Summary
Het artikel beschrijft stapsgewijze gerichte differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar driedimensionale hele longorganoïden die zowel proximale als distale epitheellongcellen bevatten, samen met mesenchym.
Abstract
De ontwikkeling en ziekte van menselijke longen is moeilijk te bestuderen vanwege het gebrek aan biologisch relevante in vitro modelsystemen. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) kunnen stapsgewijs worden gedifferentieerd in 3D meercellige longorganoïden, gemaakt van zowel epitheliale als mesenchymale celpopulaties. We reconstrueren embryonale ontwikkelingssignalen door tijdelijk een verscheidenheid aan groeifactoren en kleine moleculen te introduceren om efficiënt definitief endoderm, anterieur voorgut endoderm en vervolgens longvoorlopercellen te genereren. Deze cellen worden vervolgens ingebed in groeifactor gereduceerd (GFR) -keldermembraanmatrixmedium, waardoor ze zich spontaan kunnen ontwikkelen tot 3D-longorganoïden als reactie op externe groeifactoren. Deze hele longorganoïden (WLO) ondergaan vroege longontwikkelingsstadia, waaronder vertakkende morfogenese en rijping na blootstelling aan dexamethason, cyclisch AMP en isobutylxanthine. WLO's bezitten luchtwegepitheelcellen die de markers KRT5 (basaal), SCGB3A2 (club) en MUC5AC (bokaal) tot expressie brengen, evenals alveolaire epitheelcellen die HOPX (alveolair type I) en SP-C (alveolair type II) tot expressie brengen. Mesenchymale cellen zijn ook aanwezig, waaronder gladde spier actine (SMA) en van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor A (PDGFRα). iPSC-afgeleide WLO's kunnen vele maanden in 3D-kweekomstandigheden worden gehandhaafd en kunnen worden gesorteerd op oppervlaktemarkers om een specifieke celpopulatie te zuiveren. iPSC-afgeleideWLO's kunnen ook worden gebruikt om de ontwikkeling van menselijke longen te bestuderen, inclusief signalering tussen het longepitheel en mesenchym, om genetische mutaties op de functie en ontwikkeling van menselijke longcellen te modelleren en om de cytotoxiciteit van infectieuze agentia te bepalen.
Introduction
De long is een gecompliceerd, heterogeen, dynamisch orgaan dat zich ontwikkelt in zes verschillende stadia - embryonale, pseudoglandulaire, canalculaire, sacculaire, alveolaire en microvasculaire rijping1,2. De laatste twee fasen treden pre- en postnataal op in de menselijke ontwikkeling, terwijl de eerste vier stadia uitsluitend plaatsvinden tijdens de foetale ontwikkeling, tenzij vroeggeboorte optreedt3. De embryonale fase begint in de endodermale kiemlaag en eindigt met het ontluiken van de luchtpijp en longknoppen. Longontwikkeling vindt gedeeltelijk plaats via signalering tussen de epitheel- en mesenchymale cellen4. Deze interacties resulteren in longvertakking, proliferatie, cellulaire lotbepaling en cellulaire differentiatie van de zich ontwikkelende long. De long is verdeeld in geleidende zones (luchtpijp naar de terminale bronchiolen) en ademhalingszones (respiratoire bronchiolen naar de longblaasjes). Elke zone bevat unieke epitheelceltypen; inclusief basale, secretoire, trilhaar-, borstel-, neuro-endocriene en ionocytcellen in de geleidende luchtwegen5, gevolgd door alveolaire type I- en II-cellen in het respiratoire epitheel6. Er is nog veel onbekend over de ontwikkeling en reactie op letsel van de verschillende celtypen. iPSC-afgeleide longorganoïde modellen maken de studie mogelijk van mechanismen die de ontwikkeling van menselijke longen stimuleren, de effecten van genetische mutaties op de longfunctie en de respons van zowel het epitheel als het mesenchym op infectieuze agentia zonder de noodzaak van primair menselijk longweefsel.
Markers die overeenkomen met de verschillende stadia van embryonale differentiatie omvatten CXCR4, cKit, FOXA2 en SOX17 voor definitief endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 en SOX2 voor anterieur foregut endoderm (AFE)8 en NKX2-1 voor vroege longvoorlopercellen9. Bij embryonale longontwikkeling verdeelt het voorgut zich in de dorsale slokdarm en ventrale luchtpijp. De knoppen van de rechter- en linkerlong verschijnen als twee onafhankelijke uitstulpingen rond de tracheale knop10. Tijdens vertakkende morfogenese produceert het mesenchym rond het epitheel elastisch weefsel, gladde spieren, kraakbeen en vasculatuur11. De interactie tussen het epitheel en mesenchym is essentieel voor een normale longontwikkeling. Dit omvat de afscheiding van FGF1012 door het mesenchym en SHH13 geproduceerd door het epitheel.
Hier beschrijven we een protocol voor de gerichte differentiatie van hiPSC's in driedimensionale (3D) hele longorganoïden (WLO). Hoewel er vergelijkbare benaderingen zijn die isolatie van longvoorlopercellen omvatten via sortering in het LPC-stadium om alveolaire-achtige 14,15 (distale) organoïden of airway16 (proximale) organoïden te maken, of ventraal-anterieure foregut-sferoïden te genereren om menselijke longorganoïden te maken die alveolaire cel- en mesenchymale markers tot expressie brengen en knoptipvoorloperorganoïden17 , is de kracht van deze methode de opname van zowel longepitheel- als mesenchymale celtypen om longvertakkingsmorfogenese, rijping en expansie in vitro te patroon en te orkestreren.
Dit protocol maakt gebruik van kleine moleculen en groeifactoren om de differentiatie van pluripotente stamcellen te sturen door middel van definitief endoderm, anterieur voorgut endoderm en longvoorlopercellen. Deze cellen worden vervolgens geïnduceerd in 3D-organoïden voor de hele long door middel van belangrijke ontwikkelingsstappen, waaronder vertakking en rijping. De samenvatting van het differentiatieprotocol is weergegeven in figuur 1a met representatieve brightfieldbeelden van endodermale en organoïde differentiatie in figuur 1b. Figuur 1c,d toont de genexpressiedetails van endodermale differentiatie en de genexpressie van zowel de proximale als distale populaties van longepitheelcellen na voltooiing van de differentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit studieprotocol werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van UCSD's Human Research Protections Program (181180).
1. Definitieve endoderm-inductie uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (dag 1 - 3)
- Ontdooi langzaam groeifactor gereduceerd (GFR)-keldermembraan (BM) matrixmedium op ijs 30 minuten voor gebruik. Verdun in koud DMEM/F12 mengsel het GFR BM-matrixmedium 1:1 zodanig dat het 50% van dit medium uitmaakt. Plaats P1000 pipetpunten in de vriezer om te koelen voor gebruik.
- Bestrijk elke put van een 12-putplaat met 500 μL 50% GFR-keldermembraanmatrixmedium bereid in ijskoude DMEM /F12. Zodra het gewenste aantal putten is gecoat, verwijdert u overtollig mediummengsel en/of bubbels uit putten en plaatst u de plaat op ijs of koelkast bij 4 °C gedurende 20 minuten om uit te zetten. Verplaats vervolgens de plaat 's nachts naar de couveuse bij 37 °C om te gelen en te drogen.
- Zodra hiPSC's 70-90% confluentie bereiken, voegt u 10 μM Rho-geassocieerde kinase (ROCK) -remmer Y-27632 toe een uur voorafgaand aan de dissociatie. Zuig de media af en was eenmaal met Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Dissocieer hiPSC's door cellosperementmedium toe te voegen (0,5 ml / put van een 12-well plaat) en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2-incubator .
- Verwijder platen uit de incubator en voeg 0,5 ml /12-put stamceldoorgangsmedium (tabel 1) toe aan de putten; triturate cellen voorzichtig met behulp van een P1000-tip om eencellige suspensie te verkrijgen. Breng gedissocieerde cellen over in een conische centrifugebuis van 15 ml; centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g.
- Zuig het medium af en resuspend de celkorrel met 1 ml mTeSR Plus-media aangevuld met 10 μM ROCK-remmer (Y-27632). Voer een celtelling uit. Voeg 2,0 x 105 hiPSC's toe in 1 ml mTeSR aangevuld met ROCK-inhibitor Y-27632 per put van een 12-well GFR-basement membraan medium gecoate plaat. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
OPMERKING: Het aantal zaaicellen moet per cellijn worden geoptimaliseerd. 24 uur na het beplaten moeten putten 50% -70% confluent zijn. - Aspirateer op dag 1 de mTeSR Plus en voeg definitive endoderm (DE) inductiemedia (tabel 1) toe, aangevuld met 100 ng/ml humaan activine A en 5 μM GSK3β-remmer/Wnt-activator CHIR99021.
OPMERKING: DE media met GSK3β-remmer/Wnt-activator CHIR99021 moeten binnen 20-24 uur na dag 1 DE-inductie worden verwijderd voor een succesvolle differentiatie. - Op dag 2 en dag 3, overschakelen op DE-inductiemedia aangevuld met 100 ng / ml activine A alleen.
OPMERKING: DE-differentiatie mag in totaal niet langer zijn dan 72 uur, anders neemt de werkzaamheid af. Op dag 4, als grote celafsterving wordt waargenomen, verlaagt u de totale blootstellingstijd van DE media met 6-12 uur. - Om de DE-efficiëntie te analyseren, bevestigt u meer dan 90% CXCR4- en/of cKit-expressie via flowcytometrie of immunofluorescentieanalyse van FOXA2 en/of SOX17 (figuur 2a).
2. Anterior foregut endoderm (AFE) inductie (Dag 4 - 6)
- Verander op dag 4 de media in serumvrij basaal medium (SFBM) (tabel 1) aangevuld met 10 μM SB431542 en 2 μM dorsomorfine voor AFE-inductie. Verander AFE-media dagelijks gedurende 3 dagen (dag 4, dag 5 en dag 6).
- Om de AFE-efficiëntie te analyseren, bevestigt u de robuuste expressie van SOX2, TBX1 en FOXA2 via immunofluorescentiekleuring (figuur 2b).
3. Longvoorlopercel (LPC) differentiatie (Dag 7 - 16)
- Ontdooi op dag 7 het GFR-keldermembraanmatrixmedium op ijs. Zuig de AFE media af en was goed met 1x PBS. Voeg 1 ml celloslatingsoplossing toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C.
- Voeg 1 ml blusmedium (2% FBS in DMEM/F12) toe aan de putjes met celloslatingsoplossing. Houd cellen als aggregaten door zachtjes op en neer te pipetteren. Zorg ervoor dat alle cellen worden losgemaakt en overgebracht in een conische centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel in quenching medium aangevuld met 10 ng / ml humaan recombinant botmorfogene eiwit-4 (BMP4), 0,1 μM all-trans retinoïnezuur (RA), 3 μM GSK3β-remmer / Wnt-activator CHIR99021 en 10 μM rock inhibitor Y-27632.
- Voer een celtelling uit. Voeg 2,5 x 105 cellen toe aan 100 μL koud GFR-keldermembraanmatrixmedium, meng goed en plaats de druppel in een put van een 12-putplaat. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 30-60 minuten om het medium te laten polymeriseren. Voeg 1 ml LPC-media aangevuld met 10 μM ROCK-remmer Y-27632 per put toe om ervoor te zorgen dat de mediumdruppel volledig wordt ondergedompeld en incamineer 's nachts bij 37 °C.
- Verander op dag 8, 24 uur na LPC-inductie, het LPC-medium om ROCK-remmer Y-27632 te verwijderen. Vervang het LPC-medium om de dag gedurende in totaal 9-11 dagen.
OPMERKING: Als het medium binnen 24 uur geel wordt, verander dan elke dag van medium. - Om de LPC-efficiëntie te analyseren, bevestigt u de robuuste expressie van de intracellulaire transcriptiefactor NKX2-1 of voert u flowcytometrie uit voor oppervlaktemarkers CD47hi/CD26low15 of CPM18 (figuur 2c). Grofweg moeten de LPC-sferoïden rond en transparant zijn (figuur 2c).
OPMERKING: Ga niet verder met longorganoïde differentiatie als de efficiëntie van NKX2-1 lager is dan 30%.
4.3D long organoïde inductie (dag 16 - 22)
- Op dag 17 ontdooi GFR-keldermembraanmatrixmedium op ijs. Aspirateer het LPC-inductiemedium. Voeg vervolgens 2 μg/ml dispase (1 ml) toe aan de put en resuspend het medium/dispase mengsel met een P1000 pipet. Incubeer bij 37 °C gedurende 15 min. Trituraer het mengsel opnieuw en incubeer bij 37 °C gedurende nog eens 15 minuten.
- Breng de dispase en cellen over in een conische centrifugebuis van 15 ml. Gebruik gekoeld PBS (2-3 ml) om de put te wassen en het dispase/celmengsel opnieuw te suspenderen. Centrifugeer gedurende 5 min bij 400 x g. Verwijder het supernatant handmatig en zorg ervoor dat de medium/celkorrellaag niet wordt losgemaakt. Herhaal de gekoelde PBS-was en centrifugeer de conische centrifugebuis nog eens 5 minuten bij 400 x g.
- Verwijder het supernatant handmatig en voeg vervolgens 2 ml dissociatieoplossing op basis van trypsine toe aan de conische centrifugebuis. Incubeer bij 37 °C gedurende 12 min.
- Na incubatie resuspend cellen met een P1000 pipetpunt. Voeg vervolgens een gelijk volume blusmedia toe aan de conische centrifugebuis en draai gedurende 5 minuten op 400 x g . Aspirateer de supernatant- en resuspendcellen in blusmedium + 10 μM ROCK-remmer Y-27632.
OPMERKING: Succesvolle longorganoïde inductie treedt op wanneer cellen zijn ingebed als aggregaten, niet als afzonderlijke cellen, die het pipetteren dienovereenkomstig aanpassen. - Voer een celtelling uit. Bereken het volume dat nodig is om 5,0-8,0 x 104 cellen per put te verkrijgen. Aliquot de LPC-cel aggregeert in microcentrifugebuizen van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g. Verwijder overtollig supernatant en zorg ervoor dat u de celkorrel niet roert. Laat slechts 10 μL restmedia achter.
- Suspensie de celkorrel opnieuw in 200 μL koud GFR-keldermembraanmatrixmedium en voeg toe aan celkweekmembraaninzetstukken (6,5 mm diameter, 0,4 μm porie, polyestermembraan). Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 30-60 minuten om het GFR-keldermembraanmatrixmedium te laten polymeriseren.
- Voeg 1 ml 3D-organoïde inductiemedium (tabel 1) aangevuld met fibroblastgroeifactor-7 (FGF7) (10 ng / ml), FGF10 (10 ng / ml), GSK3β-remmer / Wnt-activator CHIR (3 μM), epidermale groeifactor (EGF) (10 ng / ml) en 10 μM ROCK-remmer Y-27632 toe aan de basolaterale kamer van het membraaninzetstuk. Vervang het medium om de andere dag gedurende 6 dagen.
5.3D Long organoïde vertakking (Dag 23 - 28)
- Op dag 23 verandering naar 3D-vertakkingsmedium (tabel 1) aangevuld met FGF7 (10 ng / ml), FGF10 (10 ng / ml), GSK3β-remmer / Wnt-activator CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng / ml) en vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF) / placentale groeifactor (PlGF) (10 ng / ml). Vervang het medium om de andere dag gedurende 6 dagen.
OPMERKING: Op dag 6 van 3D-vertakkingsdifferentiatie zouden er meerdere vertakkende organoïden moeten zijn (figuur 2).
6.3D long organoïde rijping (dag 29 - 34)
- Op dag 29, verander naar 3D-rijpingsmedium (tabel 1), wat hetzelfde is als 3D-vertakkingsmedium, maar met de toevoeging van dexamethason (50 nM), cAMP (100 μM) en en 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), een fosfodiësteraseremmer die ook isobutylxanthine (100 μM) wordt genoemd. Vervang het medium om de andere dag gedurende 6 dagen.
OPMERKING: Binnen 24 uur na 3D-rijping moeten de vertakkende organoïden uitzetten en veranderen in transparante bollen.
7.3D Immunocytochemie van longorganoïden
- Voor 3D-organoïde analyse van de hele long, fixeer GFR-keldermembraanmatrixmedium in de membraaninzetstukken met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 1 uur bij 4 °C. Insluiten in paraffine en monteren op dia's volgens standaard gepubliceerde protocollen.
- Voer antigeen ophalen uit voorafgaand aan het kleuren. Luchtwegmarkers omvatten KRT5, MUC5AC en SCGB3A2. Alveolaire markers omvatten SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 en HOPX (figuur 3).
8. Verwijdering van hele longorganoïden uit GFR-keldermembraanmatrixmedium voor passage, FACS of cryopreservatie
- Om de organoïden te distantiëren van het GFR-keldermembraanmatrixmedium, verwijdert u media uit de basale kamer en voegt u 2 μg / ml dispase (1 ml) toe aan de apicale kamer.
- Trituraleer het medium /dispase mengsel voorzichtig met een P1000 pipet en plaats gedurende 15 minuten in de couveuse. Trituraleer het mengsel opnieuw voorzichtig en incubeer nog eens 15 minuten.
- Voeg 1 ml gekoeld PBS (4 °C) toe en breng organoïden met het matrixmedium over in een conische centrifugebuis van 15 ml. Draai 5 min. op 400 x g . Verwijder het bovennatuurlijke middel voorzichtig, om de celkorrel niet te verstoren.
- Was nogmaals met 1 ml gekoelde PBS en draai gedurende 5 minuten op 400 x g . Verwijder het supernatant voorzichtig, om het medium/celmengsel niet te verstoren.
- Voeg 1 ml celloslatingsoplossing toe aan de conische centrifugebuis, triturateer voorzichtig het GFR-Basement membraanmatrixmedium/celmengsel. Plaats in de incubator gedurende 12 minuten voor passaging cellen als aggregaten of voor cryopreservatie), of 20 minuten voor eencellige suspensie.
- Voeg een gelijk volume blusmedia toe en draai gedurende 5 minuten op 400 x g . Resuspend in blusmedium + 10 μM ROCK-remmer Y-27632.
OPMERKING: Bij deze stap mag geen resterend keldermembraanmedium in de buis worden gezien. Als het resterende medium overblijft, herhaalt u stap 8.5 en 8.6. - Voer een celtelling uit. Bereken het volume dat nodig is voor downstream-toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
24 uur na plating, dag 1, moeten iPSC's 50% -90% confluent zijn. Op dag 2 moet DE 90%-95% confluent zijn. Tijdens DE-inductie is het gebruikelijk om significante celdood te observeren op dag 4, maar gehechte cellen behouden een compacte kasseienmorfologie (figuur 2b). Stop met differentiatie als de meerderheid van de aanhangende cellen loskomt en overweeg de blootstelling aan DE-media met activine A met 6-12 uur te verkorten. Tijdens AFE-inductie is de celdood minimaal en blijven cellen aanhangend, maar zullen kleiner en heterogener lijken. Het doorgeven van de cellen op dag 7 mag alleen worden gedaan als de opbrengst van dubbel positieve SOX2 en FOXA2 >80% is. Na het passeren in de keldermembraanmatrix voor 3D LPC-inductie, zullen eerst kleine sferoïden verschijnen, dan groeien en sommige kunnen zich beginnen te vertakken. Genexpressieprofielen voor succesvolle endodermale differentiatie omvatten verhoogde SOX17 bij DE, verhoogde FOXA2 en SOX2 met afnemende SOX17 en de eerste verschijning van NKX2-1, en verhoogde NKX2-1, samen met de aanwezigheid van SOX2 en FOXA2. In overeenstemming met de vroege embryonale ontwikkeling treedt de ventralisatie van AFE op voor de ontwikkeling van longknoppen (NKX2-1+) en dorsalisatie van AFE treedt op voor gastro-intestinale ontwikkeling (SOX2 +). Culturen bij LPC hebben een mix van zowel long- als maagvoorlopers.
Long organoïde inductie van LPC is uitgevoerd met behulp van verschillende methoden. Sommige groepen sorteren de cellen met behulp van NKX2-1 fluorescerende reporters of een oppervlakte-antigeenproxy (CPM, CD26lowCD47high). Maar die longorganoïden bevatten alveolaire type II-achtige cellen zonder alveolaire type I-cellen of mesenchym. Andere groepen hebben celklonten verzameld die de AFE / LPC-monolaag afsnijden en ingebed in de keldermembraanmatrix. Die organoïden bevatten een gemengde populatie van longepitheel- en mesenchymale cellen, maar het duurt maanden om te kweken19. Ons protocol omvat zowel de aanwezigheid van epitheliale als mesenchymale cellen. De WLOs drukken proximale epitheelcelmarkers p63 en KRT5 (basale cellen) en SCGB3A2 (clubcellen) uit, evenals distale epitheelcelmarkers HOPX (ATI) en proSPC, SPB en NKX2-1 (ATII). Ze drukken ook de mesenchymale marker Vimentin uit in het LPC-stadium, evenals in de organoïden van de hele long. PDGFRα is een marker voor fibroblasten die een belangrijke functie in de long hebben tijdens sacculatie en alveolering20 en wordt samen tot expressie gebracht met de transcriptiefactor die belangrijk is bij distale celdifferentiatie, SOX9 (figuur 3).
Onze methode genereert efficiënt NKX2-1-tot expressie brengende LPC 3D-culturen met behulp van signaalmoleculen die voorkomen in de foetale longontwikkeling om vroege longorganoïden te vormen. Bij het doorgeven van LPC's in GFR-keldermembraanmatrixmedium voor longorganoïde-inductie, is het noodzakelijk om niet te veel te dissociëren in een enkele celsuspensie, maar in plaats daarvan kleine klonten cellen (10 cellen / klomp) te behouden. Het tellen van cellen zal niet volledig nauwkeurig zijn, maar nog steeds noodzakelijk om overfluentie te voorkomen tijdens de 3 weken durende longorganoïde differentiatie.
Longorganoïde inductie zou kleine, vertakkende organoïden moeten opleveren op dag 6 van inductie (dag 23 van differentiatie). Deze moeten blijven groeien tijdens de organoïde vertakkingsstap en rijpingsstap. Vierentwintig uur na de introductie van dexamethason, cAMP en IBMX moeten de takken zich uitbreiden tot transparante bollen. Volledige long organoïde analyse kan worden uitgevoerd aan het einde van de differentiatie, of de WLOs kunnen worden doorgang in verse keldermembraanmatrix met GFR of gecryopreserveerd door bevriezing in 10% DMSO.
Figuur 1: Algemeen schema van de differentiatie van whole lung organoid (WLO) van hiPSC's en representatieve gegevens. (a) Schematische van WLO-differentiatie van hiPSC's. Cirkels vertegenwoordigen het endodermale celtype met identificerende markers. Tijdlijn van differentiatie wordt aangegeven in zwarte balken. Groeifactoren en/of kleine moleculen voor inductie van endodermale en longorganoïde populaties. Samenvattend worden stamcellen in ongeveer 16 dagen gedifferentieerd tot definitief endoderm, anterieur foregut endoderm tot longvoorlopercellen. Deze cellen worden vervolgens doorgegeven aan GFR-keldermembraanmatrixmedium met mediuminzetstukken en ondergaan longorganoïde-inductie, vertakking en rijping. De totale differentiatie duurt ongeveer 35 dagen. b) Representatieve fasecontrastbeelden van de cellen in belangrijke endodermale stadia en 3D-beelden van organoïden in de hele longen. Schaal de grootte van de balk zoals aangegeven in het deelvenster. c) qRT-PCR-analyse van longontwikkelingsmarkers tijdens endoderm en (d) organoïde differentiatie van proximale en distale celmarkers in de hele long. Alle gegevens vertegenwoordigen een gemiddelde van 3-5 biologische replicaties. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde en zijn genormaliseerd tot actine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering van endodermdifferentiatie door flowcytometrie en immunocytochemie. (a) Flowcytometrie van definitieve endodermmarker CXCR4. Linkerpaneel toont de gating tegen de niet-gekleurde populatie, terwijl het middelste paneel de CXCR4-positieve populatie toont. Het rechterpaneel toont immunocytochemische afbeelding van SOX17 (rood) bedekt met kernen (blauw). (b) Immunocytochemische afbeelding van AFE-markers FOXA2 en SOX2 bedekt met kernen (blauw). (c) Endogene expressie van NKX2-1-GFP in een reporter cellijn in 3D LPC. Beelden genomen van levende celkweek in brightfield en GFP. Flowcytometrie van longvoorloper intracellulaire marker NKX2-1 na fixatie en permeabilisatie. Schaalbalkgrootte = 50 μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van 3D-organoïden van de hele long na 3 weken differentiatie door immunocytochemie. (a) Proximale longmarkers. Het linkerdeelvenster toont SOX2 (wit) en SOX9 (rood) bedekt met kernen (blauw). Deze markers zijn belangrijk bij het vertakken van morfogenese en vertegenwoordigen de proximale en distale epitheliale populaties. Middelste panelen tonen P63 (rood) en KRT5 (rood), beide markers van basale cellen. Het rechterdeelvenster toont SCGB3A2, een marker van clubcellen. b) Distale longmarkers. Het linkerdeelvenster toont pro-SPC (PSPC), (groen) en HOPX (rood), markeringen van respectievelijk alveolaire type II ad I-cellen, bedekt met kernen (blauw). Het middelste paneel toont pro-SPC (PSPC) (groen) en SPB (rood), markers van alveolaire type II-cellen, bedekt met kernen (blauw). Het rechterpaneel toont NKX2-1 (rood) en ZO1 (groen) bedekt met kernen (blauw). c) Markers van longmesenchym. Het linkerdeelvenster toont PDGFRA (rood) en SOX9 (wit), die distale mesenchym voorstellen. Rechterpaneel toont Vimentin (rood), dat verspreid is over de longen. Schaalbalkgrootte = 50 μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| REAGENTIA EN OPLOSSINGEN - Voor bedrijfsnamen zie de Tabel met Materialenlijst |
| 3D organoïde inductie medium (dag 17-22) |
| Serumvrij basaal medium (zie recept) aangevuld met: |
| FGF7 (10 ng/ml) |
| FGF10 (10 ng/ml) |
| Chir99021 (3 μM) |
| EFG (10 ng/ml) |
| 3D organoïde vertakkend medium (dag 23-28) |
| Serumvrij basaal medium (zie recept) aangevuld met: |
| FGF7 (10 ng/ml) |
| FGF10 (10 ng/ml) |
| Chir99021 (3 μM) |
| All-trans retinoïnezuur (0,1 μM) |
| EFG (10 ng/ml) |
| VEGF/PIGF (10 ng/ml) |
| 3D organoïde rijping medium (dag 29-34) |
| Serumvrij basaal medium (zie recept) aangevuld met: |
| Dexamethason (50 nM) |
| Br-cAMP (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| AFE inductie medium (dag 4-6) |
| Serumvrij basaal medium (zie recept) aangevuld met: |
| SB431542 (10 μM) |
| Doromorfine (2 μM) |
| DE inductie medium (dag 1-3) |
| 48,5 ml RPMI1640 + Glutamax |
| 1 ml B27 zonder retinoïnezuur |
| 500 μl HEPES (1%) |
| 500 μl pen/streptokokken |
| Humane activiteit A (100 ng/ml) |
| CHIR99021 (5 μM) - alleen in de eerste 24 uur |
| LPC inductie medium (dag 7-16) |
| Serumvrij basaal medium (zie recept) aangevuld met: |
| BMP4 (10 ng/ml) |
| All-trans retinoïnezuur (RA) (0,1 μM) |
| Chir99021 (3 μM) |
| Blusmiddel |
| 49 ml DMEM/F12 |
| 1 ml FBS |
| Serumvrij basaal medium (SFBM) |
| 375 ml Iscove's gemodificeerde Dulbecco's Medium (IMDM) + Glutamax |
| 125 ml Ham's F12 |
| 5 ml B27 zonder retinoïnezuur |
| 2,5 ml N2 |
| 500 μl ascorbinezuur, 50 mg/ml |
| 13 μl monothioglycerol/1ml IMDM" gebruik 300ul 0.4mM monothioglycerol per 100ml serumvrije media |
| 3,75 ml runderserumalbumine (BSA) fractie V, 7,5% oplossing |
| 500 μl pen/streptokokken |
| Stamcel passageing medium (dag 0) |
| 500 ml DMEM/F12 |
| 129 ml knock-out serumvervanging (KSR) |
| 6,5 ml glutamax |
| 6,5 ml NEAA |
| 1,3 ml 2-mercaptoethanol |
| 6,5 ml pen/streptokokken |
Tabel 1: Tabel met media.
| Probleem | Oplossing |
| DE-differentiatie niet efficiënt | 24 uur na plating in stamcelmedium moeten cellen 50-70% confluent zijn |
| GSK3β-remmer/Wnt-activator CHIR99021 moet binnen 20-24 uur na dag 1 DE-inductie worden verwijderd | |
| DE-differentiatie mag in totaal niet langer zijn dan 72 uur | |
| AFE-differentiatie niet efficiënt | Zorg ervoor dat DE-differentiatie succesvol was en de cellen > 80% CXCR4 tot expressie brengen |
| Zorg ervoor dat er dagelijks nieuwe groeifactoren/kleine moleculen aan de media worden toegevoegd | |
| LPC-differentiatie niet efficiënt | Zorg ervoor dat de AFE-differentiatie succesvol was en dat de cellen > 80% FOXA2 / SOX2 tot expressie brengen |
| Zorg ervoor dat de AFE-cellen worden doorgegeven als aggregaten van 4-10 cellen en niet als eencellig | |
| 3D-longorganoïden die niet groeien of differentiëren | Zorg ervoor dat de LPC-differentatie succesvol was en dat de cellen > 30% NKX2-1 tot expressie brengen |
| Zorg ervoor dat de LPC's zijn gepasseerd als aggregaten van 4-10 cellen en niet als eencellig | |
| Zorg ervoor dat er geen matrigel achterblijft van de LPC's tijdens het passeren | |
| Voeg ROCK-remmer Y-27632 toe bij elke mediawissel | |
| Zorg ervoor dat de media op tijd worden vervangen en dat nieuwe groeifactoren/kleine moleculen worden toegevoegd | |
| Zorg ervoor dat de concentratie van groeifactoren/kleine moleculen correct is |
Tabel 2: Problemen oplossen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De succesvolle differentiatie van 3D-organoïden voor de hele long (WLO) is gebaseerd op een meerstapsprotocol van 6 weken met aandacht voor detail, inclusief tijd van blootstelling aan groeifactoren en kleine moleculen, cellulaire dichtheid na passaging en de kwaliteit van hiPSC's. Zie tabel 2 voor probleemoplossing. hiPSC's moeten ongeveer 70% -80% confluent zijn, met minder dan 5% spontane differentiatie voorafgaand aan dissociatie. Dit protocol vraagt om "mTeSR plus" medium; gewoon "mTeSR" medium is echter ook gebruikt met vergelijkbare resultaten en is minder duur. Voor de extracellulaire matrix gebruiken we GFR keldermembraanmatrixmedium. We passeren de hiPSC's met behulp van ReLesR (zie Tabel met materialen) om differentiatie te verminderen.
Tijdens endodermdifferentiatie moeten cellen dagelijks worden gevisualiseerd voor en na mediaveranderingen. Gespecificeerde groeifactoren/kleine moleculen moeten dagelijks vers aan het basismedium worden toegevoegd om voortijdige afbraak te voorkomen. Celdood bij definitief endoderm (DE) komt vaak voor, maar moet worden beperkt tijdens de inductie van anterieure foregut endoderm (AFE) en longvoorlopercellen (LPC). Als er een grote afsterving is op de derde dag van DE (dag 4), verlaag dan de totale tijd van DE met 6-12 uur. Nieuwe iPSC-cellijnen moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor succesvolle endodermdifferentiatie. Voer flowcytometrie uit bij DE voor CXCR4 om succesvolle inductie te bevestigen (>85% CXCR4 + cellen). De cellen moeten relatief stabiel zijn bij AFE en zullen morfologisch veranderen met weinig afsterven.
Passaging in LPC is een ander proces dat moet worden geoptimaliseerd voor celtype. Het afstoten van cellen met een te lage dichtheid (<50%) zal resulteren in inefficiënte differentiatie. Bevestig succesvolle LPC-inductie met immunocytochemie voor NKX2-1 of flowcytometrie voor CPM18 of CD26low/CD47high15. Succesvolle LPC-inductie moet >40% NKX2-1 hebben, anders zullen de organoïden een grotere overvloed aan dorsale AFE hebben. Voor LPC-inductie moeten groeifactoren worden toegevoegd aan basismedia bij elke mediawijziging. Als de media later geel worden in LPC-inductie, overweeg dan om het volume van verse media te verhogen of de media elke dag te veranderen. Tijdens 3D-organoïde-inductie van de hele long zijn platingnummer en het onderhouden van celclusters de sleutel tot succesvolle organoïdegroei. GFR-keldermembraanmatrixmedium is moeilijk te hanteren en zeer temperatuurgevoelig, dus houd het altijd op ijs. Als het GFR-keldermembraanmatrixmedium te vroeg gels, zullen de LPC-cellen er niet in integreren. We raden aan om 1 ml aliquots van GFR-keldermembraanmatrixmedium op ijs 30 minuten voorafgaand aan het passeren te ontdooien. Zodra de cellen/clusters zijn geteld en de juiste aliquots zijn gemaakt, plaatst u de celkorrel op ijs. We raden aan om platen voor te bereiden, te labelen en celkweekmembraaninzetstukken toe te voegen voorafgaand aan de behandeling van GFR-keldermembraanmatrixmedium.
Gebruik pipetpunten om het juiste volume vloeibaar GFR-keldermembraanmatrixmedium onmiddellijk aan de celkorrel toe te voegen, zodat het op ijs blijft. Pipetteer snel maar voorzichtig op en neer (genuanceerde hantering) om geen bubbels te introduceren en plaats de buis vervolgens terug op ijs. Voeg het mengsel van de cel en het GFR-keldermembraanmatrixmedium toe aan het apicale deel van de transwell in geprepareerde platen. Het mengsel moet de hele transwell verspreiden en coaten; kantel de plaat voorzichtig om de coating te garanderen. Na 30-60 minuten in de incubator moeten er zichtbare celclusters zijn in het GFR-keldermembraanmatrixmedium. Voeg geschikte longinductiemedia toe aan de basale kamer aangevuld met 10 μM ROCK-remmer Y-27632 en controleer de organoïdegroei om de andere dag.
Toekomstige toepassingen van de organoïden die door dit protocol worden gegenereerd, omvatten het bestuderen van de moleculaire routes die de vroege longlijntoetreding en celbestemmingsspecificatie regelen21,22,23. De interactie tussen het epitheel en mesenchym kan worden bepaald door gebruik te maken van gen knock-out modellen24. De organoïden kunnen ook worden gecokweekt met endotheelcellen om het belang te bepalen van weefselspecifieke co-patroonsignalering tussen het longepitheel, mesenchym en het endotheel25. Longontwikkeling vindt parallel met vasculaire ontwikkeling plaats en die relatie kan belangrijke moleculaire mechanismen oproepen die nodig zijn voor een goede longontwikkeling. We hebben ook aangetoond dat deze hele longorganoïden functioneel zijn door middel van oppervlakteactieve secretietests nadat GFR-keldermembraanmatrixmedium werd verwijderd, gevolgd door kortetermijnkweek in ultralage aanhechtingsputten26. Andere strategieën omvatten het sorteren van de cellen voor celoppervlakmarkers zoals NGFR (basale cellen)27 en HTII-280 (ATII-cellen)28 en deze te vervangen als homogene organoïden of een monolaag in lucht vloeibare interfase cultuuromstandigheden. Hele, proximale en distale longorganoïden zijn ook gebruikt om de cellulaire doelen en pathofysiologie van SARS-CoV-2 virale infectie te bestuderen om beter te begrijpen en te screenen op geneesmiddelen die COVID-19 kunnen bestrijden.
Dit protocol is robuust en reproduceerbaar, maar er zijn nog veel uitdagingen. Er zijn veel verschillende iPSC- en ESC-lijnen getest (>20 lijnen), maar het protocol moet voor elke cellijn worden geoptimaliseerd. Ondanks robuuste DE- en AFE-inductie kan LPC-inductie moeilijk te bereiken zijn >40% van NKX2-1 + cellen. Andere protocollen omvatten een sorteerstap voor oppervlaktemarkers van NKX2-1-cellen15,18, maar die leveren alleen alveolaire type II-achtige organoïden zonder mesenchym op en bevatten nog steeds maag- en levercelpopulaties ondanks het zuiveren van de longvoorloperpopulatie29. We hebben ook een kleine hoeveelheid maag- en levercellen opgemerkt in zowel de LPC- als de hele longorganoïden, mogelijk als gevolg van de aanwezigheid van dorsale anterieure foregutcellen die de LPC's besmetten. Daarom moet de differentiatie van zuivere longorganoïden nog worden bereikt en moet meer onderzoek naar de ontwikkeling van de longvoorlopercellen in menselijk weefsel worden voltooid. Downstream-assays moeten krachtig worden gebenchmarkt met gen- en eiwitexpressie uit primair menselijk longweefsel. Hoewel tot op heden het meest vruchtbare gebruik van longorganoïden is geweest bij het modelleren van ziekten en het screenen op geneesmiddelen in vitro, is de transplantatie van hiPSC-afgeleide longorganoïden in patiënten voor regeneratieve geneeskunde overwogen als een toekomstige therapie voor een reeks aandoeningen. Alvorens dergelijke interventies te overwegen, moet echter een groot deel van de kwaliteitscontrole worden geperfectioneerd, waaronder de identificatie en verwijdering van verontreinigende, ongewenste, potentieel tumorogene hiPSC-derivaten. Bovendien moeten er nog betere functionele assays in vitro en betere diermodellen van longziekten worden ontwikkeld.
In het bijzonder moeten de functionaliteit en veiligheid van hiPSC-afgeleide cellen worden bevestigd. Ongedifferentieerde cellen moeten worden uitgesloten omdat ze het vermogen hebben om teratomen te genereren. Een methode om ongedifferentieerde stamcellen in definitief endoderm te bepalen, is het sorteren van de cellen met behulp van de pluripotentiemarker SSEA4. Markergenen voor ongedifferentieerde hiPSC's werden onlangs gedetecteerd met behulp van single cell RNA sequencing30. ESRG, CNMD en SFRP2 kunnen worden gebruikt om ongedifferentieerde cellen te valideren bij elke differentiatiestap. Zodra de zuiverheid is bevestigd, is het voordeel van autologe iPSC-afgeleide therapieën het vermogen voor de getransplanteerde cellen om afstoting te voorkomen, omdat ze afkomstig zijn van de eigen cellen van de patiënt. De nadelen omvatten de tijd die nodig is om de cellen volledig te differentiëren, rigoureuze klinische tests te ondergaan en de cellen te transplanteren in een patiënt met een acuut letsel (respiratory distress syndrome, myocardinfarct of ruggenmergletsel). Het alternatief is om gebankte allogene iPSC-afgeleide cellen te gebruiken31. Deze kunnen worden opgeslagen en direct beschikbaar zijn voor patiënten met donoren met humaan leukocytenantigeen (HLA) en ze zullen grondig zijn getest op besmetting. Het grootste nadeel is de mogelijkheid van immuunafstoting. Immunosuppressie kan nodig zijn bij allogene celtransplantatie, wat de huidige realiteit is van allogene hele weefseltransplantaties. Er worden strategieën bedacht om de allogene iPSC-afgeleide cellen in staat te stellen de immuunrespons te ontwijken om ze veilig in patiënten te transplanteren32.
Uiteindelijk zullen iPSC-afgeleide hele longorganoïden worden gebruikt om patiëntspecifieke ziektemodellen te bestuderen, therapieën op maat te maken en regeneratief medisch onderzoek te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door het California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A.
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X.
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C.
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
