Summary
Artikkelen beskriver trinnvis rettet differensiering av induserte pluripotente stamceller til tredimensjonale hele lungeorganoider som inneholder både proksimale og distale epiteliale lungeceller sammen med mesenchyme.
Abstract
Menneskelig lungeutvikling og sykdom har vært vanskelig å studere på grunn av mangel på biologisk relevante in vitro-modellsystemer . Menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCer) kan differensieres trinnvis i 3D multicellulære lungeorganoider, laget av både epitel- og mesenchymale cellepopulasjoner. Vi rekapitulerer embryonale utviklingssignaler ved å bevisst introdusere en rekke vekstfaktorer og små molekyler for effektivt å generere definitiv endoderm, fremre foregut endoderm, og deretter lunge forfedre celler. Disse cellene er deretter innebygd i vekstfaktor redusert (GFR) -kjeller membran matrise medium, slik at de spontant kan utvikle seg til 3D lunge organoider som svar på eksterne vekstfaktorer. Disse hele lungeorganoidene (WLO) gjennomgår tidlige lungeutviklingsstadier, inkludert forgrening av morfogenese og modning etter eksponering for deksametason, syklisk AMP og isobutylxanthine. WLOer har epitelceller i luftveiene som uttrykker markørene KRT5 (basal), SCGB3A2 (klubb) og MUC5AC (beger) samt alveolar epitelceller som uttrykker HOPX (alveolar type I) og SP-C (alveolar type II). Mesenchymale celler er også til stede, inkludert glatt muskel actin (SMA), og blodplate-avledet vekstfaktor reseptor A (PDGFRα). iPSC-avledede WLOer kan opprettholdes under 3D-kulturforhold i mange måneder og kan sorteres for overflatemarkører for å rense en bestemt cellepopulasjon. iPSC-avledede WLOer kan også brukes til å studere menneskelig lungeutvikling, inkludert signalering mellom lungeepitelet og mesenchyme, for å modellere genetiske mutasjoner på menneskelig lungecellefunksjon og utvikling, og for å bestemme cytotoksisiteten til infektive midler.
Introduction
Lungen er et komplisert, heterogent, dynamisk organ som utvikler seg i seks forskjellige stadier - embryonal, pseudoglandulær, canalicular, saccular, alveolar og mikrovaskulær modning1,2. De to siste fasene forekommer før og postnatalt i menneskelig utvikling, mens de fire første stadiene forekommer utelukkende under fosterutvikling med mindre preterm fødsel oppstår3. Den embryonale fasen begynner i det endodermale bakterielaget og avsluttes med spirende luftrør og lungeknopper. Lungeutvikling skjer delvis via signalering mellom epitelceller og mesenchymale celler4. Disse interaksjonene resulterer i lungeforgrening, spredning, cellulær skjebnebestemmelse og cellulær differensiering av den utviklende lungen. Lungen er delt inn i ledende soner (luftrør til terminalbronkiolene) og åndedrettssoner (respiratoriske bronkioler til alveolene). Hver sone inneholder unike epitelcelletyper. inkludert basale, sekretoriske, cilierte, børste-, nevroendokrine og ionocyttceller i den ledende luftveiene5, etterfulgt av alveolar type I- og II-celler i respiratorisk epitel6. Mye er fortsatt ukjent om utvikling og respons på skade på de ulike celletypene. iPSC-avledede lungeorganoidmodeller muliggjør studiet av mekanismer som driver menneskelig lungeutvikling, effekten av genetiske mutasjoner på lungefunksjon, og responsen fra både epitelet og mesenchymet til smittsomme stoffer uten behov for primært humant lungevev.
Markører som tilsvarer de ulike stadiene av embryonal differensiering inkluderer CXCR4, cKit, FOXA2 og SOX17 for definitiv endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 og SOX2 for fremre foregut endoderm (AFE)8, og NKX2-1 for tidlige lungegenitorceller9. I embryonal lungeutvikling deler foregut seg i dorsal spiserøret og ventral luftrøret. Knoppene til høyre og venstre lunger vises som to uavhengige outpouchings rundt trakeal knopp10. Under forgrening av morfogenese produserer mesenchymet rundt epitelet elastisk vev, glatt muskel, brusk og vaskulatur11. Samspillet mellom epitel og mesenchyme er avgjørende for normal lungeutvikling. Dette inkluderer sekresjonen av FGF1012 av mesenchyme og SHH13 produsert av epitelet.
Her beskriver vi en protokoll for rettet differensiering av hiPSCer til tredimensjonale (3D) hele lungeorganoider (WLO). Mens det er lignende tilnærminger som inkorporerer isolasjon av lungeforfedrederceller via sortering på LPC-scenen for å lage alveolarlignende 14,15 (distale) organoider eller luftveier16 (proksimale) organoider, eller generere ventral-fremre foregut sfæroider for å lage menneskelige lungeorganoider som uttrykker alveolarcelle og mesenchymale markører og knoppeprogenitorer , styrken av denne metoden er inkludering av både lunge epitelial og mesenchymal celletyper for å mønstre og orkestrere lungeforgrening morfogenese, modning og ekspansjon in vitro.
Denne protokollen bruker små molekyler og vekstfaktorer for å lede differensiering av pluripotente stamceller gjennom definitiv endoderm, fremre foregut endoderm og lungeforfedrederceller. Disse cellene blir deretter indusert i 3D hele lungeorganoider gjennom viktige utviklingstrinn, inkludert forgrening og modning. Oppsummeringen av differensieringsprotokollen er vist i figur 1a med representative brightfield-bilder av endodermal og organoid differensiering vist i figur 1b. Figur 1c,d viser genuttrykksdetaljene til endodermal differensiering samt genuttrykket til både proksimale og distale populasjoner av lungeepitelceller etter å ha fullført differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studieprotokollen ble godkjent av Institutional Review Board i UCSDs Human Research Protections Program (181180).
1. Definitiv endoderm induksjon fra induserte pluripotente stamceller (Dag 1 - 3)
- Tines sakte vekstfaktoren redusert (GFR)-kjellermembran (BM) matrisemedium på is 30 minutter før bruk. I kald DMEM / F12 fortynner blanding GFR BM-matrisemediet 1:1 slik at det utgjør 50% av dette mediet. Plasser P1000 pipettespisser i fryseren for å kjøle deg ned før bruk.
- Belegge hver brønn av en 12-brønns plate med 500 μL 50% GFR-kjellermembranmatrise medium tilberedt i iskald DMEM / F12. Når ønsket antall brønner er belagt, fjern overflødig medium blanding og / eller bobler fra brønner og plasser platen på is eller kjøleskap ved 4 °C i 20 minutter å stille inn. Flytt deretter platen til inkubatoren ved 37 °C over natten for å gele og tørke.
- Når hiPSCer når 70-90% samløp, legg til 10 μM Rho-assosiert kinase (ROCK) Inhibitor Y-27632 i timen før dissosiasjon. Aspirer av media og vask en gang med fosfatbufret saltvann (PBS). Fjern hiPSC ved å legge til celleavløsningsmedium (0,5 ml/ brønn av en 12-brønnsplate) og inkubere i 20 minutter ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator.
- Fjern plater fra inkubatoren og tilsett 0,5 ml/12 brønn stamcellepasningsmedium (tabell 1) til brønnene; trianturer forsiktig celler ved hjelp av en P1000-spiss for å oppnå encellet suspensjon. Overfør dissosierte celler til et 15 ml konisk sentrifugerør; sentrifuge i 5 min ved 300 x g.
- Aspirer av mediet og resuspender cellepelleten med 1 ml mTeSR Plus-medier supplert med 10 μM ROCK-hemmer (Y-27632). Utføre et celleantall. Tilsett 2,0 x 105 hiPSCer i 1 ml mTeSR supplert med ROCK Inhibitor Y-27632 per brønn av en 12-brønns GFR-kjellermembran middels belagt plate. Inkuber ved 37 °C over natten.
MERK: Cellesåingsnummeret må optimaliseres per cellelinje. 24 timer etter plating skal brønnene være 50%-70% konfluensa. - På dag 1 aspirerer du av mTeSR Plus og legger til Definitive Endoderm (DE) induksjonsmedier (tabell 1) supplert med 100 ng/ml menneskelig aktivin A og 5 μM GSK3β-hemmer/Wnt-aktivator CHIR99021.
MERK: DE-medier med GSK3β-hemmer/Wnt-aktivator CHIR99021 bør fjernes innen 20-24 timer etter dag 1 DE-induksjon for vellykket differensiering. - På dag 2 og dag 3, bytt til DE induksjonsmedier supplert med 100 ng /ml kun av aktivin A.
MERK: DE-differensiering bør ikke overstige totalt 72 timer, ellers vil effekten avta. På dag 4, hvis store celle die-off observeres, redusere total DE media eksponeringstid med 6-12 h. - For å analysere DE-effektivitet må du bekrefte mer enn 90 % CXCR4- og/eller cKit-uttrykk via strømningscytometri eller immunfluorescensanalyse av FOXA2 og/eller SOX17 (figur 2a).
2. Anterior foregut endoderm (AFE) induksjon (Dag 4 - 6)
- På dag 4, bytt medium til serumfritt basalmedium (SFBM) (tabell 1) supplert med 10 μM SB431542 og 2 μM Dorsomorphin for AFE induksjon. Endre AFE-medier daglig i 3 dager (dag 4, dag 5 og dag 6).
- For å analysere AFE-effektiviteten må du bekrefte robust uttrykk for SOX2, TBX1 og FOXA2 via immunfluorescensfarging (figur 2b).
3. Lunge forfedre celle (LPC) differensiering (Dag 7 - 16)
- På dag 7 tiner du GFR-kjellermembranmatrisemedium på is. Aspirer av AFE-mediet og vask godt med 1x PBS. Tilsett 1 ml celleavløsningsløsning og inkuber i 10 min ved 37 °C.
- Tilsett 1 ml slukkemedium (2 % FBS i DMEM/F12) i brønnene som inneholder celleavløsningsløsning. Hold cellene som aggregater ved å pipettere forsiktig opp og ned. Pass på at alle celler løsnes og overføres til et konisk sentrifugerør på 15 ml. Sentrifuge i 5 min ved 300 x g.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepellet i slukkemediet supplert med 10 ng/ml humant rekombinant benmorfogene protein-4 (BMP4), 0,1 μM all-trans retinoinsyre (RA), 3 μM GSK3β-hemmer/Wnt-aktivator CHIR99021, og 10 μM rock inhibitor Y-27632.
- Utføre et celleantall. Tilsett 2,5 x 105 celler til 100 μL kaldt GFR-kjellermembranmatrisemedium, bland godt og legg dråpen i en brønn på en 12-brønns plate. Inkuber platen ved 37 °C i 30-60 min for å la mediet polymerisere seg. Tilsett 1 ml LPC-medier supplert med 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 per brønn, noe som sikrer at mediumfallet er helt nedsenket og inkuberer ved 37 °C over natten.
- På dag 8, 24 timer etter LPC-induksjon, bytt LPC-medium for å fjerne ROCK Inhibitor Y-27632. Endre LPC-mediet annenhver dag i totalt 9-11 dager.
MERK: Hvis mediet blir gult innen 24 timer, bytt medium hver dag. - For å analysere LPC-effektiviteten må du bekrefte et robust uttrykk for den intracellulære transkripsjonsfaktoren NKX2-1 eller utføre strømningscytometri for overflatemarkører CD47hi/CD26low15 eller CPM18 (figur 2c). Grovt skal LPC-sfæroidene være runde og gjennomsiktige (figur 2c).
MERK: Ikke fortsett med lungeorganoid differensiering hvis effektiviteten til NKX2-1 er under 30%.
4.3D lungeorganoid induksjon (Dag 16 - 22)
- På dag 17 tiner du GFR-kjellermembranmatrisemedium på is. Aspirer LPC-induksjonsmediet. Tilsett deretter 2 μg/ml dispase (1 ml) i brønnen og resuspender medium/dispase-blandingen med en P1000 pipette. Inkuber ved 37 °C i 15 minutter. Triturer blandingen igjen og inkuber ved 37 °C i ytterligere 15 minutter.
- Overfør dispase og celler til et 15 ml konisk sentrifugerør. Bruk kjølt PBS (2-3 ml) til å vaske brønnen og bruke dispenser/celleblandingen på nytt. Sentrifuge i 5 min ved 400 x g. Fjern supernatanten manuelt, og pass på at du ikke løsner medium/celle pelletslaget. Gjenta den avkjølte PBS-vasken, og sentrifuger det koniske sentrifugerøret i ytterligere 5 minutter ved 400 x g.
- Fjern supernatanten manuelt, og tilsett deretter 2 ml trypsinbasert dissosiasjonsløsning til det koniske sentrifugerøret. Inkuber ved 37 °C i 12 minutter.
- Etter inkubasjon, resuspend celler med en P1000 pipettespiss. Legg deretter et likt volum av slukkemedier til det koniske sentrifugerøret og spinn ned på 400 x g i 5 min. Aspirer de supernatante og resuspendcellene i slukkemedium + 10 μM rock inhibitor Y-27632.
MERK: Vellykket lungeorganoid induksjon oppstår når celler er innebygd som aggregater, ikke enkeltceller, justerer pipettering tilsvarende. - Utføre et celleantall. Beregn volumet som trengs for å oppnå 5,0-8,0 x 104 celler per brønn. Aliquot LPC-cellen aggregeres i 1,5 ml mikrosenterrør og sentrifuge i 5 min ved 400 x g. Fjern overflødig supernatant, vær forsiktig så du ikke agiterer cellepellet. La bare 10 μL gjenværende medier.
- Re-suspendere cellepellet i 200 μL kald GFR-kjeller membran matrise medium og legge til cellekultur membran innsatser (6,5 mm diameter, 0,4 μm pore, polyester membran). Inkuber platen ved 37 °C i 30–60 minutter, slik at GFR-kjellermembranmatrisemediet kan polymeriseres.
- Tilsett 1 ml 3D organoid induksjonsmedium (tabell 1) supplert med fibroblast vekstfaktor-7 (FGF7) (10 ng/ml), FGF10 (10 ng/ml), GSK3β hemmer/Wntaktivator CHIR (3 μM), epidermal vekstfaktor (EGF) (10 ng/ml) og 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 til det basolaterale kammeret i membraninnsatsen. Bytt medium annenhver dag i 6 dager.
5.3D Lungeorganoid forgrening (Dag 23 - 28)
- På dag 23 bytte til 3D forgrening medium (Tabell 1) supplert med FGF7 (10 ng/ml), FGF10 (10 ng/ml), GSK3β hemmer/Wnt aktivator CHIR9902 1 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng/ml) og vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF) / placental vekstfaktor (PlGF) (10 ng/ml). Bytt medium annenhver dag i 6 dager.
MERK: På dag 6 av 3D-forgreningsdifferensiering bør det være flere forgreningsorganoider (figur 2).
6.3D lungeorganoid modning (Dag 29 - 34)
- På dag 29, 3D-modningsmedium (tabell 1), som er det samme som 3D-forgreningsmedium, men med tilsetning av deksametason (50 nM), cAMP (100 μM) og 3-isobutyl-1-metylxanthine (IBMX), en fosfodiesterhemmerase også kalt isobutylxanthine (100 μM). Bytt medium annenhver dag i 6 dager.
MERK: Innen 24 timer etter 3D-modning skal forgreningsorganoidene ekspandere og endres til gjennomsiktige sfærer.
7.3D Lungeorganoid immuncytokjemi
- For 3D-hel lungeorganoidanalyse, fest GFR-kjellermembranmatrisemediet i membraninnleggene med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time ved 4 °C. Bygg inn parafinvoks og monter på lysbilder i henhold til standard publiserte protokoller.
- Utfør antigenuthenting før farging. Luftveismarkører inkluderer KRT5, MUC5AC og SCGB3A2. Alveolar-markører inkluderer SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 og HOPX (figur 3).
8. Fjerning av hele lungeorganoider fra GFR-kjellermembranmatrisemedium for passasje, FACS eller kryopreservering
- For å fjerne organoidene fra GFR-kjellermembranmatrisemediet, fjern medier fra basalkammeret og tilsett 2 μg/ml dispase (1 ml) i det apikale kammeret.
- Trianturer forsiktig medium / dispase-blandingen med en P1000 pipette og plasser den i inkubatoren i 15 min. Trianturer blandingen forsiktig igjen og inkuber i ytterligere 15 minutter.
- Tilsett 1 ml kjølt PBS (4 °C) og overfør organoider med matrisemediet til et konisk sentrifugerør på 15 ml. Spinn på 400 x g i 5 min. Fjern supernatanten forsiktig, ikke for å forstyrre cellepellet.
- Vask igjen med 1 ml kjølt PBS og spinn ned på 400 x g i 5 min. Fjern supernatanten forsiktig, ikke for å forstyrre medium / celleblandingen.
- Tilsett 1 ml celleavløsningsløsning til det koniske sentrifugerøret, triturat forsiktig resuspend GFR-Kjeller membranmatrise medium / celleblanding. Plasser i inkubatoren i 12 min for å passere celler som aggregater eller for kryopreservering), eller 20 min for encellet suspensjon.
- Legg til like mye slukkemedier og spinn ned ved 400 x g i 5 minutter. Resuspend i slukkemedium + 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632.
MERK: På dette trinnet bør det ikke ses noe gjenværende kjellermembranmedium i røret. Hvis restmediet gjenstår, gjentar du trinn 8,5 og 8,6. - Utføre et celleantall. Beregn volumet som trengs for nedstrømsapplikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
24 timer etter plating, dag 1, iPSC bør være 50% -90% confluent. På dag 2 skal DE være 90%-95% confluent. Under DE-induksjon er det vanlig å observere betydelig celledød på dag 4, men vedlagte celler vil beholde en kompakt brosteinsmorfologi (figur 2b). Avslutt differensiering hvis flertallet av tilhengercellene løsner og vurderer å forkorte eksponeringen for DE-medier med aktivin A med 6-12 timer. Under AFE-induksjon er celledøden minimal, og cellene forblir tilhenger, men vil virke mindre og mer heterogene. Passering av cellene på dag 7 må bare gjøres hvis utbyttet av dobbelt positivt SOX2 og FOXA2 er >80%. Etter å ha passert inn i kjellermembranmatrisen for 3D LPC-induksjon, vil små sfæroider først vises, deretter vokse og noen kan begynne å forgrene seg. Genuttrykksprofiler for vellykket endodermal differensiering inkluderer økt SOX17 ved DE, økt FOXA2 og SOX2 med redusert SOX17 og det første utseendet til NKX2-1, og økt NKX2-1, sammen med tilstedeværelsen av SOX2 og FOXA2. I samsvar med tidlig embryonal utvikling oppstår ventralisering av AFE for lungeknopputvikling (NKX2-1+) og dorsalisering av AFE oppstår for gastrointestinal utvikling (SOX2+). Kulturer ved LPC vil ha en blanding av både lunge- og magegenitorer.
Lungeorganoid induksjon fra LPC har blitt utført ved hjelp av ulike metoder. Noen grupper sorterer cellene ved hjelp av NKX2-1 fluorescerende reportere eller en overflateantigenproxy (CPM, CD26lowCD47high). Men disse lungeorganoidene inneholder alveolar type II som celler uten alveolar type I celler eller mesenchyme. Andre grupper har samlet celleklumper som knopper av AFE / LPC monolayer og innebygd dem i kjellermembranmatrisen. Disse organoidene inneholder en blandet populasjon av lungeepitele og mesenchymale celler, men tar måneder til kultur19. Vår protokoll inkluderer både tilstedeværelsen av epitelceller og mesenchymale celler. WLOene uttrykker proksimale epitelcellemarkører p63 og KRT5 (basale celler) og SCGB3A2 (klubbceller) samt distale epitelcellemarkører HOPX (ATI) og proSPC, SPB og NKX2-1 (ATII). De uttrykker også den mesenchymale markøren Vimentin på LPC-scenen, så vel som i hele lungeorganoidene. PDGFRα er en markør for fibroblaster som har en viktig funksjon i lungen under sakkulering og alveolarisering20 og uttrykkes samtidig med transkripsjonsfaktoren som er viktig i distal celledifferensiering, SOX9 (figur 3).
Vår metode genererer effektivt NKX2-1-uttrykkende LPC 3D-kulturer ved hjelp av signalmolekyler som forekommer i foster lungeutvikling for å danne tidlige lungeorganoider. Ved passering av LPCer i GFR-kjellermembranmatrisemedium for lungeorganoid induksjon, er det viktig å ikke over-dissosiere i en enkelt celle suspensjon, men å i stedet beholde små klumper av celler (10 celler / klump). Celletelling vil ikke være helt nøyaktig, men fortsatt nødvendig for å unngå overløp under 3-ukers lungeorganoid differensiering.
Lungeorganoid induksjon bør gi små, forgrenende organoider etter dag 6 av induksjon (dag 23 av differensiering). Disse bør fortsette å vokse under det organoide forgreningstrinnet og modningstrinnet. Tjuefire timer etter innføringen av deksametason, cAMP og IBMX, bør grenene utvide seg til gjennomsiktige sfærer. Hele lungeorganoidanalysen kan utføres på slutten av differensiering, eller WLOene kan passeres inn i fersk kjellermembranmatrise med GFR eller kryopreservert ved å fryse ned i 10% DMSO.
Figur 1: Samlet skjematisk for hel lungeorganoid (WLO) differensiering fra hiPSCer og representative data. (a) Skjematisk WLO-differensiering fra hiPSCer. Sirkler representerer endodermal celletype med identifiserende indikatorer. Tidslinje for differensiering er angitt i svarte stolper. Vekstfaktorer og/eller små molekyler for induksjon av endodermale og lungeorganoide populasjoner. Oppsummert differensieres stamceller til definitiv endoderm, fremre foregut endoderm og inn i lungeforfedrederceller på ca. 16 dager. Disse cellene passerer deretter inn i GFR-kjellermembranmatrisemediet som inneholder middels innsatser og gjennomgår lungeorganoid induksjon, forgrening og modning. Den totale differensiering tar ca 35 dager. (b) Representative fasekontrastbilder av cellene i store endodermale stadier og 3D-bilder av hele lungeorganoider. Skalalinjestørrelse som angitt i panelet. (c) qRT-PCR-analyse av lungeutviklingsmarkører under endoderm og (d) hele lungeorganoid differensiering av proksimale og distale cellemarkører. Alle data representerer i gjennomsnitt 3-5 biologiske replikeringer. Feilfelt representerer standardfeil av gjennomsnittet og normaliseres til aktin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakterisering av endodermdifferensiering ved strømningscytometri og immunocytokjemi. (a) Strømningscytometri av definitiv endodermmarkør CXCR4. Venstre panel viser gating mot den unstained befolkningen mens midtpanelet viser CXCR4 positiv befolkning. Høyre panel viser immunocytokjemi bilde av SOX17 (rød) overlagt med kjerner (blå). (b) Immunocytokjemi bilde av AFE markører FOXA2 og SOX2 overlaid med kjerner (blå). (c) Endogene uttrykk for NKX2-1-GFP i en reportercellelinje i 3D LPC. Bilder tatt fra live cellekultur i brightfield og GFP. Strømningscytometri av lungeforfeder intracellulær markør NKX2-1 etter fiksering og permeabilisering. Skalalinjestørrelse = 50 μM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av 3D hele lungeorganoider etter 3-ukers differensiering ved immunocytokjemi. Venstre panel viser SOX2 (hvit) og SOX9 (rød) lagt over av kjerner (blå). Disse markørene er viktige for å forgrene morfogenese og representere de proksimale og distale epitelpopulasjonene. Midtpanelene viser P63 (rød) og KRT5 (rød), begge markører av basale celler. Det høyre panelet viser SCGB3A2, en markør for klubbceller. (b) Distale lungemarkører. Venstre panel viser henholdsvis pro-SPC (PSPC), (grønn) og HOPX (rød), markører av alveolar type II ad I-celler, lagt over med kjerner (blå). Midtpanelet viser pro-SPC (PSPC) (grønn) og SPB (rød), markører av alveolar type II celler, overlagt med kjerner (blå). Høyre panel viser NKX2-1 (rød) og ZO1 (grønn) overlagt med kjerner (blå). (c) Markører av lungemesenchyme. Venstre panel viser PDGFRA (rød) og SOX9 (hvit), som representerer distal mesenchyme. Høyre panel viser Vimentin (rød), som er spredt over hele lungen. Skalalinjestørrelse = 50 μM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| REAGENSER OG LØSNINGER - For firmanavn se materiallisten |
| 3D organoid induksjonsmedium (dag 17-22) |
| Serumfritt basalmedium (se oppskrift) supplert med: |
| FGF7 (10 ng/ml) |
| FGF10 (10 ng/ml) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| EGF (10 ng/ml) |
| 3D organoid forgrening medium (dag 23-28) |
| Serumfritt basalmedium (se oppskrift) supplert med: |
| FGF7 (10 ng/ml) |
| FGF10 (10 ng/ml) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| All-trans retinoinsyre (0,1 μM) |
| EGF (10 ng/ml) |
| VEGF/PIGF (10 ng/ml) |
| 3D organoid modningsmedium (dag 29-34) |
| Serumfritt basalmedium (se oppskrift) supplert med: |
| Deksametason (50 nM) |
| Br-cAMP (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| AFE induksjonsmedium (dag 4-6) |
| Serumfritt basalmedium (se oppskrift) supplert med: |
| SB431542 (10 μM) |
| Dorsomorphin (2 μM) |
| DEduksjonsmedium (dag 1-3) |
| 48,5 ml RPMI1640 + Glutamax |
| 1 ml B27 uten retinoinsyre |
| 500 μl HEPES (1 %) |
| 500 μl penn/strep |
| Humant aktivin A (100 ng/ml) |
| CHIR99021 (5 μM) - bare i løpet av de første 24 timene |
| LPC induksjonsmedium (dag 7-16) |
| Serumfritt basalmedium (se oppskrift) supplert med: |
| BMP4 (10 ng/ml) |
| All-trans retinoinsyre (RA) (0,1 μM) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Slukkingsmedium |
| 49 ml DMEM/F12 |
| 1 ml FBS |
| Serumfritt basalmedium (SFBM) |
| 375 ml Iscoves modifiserte dulbeccos medium (IMDM) + glutamax |
| 125 ml Skinkes F12 |
| 5 ml B27 uten retinoinsyre |
| 2,5 ml N2 |
| 500 μl askorbinsyre, 50 mg/ml |
| 13 μl monothioglyserol/1 ml IMDM" bruk 300ul av 0,4 mM monothioglyserol per 100 ml serumfrie medier |
| 3,75 ml bovint serumalbumin (BSA) Brøk V, 7,5 % løsning |
| 500 μl penn/strep |
| Stamcelle passerer medium (dag 0) |
| 500 ml DMEM/F12 |
| 129 ml knockout serum erstatning (KSR) |
| 6,5 ml Glutamax |
| 6,5 ml NEAA |
| 1,3 ml 2-mercaptoetanol |
| 6,5 ml penn/strep |
Tabell 1: Mediebord.
| Problem | Løsning |
| DE-differensiering ikke effektiv | 24 timer etter plating i stamcellemedium, bør cellene være 50-70% konfluente |
| GSK3β-hemmer/Wnt-aktivator CHIR99021 bør fjernes innen 20-24 timer etter dag 1 FRADRAG | |
| DE differensiering bør ikke overstige totalt 72 timer | |
| AFE-differensiering ikke effektiv | Forsikre deg om at DE-differensiering var vellykket og cellene uttrykker > 80% CXCR4 |
| Sikre at friske vekstfaktorer/små molekyler legges til media daglig | |
| LPC-differensiering ikke effektiv | Forsikre deg om at AFE-differensiering var vellykket og cellene uttrykker > 80% FOXA2 / SOX2 |
| Sørg for at AFE-cellene passerer som aggregater av 4-10 celler og ikke encellede | |
| 3D lungeorganoider vokser eller differensierer ikke | Forsikre deg om at LPC-differensasjonen var vellykket og cellene uttrykker > 30% NKX2-1 |
| Sørg for at LPCene ble passert som aggregater av 4-10 celler og ikke encellede | |
| Pass på at det ikke er rester av matrigel fra LPC-ene under passivring | |
| Legg til ROCK Inhibitor Y-27632 med hver medieendring | |
| Sørg for at mediene endres i tide, og at nye vekstfaktorer/små molekyler tilsetts | |
| Sikre at konsentrasjonen av vekstfaktorer/små molekyler er riktig |
Tabell 2: Feilsøking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vellykkede differensiering av 3D hele lungeorganoider (WLO) er avhengig av en flertrinns, 6-ukers protokoll med oppmerksomhet på detaljer, inkludert tidspunkt for eksponering for vekstfaktorer og små molekyler, cellulær tetthet etter passivitet og kvaliteten på hiPSCer. Hvis du vil ha feilsøking, kan du se tabell 2. hiPSCer bør være omtrent 70% -80% sammenfallende, med mindre enn 5% spontan differensiering før dissosiasjon. Denne protokollen krever "mTeSR plus"-medium. Imidlertid har vanlig "mTeSR" -medium også blitt brukt med sammenlignbare resultater og er billigere. For den ekstracellulære matrisen bruker vi GFR kjellermembranmatrisemedium. Vi passerer hiPSCene ved hjelp av ReLesR (se Materialfortegnelse) for å redusere differensiering.
Under endoderm differensiering bør celler visualiseres daglig før og etter medieendringer. Spesifiserte vekstfaktorer/små molekyler bør tilsettes frisk daglig til basismediet for å forhindre for tidlig nedbrytning. Celledød i definitiv endoderm (DE) er vanlig, men bør begrenses under fremre foregut endoderm (AFE) og lunge stamcelle (LPC) induksjon. Hvis det er en stor død på den tredje dagen i DE (dag 4), redusere total tid på DE med 6-12 h. Nye iPSC-cellelinjer må kanskje optimaliseres for vellykket endoderm differensiering. Utfør strømningscytometri ved DE for CXCR4 for å bekrefte vellykket induksjon (>85% CXCR4 + celler). Cellene skal være relativt stabile ved AFE og vil endre seg morfologisk med lite dø av.
Passering til LPC er en annen prosess som må optimaliseres for celletype. Replating celler ved for lav tetthet (<50%) vil resultere i ineffektiv differensiering. Bekreft vellykket LPC-induksjon med immunocytokjemi for NKX2-1 eller strømningscytometri for CPM18 eller CD26low/CD47high15. Vellykket LPC-induksjon må ha >40% NKX2-1, ellers vil organoidene ha større overflod av dorsal AFE. For LPC-induksjon må vekstfaktorer legges til basismedier for hver medieendring. Hvis mediet senere blir gult i LPC-induksjon, bør du vurdere å øke volumet av ferske medier eller endre mediet hver dag. Under 3D hel lunge organoid induksjon, plating tall og opprettholde celle klynger er nøkkelen til vellykket organoid vekst. GFR-kjellermembranmatrisemedium er vanskelig å håndtere og svært temperaturfølsomt, så hold det alltid på is. Hvis GFR-kjellermembranmatrisen medium geler for tidlig, vil LPC-cellene ikke integreres i den. Vi anbefaler å tine 1 ml aliquots av GFR-kjellermembranmatrisemedium på is 30 min før passaging. Når cellene/klyngene er talt opp og passende aliquots laget, plasser cellepellet på is. Vi foreslår at du klargjør plater, merking og tilsetning av cellekulturmembraninnlegg før GFR-kjellermembranmatrise middels håndtering.
Bruk pipettespisser for å legge til riktig volum av flytende GFR-kjellermembranmatrisemedium umiddelbart til cellepellet, og hold på is. Pipette opp og ned raskt, men forsiktig (nyansert håndtering) for ikke å introdusere bobler, og plasser deretter røret tilbake på is. Tilsett cellen og GFR-kjellermembranmatrise medium blanding til den apikale delen av transwell i forberedte plater. Blandingen skal spre seg og belegge hele transwell; vipp platen forsiktig for å sikre belegg. Etter gelling i inkubatoren i 30-60 min, bør det være synlige celleklynger i GFR-kjellermembranmatrisemediet. Tilsett passende lungeinduksjonsmedier til basalkammeret supplert med 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 og overvåk organoid vekst annenhver dag.
Fremtidige anvendelser av organoider generert av denne protokollen inkluderer å studere molekylære veier som kontrollerer tidlig lungeavstamning forpliktelse og celle skjebne spesifikasjon21,22,23. Samspillet mellom epitelet og mesenchyme kan bestemmes ved å bruke gen knockout modeller24. Organoidene kan også samkultureres med endotelceller for å bestemme viktigheten av vevsspesifikk komønstersignalering mellom lungeepitelet, mesenchymet og endotelet25. Lungeutvikling skjer parallelt med vaskulær utvikling, og dette forholdet kan fremkalle viktige molekylære mekanismer som er nødvendige for riktig lungeutvikling. Vi har også vist at hele lungeorganoidene er funksjonelle gjennom overflateaktive sekresjonsanalyser etter at GFR-kjellermembranmatrisemediet ble fjernet etterfulgt av kortsiktig kultur i ultra-lave festebrønner26. Andre strategier inkluderer sortering av cellene for celleoverflatemarkører som NGFR (basale celler)27 og HTII-280 (ATII-celler)28 og erstatte dem som homogene organoider eller et monolayer i luftvæske interfasekulturforhold. Hele, proksimale og distale lungeorganoider har også blitt brukt til å studere cellulære mål og patofysiologi av SARS-CoV-2 virusinfeksjon for bedre å forstå og screene for legemidler som kan bekjempe COVID-19.
Denne protokollen er robust og reproduserbar, men det finnes fortsatt mange utfordringer. Mange forskjellige iPSC- og ESC-linjer er testet (>20 linjer), men protokollen må optimaliseres for hver cellelinje. Til tross for robust DE- og AFE-induksjon kan LPC-induksjon være vanskelig å oppnå >40% av NKX2-1 + celler. Andre protokoller inkluderer et sorteringstrinn for overflatemarkører av NKX2-1 celler15,18, men de gir bare alveolar type II som organoider uten mesenchyme og inneholder fortsatt mage- og levercellepopulasjoner til tross for rensing av lungeforfederpopulasjonen29. Vi har også notert en liten mengde mage- og leverceller i både LPC og hele lungeorganoider, muligens på grunn av tilstedeværelsen av dorsale fremre foregutceller som forurenser LPCene. Derfor er differensiering av rene lungeorganoider ennå ikke oppnådd, og mer forskning på utviklingen av lungeforfedredercellene i humant vev må fullføres. Nedstrømsanalyser må måles kraftig med gen- og proteinuttrykk fra primært humant lungevev. Mens den mest fruktbare bruken av lungeorganoider til dags dato har vært i modelleringssykdommer og screening for legemidler in vitro, har transplantasjonen av hiPSC-avledede lungeorganoider til pasienter for regenerativ medisin blitt vurdert som en fremtidig terapi for en rekke forhold. Men før man vurderer slike intervensjoner, må en god del kvalitetskontroll perfeksjoneres, inkludert identifisering og fjerning av forurensende, uønskede, potensielt tumorigene hiPSC-derivater. Videre må det fortsatt utvikles bedre funksjonelle analyser in vitro og bedre dyremodeller av lungesykdom.
Spesielt må funksjonaliteten og sikkerheten til hiPSC-avledede celler bekreftes. Undifferentiated celler må utelukkes siden de har kapasitet til å generere teratomer. En metode for å bestemme udifferensierte stamceller i definitiv endoderm er å sortere cellene ut ved hjelp av pluripotensmarkøren SSEA4. Markørgener for udifferensierte hiPSCer ble nylig oppdaget ved hjelp av encellet RNA-sekvensering30. ESRG, CNMD og SFRP2 kan brukes til å validere udifferensierte celler på et hvilket som helst differensieringstrinn. Når renhet er bekreftet, er fordelen med autologe iPSC-avledede terapier muligheten for de transplanterte cellene til å unngå avvisning siden de kommer fra pasientens egne celler. Ulempene inkluderer tiden det tar å skille cellene fullt ut, gjennomgå streng klinisk karaktertesting og transplantere cellene til en pasient med akutt skade (respiratorisk nødsyndrom, hjerteinfarkt eller ryggskade). Alternativet er å bruke bankede allogene iPSC-avledede celler31. Disse kan lagres og er lett tilgjengelige for pasienter med humant leukocyttantigen (HLA) matchede donorer, og de vil ha gjennomgått grundig testing for forurensning. Den største ulempen er muligheten for immunavvisning. Immunsuppresjon kan være nødvendig i allogen celletransplantasjon, som er den nåværende virkeligheten av allogene hele vevstransplantasjoner. Strategier utarbeides for å tillate de allogene iPSC-avledede cellene å unngå immunresponsen for å transplantere dem trygt til pasienter32.
Etter hvert vil iPSC-avledede hele lungeorganoider bli brukt til å studere pasientspesifikke sykdomsmodeller, skreddersy terapeutiske behandlinger og forbedre regenerativ medisinsk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A.
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X.
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C.
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
