Automatisert deteksjon og analyse av eksocytose
Summary
Vi utviklet automatisert datasynsprogramvare for å oppdage eksocytiske hendelser preget av pH-sensitive fluorescerende sonder. Her demonstrerer vi bruken av et grafisk brukergrensesnitt og RStudio for å oppdage fusjonshendelser, analysere og vise romlige parametere for fusjon, og klassifisere hendelser i distinkte fusjonsmoduser.
Abstract
Timelapse TIRF mikroskopi av pH-sensitiv GFP (pHluorin) festet til vesicle SNARE proteiner er en effektiv metode for å visualisere enkelt vesicle eksocytiske hendelser i cellekulturen. For å utføre en objektiv, effektiv identifisering og analyse av slike hendelser, ble en datasynsbasert tilnærming utviklet og implementert i MATLAB. Analysepipeline består av en cellesegmenterings- og eksocytisk hendelsesidentifikasjonsalgoritme. Datasynstilnærmingen inkluderer verktøy for å undersøke flere parametere for enkelthendelser, inkludert halveringstiden til fluorescensforfall og topp ΔF / F, samt helcelleanalyse av frekvensen av eksocytose. Disse og andre parametere for fusjon brukes i en klassifiseringstilnærming for å skille forskjellige fusjonsmoduser. Her utfører et nybygd GUI analyserørledningen fra start til slutt. Videre tilpasning av Ripleys K-funksjon i R Studio brukes til å skille mellom grupperte, spredte eller tilfeldige forekomster av fusjonshendelser i både rom og tid.
Introduction
VAMP-pHluorin konstruksjoner eller transferrin reseptor (TfR)-pHuji konstruksjoner er gode markører av eksocytiske hendelser, da disse pH-sensitive fluoroforene slukkes i syre vesicle lumen og fluoresce umiddelbart ved fusjon pore åpning mellom vesicle og plasmamembran1. Etter fusjonsporenes åpning forfaller fluorescens eksponentielt, med noe heterogenitet som avslører informasjon om fusjonshendelsen. Her beskrives et grafisk brukergrensesnittprogram (GUI) som automatisk oppdager og analyserer eksocytiske hendelser. Dette programmet lar brukeren automatisk oppdage eksocytiske hendelser avslørt av pH sensitive markører2 og generere funksjoner fra hver hendelse som kan brukes til klassifiseringsformål3 (Figur 1A). I tillegg beskrives analyse av eksocytiske hendelsesklynger ved hjelp av Ripleys K-funksjon.
Den automatiserte klassifiseringen av eksocytiske hendelser i forskjellige eksocytiske moduser ble nylig rapportert3. To moduser av eksocytose, full-vesicle fusion (FVF) og kiss-and-run fusion (KNR) eksocytose har tidligere blitt beskrevet4,5,6,7. Under FVF utvider fusjonsporene, og vesicle er innlemmet i plasmamembranen. Under KNR åpnes fusjonsporene midlertidig og går deretter på nytt4,5,8,9,10. Fire eksocytoseformer ble identifisert i utviklingen av nevroner, to relatert til FVF og to relatert til KNR. Dette arbeidet viser at både FVF og KNR kan videre deles inn i fusjonshendelser som umiddelbart går videre til fluorescensforfall (FVFi og KNRi) etter fusjonsporeråpning eller eksocytiske hendelser som viser en forsinkelse etter fusjonsporåpning før fluorescensforfall begynner (FVFd og KNRd) (Figur 1B). Klassifisereren identifiserer eksocytosemodusen for hver fusjonshendelse. Her har denne analysen blitt innlemmet i et GUI som kan installeres i MATLAB i Windows- og Mac-baserte operativsystemer. Alle analysefiler finner du på https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing eller
https://github.com/GuptonLab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Når du bruker exocytic deteksjons- og analyseprogramvare, må du vurdere at programmet bare godtar tapsfri komprimering .tif filer som inndata. De .tif bildefilene kan være 8-biters, 16-biters eller 32-biters gråtonebilder (én kanal). Andre bildeformater må konverteres til én av disse typene før inndata. Eksempler som brukes her, er 16-biters gråtonebilder som referanse.
Iboende i den automatiserte deteksjonsprosessen behandles tidsforløpbildesettene for den automatiserte bakgrunnsdel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dustin Revell og Reginald Edwards for testkode og GUI. Støtten ble gitt av National Institutes of Health støttet denne forskningen: inkludert R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) og F31NS103586 (FLU).
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
