We ontwikkelden geautomatiseerde computer vision software om exocytische gebeurtenissen te detecteren die worden gekenmerkt door pH-gevoelige fluorescentiesondes. Hier demonstreren we het gebruik van een grafische gebruikersinterface en RStudio om fusiegebeurtenissen te detecteren, spatiotemporale parameters van fusie te analyseren en weer te geven en gebeurtenissen in verschillende fusiemodi te classificeren.
Timelapse TIRF-microscopie van pH-gevoelige GFP (pHluorine) verbonden aan blaasjes SNARE-eiwitten is een effectieve methode om exocytische gebeurtenissen in het celkweek van één blaasje te visualiseren. Om een onbevooroordeete, efficiënte identificatie en analyse van dergelijke gebeurtenissen uit te voeren, werd een computervisiegebaseerde aanpak ontwikkeld en geïmplementeerd in MATLAB. De analyse pijplijn bestaat uit een algoritme voor cel segmentatie en exocytische gebeurtenis identificatie. De computervisiebenadering omvat hulpmiddelen voor het onderzoeken van meerdere parameters van afzonderlijke gebeurtenissen, waaronder de halfwaardetijd van fluorescentiebederf en piek ΔF/F, evenals analyse van de frequentie van exocytose in hele cellen. Deze en andere parameters van fusie worden gebruikt in een classificatiebenadering om verschillende fusiemodi te onderscheiden. Hier voert een nieuw gebouwde GUI de analysepijplijn van begin tot eind uit. Verdere aanpassing van Ripley’s K-functie in R Studio wordt gebruikt om onderscheid te maken tussen geclusterde, verspreide of willekeurige voorkomen van fusiegebeurtenissen in zowel ruimte als tijd.
VAMP-pHluorine constructen of transferrine receptor (TfR)-pHuji constructies zijn uitstekende markers van exocytische gebeurtenissen, omdat deze pH-gevoelige fluoroforen worden gedoofd in het zure blaasje lumen en fluoresce onmiddellijk na fusie porie opening tussen het blaasje en plasmamembraan1. Na het openen van de fusieporiën vergaat fluorescentie exponentieel, met enige heterogeniteit die informatie over de fusiegebeurtenis onthult. Hier wordt een GUI-toepassing (Graphical User Interface) beschreven die automatisch exocytische gebeurtenissen detecteert en analyseert. Met deze applicatie kan de gebruiker automatisch exocytische gebeurtenissen detecteren die worden onthuld door pH-gevoelige markers2 en functies genereren van elke gebeurtenis die kan worden gebruikt voor classificatiedoeleinden3 (Figuur 1A). Daarnaast wordt analyse van exocytische gebeurtenisclustering met behulp van ripley’s K-functie beschreven.
De geautomatiseerde classificatie van exocytische gebeurtenissen in verschillende exocytische modi werd onlangs gerapporteerd3. Twee modi van exocytose, full-vesicle fusion (FVF) en kiss-and-run fusion (KNR) exocytose zijn eerder beschreven4,5,6,7. Tijdens FVF verwijdt de fusieporiën en wordt het blaasje opgenomen in het plasmamembraan. Tijdens KNR opent de fusieporiën tijdelijk en hersealen vervolgens4,5,8,9,10. Vier modi van exocytose werden geïdentificeerd in het ontwikkelen van neuronen, twee gerelateerd aan FVF en twee gerelateerd aan KNR. Dit werk toont aan dat zowel FVF als KNR verder kunnen worden onderverdeeld in fusiegebeurtenissen die onmiddellijk overgaan tot fluorescentiebederf (FVFi en KNRi) na het openen van de fusieporiën of exocytische gebeurtenissen die een vertraging vertonen na het openen van de fusieporiën voordat fluorescentieverval begint (FVFd en KNRd) (Figuur 1B). De classificatie identificeert de modus van exocytose voor elke fusiegebeurtenis. Hier is deze analyse opgenomen in een GUI die kan worden geïnstalleerd in MATLAB in Windows- en Mac-gebaseerde besturingssystemen. Alle analysebestanden zijn te vinden op https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing of
https://github.com/GuptonLab.
Houd er bij het gebruik van de exocytische detectie- en analysesoftware rekening mee dat het programma alleen compressie zonder verlies accepteert .tif bestanden als invoer. De .tif afbeeldingsbestanden kunnen 8-bits, 16-bits of 32-bits grijswaardenafbeeldingen (één kanaal) zijn. Andere afbeeldingsindelingen moeten vóór invoer worden geconverteerd naar een van deze typen. Ter referentie, voorbeelden die hier worden gebruikt, zijn 16-bits grijswaardenafbeeldingen.
Inherent aan het geautomat…
The authors have nothing to disclose.
We danken Dustin Revell en Reginald Edwards voor het testen van code en de GUI. De nationale instituten voor gezondheid ondersteunden dit onderzoek: waaronder R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) en F31NS103586 (FLU).
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |