pH’a duyarlı floresan probların işaretlediği eksosit olayları tespit etmek için otomatik bilgisayar görme yazılımı geliştirdik. Burada, füzyon olaylarını tespit etmek, füzyonun mekansal parametrelerini analiz etmek ve görüntülemek ve olayları farklı füzyon modlarında sınıflandırmak için grafiksel bir kullanıcı arayüzü ve RStudio’nun kullanımını gösteriyoruz.
Vezikül SNARE proteinlerine bağlı pH’a duyarlı GFP (pHluorin) timelapse TIRF mikroskopisi, hücre kültüründe tek vezikül ekzosit olaylarını görselleştirmek için etkili bir yöntemdir. Bu tür olayların tarafsız, verimli bir şekilde tanımlanması ve analizini yapmak için MATLAB’da bilgisayar görüşüne dayalı bir yaklaşım geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Analiz ardışık düzeni bir hücre segmentasyonu ve eksosit olay tanımlama algoritması oluşur. Bilgisayarla görme yaklaşımı, floresan çürümesinin yarı ömrü ve ΔF/F zirvesi de dahil olmak üzere tek olayların birden fazla parametresini araştırmak için araçlar ve eksositoz sıklığının tam hücre analizi içerir. Bu ve diğer füzyon parametreleri, farklı füzyon modlarını ayırt etmek için bir sınıflandırma yaklaşımında kullanılır. Burada yeni oluşturulan bir GUI, analiz işlem hattını baştan sona gerçekleştirir. Ripley’in R Studio’daki K işlevinin daha fazla uyarlaması, hem uzay hem de zamandaki füzyon olaylarının kümelenmiş, dağılmış veya rastgele oluşumunu ayırt etmek için kullanılır.
VAMP-pHluorin yapıları veya transferrin reseptörü (TfR)-pHuji yapıları, bu pH’a duyarlı floroforlar veziklin ve plazma zarı arasındaki füzyon gözenek açıklığı üzerine hemen asit veziklin lümeni ve floresan içinde söndürüldüğünden, ekzosit olayların mükemmel belirteçleridir1. Füzyon gözenek açıklığını takiben, floresan katlanarak bozunur ve füzyon olayı hakkında bilgi veren bazı heterojenlikler ortaya çıkardı. Burada, eksosit olayları otomatik olarak algılayan ve analiz eden bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) uygulaması açıklanmıştır. Bu uygulama, kullanıcının pH hassas işaretleyiciler2 tarafından ortaya çıkan ekzositik olayları otomatik olarak algılamasına ve sınıflandırma amacıyla kullanılabilecek her olaydan özellikler oluşturmasına izin verir3 (Şekil 1A). Ek olarak, Ripley’in K işlevi kullanılarak ekzosit olay kümeleme analizi açıklanmıştır.
Ekzosit olayların farklı ekzosit modlarına otomatik sınıflandırılması yakın zamanda bildirilmiştir3. İki eksositoz modu, tam vezikül füzyonu (FVF) ve öpücük ve çalıştırma füzyonu (KNR) eksositozu daha öncetanımlanmıştır 4,5,6,7. FVF sırasında füzyon gözenekleri genişler ve vesicle plazma zarına dahil edilir. KNR sırasında, füzyon gözenekleri geçici olarak açılır ve daha sonra 4 ,5,8,9,10‘u yeniden kaydırır. Gelişen nöronlarda ikisi FVF, ikisi KNR ile ilgili olmak üzere dört eksositoz modu saptandı. Bu çalışma, hem FVF hem de KNR’nin füzyon gözenek açıklığı veya floresan çürümesi başlamadan önce füzyon gözenek açılmasından sonra gecikme gösteren eksosit olaylardan sonra floresan çürümesine (FVFi ve KNRi) hemen ilerleyen füzyon olaylarına daha da bölünebileceğini göstermektedir (FVFd ve KNRd) (Şekil 1B). Sınıflandırıcı, her füzyon olayı için eksositoz modunu tanımlar. Burada bu analiz, Windows ve Mac tabanlı işletim sistemlerinde MATLAB’a yüklenebilen bir GUI’ye dahil edilmiştir. Tüm analiz dosyaları https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing veya
https://github.com/GuptonLab.
Eksosit algılama ve analiz yazılımını kullanırken, lütfen programın yalnızca kayıpsız sıkıştırma .tif dosyalarını giriş olarak kabul ettiğini düşünün. .tif görüntü dosyaları 8 bit, 16 bit veya 32 bit gri tonlamalı (tek kanallı) görüntüler olabilir. Diğer görüntü biçimleri giriş öncesi bu türlerden birine dönüştürülmelidir. Başvuru için, burada kullanılan örnekler 16 bit gri tonlamalı görüntülerdir.
Otomatik algılama işleminin doğasında b…
The authors have nothing to disclose.
Dustin Revell ve Reginald Edwards’a test kodu ve GUI için teşekkür ederiz. R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) ve F31NS103586 (FLU) dahil olmak üzere bu araştırmayı destekleyen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finansman sağlanmıştır.
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |