Summary
Sobre la base de una matriz peptídica derivada del virus de la hepatitis B (VHB), las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB podrían evaluarse en paralelo con la identificación de epítopos de células T CD4 específicas del VHB.
Abstract
Las células T CD4 juegan un papel importante en la patogénesis de la hepatitis B crónica. Como población celular versátil, las células T CD4 se han clasificado como subconjuntos funcionales distintos en función de las citoquinas que secretaron: por ejemplo, IFN-γ para las células CD4 T helper 1, IL-4 e IL-13 para las células CD4 T helper 2, IL-21 para las células auxiliares foliculares CD4 T y LA IL-17 para las células CD4 T helper 17. El análisis de las células T CD4 específicas del virus de la hepatitis B (VHB) basadas en la secreción de citoquinas después de la estimulación de péptidos derivados del VHB podría proporcionar información no solo sobre la magnitud de la respuesta de las células T CD4 específicas del VHB, sino también sobre los subconjuntos funcionales de las células T CD4 específicas del VHB. Los enfoques novedosos, como la transcriptómica y el análisis metabolómico, podrían proporcionar información funcional más detallada sobre las células T CD4 específicas del VHB. Estos enfoques generalmente requieren el aislamiento de células T CD4 viables específicas del VHB basadas en multómeros del complejo II de histocompatibilidad mayor peptídico, mientras que actualmente la información sobre los epítopos de células T CD4 específicas del VHB es limitada. Sobre la base de una matriz peptídica derivada del VHB, se ha desarrollado un método para evaluar las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificar epítopos de células T CD4 específicas del VHB simultáneamente utilizando muestras de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con infección crónica por VHB.
Introduction
Actualmente, hay 3 enfoques principales para analizar las células T específicas del antígeno. El primer enfoque se basa en la interacción entre el receptor de células T y el péptido (epítopo). Las células T específicas del antígeno podrían teñirse directamente con multómeros del complejo de histocompatibilidad peptídico mayor (MHC). La ventaja de este método es que podría obtener células T viables específicas de antígenos, adecuadas para el análisis transcriptómico / metabolómico posterior. Una limitación de este método es que no pudo proporcionar información sobre toda la respuesta de las células T a un antígeno específico, ya que requiere péptidos de epítopo validados, mientras que el número de epítopos identificados para un antígeno específico es limitado por ahora. En comparación con los epítopos de células T CD8 específicos del virus de la hepatitis B (VHB), se han identificado menos epítopos de células T CD4 específicos del VHB1,2, lo que hizo que este método fuera menos aplicable para el análisis de células T CD4 específicas del VHB actualmente.
El segundo enfoque se basa en la regulación al alza de una serie de marcadores inducidos por activación después de la estimulación peptídica del antígeno3. Los marcadores comúnmente utilizados incluyen CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Este método se ha utilizado ahora para analizar las respuestas de células T específicas de antígenos en individuos vacunados5,6,pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana7y pacientes con infección por coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo8,9. A diferencia del ensayo basado en multómeros péptidos-MHC, este método no está restringido por epítopos validados y podría obtener células viables para el análisis posterior. Una limitación de este método es que no pudo proporcionar información sobre el perfil de citoquinas de las células T específicas del antígeno. Además, la expresión de estos marcadores inducidos por la activación por algunas células no específicas de antígeno activado podría contribuir a las señales de fondo en el análisis, lo que podría ser un problema, especialmente cuando las células T específicas del antígeno objetivo son raras. Actualmente, existe una aplicación limitada de este método en las células T CD4 específicas delVHB 4. Si este método podría utilizarse para analizar las células T CD4 específicas del VHB de una manera confiable necesita más investigación.
El tercer enfoque se basa en la secreción de citoquinas después de la estimulación del péptido antígeno. Al igual que el análisis basado en marcadores inducidos por activación, este método no está restringido por epítopos validados. Este método podría revelar directamente el perfil de citoquinas de las células T específicas del antígeno. La sensibilidad de este método es menor que el método basado en marcadores inducidos por activación, ya que se basa en la secreción de citoquinas de células T específicas de antígenos y el número de citoquinas analizadas suele ser limitado. Actualmente, este método es ampliamente utilizado en el análisis de células T específicas del VHB. Como las células T específicas del VHB secretas de citoquinas difícilmente podrían detectarse mediante la estimulación directa del péptido ex vivo10,11, el perfil de citoquinas de las células T específicas del VHB generalmente se analiza después de 10 días de expansión estimulada por péptidos in vitro12,13,14,15,16. La disposición de grupos de péptidos en forma de matriz se ha utilizado para facilitar la identificación de epítopos específicos de antígenos17,18. Con la combinación de la matriz peptídica y el análisis de secreción de citoquinas, se ha desarrollado un método para evaluar las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificar los epítopos de células T CD4 específicas del VHB simultáneamente16. En este protocolo, se describen los detalles de este método. El antígeno central del VHB se elige como ejemplo de demostración en este protocolo.
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Protocol
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente incluido en el estudio. El protocolo del estudio se ajusta a las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975 reflejadas en la aprobación a priori del comité de ética médica del Southwest Hospital.
1. Diseño de la matriz peptídica derivada del VHB
- Descargue secuencias de aminoácidos del antígeno central del VHB de las bases de datos del NCBI (GenBank: AFY98989.1).
- Compre péptidos derivados del antígeno central del VHB (un panel de 35 péptidos 15-mer superpuestos por 10 residuos, pureza > 90%, 4 mg / péptido) de un proveedor de servicios de síntesis de péptidos.
- Establezca una matriz peptídica cuadrada 6×6 con cada posición en la matriz que contenga solo 1 péptido. Hay 12 grupos de péptidos: 6 grupos de péptidos de fila y 6 grupos de péptidos de columna, 5-6 péptidos en cada grupo16. Las agrupaciones de péptidos de fila y las piscinas de péptidos de columna en la matriz representan 2 formaciones separadas de antígeno central del VHB.
- Para 3/4 de los péptidos comprados, mezcle péptidos en la misma fila / columna de la matriz en 12 grupos de péptidos separados disolviéndolos juntos en dimetilsulfóxido (DMSO) (2 μg / μL para cada péptido). Conservar a -80 °C para el análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB.
- Disolver el resto de los péptidos por separado (10 μg/μL) y almacenar a -80 °C para la identificación del epítopo.
2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
- Muestra de 5 ml de sangre venosa de pacientes con infección crónica por VHB.
NOTA: El volumen de sangre debe estimarse aproximadamente de acuerdo con el número de grupos de péptidos más 1 control de fondo y 1 control positivo. El análisis de 1 grupo de péptidos necesita 3 x10 5 PBMCs. En promedio, se pudo obtener 1 x10 6 PBMCs a partir de 1 mL de sangre. - Aislar PBMCs de la sangre usando centrifugación por gradiente de densidad Ficoll (800 × g, 20 min) y criopreservar PBMCs aislados en nitrógeno líquido para su uso posterior.
- Use una pipeta Pasteur para recolectar granulocitos entre la capa transparente de Ficoll y la capa de glóbulos rojos. Extraiga ADN genómico de granulocitos utilizando un kit de purificación de ADN genómico de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Envíe la muestra de ADN a los proveedores de servicios de genotipado para determinar el genotipo HLA-DRB1.
3. Expansión in vitro de PBMC utilizando una matriz peptídica del VHB
- Descongelar pbMCs.
- RPMI 1640 caliente suplementado con 1:10.000 benzonasa (25 U/mL) a 37 °C en un baño de agua.
NOTA: La benzonasa ayuda a limitar la aglomeración celular durante la descongelación. Cada muestra requerirá 20 ml de RPMI 1640 con benzonasa. Calcule la cantidad necesaria para descongelar todas las muestras y prepare una alícuota separada de medios (37 °C) con 1:10.000 benzonasa (25 U/mL). Descongele no más de 5 muestras a la vez. - Retire las muestras de nitrógeno líquido y descongele rápidamente los viales congelados en un baño de agua (37 °C).
- Transfiera la suspensión de la célula descongelada a un tubo centrífugo de 15 ml. Añadir 1 ml de benzonasa RPMI 1640 (37 °C) gota a gota al tubo. Agregue lentamente 6 ml de Benzonasa RPMI 1640 (37 ° C) al tubo de la centrífuga, enjuague criovial con otros 2 ml de Benzonasa RPMI 1640 (37 ° C) para recuperar todas las células. Continuar con el resto de las muestras lo más rápido posible.
NOTA: La dilución lenta de las muestras criopreservadas es la clave para mantener la viabilidad de las células descongeladas. - Centrifugar (400 × g, 10 min), retire el sobrenadante y afloje el pellet golpeando el tubo.
- Resuspenda suavemente el pellet en 1 ml de Benzonase RPMI 1640 caliente. Mezcle suavemente y filtre las células a través de un colador de células de 70 μm si es necesario (es decir, si existe algún grupo visible).
- Alícuota una suspensión de 10 μL y diluya en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, agregue azul de tripano (0.04%), cargue en un hemocitómetro, espere 1 min y cuente el número de células viables (células claras).
- Agregue 9 ml de benzonasa RPMI 1640 (37 ° C) al tubo, centrífuga (400 × g, 10 min), retire el sobrenadante y afloje el pellet golpeando el tubo.
- RPMI 1640 caliente suplementado con 1:10.000 benzonasa (25 U/mL) a 37 °C en un baño de agua.
- PBMCs de resuspend en RPMI 1640 suplementados con 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 10% de suero AB humano (medio de cultivo completo). Ajuste la densidad celular a 1.5 x 106 celdas/ml. Placa PBMCs en placas de 96 pozos (fondo plano) a una densidad de 3 x 105 celdas/pozo.
- Agregue grupos de péptidos derivados del VHB (2 μg/ml por cada péptido individual) a cada polo. Para pozos de control de fondo y control positivo, agregue la misma cantidad de disolvente (DMSO, 1 μL/mL). Añadir 10 U/mL IL-2 y 10 ng/mL IL-7. Incubar a 37 °C y 5% CO2.
- En el día 3, suplementar el medio de cultivo con 50 U/mL de IL-2 y 10 ng/mL de IL-7.
NOTA: Durante el día 1 al día 3, no se observará una proliferación obvia de células T. El número total de células generalmente disminuirá de 1/3 a 1/2, debido a la muerte de células no T como las células B, las células NK, las células NKT y los monocitos. - En el día 7, reemplace la mitad del medio de cultivo con medio fresco que contenga péptidos (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) e IL-7 (20 ng/mL).
NOTA: Para evitar perturbar las células en la parte inferior, pipetee cuidadosamente unos 90 μL de medio de cultivo desde la parte superior del medio. Durante el día 3 al día 7, se observará una proliferación robusta de células T, y las células T que proliferan generalmente se agregan para formar grupos. - En el día 10, pipetee suavemente el cultivo celular en cada pozo 7-9 veces para desagregar los grupos celulares, contar el número de células viables y transferir 2×105 células en cada pozo a una placa de 96 pozos (fondo redondo) para el análisis de la respuesta de células T CD4 específicas del VHB.
- Continúe cultivando el resto de células para la identificación del epítopo en el día 12, ajuste el volumen del medio de cultivo a 100 μL (descartando el medio excesivo) y complemente el cultivo con 100 μL de medio de cultivo completo fresco que contenga péptidos (4 μg / ml), IL-2 (100 U / ml) e IL-7 (20 ng / ml).
NOTA: Durante el día 7 al día 10, las células T continúan proliferando vigorosamente. Reemplace el medio de cultivo como en el paso 3.5 si el medio se vuelve amarillo. En general, el número de celdas superará el 6×105 al día 10. Cada pozo generalmente muestra un número de celda similar, cuenta el número de celda en 3 pozos y usa el valor promedio como una estimación del número de celdas para todos los pozos.
4. Análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB mediante citometría de flujo intracelular
- Estimulando PBMCs con grupos de péptidos
- Para las células transferidas a la placa de 96 pozos (fondo redondo), lavar 3 veces en una placa (550 × g, 3 min). Utilice 200 μL de medio para cada lavado (RPMI 1640 para los primeros 2 lavados, medio de cultivo completo para el último lavado). Descarta los sobrenadantes.
NOTA: La eliminación de citoquinas residuales en el cultivo mediante lavado repetido podría disminuir efectivamente el fondo en el análisis de citometría de flujo intracelular. - Para cada poto de células estimuladas con un grupo de péptidos específico, agregue 200 μL de medio de cultivo completo suplementado con los mismos grupos de péptidos (2 μg / ml para cada péptido individual). Para el pozo de control de fondo, agregue un medio de cultivo completo complementado con 1 μL / ml de DMSO. Para el pozo de control positivo, agregue un medio de cultivo completo suplementado con 1 μL / ml de DMSO, 150 ng / ml de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y 1 μmol / L de ionomicina.
NOTA: Una dosis alta de DMSO bloqueará la secreción de citoquinas de las células T (más importante para el TNF-α). No se recomienda una dosis de DMSO superior a 5 μL/ml. Generalmente, la dosis de DMSO en nuestro experimento no supera 1 μL/mL. - Incubar a 37 °C y 5% CO2 durante 6 h.
- Después de 1 h de incubación, añadir Monensin (1,37 μg/ml) al cultivo.
- Para las células transferidas a la placa de 96 pozos (fondo redondo), lavar 3 veces en una placa (550 × g, 3 min). Utilice 200 μL de medio para cada lavado (RPMI 1640 para los primeros 2 lavados, medio de cultivo completo para el último lavado). Descarta los sobrenadantes.
- Citometría de flujo
- Después de 6 h de incubación. Retire el sobrenadante después de la centrifugación (550 × g, 3 min), lave las células una vez con 200 μL de DPBS (550 × g, 3 min), manche los marcadores de superficie (CD3, CD4 y CD8) y el marcador de viabilidad (utilizando un tinte de viabilidad fijable) en un refrigerador de 4 °C durante 30 min.
- Lavar una vez con 200 μL de DPBS (550 × g, 3 min). Fijar y permeabilizar células, y teñir citoquinas intracelulares (TNF-α e IFN-γ) en un refrigerador de 4 °C durante 45 min.
- Después del lavado final en tinción intracelular, resuspend las células en 150 μL de tampón de citometría de flujo (DPBS + 0,5% BSA).
- Adquirir datos de citometría de flujo en un citómetro de flujo.
- Análisis de los resultados de la citometría de flujo
- Definición de pozo positivo: considere un pozo como positivo si tiene una frecuencia de células T secretoras de citoquinas al menos dos veces del fondo de control del pozo (Figura 1).
- De acuerdo con la siguiente fórmula, calcule la tasa de respuesta para cada citoquina analizada (Figura 2):
NOTA: El grupo de péptidos de fila y los grupos de péptidos de columna en la matriz representan 2 formaciones distintas de antígeno central del VHB, por lo que la tasa de respuesta final debe dividirse por 2.
5. Identificación de epítopos de células T CD4 restringidas HLA-DR específicas del VHB
- Descongelar y mantener líneas celulares linfoblastoides Alogénicas B (BLCLs) en matraz T-75 (5-20 ×106 células, 20 mL de medio de cultivo completo).
NOTA: Para garantizar el buen estado de los BLCL, este paso debe iniciarse 2 semanas antes de la descongelación de los PBMC de los pacientes. Los BLCL deben ser homocigotos en el alelo HLA-DRB1. De acuerdo con el resultado del genotipado, los pacientes deben compartir el mismo alelo HLA-DRB1 que los BLCL. - Cribado de péptidos candidatos para su identificación (Figura 3)
- De acuerdo con los resultados de la tasa de respuesta de las células T en el día 10, evalúe 2 grupos de péptidos con la tasa de respuesta más alta (1 grupo de péptidos de fila y 1 grupo de péptidos de columna).
- Establezca el péptido en esos 2 grupos como un péptido candidato si el otro grupo de péptidos que contiene este péptido también muestra un resultado positivo en el análisis de respuesta de las células T. Utilice los PBMC expandidos con el otro grupo de péptidos para la identificación del epítopo más adelante.
- BLCL pulsantes con péptido
- En el día 12, cuente el número de VLCL viables, transfiera las células a 15 ml de tubos de centrífuga, centrífuga (350 × g, 10 min) y retire el sobrenadante. Resuspónda el pellet celular en medio de cultivo completo y Alícuota BLCLs a una placa de 96 pozos (fondo redondo) a 4×104 células/pozo en medio de cultivo completo de 80 μL.
- Añadir un solo péptido (10 μg/mL), incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 2 h. Set 2 control de fondo: pulsación peptídica con bloqueo HLA-DR (pretratamiento con anti-HLA-DR (10 μg/mL) durante 1 h); DMSO (1 μL/mL) pulsante. El volumen final del medio de cultivo completo en cada pozo es de 100 μL.
- Añadir mitomicina C (100 μg/mL), incubar a 37 °C y 5% DECO 2 durante 1 h.
- Lavar 3 veces con 200 μL de RPMI 1640 (550 × g, 3 min) en una placa para eliminar el péptido no pulsado y la mitomicina C. Para el primer lavado, complemente el cultivo de incubación con 100 μL de RPMI 1640.
- Resuspend células en 120 μL de medio de cultivo completo.
- Estimulantes de PBMC con BLCL pulsados peptídicos.
- En el día 12, transfiera PBMC a una placa de 96 pozos (fondo redondo).
- Retire el sobrenadante después de la centrifugación (550 × g, 3 min) en un plato, un lavado dos veces con 200 μL de RPMI 1640 (550 × g, 3 min) en un plato.
NOTA: La eliminación de citoquinas y péptidos residuales en el cultivo mediante lavado repetido es el paso clave para disminuir el fondo en el análisis de citometría de flujo intracelular. Especialmente para los péptidos residuales, se unirá a los BLCL y aumentará significativamente el fondo. - Resuspend PBMCs en cada pozo con 210 μL de medio de cultivo completo.
- Para el pozo de PBMC elegido para la identificación del epítopo, mezcle la alícuota (70 μL cada uno) con PÉptidos pulsados BLCL (3 pozos, incluidos 2 controles de fondo).
NOTA: En el día 12, el número de grupos de péptidos de PBMC expandidos generalmente alcanzará por encima de 5-7×105 por pozo, por lo que la proporción de PBMC / BLCL es de aproximadamente 6/1 a 4/1. - Incubar a 37 °C y 5% CO2 durante 6 h.
- Después de 1 h de incubación, añadir Monensin (1,37 μg/ml) al cultivo. El volumen final del medio de cultivo completo en cada pozo es de 200 μL.
- Citometría de flujo
- Repita las mismas operaciones que en el paso 4.2.
- Análisis de los resultados de la citometría de flujo
- Verificar un péptido como un epítopo de células T CD4 restringidas por HLA-DR si los PBMC incubados con este péptido pulsado BLCL muestran una frecuencia de citoquinas secretando células T CD4 al menos dos veces de los PBMC incubados con controles de fondo (péptido pulsando con prebloqueo HLA-DR; DMSO pulsante) (Figura 4).
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Representative Results
La frecuencia de las células T CD4 secretoras de citoquinas se calcula como la suma de productores simples y productores dobles. Como se demuestra en la Figura 1,la frecuencia de las células T CD4 secretoras de α TNF-y la frecuencia de las células T CD4 secretoras de IFN-γ en el control de fondo (DMSO) son del 0,154% y 0,013% respectivamente. La frecuencia de TNF-α secretando células T CD4 y la frecuencia de IFN-γ secretando células T CD4 específicas para el grupo de péptidos Core11 son 0.206 y 0.017 respectivamente, por lo que tanto TNF-α secretando la respuesta de células T CD4 como ifN-γ secretando respuesta de células T CD4 para este grupo de péptidos se consideran negativos. La frecuencia de TNF-α secretando células T CD4 y la frecuencia de IFN-γ secretando células T CD4 específicas para el grupo de péptidos Core09 son 2.715% y 0.973% respectivamente, por lo que tanto TNF-α secretando la respuesta de células T CD4 como ifN-γ secretando respuesta de células T CD4 para este grupo de péptidos se consideran positivos.
Como se demuestra en la Figura 2,los pozos positivos se indican con fondo gris. Al calcular el TNF-α la tasa de respuesta de células T CD4 específica del núcleo del VHB, se deben incluir datos de grupos de péptidos Core01, Core02, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 y Core10. Al calcular el IFN-γ la tasa de respuesta de células T CD4 específica del núcleo del VHB, se incluyen datos de grupos de péptidos Core01, Core02, Core03, Core04, Core05, Core06, Core07, Core08, Core09 y Core10.
Como se demuestra en la Figura 3,los péptidos candidatos para la identificación de epítopos están indicados en rojo. Core01 tiene la tasa de respuesta más alta tanto para las células T CD4 secretoras de TNF-α como para las células T CD4 secretoras de IFN-γ en grupos de péptidos en columna. Los péptidos C1-15, C31-45, C61-75 y C91-105 en este grupo de péptidos se establecen como péptidos candidatos, ya que los grupos de péptidos en fila que contienen esos péptidos también muestran resultados positivos en la respuesta de las células T. Los PBMC expandidos con las agrupaciones de péptidos Core07, Core08, Core09 y Core10 se utilizan para la identificación de epítopos de péptidos C1-15, C31-45, C61-75 y C91-105, respectivamente. Core09 tiene la tasa de respuesta más alta tanto para las células T CD4 secretoras de TNF-α como para las células T CD4 secretoras de IFN-γ en grupos de péptidos en fila. Los péptidos C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 y C86-100 en este grupo de péptidos se establecen como péptidos candidatos, ya que los grupos de péptidos de columna que contienen esos péptidos también muestran un resultado positivo en la respuesta de las células T. Los PBMC expandidos con las agrupaciones de péptidos Core01, Core02, Core03, Core04, Core05 y Core06 se utilizan para la identificación de epítopos de péptidos C61-75, C66-80, C71-85, C76-90, C81-95 y C86-100, respectivamente.
Como se demuestra en la Figura 4,para los PBMC expandidos del grupo de péptidos Core08, después de la estimulación con péptidos C31-45 BLCL pulsados, la frecuencia de TNF-α secretando células T CD4 y la frecuencia de IFN-γ secretando células T CD4 son 0.995% y 0.131% respectivamente, que son más de 2 veces más altas que los controles de fondo (péptido C31-45 BLCL pulsados con prebloqueo HLA-DR, MLLC pulsadas DMSO). Por lo tanto, el péptido C31-45 se verifica como un epítopo de células T CD4 restringidas por HLA-DR. Para los PBMC expandidos de la piscina peptídica Core10, después de la estimulación con péptidos C91-105 BLCL pulsados, la frecuencia de TNF-α secretando células T CD4 y la frecuencia de IFN-γ secretando células T CD4 son 0.221% y 0.000% respectivamente, que no exceden las 2 veces de los controles de fondo (péptidos C91-45 BLCL pulsados con prebloqueo HLA-DR, HZCL pulsados DMSO), por lo que el péptido C91-105 no se verifica como epítopo de células T CD4 restringido por HLA-DR.
Figura 1: Demostración de citometría de flujo de TNF-α/IFN-γ secretando células T CD4 en grupos de péptidos PBMC expandidos después de ser estimulados con sus respectivos grupos de péptidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Demostración del análisis de TNF-α/IFN-γ del núcleo específico del VHB de células T CD4. El TNF/DMSO y el IFN-Ƴ/DMSO indican las proporciones de las frecuencias de TNF-α/IFN-γ secretando células T CD4 en cada pozo de PBMC estimulados por la reserva peptídica divididos por la frecuencia de TNF-α/IFN-γ secretando células T CD4 en el pozo de control DMSO. El fondo gris indica pozos con respuesta positiva de células T CD4 juzgada por comparación con el control de fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Demostración del cribado de péptidos candidatos para la identificación de epítopos. El TNF/DMSO y el IFN-Ƴ/DMSO indican las proporciones de las frecuencias de TNF-α/IFN-γ secretando células T CD4 en cada pozo de PBMC estimulados por la reserva peptídica divididos por la frecuencia de TNF-α/IFN-γ secretando células T CD4 en el pozo de control DMSO. El fondo gris indica pozos con respuesta positiva de células T CD4 juzgada por comparación con el control de fondo. Los péptidos en rojo indican péptidos candidatos de acuerdo con los criterios de selección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Demostración de citometría de flujo de los resultados de identificación de epítopos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos más críticos en este protocolo se enumeran a continuación: 1) suficientes PBMC de alta viabilidad para iniciar la expansión de PBMCs; 2) entorno apropiado para la expansión de pbMC; y 3) eliminación completa de grupos de péptidos residuales en cultivo de PBMC antes de la identificación del epítopo.
Todo el análisis en este protocolo depende de la proliferación robusta de células T CD4. En general, el número de PBMC después de la expansión de 10 días será de 2 a 3 veces el número inicial. El número de células y la viabilidad de los PBMC son 2 factores clave en la expansión de los PBMC. Si el propósito es solo analizar las células T CD4 específicas del VHB sin identificación de epítopos, es razonable reducir el número inicial de PBMC, especialmente cuando el volumen de la muestra de sangre es limitado. Mientras que, en nuestra experiencia, la expansión exitosa de PBMCs apenas podría obtenerse si el número inicial de PBMCs está por debajo de 1.5×105 celdas/pozo. Cuando se utilizan PBMC frescos para la expansión, la viabilidad celular no será un problema. Mientras que cuando se utilizan PBMC criopreservados para la expansión, la criopreservación y descongelación de PBMC debe llevarse a cabo con mucho cuidado para mantener la viabilidad de los PBMC.
En el análisis funcional de células T específicas del VHB, la IL-12 se usa generalmente en la expansión de PBMCs para mejorar la función de las células T CD8. Como la IL-12 podría inducir la diferenciación de las células T CD4 hacia las células auxiliares foliculares T CD4, esta citoquina debe evitarse en el análisis funcional de las células T CD4 específicas del VHB. En nuestro protocolo, solo la IL-2 (para la expansión de las células T) y la IL-7 (para la supervivencia de las células T) se complementan para mantener el perfil funcional de las células T CD4 específicas del VHB durante la expansión lo más intacto posible. Hemos probado 5 citoquinas para el análisis funcional de células T CD4 específicas del VHB: TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-17 e IL-21. En nuestras muestras analizadas, TNF-α e IFN-γ son 2 citoquinas principales secretadas por células T CD4 específicas del VHB16. Al analizar el perfil funcional de las células T CD4 específicas del VHB, se recomienda probar tantas citoquinas como sea posible para obtener la información detallada del perfil funcional. Mientras que en la identificación del epítopo, se recomienda analizar solo el TNF-α y el IFN-γ, para consideración económica.
Suficientes células T CD4 específicas del VHB son vitales para la identificación exitosa del epítopo, por lo que la identificación del epítopo debe considerarse en pacientes con alta respuesta de células T CD4 específica del VHB, como los pacientes con brotes de hepatitis B (fuerte TNF-α secreto de la respuesta de células T CD4) y los pacientes con aclaramiento viral (respuesta fuerte de células T CD4 específicas γ del VHB)16 . Es muy importante eliminar los péptidos residuales en el grupo de péptidos pbmc expandidos mediante el lavado repetido antes de incubar estas células con BLCL para la identificación del epítopo. Los péptidos residuales se unirán a las VLLC pulsadas DMSO, activarán las células T CD4 específicas del péptido, por lo tanto, aumentarán el fondo en gran medida.
Algunos antígenos del VHB tienen secuencias variables en diferentes genotipos del VHB (por ejemplo, antígeno de superficie del VHB). Una solución es prea determinar los genotipos específicos del VHB en pacientes y diseñar grupos de péptidos específicos del genotipo del VHB para pacientes con diferentes genotipos del VHB. Si bien el genotipo del VHB no es medible en pacientes con cargas virales bajas del VHB (por ejemplo, pacientes HBeAg negativos con tratamiento antiviral regular), en este escenario, la solución es mezclar péptidos de diferentes genotipos del VHB en los mismos grupos de péptidos, como lo hicimos en un estudio anterior16. Un inconveniente de esta estrategia de mezcla es que el epítopo podría identificarse como un par de péptidos pero no como un solo péptido, ya que algunas posiciones en la matriz de péptidos contienen un par de péptidos en el mismo fragmento del antígeno.
Un inconveniente importante en este método es la expansión de PBMC de 10 días que consume mucho tiempo. Actualmente, el análisis ex vivo de la secreción de citoquinas no pudo detectar las células T CD4 específicas del VHB de una manera confiable. El uso de PÉptidos alogénicos pulsados de péptidos como estimuladores generalmente detectó más células T CD4 específicas de péptidos en PBMC expandidos de péptidos, en comparación con simplemente estimular con péptidos16. Vale la pena investigar si el uso de células B autólogas pulsadas peptídicas como células de presentación de antígenos podría ayudar a detectar de manera confiable las células T CD4 específicas del VHB ex vivo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81930061), la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) y Chinese Key
Proyecto Especializado en Enfermedades Infecciosas (2018ZX10723203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
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