Summary
Vi utviklet automatisert datasynsprogramvare for å oppdage eksocytiske hendelser preget av pH-sensitive fluorescerende sonder. Her demonstrerer vi bruken av et grafisk brukergrensesnitt og RStudio for å oppdage fusjonshendelser, analysere og vise romlige parametere for fusjon, og klassifisere hendelser i distinkte fusjonsmoduser.
Abstract
Timelapse TIRF mikroskopi av pH-sensitiv GFP (pHluorin) festet til vesicle SNARE proteiner er en effektiv metode for å visualisere enkelt vesicle eksocytiske hendelser i cellekulturen. For å utføre en objektiv, effektiv identifisering og analyse av slike hendelser, ble en datasynsbasert tilnærming utviklet og implementert i MATLAB. Analysepipeline består av en cellesegmenterings- og eksocytisk hendelsesidentifikasjonsalgoritme. Datasynstilnærmingen inkluderer verktøy for å undersøke flere parametere for enkelthendelser, inkludert halveringstiden til fluorescensforfall og topp ΔF / F, samt helcelleanalyse av frekvensen av eksocytose. Disse og andre parametere for fusjon brukes i en klassifiseringstilnærming for å skille forskjellige fusjonsmoduser. Her utfører et nybygd GUI analyserørledningen fra start til slutt. Videre tilpasning av Ripleys K-funksjon i R Studio brukes til å skille mellom grupperte, spredte eller tilfeldige forekomster av fusjonshendelser i både rom og tid.
Introduction
VAMP-pHluorin konstruksjoner eller transferrin reseptor (TfR)-pHuji konstruksjoner er gode markører av eksocytiske hendelser, da disse pH-sensitive fluoroforene slukkes i syre vesicle lumen og fluoresce umiddelbart ved fusjon pore åpning mellom vesicle og plasmamembran1. Etter fusjonsporenes åpning forfaller fluorescens eksponentielt, med noe heterogenitet som avslører informasjon om fusjonshendelsen. Her beskrives et grafisk brukergrensesnittprogram (GUI) som automatisk oppdager og analyserer eksocytiske hendelser. Dette programmet lar brukeren automatisk oppdage eksocytiske hendelser avslørt av pH sensitive markører2 og generere funksjoner fra hver hendelse som kan brukes til klassifiseringsformål3 (Figur 1A). I tillegg beskrives analyse av eksocytiske hendelsesklynger ved hjelp av Ripleys K-funksjon.
Den automatiserte klassifiseringen av eksocytiske hendelser i forskjellige eksocytiske moduser ble nylig rapportert3. To moduser av eksocytose, full-vesicle fusion (FVF) og kiss-and-run fusion (KNR) eksocytose har tidligere blitt beskrevet4,5,6,7. Under FVF utvider fusjonsporene, og vesicle er innlemmet i plasmamembranen. Under KNR åpnes fusjonsporene midlertidig og går deretter på nytt4,5,8,9,10. Fire eksocytoseformer ble identifisert i utviklingen av nevroner, to relatert til FVF og to relatert til KNR. Dette arbeidet viser at både FVF og KNR kan videre deles inn i fusjonshendelser som umiddelbart går videre til fluorescensforfall (FVFi og KNRi) etter fusjonsporeråpning eller eksocytiske hendelser som viser en forsinkelse etter fusjonsporåpning før fluorescensforfall begynner (FVFd og KNRd) (Figur 1B). Klassifisereren identifiserer eksocytosemodusen for hver fusjonshendelse. Her har denne analysen blitt innlemmet i et GUI som kan installeres i MATLAB i Windows- og Mac-baserte operativsystemer. Alle analysefiler finner du på https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing eller
https://github.com/GuptonLab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Velg datasett og katalog
- Hvis du vil velge datasett for analyse, klikker du Knappen Søk etter datasett (Figur 2A, rød boks 1) for å navigere til mappen der data er deponert (for eksempel RawData-mappen). Datafiler fyller automatisk ut datafilene som en liste. Det kan være mer enn ett datasett i mappen.
- Klikk Velg katalog -knappen, og velg mappen (for eksempel Test) der analyserte filer skal deponeres (Figur 2A, rød boks 2) . Et sett med mapper og ferdige analysefiler samt midlertidige mellomliggende bilder opprettes i denne katalogen når analyseknappen trykkes. Det vil bli produsert feil hvis en mappe ikke er valgt.
2. Angi pikselstørrelse og bildefrekvens
- Fyll ut riktig bildefrekvens og pikselstørrelse for bildene i den aktuelle boksen Bildefrekvens eller bildepunktstørrelse (Figur 2A, grønn boks). Hvis ingen verdier er angitt (de er satt til standard "0"), vil programmet søke i metadataene som er knyttet til filen for bildefrekvens og pikselstørrelse. Hvis disse verdiene ikke blir funnet, settes programmet som standard til per piksel for måling og per ramme for tidspunkter.
MERK: I det angitte eksemplet er bildefrekvensen 100, og pikselstørrelsen er 0,08.
3. Velg eller lag masker
- Bruk Maske maker -knappen til å opprette cellemasker automatisk for dataene i fildatasettlisten (Figur 2A, blå boks). Når du bruker Mask Maker-knappen, opprettes det en ny mappe i den valgte mappen kalt MaskFiles. "Kjør-indikatoren" blir gul under løping og går tilbake til grønt når den er fullført.
MERK: En maske for hver fil i datafillisten opprettes fra de første 10 rammene i bildefilen (eller fra alle delbildene hvis mindre enn 10 er i bildefilen) og deponeres i MaskFiles-mappen ved hjelp av riktig navngivningsskjema (beskrevet nedenfor). - Kontroller at maskefilene automatisk fyller ut maskefiler -listen. Brukeren kan gå direkte til analysen.
MERK: Kontroller alltid maskefiler visuelt og bekreft at de fanger opp hele interesseområdet. Den første rammen i datafilen og maskefilen vises i brukergrensesnittet når den er valgt. (Figur 2B). Mask Maker kan produsere feil ved lite signal-til-støy, så validering av at maskefiler er passende, er avgjørende for kvalitetskontroll. - Som et alternativ til å bruke Mask Maker, hvis signalet til støy fra bilder ikke er tilstrekkelig, oppretter du masker manuelt i ImageJ.
- Først åpner du RAW-bildefilen i ImageJ (figur 3A).
- Klikk Knappen Valg av mangekant , og klikk for å tegne en maske rundt cellen. Når du er ferdig, dobbeltklikker du på det siste punktet for å fullføre polygonen.
- Når du er ferdig, navigerer du til Rediger | Merket område | Opprett maske (figur 3B). En ny invertert maske opprettes basert på polygontegningen. Lagre masker i en angitt MaskFiles-mappe i den valgte mappen. Navneoppsettet for maskefilen må samsvare med de tilsvarende individuelle datafilene etterfulgt av "_mask_file". Hvis for eksempel en datafil heter "VAMP2_488_WT_1.tif", må den tilsvarende maskefilen hete "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
- Bruk knappen Søk etter masker for å navigere til den valgte mappen med avsatte egendefinerte maskefiler. Maskene fyller ut maskefilene som en liste.
MERK: Det er viktig å ha en maske for hver datafil før du kjører analysen.
4. Analyse og funksjonsuttrekking
- Når mappen er valgt og listen Datafiler og maskefiler er fylt ut, klikker du Analyse -knappen (Figur 4A). Hvis klassifiseringen av eksocytiske hendelser kreves, går du til trinn 5.
MERK: Analyse-knappeklikket utfører en rekke automatiserte oppgaver for å analysere dataene. Det vil opprette individuelle mapper i den valgte katalogen for å sette inn analyserte data. Under kjøring endres "kjøreindikatoren" fra grønn til gul (Figur 4A, rød boks). Etter at analysen er ferdig, vil dette endres tilbake til grønt. - Finn en DataFiles-mappe (Figur 4B) med hele settet med analysefiler (i tillegg til funksjonsuttrekkingsfiler, som skal brukes i klassifisering senere) navngitt i henhold til hver datafile (Figur 4C).
MERK: En beskrivelse av disse analysefilene er inkludert nedenfor i delen Representative Resultater.
5. Klassifisering av eksocytiske hendelser
- Hvis du vil utføre samtidig klassifisering av eksocytiske hendelser med automatisert deteksjon, merker du av for Klassifisering før du klikker Analyse-knappen. For hver eksocytisk hendelse tilordner du en sannsynlighetspoengsum mellom 0-1 for hver klasse. En eksocytisk hendelse regnes som klassifisert som en av de fire klassene hvis sannsynlighetspoengsummen for den klassen er > 0,5.
MERK: Når analysen er fullført, vises en ny datafilmappe i den valgte katalogen. Mappen vil inneholde analysefiler som tilsvarer hver bildefil.
6. Spatiotemporal analyse av eksocytose ved bruk av Ripleys K-verdier
- Opprett en separat "neurite" og "soma" maskefil. Først segmenterer du soma fra neuritten. Det er ingen objektiv metode for segmentering av soma fra nevrittene, så brukeren bør blindes til kondisjoneringseksperimentet og bruke den beste dommen; en ellipsoid uten åpenbare nevrittutvidelser foreslås.
- Åpne ImageJ/Fiji.
- Dra og slipp maskefilen, eller bruk Fil | Åpne og velg maskefilen.
- Bruk fargevelgerverktøyet, og klikk en av de svarte bildepunktene i bakgrunnen av masken for å angi fargen til svart.
- Bruk verktøyet for polygonmarkering eller frihånd til å tegne en kontur rundt somaen, og skille den fra nevrittene. Dette krever manuell beslutningstaking.
- Klikk Rediger | Merket område | Lag maske. Et nytt bilde åpnes med den sirklede somaen segmentert fra resten av bildet. Dette vil opprette en soma maskefil.
- Uten å flytte det tegnede området, klikker du på overskriften til den opprinnelige maskefilen.
- Klikk Rediger | Fyll for å fylle ut den sirklede soma slik at bare nevrittene forblir masken.
- Når separate neurite- og maskefiler er hentet, lagrer du begge maskefilene.
- Åpne "neurite_2D_network" i Matlab.
- I MATLAB navigerer du til katalog med alle analysedata.
- Endre banen "maskenavn" til navnet på neurite masken, det vil si "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
- Endre "csv_file_name" til der fluorescent_traces.csv fil er plassert, det vil si "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
- Klikk Kjør for å skeletonisere neurite maskefilen. Dette oppretter en skeletonisert versjon av neurite maskefilen og legger den som en CSV-fil under maskefilmappen.
- Deretter genererer du en CSV-fil for soma. Åpne "CSV_mask_creator.m" i Matlab.
- Plasser i banen for "maskenavnet" til navnet på soma-masken, det vil si "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- Endre "writematrix" til csv-filnavn som skal opprettes, det vil si "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- Klikk Kjør. Dette oppretter den nye VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv filen.
- Gjenta 6.14 for hver maskefil.
7. RStudio-oppsett
- Åpne Rstudio og åpne ripleys_k_analysis. R-fil.
- Installer pakken "spatstat" i RStudio ved å gå til Verktøy | Installer pakker og skriv inn "spatstat" etterfulgt av å klikke Installer.
MERK: Dette trenger bare å utføres én gang per Rstudio-installasjon. - Kjør biblioteket spatstat i begynnelsen av hver økt.
- Vær oppmerksom på to hovedvariabler i dette tilfellet: "neuron_mask" og "neuron_datapoints". Neuron Mask peker på settet med maskefiler som skal kjøres, det vil si soma maskefiler.
MERK: Kjør alle soma maskefiler sammen, separat fra Neurite maskefiler, og omvendt. - Les i .csv av maskefilene for hver av nevronene som skal analyseres.
- Kjør flere filer samtidig ved å kopiere flere neuron_mask_n+1. Dette vil tillate å aggregere Ripleys analyse sammen ved hjelp av skriptet beskrevet i avsnitt 8.
- Sjekk nå den andre variabelen, "neuron_datapoints".
- Les i." X_fluorescent_traces.csv" fil generert av analyseprogrammet (av funksjoner alle extracted_R fil) med x,y,t posisjoner av de exocytic hendelser, samt neurite-spesifikk fil av x,y posisjoner for 2D-nettverket. Dette går i "neuron_datapoints" -posisjonen.
- Velg kode i RStudio | Kjør region | Kjør alle. Dette genererer flere tomter, inkludert de grupperte Ripleys K-verdier samt tetthetsplott.
- Lagre plott ved å gå til Eksporter | Lagre bilde som | Velg riktig bildeformat og mappe, og skriv inn riktig filnavn, og klikk deretter Lagre.
MERK: Plottingsfunksjonen for varmekartene kalles i skriptet ved hjelp av "plot(density(soma_data,0.4))". Tallet "0.4" her representerer hvor utjevnet tetthetsfunksjonen skal være. Det kan endres for å passe til brukerdata på en meningsfull måte, men hvis sammenligninger skal utføres mellom forskjellige varmekart, må tallet være det samme mellom dem. - Eksporter eller lagre bilde fra Rstudio. Hvis et varmekart krever videre redigering, velger du en passende filtype (SVG eller EPS).
8. Ripleys analyse
MERK: Ripleys_k_analysis. R-filen genererte også automatisk Ripleys k verdiplott. Hvis du kjører hele skriptet, kjøres funksjonene som er nevnt nedenfor, automatisk, men det inkluderes i detalj hvis man ønsker å kjøre hver del av skriptet individuelt eller gjøre endringer i analysen.
- Kjør først konvoluttfunksjonen for hver celle. Denne funksjonen simulerte fullstendig romlig tilfeldighet (CSR) for å teste Ripleys K-verdi for det eksocytiske hendelsespunktmønsteret mot.
Data_envelope_1 = konvolutt (soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = SANN)
Data_envelope_2 = konvolutt (soma_data_2, Nest, nsim = 19, savefuns = SANN) - Deretter grupperer du disse konvoluttene sammen og oppretter ett estimat av kundeservicerepresentanten for gruppen:
Pool_csr = utvalg(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
Deretter kjører du Ripleys K-funksjon for alle datapunkter.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, forhold = SANN)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, forhold = SANN) - Når du er ferdig, kan du samle Ripleys K-verdier og starte opp konfidensintervallene med følgende kommando:
Datautvalg = utvalg(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - Bootstrap med følgende kommando:
Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool) - Tegn inn dataene.
- Hvis det kreves en hard statistisk forskjell, er studentisert permutasjonstest inkludert i spatstatpakken for å teste for en forskjell mellom grupper av punktmønstre:
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ gruppe, nperm = np).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her ble GUI (Figur 2A) brukt til å analysere eksocytiske hendelser fra tre VAMP2-pHluorin som uttrykker nevroner ved 3 DIV ved hjelp av TIRF (total intern refleksjon fluorescens) mikroskopi. E15.5 kortikale nevroner ble isolert, etterfulgt av transfeksjon med VAMP2-pHluorin og plating ved hjelp av protokollene som beskrevet i Winkle et al., 2016 og Viesselmann et al., 201111,12. Metodikken for avbildningsparametere er som skissert i Urbina et al., 20182. Kort sagt ble TIRF-mikroskopi brukt til å avbilde basal plasmamembranen til nevroner hver 100 ms i 2 min. Figur 2, Figur 3, Figur 4 viser en trinnvis guide for å analysere eksocytiske hendelser. Mappen der nevronbildene er plassert, er valgt, og en katalog for å deponere de endelige analysedatamappene velges (Figur 2A). Ved hjelp av MaskMaker -funksjonen genereres det en maske for nevronene, som inspiseres i GUI (Figur 2B). I dette tilfellet er cellemasken av god kvalitet, og analysen kan fortsette. Hvis en maske ikke er tilstrekkelig, kan det opprettes en maske i ImageJ (figur 3). Når du har brukt MaskMaker -funksjonen eller opprettet en maske i ImageJ og valgt mappen der maskefilene er plassert, utføres analysen (Figur 4A). Resultatene genereres i DataFiles -mappen når analysen er fullført (den gule indikatoren endres tilbake til grønt) (Figur 4B).
Datafiler genereres automatisk og navngis i henhold til de angitte rådatafilene.
Forutsatt at datafilen heter X:
X_tracking: Denne filen inneholder x,y posisjon og rammenummer for hver hendelse, samt markeringsrammer som kan brukes til å tegne bokser rundt hver hendelse. Alder angir antall rammer forbi den første oppdagelsen der en hendelse er en distinkt gaussisk puncta. Hvis klassifisering er merket, vises klassifiseringsresultatene i denne filen, noe som indikerer sannsynligheten for en eksokytisk hendelse som tilhører en av fire klasser. Hvis sannsynligheten er større enn 0,5 og større enn andre sannsynligheter, ble det valgt en eksokytisk klasse.
X_fluorescent spor: Denne filen inneholder x,y posisjon og rammenummer for hver hendelse. I tillegg inkluderer den fluorescerende intensitetsmål i en interesseregion rundt hver hendelse 2 sekunder før og 10 sekunder etter toppen ΔF/F for hver hendelse (angitt av Timepoint-kolonnene).
X_cell_statistics: Denne filen inneholder celleområdet, total bildetid og automatisk beregnet frekvens for eksocytiske hendelser for hver celle (i hendelser/mm2/minutt).
Funksjonsuttrekkingsfiler inkluderer:
X_contrast: Kontrast. Et mål på intensitetskontrasten mellom en piksel og naboen over hele bildet.
X_correlation: Korrelasjon. Et mål på hvor korrelert en piksel er med naboen over hele bildet.
X_energy Total energi. Definert som den kvadrert summen av pikselintensiteten.
X_homogeneity måler nærheten til fordelingen av elementer i avkastningen til ROI-diagonalen.
X_ring_fluorescence: gjennomsnittlig fluorescens av kantlinjepiksler.
X_SD: Standardavvik. Dette er definert som standardavviket for avkastningen.
Eksempler på gjennomsnittlig fluorescensspor ± SEM fra hver eksocytisk klasse ble plottet inn fra X_fluorescent sporingsfil (figur 5A). Ved hjelp av den Cell_statistics filen ble frekvensen av eksocytose for hver klasse plottet for hver nevron (figur 5B). Når det er merket av for Klassifisering , tilordnes hver eksoytiske hendelse til en klasse, tegnet inn i Figur 5C. Etter klassifiseringen ble Ripleys K-analysekode brukt til å avgjøre om eksocytiske hendelser er tilfeldige, grupperte eller spredt i rom og tid. Tetthetsvarmekart for lokalisering av eksocytiske hendelser (figur 5D) ble generert. Disse avslører forventede grupperte "hotspots" i forskjellige områder av nevronen. Deretter ble Ripleys K-analyse utført for soma, neurite og clustering over tid (Figur 5E). Ripleys K-verdi og SEM (henholdsvis svart linje og blått skyggelagt område) stiger over linjen med fullstendig romlig tilfeldighet (rød prikket linje), noe som tyder på statistisk signifikant klynger.
Figur 1: Representasjon av eksotokytisk analyse og klassifisering. (A) Omriss av analyserørledningen for GUI. Celler segmenteres fra bakgrunnen før eksocytiske hendelser identifiseres og spores. Parametere som toppen ΔF/F og t1/2 beregnes ut fra fluorescerende spor av eksocytose i en avkastning rundt hendelsen før og etter fusjon. (B) illustrasjon av de fire modusene eksocytose og eksempelbildemontasjer. Etter fusjon kan hendelser fortsette øyeblikkelig til FVF eller KNR (FVFi og KNRi), eller en forsinkelse kan være til stede før utbruddet av fusjons skjebne til FVF eller KNR (FVFd og KNRd). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinnvis eksempelanalyse. (A) Først velges datasett (1., rød boks), og en mappe velges for å plassere analysefiler (2., rød boks). Deretter angis bildefrekvensen og pikselstørrelsen (3., grønn boks). Her ble det brukt 0,08 μm pikselstørrelse og 100 ms bildefrekvens. MaskMaker-funksjonsknappen trykkes deretter på (4., blå boks). En mappe med tittelen MaskFiles opprettes automatisk i den valgte mappen som inneholder en maskefil for hver bildefil i datasettet. (B) Når datasett lastes inn, vil valg av datafil og/eller maskefil vise den første rammen i bildene for enkel sammenligning (grønn boks). Maskefiler er kanskje ikke helt riktige. Denne maskefilen kan korrigeres for feil, eller en ny maskefil kan gjøres manuelt Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Opprette en maskefil manuelt i ImageJ. (A) Først åpner du filen for å lage en maske. Knappen "Mangekantede valg" er omrisset av rødt. Ved å klikke rundt kanten av cellen opprettes det en polygonomriss. (B) Hvordan lage en maske fra polygonomrisset. Ved å velge Rediger | | merke Opprett maske, opprettes det en svart-hvitt-maske fra polygonen (høyre bilde). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av eksocytiske hendelser. (A) Demonstrasjon av analyseknappen (oransje boks) og en løpende analyse. Legg merke til at kjøreindikatoren blir gul mens en analyse utføres. (B) Eksempelanalysefiler som opprettes i den valgte mappen når analysen er fullført. DataFiles inneholder alle analysefiler av den eksocytiske hendelsen. (C) Analysefiler generert i DataFiles-mappen. Fargebokser representerer de åpne filene i etterfølgende bilder. (D) Tre åpne filer, "X_fluorescent_traces.csv" (rød) og "X_Cell_statistics"(grønn) og "X_tracking"(blå). Fluorescerende spor inneholder x,y posisjon og rammenummer for hver hendelse, samt fluorescerende intensitet ved hver avkastning. Cell_statistics inneholder sammendragsinformasjon om eksocytisk statistikk i hele cellen, for eksempel hyppigheten av eksocytose. X_tracking inneholder posisjons- og tidsinformasjon for hver eksocytisk hendelse, i tillegg til sannsynligheten for hver eksocytoseklasse for hver hendelse, representert som et tall mellom 0-1 (>0,5 angir at en hendelse tilhører en bestemt klasse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative resultater. (A) Gjennomsnittlig fluorescens spor +/- SEM fra hver eksocytisk klasse. (B) Frekvens av hendelser plottet for tre murin kortikale nevroner for hver eksocytisk klasse. Disse dataverdiene ble tegnet inn fra "X_Cell_statistics", ved hjelp av klassene som er tilordnet i "X_tracking". (C) Fordeling av eksocytoseklasser for de samme tre cellene som brukes i A). Her tegnes forholdet mellom hver modus. (D) Tetthetsplott for hvor eksocytiske hendelser forekommer som generert i Ripleys K-analysedel av protokollen. Dette kan tolkes som et "varmekart" av den romlige sannsynligheten for hvor hendelser forekommer. (E) Ripleys K-analyse av tre celler som brukes for A) og B). Den røde linjen angir hvilken verdi som er fullstendig tilfeldig fordeling av eksocytiske hendelser. Den svarte linjen angir den aggregerte Ripleys K-verdi for de tre cellene i dette eksemplet, og det blå skyggelagte området representerer konfidensintervallet. Her faller den skyggefulle regionen merkbart utenfor linjen med fullstendig romlig tilfeldighet mellom ~ 0,25-1 μm, noe som tyder på at eksocytiske hendelser er gruppert på disse avstandene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når du bruker exocytic deteksjons- og analyseprogramvare, må du vurdere at programmet bare godtar tapsfri komprimering .tif filer som inndata. De .tif bildefilene kan være 8-biters, 16-biters eller 32-biters gråtonebilder (én kanal). Andre bildeformater må konverteres til én av disse typene før inndata. Eksempler som brukes her, er 16-biters gråtonebilder som referanse.
Iboende i den automatiserte deteksjonsprosessen behandles tidsforløpbildesettene for den automatiserte bakgrunnsdeltraksjonen og fotobleachingkorrigeringen. For bakgrunnsdelsnitt beregnes bildepunktene utenfor det maskerte området i maskefilen i gjennomsnitt over tidsforløpet for hele bildet, og gjennomsnittsverdien trekkes fra bildesettet. For fotobleaching korreksjon påføres en monoeksponentiell forfallsform på gjennomsnittlig fluorescens av piksler i masken i løpet av videoen, med riktig intensitet justert som følger:
Korrigert intensitet = (Intensitet på tidspunktet t) ÷ exp-k×t der k = forfall konstant
Derfor er det ikke nødvendig med forhåndsbehandling før inntasting. Disse prosessene er imidlertid kritisk avhengige av bildemasken for effektivt å skille cellen fra bakgrunnen, og dermed er en riktig cellemaske nødvendig for gode resultater.
Den automatiserte cellemaskeskaperen krever et ensartet signal med tilstrekkelig signal-til-støy-forhold (ideelt sett minst 2 ganger standardavviket for det gjennomsnittlige bakgrunnssignalet) for å fungere bra. Empirisk fungerer CAAX-boksen merket med et fluorescerende protein, som setter inn i plasmamembranen ved preylering, bra. Det er ikke noe krav om at signalet kan opprettholdes gjennom hele tidsforløpavbildningen av eksocytose, da en passende maske kan opprettes fra et høyt signal i de første 10 rammene i sekvensen. Men hvis cellemorfologien endres betydelig under bildeparadigmet, bør det tas hensyn.
Når du bruker den automatiserte deteksjonsprogramvaren, må du inkludere bildefrekvensen og pikselstørrelsen for nøyaktige tids- og romlige utganger. Hvis ingen bildefrekvens eller pikselstørrelse er deklarert, vil utdataene være per piksel og per ramme. Som en tommelfingerregel er vesiclediametre i å utvikle nevroner på skalaen ~ 100 nm13, og dermed kan den automatiserte påvisning av hendelser fungere for vesikler som ligner i størrelse. Slik det ser ut, er det ingen hard grense for størrelsen på vesicles som kan oppdages (etter pikselområde), da automatisert deteksjon er avhengig av gaussisk-formet intensitet over et stort utvalg av gaussiske bredder. Fusjon av vesicles mindre enn bredden på en piksel kan oppdages nøyaktig hvis intensiteten av hendelsen oppfyller signal-til-støy-kriteriene på 2x standardavviket til det gjennomsnittlige bakgrunnssignalet når fluorescensdiffraksjonen utvides over flere piksler.
Dette programmet ble utviklet for å oppdage eksocytiske hendelser i utviklingen av nevroner. Programvaren har imidlertid blitt utnyttet til å oppdage eksocytiske hendelser i andre cellelinjer2, noe som indikerer at deteksjonsalgoritmen er robust. Selv om vi har brukt programvaren til å oppdage eksocytiske hendelser i ikke-nevronale celletyper, indikerer forskjeller i eksokytisk hendelsesmodus mellom celle type14 at klassifiseringsalgoritmen kanskje ikke passer for andre celletyper. Eksocytiske hendelser i utviklingen av nevroner ble opprinnelig klassifisert ved hjelp av tre forskjellige metoder: Hierarkisk klynger, Dynamic Time Warping og Principal Component Analysis (PCA), som avslørte fire forskjellige klasser3. Her er alle tre klassifisererne ansatt i GUI for å kategorisere eksocytiske hendelser i en av disse etablerte fire klassene. For hver eksocytisk hendelse tilordnes en sannsynlighetspoengsum mellom 0-1 for hver av de fire mulige klassene. Alle klasser med sannsynlighetspoeng > 0,5 regnes for å være av den klassen. Denne klassifiseringen har bare blitt brukt til å utvikle nevroner til dags dato. Hvorvidt disse klassene eksisterer i andre celletyper eller ved senere utviklingstidspunkter i nevroner er ikke kjent. Et stort antall hendelser med sannsynlighetspoeng på <0,5 for noen av klassene vil antyde at klassifiseringsprosedyren kanskje ikke passer for de eksocytiske hendelsene som evalueres. Hvis lave sannsynlighetspoeng tildeles eksocytiske hendelser av forskjellige celletyper, vil dette antyde at de novo-klassifisering er nødvendig ettersom nye eller alternative eksocytosemoduser kan eksistere. De samme klassifikasjonsmetodene som brukes her, må brukes på de automatisk oppdagede eksocytiske hendelsene.
For å utforske den romlige og tidsmessige klyngen av eksocytiske hendelser, utnyttes Ripleys K-analyse15. Analyse av klynger for nevroner innebærer tre separate analyser: En for soma, en for nevrittene og en for tid. Årsaken til å dele soma og neurites er å ta hensyn til den ekstreme morfologien til nevritter, som ofte er tynne nok til at de kan behandles som et 2D-nettverk og bruke en 2D-variant av Ripleys K-analyse. For tid er en 1D Ripleys K-analyse implementert for temporal klynger. Ripleys K-analyse er en robust metode for å oppdage klynger av punktprosesser og colokalisering. Grafen til Ripleys K kan tolkes som sådan: Ripleys K-verdi + konfidensintervall har en 5% sjanse til å falle utenfor linjen med fullstendig romlig tilfeldighet når som helst, analogt med en p-verdi på 0,05. Der verdien faller utenfor linjen med fullstendig romlig tilfeldighet, grupperes eksocytiske hendelser (over CSR) eller separeres med jevne mellomrom (under CSR) med disse avstandene (x-aksen).
Opprettelsen av maskefilen er avhengig av en høy innledende signal-til-støy av cellen. pH-følsomme markører fungerer kanskje ikke alltid bra i å belyse en celle, avhengig av hvilket protein sonden er festet til. Et annet alternativ for å lage maskefiler hvis signalet til støy fra eksocytisk markør utilstrekkelig fremhever cellegrensen, er å bruke en annen fluorescerende kanal / bilde for maskeoppretting. Hvis du bruker en annen fluorescensmarkør (for eksempel tagRFP-CAAX) til å lage masker, må du først navigere til mappen med bildene du vil lage masker fra (for eksempel en mappe som inneholder tagRFP-CAAX-bildene). Bruk Mask Maker-knappen her. Husk å gi nytt navn til maskefilene slik at de samsvarer med den eksotokytiske datafilen som skal analyseres med navneskjemaet ovenfor (etter eksemplet ovenfor må maskefilene med navnet "CAAX_1_mask_file.tif" gis nytt navn til "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" for å samsvare med VAMP2-bildesettet som skal analyseres). Når maskefiler har fått riktig navn, går du tilbake til Velg datasett-knappen på nytt for å navigere til eksokytiske datasettfiler som skal analyseres.
Påvisning av eksocytose er bemerkelsesverdig følsom, og eksocytiske hendelser ble nøyaktig oppdaget ved signal-til-støy-forhold så lave som en ΔF / F på 0,01. Følsomheten til deteksjonen avhenger delvis av variansen i bakgrunnsfluorescensen, og hendelser mindre enn 4 standardavvik over bakgrunnssignalet vil ikke bli oppdaget.
Påvisning av eksocytiske hendelser er avhengig av deres forbigående natur. Som en funksjon i analysen av forbigående hendelser utforsker deteksjonskoden vår et 20-sekunders vindu rundt den eksocytiske hendelsen. I noen celletyper kan kyss-og-opphold-eksocytose "bli" i et mye lengre temporalt vindu enn i å utvikle nevroner, og den automatiserte deteksjonen fanger kanskje ikke disse mindre forbigående hendelsene på en robust måte. Denne funksjonen er en lett modifiserbar variabel for de som er komfortable med MATLAB. I likhet med begrensningen av 20 sekunders avkastning, kan eksocytiske hendelser som vises, men ikke forsvinner før den siste tidsrammen for videoen, ikke telles som ekte eksocytose, noe som kan påvirke frekvensen, som beregnes basert på hele lengden av tidsserien.
Maskemakeren som er inkludert, automatiseres av design og fungerer bra på segmentering av komplekse former fra bakgrunnen; Den helautomatiske designen begrenser imidlertid rekkevidden av signal-til-støy og signaltype som kan brukes til å generere en maske automatisk. Hvis brukeren ikke kan inkludere en fluorescerende cellemarkør som er jevn og av et betydelig signal-til-støy-forhold, må cellemasken tegnes manuelt.
Brukerbasert analyse av eksocytose er en tidkrevende prosess og underlagt personlig skjevhet, da hendelser ikke alltid er tydelig skilt fra annen fluorescens. Bruken av et automatisert analyseprogram for å identifisere og analysere eksocytiske hendelser på en objektiv måte øker analyseeffektiviteten og forbedrer reproduserbarhet og strenghet.
Ikke bare fungerer denne eksocytiske hendelsesdeteksjonen for nøyaktig å fange pH-sensitiv fluorescens i å utvikle nevroner, men også andre celletyper (Urbina et al., 2018). Om klassifisering fungerer for andre celletyper, vil kreve bestemmelse. Fremtidige anvendelser av denne teknikken kan være nyttige ved synapser, i ikke-nevronale celletyper, eller med nye markører av eksokytisk vesicle docking og fusjon, for eksempel nylig beskrevet pHmScarlet16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dustin Revell og Reginald Edwards for testkode og GUI. Støtten ble gitt av National Institutes of Health støttet denne forskningen: inkludert R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) og F31NS103586 (FLU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L.
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
