Summary

Автоматизированное обнаружение и анализ экзоцитоза

Published: September 11, 2021
doi:

Summary

Мы разработали автоматизированное программное обеспечение для компьютерного зрения для обнаружения экзоцитарных событий, отмеченных pH-чувствительными флуоресцентными зондами. Здесь мы демонстрируем использование графического пользовательского интерфейса и RStudio для обнаружения событий слияния, анализа и отображения пространственно-временных параметров слияния и классификации событий в различные режимы слияния.

Abstract

Замедленная TIRF-микроскопия pH-чувствительного GFP (pHluorin), прикрепленного к белкам SNARE везикул, является эффективным методом визуализации одиночных экзоцитарных событий в клеточной культуре. Для проведения непредвзятой, эффективной идентификации и анализа таких событий в MATLAB был разработан и внедрен подход, основанный на компьютерном зрении. Конвейер анализа состоит из алгоритма сегментации клеток и идентификации экзоцитарных событий. Подход компьютерного зрения включает в себя инструменты для исследования множественных параметров единичных событий, включая период полураспада флуоресценции и пик ΔF/F, а также общеклеточный анализ частоты экзоцитоза. Эти и другие параметры синтеза используются в классификационном подходе для различения различных режимов синтеза. Здесь недавно созданный графический интерфейс выполняет конвейер анализа от начала до конца. Дальнейшая адаптация K-функции Рипли в R Studio используется для различения кластеризованным, рассеянным или случайным возникновением событий слияния как в пространстве, так и во времени.

Introduction

Конструкции VAMP-pHluorin или конструкции рецептора трансферрина (TfR)-pHuji являются отличными маркерами экзоцитарных событий, поскольку эти pH-чувствительные флуорофоры гасятся в просвете кислых езикул и флуоресцируют сразу после открытия пор слияния между везикулой и плазматической мембраной1. После открытия пор синтеза флуоресценция распадается экспоненциально, с некоторой неоднородностью, которая раскрывает информацию о событии синтеза. Здесь описано приложение графического интерфейса пользователя (GUI), которое автоматически обнаруживает и анализирует экзоцитарные события. Это приложение позволяет пользователю автоматически обнаруживать экзоцитарные события, выявленные чувствительными к pH маркерами2, и генерировать признаки из каждого события, которые могут быть использованы для целей классификации3 (рисунок 1A). Кроме того, описан анализ кластеризации экзоцитарных событий с использованием K-функции Рипли.

Автоматизированная классификация экзоцитарных событий в различные экзоцитарные режимы была недавно сообщена3. Два режима экзоцитоза, полное везикулярное слияние (FVF) и слияние поцелуев (KNR), ранее были описаны4,5,6,7. Во время FVF пора слияния расширяется, и везикула включается в плазматическую мембрану. Во время KNR пора плавления временно открывается, а затем повторно засовывает4,5,8,9,10. Четыре режима экзоцитоза были идентифицированы в развивающихся нейронах, два из которых связаны с FVF и два связаны с KNR. Эта работа демонстрирует, что как FVF, так и KNR могут быть дополнительно подразделены на события синтеза, которые немедленно переходят к флуоресцентному распаду (FVFi и KNRi) после открытия пор синтеза или экзоцитарным событиям, которые проявляют задержку после открытия пор синтеза до начала распада флуоресценции (FVFd и KNRd)(рисунок 1B). Классификатор определяет режим экзоцитоза для каждого события слияния. Здесь этот анализ был включен в графический интерфейс, который может быть установлен в MATLAB в операционных системах windows и Mac. Все файлы анализа можно найти по адресу https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing или
https://github.com/GuptonLab.

Protocol

1. Выберите наборы данных и каталог Чтобы выбрать наборы данных для анализа, нажмите кнопку Find Datasets (рисунок 2A,красное поле 1),чтобы перейти в папку, в которую депонируются данные (например, папка RawData). Файлы данных автоматически заполняют файлы дан?…

Representative Results

Здесь графический интерфейс(рисунок 2A)использовался для анализа экзоцитарных событий из трех VAMP2-pHluorin,экспрессирующих нейроны при 3 DIV с использованием микроскопии TIRF (полная флуоресценция внутреннего отражения). Корковые нейроны E15.5 были выделены с последующей трансф?…

Discussion

При использовании программного обеспечения для обнаружения и анализа экзоцитов, пожалуйста, учитывайте, что программа принимает только сжатие без потерь .tif файлы в качестве входных данных. Файлы изображений .tif могут быть 8-битными, 16-битными или 32-битными изображениями в градациях сер?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Дастина Ревелла и Реджинальда Эдвардса за тестирование кода и графического интерфейса. Финансирование было предоставлено Национальными институтами здравоохранения, поддержали это исследование: в том числе R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) и F31NS103586 (FLU).

Materials

MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/matlab.html
R R Core Team https://www.r-project.org/
Rstudio Rstudio, PBC https://rstudio.com/

References

  1. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  2. Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
  3. Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
  4. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
  5. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  6. He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
  7. Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
  8. Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
  9. Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
  10. Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
  11. Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
  12. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
  13. Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
  14. Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
  15. Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
  16. Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).

Play Video

Cite This Article
Urbina, F., Gupton, S. L. Automated Detection and Analysis of Exocytosis. J. Vis. Exp. (175), e62400, doi:10.3791/62400 (2021).

View Video