderade med peptidpoolerna Core07, Core08, Core09 och Core10 används för epitopidentifiering av peptiderna C1-15, C31-45, C61-75 respektive C91-105. Core09 har den högsta svarsfrekvensen för både TNF-α som utsöndrar CD4 T-celler och IFN-γ som utsöndrar CD4 T-celler i radpeptidpooler. Peptiderna C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 och C86-100 i denna peptidpool är inställda som kandidatpeptider eftersom kolumnpeptidpoolerna som innehåller dessa peptider också visar positivt resultat i T-cellssvar. PBMCs som utökas med peptidpoolerna Core01, Core02, Core03, Core04, Core05 och Core06 används för epitopidentifiering av peptiderna C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 respektive C86-100.
Som framgår av figur 4, för peptidpool core08 expanderade PBMCs, efter stimulering med peptid C31-45 pulsade BLCLs, Frekvensen av TNF-α som utsöndrar CD4 T-celler och frekvensen av IFN-γ som utsöndrar CD4 T-celler är 0,995% respektive 0,131%, som är mer än 2 gånger högre än bakgrundskontroller (peptid C31-45 pulserade BLCLs med HLA-DR förblockering, DMSO pulserade BLCLs). Således verifieras peptid C31-45 som en HLA-DR begränsad CD4 T-cells epitope. För peptidpool Core10 expanderade PBMCs, efter stimulering med peptid C91-105 pulsade BLCLs, frekvensen av TNF-α utsöndra CD4 T-celler och frekvensen av IFN-γ utsöndra CD4 T-celler är 0,221% respektive 0,000% som inte överskrider de 2 gånger bakgrundskontrollerna (peptid C91-45 pulsade BLCLs med HLA-DR pre-blocking, DMSO pulserade BLCLs), så peptid C91-105 verifieras inte som HLA-DR begränsad CD4 T-cells epitope.
Bild 1:Flödescytometridemonstration av TNF-α/IFN-γ som utsöndrar CD4 T-celler i peptidpooler expanderade PBMCs efter att ha stimulerats med sina respektive peptidpooler.
Figur 2: Demonstration av analysen HBV kärnspecifika TNF-α/IFN-γ utsöndrar CD4 T-celler. TNF/DMSO och IFN-Ƴ/DMSO anger förhållandet mellan frekvenserna för TNF-α/IFN-γ som utsöndrar CD4 T-celler i varje brunn i peptidpoolen stimulerade PBMCs dividerat med frekvensen av TNF-α/IFN-γ som utsöndrar CD4 T-celler i dmso-kontrollens brunn. Grå bakgrund indikerar brunnar med positiv CD4 T-cells svar bedöms i jämförelse med bakgrundskontroll. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Demonstration av screening av kandidatpeptider för epitopidentifiering. TNF/DMSO och IFN-Ƴ/DMSO anger förhållandet mellan frekvenserna för TNF-α/IFN-γ som utsöndrar CD4 T-celler i varje brunn i peptidpoolen stimulerade PBMCs dividerat med frekvensen av TNF-α/IFN-γ som utsöndrar CD4 T-celler i dmso-kontrollens brunn. Grå bakgrund indikerar brunnar med positiv CD4 T-cells svar bedöms i jämförelse med bakgrundskontroll. Peptider i rött indikerar kandidatpeptider enligt screeningkriterierna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Flödescytometri demonstration av epitopidentifiering resultat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiska stegen i det här protokollet listas på följande sätt: 1) tillräckligt många PBMCs med hög lönsamhet för att starta PBMCs-expansion; 2) Lämplig miljö för utbyggnad av pbmcs. och 3) fullständigt avlägsnande av kvarvarande peptidpooler i PBMCs-kulturen före epitopidentifiering.
All analys i detta protokoll beror på den robusta spridningen av CD4 T-celler. I allmänhet kommer antalet PBMCs efter 10 dagars expansion att vara 2-3 gånger av det ursprungliga antalet. Cellnumret och livskraften hos PBMCs är 2 nyckelfaktorer i PBMCs expansion. Om syftet endast är att analysera HBV-specifika CD4 T-celler utan epitopidentifiering är det rimligt att minska det ursprungliga PBMCs-antalet, särskilt när volymen blodprov är begränsad. Även om, enligt vår erfarenhet, framgångsrik PBMCs expansion knappt kunde erhållas om startnumret för PBMCs är under 1,5×105 celler / väl. När du använder färska PBMCs för expansion kommer cellens livskraft inte att vara ett problem. Vid användning av kryopreserverade PBMCs för expansion bör kryopreservation och upptining av PBMCs utföras mycket noggrant för att bibehålla pbmcs livskraft.
Vid funktionell analys av HBV-specifika T-celler används IL-12 vanligtvis i PBMCs expansion för att förbättra funktionen hos CD8 T-celler. Eftersom IL-12 kan inducera differentiering av CD4 T celler mot CD4 T follicular helper celler, bör denna cytokin undvikas i funktionell analys av HBV-specifika CD4 T celler. I vårt protokoll kompletteras endast IL-2 (för T-cellsexpansion) och IL-7 (för T-cellsöverlevnad) för att upprätthålla den funktionella profilen hos HBV-specifika CD4 T-celler under expansionen så intakt som möjligt. Vi har testat 5 cytokiner för funktionell analys av HBV-specifika CD4 T celler: TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 och IL-21. I våra analyserade prover är TNF-α och IFN-γ 2 stora cytokiner utsöndras av HBV-specifika CD4T-celler 16. Vid analys av den funktionella profilen för HBV-specifika CD4 T-celler rekommenderas att testa så många som möjligt cytokiner för att få detaljerad funktionell profilinformation. I epitopidentifiering rekommenderas att endast analysera TNF-α och IFN-γ, för ekonomisk hänsyn.
Tillräckligt många HBV-specifika CD4 T-celler är avgörande för framgångsrik epitopidentifiering, så epitopidentifiering bör övervägas hos patienter med högt HBV-specifikt CD4 T-cellssvar, såsom hepatit B-flarepatienter (starka HBV-specifika TNF- α som utsöndrar CD4 T-cellssvar) och patienter med viral clearance (starkt HBV-specifikt IFN- γ CD4 T-cellssvar)16 . Det är mycket viktigt att ta bort restpeptider i peptidpoolen expanderade PBMCs genom upprepad tvätt innan du inkuberar dessa celler med BLCLs för epitopidentifiering. De återstående peptiderna kommer att binda till DMSO pulsade BLCLs, aktivera peptidspecifika CD4 T-celler, härmed öka bakgrunden i stor utsträckning.
Vissa HBV-antigen har variabla sekvenser i olika HBV-genotyper (t.ex. HBV-ytantigen). En lösning är att förbestämma de specifika HBV genotyperna hos patienter och utforma HBV genotyp-specifika peptid pooler för patienter med olika HBV genotyper. Medan HBV-genotypen inte är mätbar hos patienter med låg HBV-virusbelastning (t.ex. HBeAg-negativa patienter med regelbunden antiviral behandling), är lösningen i detta scenario att blanda peptider från olika HBV-genotyper tillsammans i samma peptidpooler, som vi gjorde i en tidigare studie16. En nackdel med denna blandningsstrategi är att epitop kan identifieras som ett peptidpar men inte en enda peptid, eftersom vissa positioner i peptidmatrisen innehåller ett peptidpar i samma fragment av antigenet.
En stor nackdel med den här metoden är den tidskrävande 10-dagars PBMCs-expansionen. För närvarande kunde ex vivo analys av cytokin utsöndring inte upptäcka HBV-specifika CD4 T celler på ett tillförlitligt sätt. Med hjälp av peptid pulsade allogena BLCLs som stimulatorer upptäckte vanligtvis mer peptidspecifika CD4 T-celler i peptid expanderade PBMCs, jämfört med att helt enkelt stimulera medpeptider 16. Det är värt att undersöka om användning av peptidpulserade autologa B-celler som antigenpresentationsceller kan bidra till att tillförlitligt upptäcka HBV-specifika CD4 T-celler ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) och Chinese Key
Projekt specialiserat för infektionssjukdomar (2018ZX10723203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
- Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
- Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
- Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
- Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
- Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
- Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
- Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
- Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
- Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
- de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
- Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
- Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).
