Summary
Op basis van een van hepatitis B-virus (HBV) afgeleide peptidematrix konden HBV-specifieke CD4 T-celresponsen parallel aan de identificatie van HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen worden geëvalueerd.
Abstract
CD4 T-cellen spelen een belangrijke rol in de pathogenese van chronische hepatitis B. Als een veelzijdige celpopulatie zijn CD4 T-cellen geclassificeerd als verschillende functionele subsets op basis van de cytokines die ze hebben uitgescheiden: bijvoorbeeld IFN-γ voor CD4 T-helper 1-cellen, IL-4 en IL-13 voor CD4 T-helper 2-cellen, IL-21 voor CD4 T folliculaire helpercellen en IL-17 voor CD4 T-helper 17-cellen. Analyse van hepatitis B-virus (HBV)-specifieke CD4 T-cellen op basis van cytokinesecretie na HBV-afgeleide peptidenstimulatie zou niet alleen informatie kunnen opleveren over de omvang van HBV-specifieke CD4 T-celrespons, maar ook over de functionele subsets van HBV-specifieke CD4 T-cellen. Nieuwe benaderingen, zoals transcriptomics en metabolomics-analyse, kunnen meer gedetailleerde functionele informatie opleveren over HBV-specifieke CD4 T-cellen. Deze benaderingen vereisen meestal isolatie van levensvatbare HBV-specifieke CD4 T-cellen op basis van peptide-major histocompatibiliteit complex-II multimeren, terwijl momenteel de informatie over HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen beperkt is. Op basis van een hbv-afgeleide peptidematrix is een methode ontwikkeld om HBV-specifieke CD4 T-celresponsen te evalueren en HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen gelijktijdig te identificeren met behulp van perifere bloedmononucleaire celmonsters van chronische HBV-infectiepatiënten.
Introduction
Momenteel zijn er 3 hoofdbenaderingen om antigeenspecifieke T-cellen te analyseren. De eerste benadering is gebaseerd op de interactie tussen de T-celreceptor en het peptide (epitoop). Antigeenspecifieke T-cellen kunnen direct worden gekleurd met peptide-major histocompatibiliteitscomplex (MHC) multimeren. Het voordeel van deze methode is dat het levensvatbare antigeenspecifieke T-cellen kan verkrijgen, geschikt voor downstream transcriptomics / metabolomics-analyse. Een beperking van deze methode is dat het geen informatie kon geven over de hele T-celrespons op een specifiek antigeen, omdat het gevalideerde epitooppeptiden vereist, terwijl het aantal geïdentificeerde epitopen voor een specifiek antigeen voorlopig beperkt is. Vergeleken met hepatitis B-virus (HBV)-specifieke CD8 T-cel epitopen zijn er minder HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen geïdentificeerd1,2, waardoor deze methode momenteel minder toepasbaar is voor de analyse van HBV-specifieke CD4 T-cellen.
De tweede benadering is gebaseerd op de upregulatie van een reeks activeringsgeïnduceerde markers na antigeenpeptidestimulatie3. De meest gebruikte markers zijn CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Deze methode is nu gebruikt om antigeenspecifieke T-celresponsen te analyseren bij gevaccineerde personen5,6,human immunodeficiëntievirusinfectiepatiënten7en ernstig acuut respiratoir syndroom Coronavirus 2 infectiepatiënten8,9. In tegenstelling tot de op peptide-MHC-multimeren gebaseerde test, wordt deze methode niet beperkt door gevalideerde epitopen en kunnen levensvatbare cellen verkrijgen voor downstream-analyse. Een beperking van deze methode is dat het geen informatie kon geven over het cytokineprofiel van antigeenspecifieke T-cellen. Ook kan de expressie van deze activerings-geïnduceerde markers door sommige geactiveerde antigeen-niet-specifieke cellen bijdragen aan de achtergrondsignalen in de analyse, wat een probleem kan zijn, vooral wanneer de doelantigeenspecifieke T-cellen zeldzaam zijn. Momenteel is er beperkte toepassing van deze methode op HBV-specifieke CD4 T-cellen4. Of deze methode kan worden gebruikt om HBV-specifieke CD4 T-cellen op een betrouwbare manier te analyseren, moet verder worden onderzocht.
De derde benadering is gebaseerd op de cytokinesecretie na antigeenpeptidestimulatie. Net als activeringsgeïnduceerde markergebaseerde analyse wordt deze methode niet beperkt door gevalideerde epitopen. Deze methode zou direct het cytokineprofiel van antigeenspecifieke T-cellen kunnen onthullen. De gevoeligheid van deze methode is lager dan de activeringsgeïnduceerde markergebaseerde methode, omdat deze afhankelijk is van de cytokinecretie van antigeenspecifieke T-cellen en het aantal geteste cytokines meestal beperkt is. Momenteel wordt deze methode veel gebruikt bij de analyse van HBV-specifieke T-cellen. Omdat cytokine-afscheidende HBV-specifieke T-cellen nauwelijks konden worden gedetecteerd door directe ex vivo peptidestimulatie10,11,wordt het cytokineprofiel van HBV-specifieke T-cellen meestal geanalyseerd na 10-daagse in vitro peptide gestimuleerde expansie12,13,14,15,16. Rangschikking van peptidepools in een matrixvorm is gebruikt om de identificatie van antigeenspecifieke epitopen17,18te vergemakkelijken. Met de combinatie van peptidematrix en cytokinesecretieanalyse is een methode ontwikkeld om HBV-specifieke CD4 T-celresponsen te evalueren en HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen tegelijkertijd te identificeren16. In dit protocol worden de details van deze methode beschreven. HBV-kernantigeen wordt gekozen als voorbeeld van demonstratie in dit protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke patiënt die in het onderzoek werd opgenomen. Het studieprotocol voldoet aan de ethische richtlijnen van de Verklaring van Helsinki van 1975, zoals weerspiegeld in a priori goedkeuring door de medisch-ethische commissie van het Southwest Hospital.
1. Ontwerp van de hbv-afgeleide peptidematrix
- Download aminozuursequenties van het HBV-kernantigeen uit NCBI-databases (GenBank: AFY98989.1).
- Koop HBV-kernantigeen afgeleide peptiden (een panel van 35 15-mer peptiden overlappend door 10 residuen, zuiverheid > 90%, 4 mg / peptide) van een peptidesynthesedienstverlener.
- Stel een vierkante 6×6 peptidematrix in met elke positie in de matrix die slechts 1 peptide bevat. Er zijn 12 peptide pools: 6 rij peptide pools en 6 kolom peptide pools, 5-6 peptiden in elke pool16. De rijpeptidepools en de kolompeptidepools in de matrix vertegenwoordigen 2 afzonderlijke formaties van HBV-kernantigeen.
- Meng voor 3/4 van de gekochte peptiden peptiden in dezelfde rij /kolom van de matrix in 12 afzonderlijke peptidepools door ze samen op te lossen in dimethylsulfoxide (DMSO) (2 μg / μL voor elk peptide). Bewaren bij -80 °C voor analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen.
- Los de rest van de peptiden afzonderlijk op (10 μg/μL) en bewaar bij -80 °C voor epitoopidentificatie.
2. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's)
- Monster 5 ml veneus bloed van patiënten met chronische HBV-infectie.
OPMERKING: Het bloedvolume moet ruwweg worden geschat op basis van het aantal peptidepools plus 1 achtergrondcontrole en 1 positieve controle. Analyse van 1 peptidepool heeft 3 x 105 PBMC's nodig. Gemiddeld konden 1 x 106 PBMC's worden verkregen uit 1 ml bloed. - Isoleer PBMC's uit bloed met behulp van Ficoll-dichtheidsgradiëntcentrifugatie (800 × g, 20 min) en cryopreserve geïsoleerde PBMC's in vloeibare stikstof voor later gebruik.
- Gebruik een Pasteur pipet om granulocyten te verzamelen tussen de heldere Ficoll-laag en de rode bloedcellaag. Extraheer genomisch DNA uit granulocyten met behulp van een genomische DNA-zuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant.
- Stuur het DNA-monster naar genotyperingsserviceproviders om het HLA-DRB1-genotype te bepalen.
3. In vitro expansie van PBMC's met behulp van een HBV Peptide Matrix
- Ontdooi PBMC's.
- Warme RPMI 1640 aangevuld met 1:10.000 benzonase (25 U/ml) tot 37 °C in een waterbad.
OPMERKING: Benzonase helpt om celklonteren tijdens het ontdooien te beperken. Elk monster vereist 20 ml RPMI 1640 met benzonase. Bereken de hoeveelheid die nodig is om alle monsters te ontdooien en bereid een apart aliquot van media (37 °C) met 1:10.000 Benzonase (25 E/ml). Ontdooi niet meer dan 5 monsters tegelijk. - Verwijder monsters van vloeibare stikstof en ontdooi bevroren injectieflacons snel in een waterbad (37 °C).
- Breng de ontdooide celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml. Voeg 1 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) druppelsgewijs toe aan de buis. Voeg langzaam 6 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) toe aan de centrifugebuis, spoel cryoviaal met nog eens 2 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) om alle cellen op te halen. Ga zo snel mogelijk verder met de rest van de monsters.
OPMERKING: Langzame verdunning van gecryopreserveerde monsters is de sleutel tot het behoud van de levensvatbaarheid van ontdooide cellen. - Centrifugeer (400 × g, 10 min), verwijder het supernatant en maak de pellet los door op de buis te tikken.
- Resuspend de pellet voorzichtig in 1 ml warme benzonase RPMI 1640. Meng voorzichtig en filter cellen door een celzeef van 70 μm indien nodig (d.w.z. als er een zichtbare klomp bestaat).
- Aliquot een suspensie van 10 μL en verdun in Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), voeg Trypan blauw (0,04%) toe, laad op een hemocytometer, wacht 1 minuut en tel het aantal levensvatbare cellen (heldere cellen).
- Voeg 9 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) toe aan de buis, centrifugeer (400 × g, 10 min), verwijder het supernatant en maak de pellet los door op de buis te tikken.
- Warme RPMI 1640 aangevuld met 1:10.000 benzonase (25 U/ml) tot 37 °C in een waterbad.
- Resuspend PBMC's in RPMI 1640 aangevuld met 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine en 10% humaan AB-serum (volledig kweekmedium). Pas de celdichtheid aan tot 1,5 x10 6 cellen/ml. Plaat PBMC's in 96-well platen (vlakke bodem) met een dichtheid van 3 x 105 cellen/put.
- Voeg HBV-afgeleide peptidepools (2 μg / ml voor elk afzonderlijk peptide) toe aan elke put. Voeg voor putjes van achtergrondcontrole en positieve controle dezelfde hoeveelheid oplosmiddel (DMSO, 1 μL/ml) toe. Voeg 10 U/ml IL-2 en 10 ng/ml IL-7 toe. Incuberen bij 37 °C en 5% CO2.
- Vul op dag 3 het kweekmedium aan met 50 U/ml IL-2 en 10 ng/ml IL-7.
OPMERKING: Gedurende dag 1 tot dag 3 zal er geen duidelijke T-celproliferatie worden waargenomen. Het totale celaantal zal meestal afnemen met 1/3 tot 1/2, als gevolg van de dood van niet-T-cellen zoals B-cellen, NK-cellen, NKT-cellen en monocyten. - Vervang op dag 7 de helft van het kweekmedium door vers medium met peptiden (4 μg/ml), IL-2 (100 U/ml) en IL-7 (20 ng/ml).
OPMERKING: Om te voorkomen dat de cellen aan de onderkant worden verstoord, pipetteer u ongeveer 90 μL kweekmedium zorgvuldig vanaf de bovenkant van het medium. Gedurende dag 3 tot dag 7 zal robuuste T-celproliferatie worden waargenomen en prolifererende T-cellen aggregeren meestal om clusters te vormen. - Pipetteer op dag 10 voorzichtig celkweek in elke put 7-9 keer om celclusters uit te splitsen, het aantal levensvatbare cellen te tellen en 2×105 cellen in elke put over te brengen naar een 96 putplaat (ronde bodem) voor HBV-specifieke CD4 T-celresponsanalyse.
- Ga door met het kweken van de rest van de cellen voor epitoopidentificatie op dag 12, pas het volume van het kweekmedium aan op 100 μL (waarbij overmatig medium wordt weggegooid) en vul de cultuur aan met 100 μL vers volledig kweekmedium met peptiden (4 μg / ml), IL-2 (100 U / ml) en IL-7 (20 ng / ml).
OPMERKING: Gedurende dag 7 tot dag 10 blijven T-cellen zich krachtig vermenigvuldigen. Vervang het kweekmedium zoals in stap 3.5 als het medium geel wordt. Over het algemeen zal het celgetal op dag 10 hoger zijn dan 6×105. Elke put toont meestal een vergelijkbaar celnummer, telt het celnummer in 3 putten en gebruikt de gemiddelde waarde als schatting van het celnummer voor alle putten.
4. Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen door intracellulaire flowcytometrie
- Pbmc's stimuleren met peptidepools
- Voor de cellen overgebracht naar de 96 putplaat (ronde bodem), was 3 keer in een plaat (550 × g, 3 min). Gebruik 200 μL medium voor elke wasbeurt (RPMI 1640 voor de eerste 2 wasbeurten, compleet kweekmedium voor de laatste wasbeurt). Gooi de supernatanten weg.
OPMERKING: Verwijdering van resterende cytokines in de kweek door herhaald wassen zou de achtergrond in intracellulaire flowcytometrie-analyse effectief kunnen verminderen. - Voeg voor elke bron van cellen gestimuleerd met een specifieke peptidepool 200 μL volledig kweekmedium toe, aangevuld met dezelfde peptidepools (2 μg / ml voor elk afzonderlijk peptide). Voeg voor de bron van achtergrondcontrole een volledig kweekmedium toe, aangevuld met 1 μL/ml DMSO. Voeg voor de bron van positieve controle een volledig kweekmedium toe aangevuld met 1 μL / ml DMSO, 150 ng / ml phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en 1 μmol / l ionomycine.
OPMERKING: Een hoge dosis DMSO blokkeert de cytokinesecretie van T-cellen (het meest significant voor TNF-α). Een dosis DMSO hoger dan 5 μL/ml wordt niet aanbevolen. Over het algemeen is de dosis DMSO in ons experiment niet hoger dan 1 μL / ml. - Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 6 uur.
- Voeg na 1 uur incubatie Monensin (1,37 μg/ml) toe aan de kweek.
- Voor de cellen overgebracht naar de 96 putplaat (ronde bodem), was 3 keer in een plaat (550 × g, 3 min). Gebruik 200 μL medium voor elke wasbeurt (RPMI 1640 voor de eerste 2 wasbeurten, compleet kweekmedium voor de laatste wasbeurt). Gooi de supernatanten weg.
- Flowcytometrie
- Na 6 uur incubatie. Verwijder supernatant na centrifugeren (550 × g, 3 min), wascellen eenmaal met 200 μL DPBS (550 × g, 3 min), vlekoppervlakmarkeringen (CD3, CD4 en CD8) en levensvatbaarheidsmarker (met fixable viability dye) in een koelkast van 4 °C gedurende 30 minuten.
- Eenmaal wassen met 200 μL DPBS (550 × g, 3 min). Fixeer en permeabiliseer cellen en kleur intracellulaire cytokines (TNF-α en IFN-γ) in een koelkast van 4 °C gedurende 45 minuten.
- Na de laatste wassing in intracellulaire kleuring, resuspend cellen in 150 μL flowcytometriebuffer (DPBS + 0,5% BSA).
- Verkrijg flowcytometriegegevens op een flowcytometer.
- Analyse van flowcytometrieresultaten
- Definitie van positieve put: beschouw een put als positief als het een frequentie heeft van cytokine die T-cellen afscheidt ten minste twee keer van de achtergrondcontrole goed (Figuur 1).
- Bereken volgens de volgende formule het responspercentage voor elk geanalyseerd cytokine (figuur 2):
OPMERKING: De rijpeptidepool en de kolompeptidepools in de matrix vertegenwoordigen 2 verschillende formaties van HBV-kernantigeen, dus de uiteindelijke responssnelheid moet worden gedeeld door 2.
5. Identificatie van HBV-specifieke HLA-DR Restricted CD4 T-cell Epitopen
- Ontdooi en onderhoud allogene B-lymfoblastoïde cellijnen (BLCLs) in T-75-kolf (5-20 ×106 cellen, 20 ml volledig kweekmedium).
OPMERKING: Om de goede toestand van BLCLs te garanderen, moet deze stap 2 weken voor het ontdooien van de PBMC's van patiënten worden gestart. BLCLs moeten homozygoot zijn in HLA-DRB1-allel. Volgens het genotyperingsresultaat moeten patiënten hetzelfde HLA-DRB1-allel delen als BLCLs. - Screening van kandidaat-peptiden voor identificatie (Figuur 3)
- Volgens de resultaten van het T-celresponspercentage op dag 10, screen 2 peptidepools met het hoogste responspercentage (1 rij peptidepool en 1 kolompeptidepool).
- Stel het peptide in die 2 pools in als kandidaat-peptide als de andere peptidepool die dit peptide bevat ook een positief resultaat laat zien in T-celresponsanalyse. Gebruik de PBMC's uitgebreid met de andere peptidepool voor epitoopidentificatie later.
- Pulserende BLCLs met peptide
- Tel op dag 12 het aantal levensvatbare BLCLs, breng cellen over naar 15 ml centrifugebuizen, centrifugeer (350 × g, 10 min) en verwijder het supernatant. Resuspend de celkorrel in volledig kweekmedium en aliquot BLCLs op een 96-well plaat (ronde bodem) bij 4×104 cellen/put in 80 μL volledig kweekmedium.
- Voeg een enkel peptide (10 μg/ml) toe, incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2 uur. Set 2 achtergrondcontrole: peptidepulsing met HLA-DR-blokkering (voorbehandeling met anti-HLA-DR (10 μg /ml) gedurende 1 uur); DMSO (1 μL/ml) pulserend. Het uiteindelijke volume van het volledige kweekmedium in elke put is 100 μL.
- Voeg mitomycine C (100 μg/ml) toe, incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur.
- Was 3 keer met 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in een plaat om niet-gepulseerd peptide en mitomycine C te verwijderen. Vul voor de eerste wasbeurt de incubatiecultuur aan met 100 μL RPMI 1640.
- Resuspend cellen in 120 μL volledig kweekmedium.
- Het stimuleren van PBMC's met peptide gepulste BLCLs.
- Breng op dag 12 PBMC's over naar een 96-well plaat (ronde bodem).
- Verwijder het supernatant na centrifugeren (550 × g, 3 min) in een plaat, een wasbeurt tweemaal met 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in een plaat.
OPMERKING: Verwijdering van resterende cytokines en peptiden in de cultuur door herhaald wassen is de belangrijkste stap om de achtergrond in intracellulaire flowcytometrie-analyse te verminderen. Vooral voor resterende peptiden zal het binden aan BLCLs en de achtergrond aanzienlijk vergroten. - Resuspend PBMC's bij elke put met 210 μL volledig kweekmedium.
- Voor de put van PBMC's die zijn gekozen voor epitoopidentificatie, mengt u de aliquot (elk 70 μL) met peptide gepulste BLCLs (3 putten, inclusief 2 achtergrondcontroles).
OPMERKING: Op dag 12 zal het aantal peptidepools uitgebreide PBMC's meestal oplopen tot meer dan 5-7×105 per put, dus de verhouding van PBMC's / BLCLs is ongeveer 6/1 tot 4/1. - Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 6 uur.
- Voeg na 1 uur incubatie Monensin (1,37 μg/ml) toe aan de kweek. Het uiteindelijke volume van het volledige kweekmedium in elke put is 200 μL.
- Flowcytometrie
- Herhaal dezelfde bewerkingen als in stap 4.2.
- Analyse van flowcytometrieresultaten
- Verifieer een peptide als een HLA-DR-beperkt CD4 T-cellen epitoop als PBMC's geïncubeerd met dit peptide gepulseerde BLCLs een frequentie vertonen van cytokine afscheiding CD4 T-cellen ten minste twee keer van de PBMC's geïncubeerd met achtergrondcontroles (peptide pulseren met HLA-DR pre-blocking; DMSO pulserend) (Figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De frequentie van cytokine-afscheidende CD4 T-cellen wordt berekend als de som van zowel enkele producenten als dubbele producenten. Zoals aangetoond in figuur 1,zijn de frequentie van TNF-α die CD4 T-cellen afscheiden en de frequentie van IFN-γ die CD4 T-cellen in background control (DMSO) afscheiden respectievelijk 0,154% en 0,013%. De frequentie van TNF-α die CD4 T-cellen afscheiden en de frequentie van IFN-γ die CD4 T-cellen afscheiden die specifiek zijn voor peptidepool Core11 zijn respectievelijk 0,206 en 0,017, dus zowel TNF-α die CD4 T-celrespons afscheiden als IFN-γ die CD4 T-celrespons voor deze peptidepool afscheiden, worden als negatief beschouwd. De frequentie van TNF-α die CD4 T-cellen afscheiden en de frequentie van IFN-γ die CD4 T-cellen afscheiden specifiek voor peptidepool Core09 zijn respectievelijk 2,715% en 0,973%, dus zowel TNF-α die CD4 T-celrespons afscheiden als IFN-γ die CD4 T-celrespons afscheiden voor deze peptidepool worden als positief beschouwd.
Zoals aangetoond in figuur 2,worden positieve putten aangegeven met een grijze achtergrond. Bij het berekenen van HBV core-specifieke TNF-α het afscheiden van CD4 T-cell response rate, moeten gegevens van peptide pools Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 en Core10 worden opgenomen. Bij het berekenen van HBV core-specifieke IFN-γ het afscheiden van CD4 T-cell response rate, gegevens van peptide pools Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 en Core10 worden opgenomen.
Zoals aangetoond in figuur 3,zijn kandidaat-peptiden voor epitoopidentificatie in rood aangegeven. Core01 heeft het hoogste responspercentage voor zowel TNF-α het afscheiden van CD4 T-cellen als IFN-γ het afscheiden van CD4 T-cellen in kolompeptidepools. Peptiden C1-15, C31-45, C61-75 en C91-105 in deze peptidepool worden ingesteld als kandidaat-peptiden omdat de rijpeptidepools die deze peptiden bevatten ook positieve resultaten laten zien in T-celrespons. De PBMC's uitgebreid met de peptidepools Core07, Core08, Core09 en Core10 worden gebruikt voor epitoopidentificatie van respectievelijk peptiden C1-15, C31-45, C61-75 en C91-105. Core09 heeft het hoogste responspercentage voor zowel TNF-α die CD4 T-cellen afscheiden als IFN-γ die CD4 T-cellen in rijpeptidepools afscheiden. Peptiden C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 en C86-100 in deze peptidepool worden ingesteld als kandidaat-peptiden omdat de kolompeptidepools die deze peptiden bevatten ook een positief resultaat in T-celrespons laten zien. De PBMC's uitgebreid met de peptidepools Core01, Core02, Core03, Core04, Core05 en Core06 worden gebruikt voor epitoopidentificatie van respectievelijk peptiden C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 en C86-100.
Zoals aangetoond in figuur 4, voor peptidepool Core08 uitgebreide PBMC's, na stimulatie met peptide C31-45 gepulste BLCLs, zijn de frequentie van TNF-α afscheidende CD4 T-cellen en de frequentie van IFN-γ afscheidende CD4 T-cellen respectievelijk 0,995% en 0,131%, die meer dan 2 keer hoger zijn dan achtergrondcontroles (peptide C31-45 gepulseerde BLCLs met HLA-DR pre-blocking, DMSO gepulste BLCLs). Zo wordt peptide C31-45 geverifieerd als een HLA-DR beperkt CD4 T-cel epitoop. Voor peptidepool Core10 uitgebreide PBMC's, na stimulatie met peptide C91-105 gepulste BLCLs, de frequentie van TNF-α afscheiding CD4 T-cellen en de frequentie van IFN-γ afscheidende CD4 T-cellen zijn respectievelijk 0,221% en 0,000%, die de 2 keer achtergrondcontroles niet overschrijden (peptide C91-45 gepulseerde BLCLs met HLA-DR pre-blocking, DMSO gepulste BLCLs), dus peptide C91-105 is niet geverifieerd als HLA-DR beperkt CD4 T-cel epitoop.
Figuur 1: Flowcytometrie demonstratie van TNF-α/IFN-γ afscheiding van CD4 T cellen in peptide pools uitgebreide PBMC's na gestimuleerd met hun respectievelijke peptide pools. Klik hier om een grotere versie van dit figuur te bekijken.
Figuur 2: Demonstratie van de analyse HBV core-specific TNF-α/IFN-γ het afscheiden van CD4 T-cellen. De TNF/DMSO en IFN-Ƴ/DMSO geven de verhoudingen aan van de frequenties van TNF-α/IFN-γ die CD4 T-cellen afscheiden in elke put van de peptidepool gestimuleerde PBMC's gedeeld door de frequentie van TNF-α/IFN-γ die CD4 T-cellen afscheiden in de put van DMSO-controle. Grijze achtergrond geeft putjes aan met een positieve CD4 T-cel respons beoordeeld in vergelijking met achtergrondcontrole. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Demonstratie van de screening van kandidaat-peptiden voor epitoopidentificatie. De TNF/DMSO en IFN-Ƴ/DMSO geven de verhoudingen aan van de frequenties van TNF-α/IFN-γ die CD4 T-cellen afscheiden in elke put van de peptidepool gestimuleerde PBMC's gedeeld door de frequentie van TNF-α/IFN-γ die CD4 T-cellen afscheiden in de put van DMSO-controle. Grijze achtergrond geeft putjes aan met een positieve CD4 T-cel respons beoordeeld in vergelijking met achtergrondcontrole. Peptiden in rood duiden op kandidaat-peptiden volgens de screeningscriteria. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Flowcytometrie demonstratie van epitoop identificatie resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritieke stappen in dit protocol worden als volgt opgesomd: 1) voldoende PBMC's met een hoge levensvatbaarheid om pbmc-uitbreiding te starten; 2) geschikte omgeving voor pbmc-uitbreiding; en 3) volledige verwijdering van resterende peptidepools in PBMC-cultuur vóór epitoopidentificatie.
Alle analyse in dit protocol hangt af van de robuuste proliferatie van CD4 T-cellen. Over het algemeen zal het aantal PBMC's na 10-daagse uitbreiding 2-3 keer het oorspronkelijke aantal zijn. Het celnummer en de levensvatbaarheid van PBMC's zijn 2 belangrijke factoren bij de uitbreiding van PBMC's. Als het doel alleen is om HBV-specifieke CD4 T-cellen te analyseren zonder epitoopidentificatie, is het redelijk om het initiële PBMC-aantal te verminderen, vooral wanneer het volume bloedmonster beperkt is. Terwijl, in onze ervaring, succesvolle PBMC-uitbreiding nauwelijks kan worden verkregen als het startnummer van PBMC's lager is dan 1,5×105 cellen / put. Bij het gebruik van verse PBMC's voor uitbreiding zal de levensvatbaarheid van de cel geen probleem zijn. Terwijl bij het gebruik van gecryopreserveerde PBMC's voor expansie, de cryopreservatie en het ontdooien van PBMC's zeer zorgvuldig moet worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid van PBMC's te behouden.
In functionele analyse van HBV-specifieke T-cellen wordt IL-12 meestal gebruikt in PBMC-uitbreiding om de functie van CD8 T-cellen te verbeteren. Aangezien IL-12 differentiatie van CD4 T-cellen naar CD4 T folliculaire helpercellen kan induceren, moet dit cytokine worden vermeden bij functionele analyse van HBV-specifieke CD4 T-cellen. In ons protocol worden alleen IL-2 (voor T-celexpansie) en IL-7 (voor T-celoverleving) aangevuld om het functionele profiel van HBV-specifieke CD4 T-cellen tijdens expansie zo intact mogelijk te houden. We hebben 5 cytokines getest voor functionele analyse van HBV-specifieke CD4 T-cellen: TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 en IL-21. In onze geanalyseerde monsters zijn TNF-α en IFN-γ 2 belangrijke cytokines die worden uitgescheiden door HBV-specifieke CD4 T-cellen16. Bij het analyseren van het functionele profiel van HBV-specifieke CD4 T-cellen, wordt aanbevolen om zoveel mogelijk cytokines te testen om de gedetailleerde functionele profielinformatie te verkrijgen. Terwijl in epitoop identificatie, wordt het aanbevolen om alleen TNF-α en IFN-γ te analyseren, voor economische overweging.
Voldoende HBV-specifieke CD4 T-cellen zijn van vitaal belang voor een succesvolle epitoopidentificatie, dus epitoopidentificatie moet worden overwogen bij patiënten met een hoge HBV-specifieke CD4 T-celrespons, zoals hepatitis B-flarepatiënten (sterke HBV-specifieke TNF-α afscheiding van CD4 T-celrespons) en patiënten met virale klaring (sterke HBV-specifieke IFN-γ CD4 T-celrespons)16 . Het is erg belangrijk om resterende peptiden in de peptidepool geëxpandeerde PBMC's te verwijderen door herhaaldelijk te wassen voordat deze cellen worden geïncubeerd met BLCLs voor epitoopidentificatie. De resterende peptiden zullen binden aan DMSO gepulste BLCLs, peptide-specifieke CD4 T-cellen activeren en hierdoor de achtergrond in grote mate vergroten.
Sommige HBV-antigeen heeft variabele sequenties in verschillende HBV-genotypen (bijv. HBV-oppervlakteantigeen). Een oplossing is om de specifieke HBV-genotypen bij patiënten vooraf te bepalen en HBV-genotypespecifieke peptidepools te ontwerpen voor patiënten met verschillende HBV-genotypen. Hoewel het HBV-genotype niet meetbaar is bij patiënten met een lage HBV-virale lading (bijv. HBeAg-negatieve patiënten met regelmatige antivirale behandeling), is de oplossing in dit scenario om peptiden van verschillende HBV-genotypen samen te mengen in dezelfde peptidepools, zoals we deden in een eerdere studie16. Een nadeel van deze mengselstrategie is dat epitoop kan worden geïdentificeerd als een peptidepaar, maar niet als een enkel peptide, omdat sommige posities in de peptidenmatrix een peptidepaar bevatten in hetzelfde fragment van het antigeen.
Een groot nadeel van deze methode is de tijdrovende 10-daagse PBMC-uitbreiding. Momenteel kon ex vivo analyse van cytokinesecretie hbv-specifieke CD4 T-cellen niet op een betrouwbare manier detecteren. Met behulp van peptide gepulste allogene BLCLs als stimulatoren detecteerde meestal meer peptide-specifieke CD4 T-cellen in peptide-geëxpandeerde PBMC's, vergeleken met eenvoudig stimuleren met peptiden16. Het is de moeite waard om te onderzoeken of het gebruik van peptide gepulste autologe B-cellen als antigeenpresentatiecellen kan helpen om HBV-specifieke CD4 T-cellen ex vivo betrouwbaar te detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) en Chinese Key
Project Gespecialiseerd voor Infectieziekten (2018ZX10723203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
- Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
- Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
- Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
- Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
- Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
- Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
- Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
- Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
- Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
- de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
- Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
- Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).
