Summary
本稿では、近位および遠位上皮肺細胞と共に近位および遠位上皮肺細胞の両方を含む3次元全肺オルガノイドに対する誘導多能性幹細胞のステップ指向分化について説明する。
Abstract
ヒトの肺の発達と疾患は、生体関連の インビトロ モデルシステムがないため、研究が困難であった。ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、上皮細胞と間葉系細胞集団の両方からなる3D多細胞性肺オルガノイドに段階的に分化することができる。胚発生の手掛かりを、様々な成長因子と小分子を一時的に導入し、決定的な内胚、前腸内胚の内胚体、そしてその後肺前駆細胞を効率的に生成することによって再現します。これらの細胞は、次に成長因子還元(GFR)基膜マトリックス培地に埋め込まれ、外部の成長因子に応答して3D肺オルガノイドに自発的に発達することを可能にする。これらの全肺オルガノイド(WLO)は、デキサメタゾン、環状AMPおよびイソブチルキサンチンへの暴露後の分岐形態形成および成熟を含む初期の肺発達段階を受ける。Wloは、マーカーKRT5(基底)、SCGB3A2(クラブ)およびMUC5AC(ゴブレット)、およびHOPX(肺胞タイプI)およびSP-C(肺胞タイプII)を発現する肺胞上皮細胞を発現する気道上皮細胞を有する。間葉系細胞は、平滑筋アクチン(SMA)、および血小板由来増殖因子受容体A(PDGFRα)を含む存在も存在する。iPSC由来のWloは、何か月の間、3D培養条件で維持することができ、特定の細胞集団を精製するために表面マーカーのためにソートすることができる。iPSC由来のWlosは、肺上皮と間葉系間のシグナル伝達を含むヒト肺の発達を研究し、ヒト肺細胞の機能および発達に関する遺伝子変異をモデル化し、感染剤の細胞毒性を決定するためにも利用することができる。
Introduction
肺は、胚性、仮頭腺、運河、嚢胞、眼胞、微小血管成熟の6つの異なる段階で発達する複雑で異質な動的器官である1,2。後者の2つの段階は人間の発達において出生前および出生後に起こり、最初の4段階は早産が起こらない限り胎児の発達中に排他的に起こる3。胚期は内胚芽層から始まり、気管と肺の芽の出芽で終わる。肺の発達は、上皮細胞と間葉系細胞4との間のシグナル伝達を介して部分的に起こる。これらの相互作用は、肺の分岐、増殖、細胞の運命決定および発達中の肺の細胞分化をもたらす。肺は伝導域(末端気管支への気管)と呼吸帯(肺胞への呼吸気管支)に分けられる。各ゾーンには、ユニークな上皮細胞タイプが含まれています。導体気道内に基底、分泌、毛様体、ブラシ、神経内分泌、ヨウノサイト細胞を含む5、続いて肺胞型I型およびII細胞を呼吸上皮6に含む。様々な細胞型の損傷に対する発達と反応については、まだ多くのことが不明である。iPSC由来の肺オルガノイドモデルは、ヒト肺の発達を促進するメカニズム、肺機能に対する遺伝子変異の影響、および原発性ヒト肺組織を必要とせずに感染因子に対する上皮および間葉の両方の反応を促進する。
胚分化の様々な段階に対応するマーカーとしては、CXCR4、cKit、FOXA2、およびSOX17が決定的な内胚(DE)7、FOXA2、TBX1、および前前腸内胚葉(AFE)8のSOX2、早期肺前駆細胞用NKX2-1が含まれる。胚性肺の発達では、前腸は食道および腹側気管に分かれる。右と左の肺の芽は気管の芽10のまわりの2つの独立した外挿として現れる。分岐形態形成の間葉形成の間葉は、伸縮性組織、平滑筋、軟骨、脈管構造11を生成する。上皮と間葉系の相互作用は、正常な肺の発達に不可欠である。これには、上皮によって産生される間葉系およびSHH13によるFGF1012の分泌が含まれる。
ここでは、HIPSCを3次元(3D)全肺オルガノイド(WLO)に誘導分化するためのプロトコルについて説明する。LPC段階で並べ替えを行って肺胞状の14,15(遠位)オルガノイドまたは気道16(近位)オルガロイドを作ったり、腹側前腸前腸球体を生成して肺胞細胞とmesenterのマーカーと親子のマーカーと前駆体のマーカーと前足のマーカーを選別することによって肺前駆細胞の単離を組み込む同様のアプローチがある。この方法の強さは、肺分岐形態形成、成熟、およびインビトロでの拡張をパターン化し、調整するための肺上皮および間葉細胞型の両方を含めることである。
このプロトコルは、小分子と成長因子を使用して、決定的な内胚葉、前腸内臓内臓、肺前駆細胞を介して多能性幹細胞の分化を指示する。これらの細胞は、分岐および成熟を含む重要な発達段階を通じて3D全肺オルガノイドに誘導される。分化プロトコルの概要は、図1bに示す内胚葉およびオルガノイド分化の代表的な明視野画像を用いて図1aに示されている。図1c,dは、分化を完了した後の肺上皮細胞の近位および遠位の両方の集団の遺伝子発現と同様に、内皮分化の遺伝子発現の詳細を示す。
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Protocol
この研究議定書は、UCSDの人間研究保護プログラム(181180)の機関審査委員会によって承認されました。
1. 人工多能性幹細胞からの決定的な内胚葉誘導(1日目~3日目)
- ゆっくりと解凍成長因子は、使用の30分前に氷上の(GFR)基質膜(BM)マトリックス培地を減少させた。冷たいDMEM/F12において、混合物は、この培地の50%を構成するようなGFRBMマトリックス培地1:1を希釈する。P1000ピペットの先端を冷凍庫に入れ、使用前に冷やします。
- 氷冷DMEM/F12で調製した50%GFR基膜マトリックス媒体の500 μLで12ウェルプレートの各ウェルをコーティングします。必要な数のウェルがコーティングされたら、余分な培地混合物および/または気泡を井戸から取り除き、プレートを氷または冷蔵庫の上に4°Cで20分間置きます。その後、プレートを一晩37°Cでインキュベーターに移動させてゲル化し、乾燥させた。
- HiPSCが70-90%の合流度に達したら、解離の1時間前に10μMのRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632を加えます。培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で一度洗います。細胞剥離培地(12ウェルプレートの0.5mL/ウェル)を添加してHIPSCを解離し、5%CO2 インキュベーターで37°Cで20分間インキュベートします。
- インキュベーターからプレートを取り出し、0.5 mL/12ウェルの幹細胞通過媒体(表1)をウェルに加えます。P1000チップを使用して細胞を穏やかに三分し、単細胞懸濁液を得る。解き分けた細胞を15 mL円錐形遠心分離管に移す;遠心分離機は300× gで5分間。
- 培地を吸引し、10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)を添加したmTeSR Plus培地1 mLで細胞ペレットを再懸濁する。セルカウントを実行します。12ウェルGFR地下膜媒体被覆プレートのウェルあたりROCK阻害剤Y-27632を補ったmTeSRの1 mLに2.0 x 105のhiPSCを加えます。一晩で37°Cでインキュベートする。
注: セルのシード数はセルラインごとに最適化する必要があります。めっき後24時間、ウェルは50%-70%コンフルエントでなければなりません。 - 1日目、mTeSR Plusを吸引し、ヒトアクチビンAの100ng/mLとGSK3β阻害剤/WntアクチベーターCHIR99021の5μMを添加した決定的内胚葉(DE)誘導培地(表1)を加える。
注:GSK3β阻害剤/WntアクチベーターCHIR99021を有するDE培地は、分化を成功させるために1日目DE誘導の20-24時間以内に除去されるべきである。 - 2日目および3日目に、100 ng/mLのアクチビンAのみを補ったDE誘導培地に変更する。
注: DE 分化は合計 72 時間を超えないようにしてください。4日目に、大きな細胞ダイオフが観察された場合、DE培地の総暴露時間を6〜12時間減少させる。 - DE効率を解析するには、FOXA2および/またはSOX17のフローサイトメトリーまたは免疫蛍光分析を介して、CXCR4および/またはcKit発現を90%以上確認します(図2a)。
2. 前腸内臓(AFE)誘導(4日目~6日目)
- 4日目、培地をAFE誘導用に10μM SB431542および2μMドーソモルフィンを添加した無血清基底培地(SFBM)(表1)に変更します。AFE メディアを毎日 3 日間 (4 日目、5 日目、および 6 日目) に変更します。
- AFE効率を解析するために、免疫蛍光染色によるSOX2、TBX1、FOXA2の強い発現を確認します(図2b)。
3. 肺前駆細胞(LPC)分化(7日目~16日目)
- 7日目に、氷上のGFR基基膜マトリックス培地を解凍する。AFE培地を吸引し、1x PBSでよく洗います。1 mLの細胞剥離液を加え、37°Cで10分間インキュベートします。
- 細胞剥離液を含むウェルに1mLの焼入媒体(DMEM/F12で2%FBS)を加えます。細胞を上下に軽くピペット化して凝集体として保持します。すべての細胞が外れ、15 mL円錐形遠心分離管に移ることを確認してください。遠心分離機は300× gで5分間
- 上清を取り除き、ヒト組換え骨形態形成タンパク質-4(BMP4)の10 ng/mL、全トランスレチノイン酸(RA)の0.1 μM、GSK3β阻害剤/Wnt活性化剤CHIR99021の3μM、および10μMのロック阻害剤Y-2766666600を補ったクエンチン化培地中の細胞ペレットを再懸濁させる。
- セルカウントを実行します。2.5 x 105 細胞を100 μLの冷たいGFR基膜マトリックス培地に加え、よく混ぜ合わせ、液滴を12ウェルプレートのウェルに入れる。プレートを37°Cで30〜60分間インキュベートし、培地を重合させます。10 μMのROCK阻害剤Y-27632を添加したLPC培地を1ウェルあたり1mL添加して、培地の低下が完全に水没し、一晩で37°Cでインキュベートされるようにします。
- 8日目、LPC誘導後24時間、LPC培地を変更してROCK阻害剤Y-27632を除去した。LPC培地を1日おきに9~11日間変更します。
注:24時間以内にメディアが黄色になった場合は、毎日メディアを変更してください。 - LPC効率を解析するには、細胞内転写因子NKX2-1の強い発現を確認するか、CD47hi/CD26low15またはCPM18の表面マーカーに対してフローサイトメトリーを行う(図2c)。LPCスフェロイドは、丸く透明である必要があります(図2c)。
注:NKX2-1の効率が30%を下回る場合は、肺オルガノイド分化を進めないでください。
4.3D肺オルガノイド誘導(16日目~22日目)
- 17日目に、氷上のGFR基基膜マトリックス培地を解凍する。LPC誘導培地を吸引する。その後、2 μg/mL のディスパーゼ (1 mL) をウェルに加え、P1000 ピペットで培地/ディスパーゼ混合物を再中断します。37°Cで15分間インキュベートします。再び混合物をトリチュレートし、さらに15分間37°Cでインキュベートします。
- ディスパーゼと細胞を15 mL円錐形遠心分離チューブに移します。冷やしたPBS(2〜3mL)を使用して井戸を洗浄し、ディスパーゼ/細胞混合物を再中断します。遠心分離機 400 x g で 5 分間上清を手動で除去し、培地/細胞ペレット層を外さないよう注意する。冷やしたPBS洗浄を繰り返し、円錐状遠心管を400xgでさらに5分間遠心分離 します。
- 上清を手動で取り出し、2 mLのトリプシンベース解離液を円錐遠心管に加えます。37°Cで12分間インキュベートします。
- インキュベーション後、P1000ピペットチップで細胞を再懸濁する。その後、円錐遠心管に焼入れ培地の等量を追加し、5分間400 x g でスピンダウンします。ROCK阻害剤Y-27632の焼入培地+10μMの上清および再懸濁細胞を吸引する。
注:成功した肺オルガノイド誘導は、細胞が単一細胞ではなく凝集体として埋め込まれるときに発生し、それに応じてピペットを調整します。 - セルカウントを実行します。ウェルあたり 5.0~ 8.0 x 104 セルを得るために必要な体積を計算します。アリコートLPC細胞は、400 x gで5分間、1.5 mLマイクロ遠心分離チューブと遠心分離機に凝集 する。余分な上清を除去し、細胞ペレットを攪拌しないように注意する。残りの媒体は10μLだけ残します。
- 細胞ペレットを200μLの冷たいGFR基底膜マトリックス培地に再懸濁し、細胞培養膜挿入物(直径6.5mm、0.4μmの細孔、ポリエステル膜)に添加します。30~60分間37°Cでプレートをインキュベートし、GFR基質膜マトリックス媒体を重合させます。
- 線維芽細胞増殖因子-7(FGF7)(10 ng/mL)、FGF10(10 ng/mL)、GSK3β阻害剤/Wnを添加した3Dオルガノイド誘導培地(表1)を1mL追加 チロピターCHIR(3μM)、表皮成長因子(EGF)(10 ng/mL)、および10μMのROCK阻害剤Y-27632を膜インサートのバソラテラチャンバーに挿入した。1 日おきに 6 日間、メディアを変更します。
5.3D肺オルガノイド分枝(23日目~28日目)
- 23日目にFGF7(10 ng/mL)、FGF10(10 ng/mL)、GSK3β阻害剤/Wnt活性化剤CHIR9902を添加した3D分岐培地(表1)に変更 1(3 μM)、RA(0.1 μM)、EGF(10 ng/mL)、血管内皮成長因子(VEGF)/胎盤成長因子(PlGF)(10 ng/mL)。1 日おきに 6 日間、メディアを変更します。
注: 3D 分岐分化の 6 日目には、複数の分岐オルガノイドが存在する必要があります(図 2)。
6.3D肺オルガノイド成熟(29日目~34日目)
- 29日目には、3D分岐培地と同じであるが、デキサメタゾン(50nM)、cAMP(100μM)、および3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を添加した3D分岐培地(表1)に変更し、ホスホジエステラーゼ阻害剤(100μM)とも呼ばれる。1 日おきに 6 日間、メディアを変更します。
注:3D成熟後24時間以内に、分枝オルガノイドは拡大し、透明な球に変わるはずです。
7.3D肺オルガノイド免疫細胞化学
- 3D全肺オルガノイド分析では、GFR基基膜マトリックス培地を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で4%のパラホルムアルデヒド(PFA)で4°Cで1時間固定します。 パラフィンワックスに埋め込み、標準的な公開プロトコルごとにスライドにマウントします。
- 染色前に抗原検索を行う。気道マーカーにはKRT5、MUC5AC、およびSCGB3A2が含まれます。歯槽マーカーには、SP-C、SP-B、HTII-280、HTI-56、およびHOPXが含まれる(図3)。
8. GFR基基膜マトリックス媒体からの全肺オルガノイドの除去、FACS、または凍結保存
- GFR基底膜マトリックス媒体からオルガノイドを解離するには、基底チャンバーから培地を取り出し、坐骨室に2μg/mLのディスパーゼ(1mL)を加えます。
- P1000ピペットで培地/ディスパーゼ混合物を穏やかにトリチュレートし、インキュベーターに15分間置きます。混合物をもう一度穏やかにトリチュレートし、さらに15分間インキュベートします。
- 1 mLの冷蔵PBS(4°C)を加え、マトリックス培地を用いてオルガノイドを15 mL円錐形遠心管に移します。400 x g で 5 分間スピンします。上清を慎重に除去し、細胞ペレットを乱さない。
- 1 mLチルドPBSでもう一度洗い、400 x g で5分間スピンダウンします。上清を慎重に取り除き、培地/細胞混合物を乱さない。
- 円錐状遠心分離管に1 mLの細胞剥離液を加え、GFR基膜マトリックス培地/細胞混合物を穏やかにトリチュレート再懸濁させる。インキュベーターに12分間、凝集体または凍結保存用として細胞を通過させるため、または単一細胞懸濁液の場合は20分間置きます。
- 同じ量の焼入れメディアを追加し、400 x g で5分間スピンダウンします。ROCK阻害剤Y-27632の焼入培地+ 10 μMで再懸濁します。
注:このステップでは、チューブに残った基質膜媒体は見られるべきではありません。残留媒体が残っている場合は、ステップ8.5と8.6を繰り返します。 - セルカウントを実行します。ダウンストリーム アプリケーションに必要なボリュームを計算します。
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Representative Results
めっきの24時間後、1日目、iPSCは50%-90%コンフルエントでなければなりません。2日目には、DEは90%-95%コンフルエントでなければなりません。DE誘導の間、4日目に有意な細胞死を観察することが一般的であるが、結合された細胞はコンパクトな石畳の形態を保持する(図2b)。接着細胞の大部分が剥離する場合は分化を中止し、6-12時間でアクチビンAを有するDE培地への暴露を短縮することを検討する。AFE誘導の間、細胞死は最小限であり、細胞は付着したままであるが、より小さく、より異質に見える。7日目に細胞を通過させるのは、二重陽性のSOX2とFOXA2の収率が>80%である場合にのみ行う必要があります。3D LPC誘導のために基部膜マトリックスに通過した後、小さな回転楕円体が最初に現れ、次に成長し、いくつかは分岐し始める可能性があります。正常な内胚葉分化のための遺伝子発現プロファイルには、DEでのSOX17の増加、SOX17の減少とNKX2-1の初登場に伴うFOXA2およびSOX2の増加、およびSOX2およびFOXA2の存在とともにNKX2-1の増加が含まれる。初期の胚発生と一致して、AFEの腹側は肺芽発生(NKX2-1+)のために起こり、AFEの側振は胃腸の発達(SOX2+)のために起こる。LPCの培養は、肺と胃の前駆物質の両方のミックスを持つことになります。
LPCからの肺オルガノイド誘導は、種々の方法を用いて行われている。一部のグループは、NKX2-1蛍光レポーターまたは表面抗原プロキシ(CPM、CD26lowCD47high)を使用して細胞を選別します。しかし、これらの肺オルガノイドは、歯槽型I細胞または間葉系を持たない細胞のような肺胞型II型を含んでいる。他のグループは、AFE /LPC単層から芽を出し、基体膜マトリックスに埋め込んだ細胞塊を収集しました。これらのオルガノイドは、肺上皮細胞と間葉細胞の混合集団を含むが、培養19に数ヶ月かかる。我々のプロトコルは上皮細胞および間葉細胞の両方の存在を含んでいる。このWloは、近位上皮細胞マーカーp63およびKRT5(基底細胞)およびSCGB3A2(クラブ細胞)ならびに遠位上皮細胞マーカーHOPX(ATI)およびプロSPC、SPBおよびNKX2-1(ATII)を発現する。彼らはまた、LPC段階で間葉マーカーVimentinを発現します, だけでなく、全肺オルガノイドで.PDGFRαは、微分および肺分化20の間に肺に重要な機能を有する線維芽細胞のマーカーであり、遠位細胞分化において重要な転写因子と共発現される、SOX9(図3)。
我々の方法は、胎児肺の発達で起こるシグナル伝達分子を用いてNKX2-1発現LPC3D培養を効率よく生成し、早期肺オルガノイドを形成する。LFCを肺オルガノイド誘導用のGFR基膜マトリックス培地に通過する場合、単一の細胞懸濁液に過剰解離するのではなく、細胞の小さな塊(10細胞/塊)を保持することが不可欠です。細胞数は完全に正確ではありませんが、3週間の肺オルガノイド分化中に合流を避けるために必要です。
肺オルガノイド誘導は、6日目の誘導(分化23日目)までに小さな分枝オルガノイドを生み出すはずです。これらは、オルガノイド分岐ステップおよび成熟ステップ中に成長し続ける必要があります。デキサメタゾン、cAMP、およびIBMXの導入から24時間後、枝は透明な球体に拡大する必要があります。全肺オルガノイド分析は、分化の終わりに行うことができるか、または、Wloは、GFRを有する新しい基膜マトリックスに通じることができ、または10%DMSOで凍結することによって凍結保存することができる。
図1:全肺オルガノイド(WLO)の全分化の全体の概略を、hiPSCおよび代表データと の間で行う。(a)ハイプスからのWLO分化の概略図。円は、識別マーカーを持つ内胚葉細胞タイプを表します。差別化のタイムラインは黒いバーで示されます。内胚葉および肺オルガノイド集団の誘導のための成長因子および/または小分子。要約すると、幹細胞は約16日間で決定的な内胚葉、前腸内臓内および肺前駆細胞に分化される。これらの細胞は、次いで、培地挿入物を含むGFR基基膜マトリックス培地に通じ、肺オルガノイド誘導、分岐、および成熟を受ける。全分化には約35日かかります。(b)主要な内胚期の細胞の代表的な位相コントラスト画像および肺オルガノイド全体の3D画像。パネルで示されているスケールバーのサイズ。(c) 内胚葉および(d)近位および遠位細胞マーカーの全肺オルガノイド分化中の肺現像マーカーのqRT-PCR分析。すべてのデータは、3〜5個の生物学的複製の平均を表します。誤差範囲は平均の標準誤差を表し、actin に正規化されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:フローサイトメトリーおよび免疫細胞化学による内胚分化の特徴評価(a)決定的内胚葉マーカーCXCR4のフローサイトメトリー。左パネルは、中央のパネルがCXCR4陽性母集団を示している間、染色されていない集団に対する格言を示す。右のパネルは、SOX17(赤)の核(青)を重ねた免疫細胞化学画像を示しています。(b) AFEマーカーFOXA2およびSOX2の免疫細胞化学画像は、核(青)で重ね合わせたもの。(c) 3D LPCにおけるレポーター細胞系におけるNKX2-1-GFPの内因性発現明視野およびGFPの生きた細胞培養から撮影された画像。固定および透過後の肺前駆細胞マーカーNKX2-1のフローサイトメトリースケールバーサイズ= 50 μM. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:免疫細胞化学による3週間分化後の3D全肺オルガノイドの特徴付け. (a)近位肺マーカー。左パネルは、SOX2(白)とSOX9(赤)が核(青)で重なっている様子を示しています。これらのマーカーは、分岐形態形成において重要であり、近位および遠位上皮集団を表す。中央のパネルは、P63(赤)とKRT5(赤)、両方の基底細胞のマーカーを示しています。右のパネルには、クラブセルのマーカーであるSCGB3A2が表示されます。(b) 遠位肺マーカー左パネルは、親SPC(PSPC)、(緑)およびHOPX(赤)、肺胞II型広告I細胞のマーカー、それぞれ、核(青)で重ね合せたマーカーを示しています。中央パネルは、親SPC(PSPC)(緑色)およびSPB(赤)、肺胞タイプII細胞のマーカー、核(青)で重ね合ったマーカーを示す。右パネルは、核(青)で重ね合ったNKX2-1(赤)とZO1(緑)を示しています。(c) 肺間質のマーカー。左側のパネルには、遠位間線を表す PDGFRA (赤) と SOX9 (白) が表示されます。右パネルは、肺全体に分散しているビメンチン(赤)を示しています。スケールバーサイズ= 50 μM. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬とソリューション - 会社名については、材料表リストをご覧ください。 |
| 3Dオルガノイド誘導培地(17-22日目) |
| 無血清基底培地(レシピを参照)を補った: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| EGF (10 ng/mL) |
| 3Dオルガノイド分岐培地(23-28日目) |
| 無血清基底培地(レシピを参照)を補った: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| オールトランスレチノイン酸(0.1 μM) |
| EGF (10 ng/mL) |
| VEGF/ピッグフ (10 ng/mL) |
| 3Dオルガノイド成熟培地(29-34日目) |
| 無血清基底培地(レシピを参照)を補った: |
| デキサメタゾン (50 nM) |
| Br-cAMP (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| AFE誘導培地(4-6日目) |
| 無血清基底培地(レシピを参照)を補った: |
| SB431542 (10 μM) |
| ドーソモルフィン (2 μM) |
| DE誘導媒体(1-3日目) |
| 48.5 mL RPMI1640 + グルタマックス |
| レチノイン酸なし 1 mL B27 |
| 500 μl HEPES (1%) |
| 500 μl ペン/ストレップ |
| ヒトアクチビンA(100 ng/mL) |
| CHIR99021(5 μM) - 最初の24時間のみ |
| LPC誘導培地(日7-16) |
| 無血清基底培地(レシピを参照)を補った: |
| BMP4 (10 ng/mL) |
| 全トランスレチノイン酸(RA)(0.1 μM) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| クエンチ培地 |
| 49 mL DMEM/F12 |
| 1 mL FBS |
| 無血清基底培地(SFBM) |
| 375 mL アイコーブの修正ダルベッコのミディアム (IMDM) + グルタマックス |
| 125 mL ハムズ F12 |
| レチノイン酸なし 5 mL B27 |
| 2.5 mL N2 |
| 500 μl アスコルビン酸、50 mg/mL |
| 13 μl モノチオグリセロール/1ml IMDM"300ul を使用して 0.4mM 1thioグリセロール 100ml の血清フリー培地 |
| 3.75 mL ウシ血清アルブミン(BSA) フラクション V, 7.5% 溶液 |
| 500 μl ペン/ストレップ |
| 幹細胞通過培地(0日目) |
| 500 mL DMEM/F12 |
| 129 mL ノックアウト血清交換(KSR) |
| 6.5 mL グルタマックス |
| 6.5 mL NEAA |
| 1.3 mL 2-メルカプトエタノール |
| 6.5 mLペン/ストレップ |
表1:メディアの表
| 問題 | 解決 |
| DE 差別化は効率的ではありません | 幹細胞培地でめっき後24時間、細胞は50-70%コンフルエントでなければなりません |
| GSK3β阻害剤/Wnt活性化剤CHIR99021は、1日目DE誘導の20〜24時間以内に除去されるべきである | |
| DE の差別化は合計 72 時間を超えないようにする必要があります | |
| AFE 差別化は効率的ではない | DE の分化が成功し、セルが80%CXCR4>表現していることを確認します。 |
| 新鮮な成長因子/小分子が毎日メディアに追加されていることを確認 | |
| LPC 差別化は効率的ではない | AFE の分化が成功し、細胞が 80% FOXA2/SOX2 >表現していることを確認します。 |
| AFE細胞が4~10個の細胞の集合体として継代され、単細胞化されていないことを確認する | |
| 3D肺オルガノイドは成長していないか、または分化しない | LPC の分化が成功し、細胞が 30% NKX2-1 >表現していることを確認します。 |
| LPCが4〜10個の細胞の集合体として継代され、単細胞化されていないことを確認する | |
| 過渡中にLFCからの残留マトリゲルがないことを確認する | |
| 各メディア変更にロックインヒビターY-27632を追加 | |
| メディアが時間に合うように変更され、新鮮な成長因子/小分子が追加されることを確認する | |
| 成長因子/小分子の濃度が正しいことを確認する |
表 2: トラブルシューティング
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Discussion
3D全肺オルガノイド(WLO)の分化が成功したのは、成長因子や小分子への暴露時間、通過後の細胞密度、HiPSCの品質など、細部に注意を払った6週間のマルチステッププロトコルに依存しています。トラブルシューティングについては、 表 2 を参照してください。hiPSCは、解離前に約70%〜80%のコンフルエントで、5%未満の自発的分化を行う必要があります。このプロトコルは"mTeSR プラス" メディアを必要とします。しかし、プレーンな"mTeSR"培地も同等の結果で使用されており、安価です。細胞外マトリックスについては、GFR基膜マトリックス培地を用います。分化を減らすためにReLesR( 材料表を参照)を使用してHIPSCを通過します。
内胚分化の間、細胞はメディアの変更の前と後に毎日視覚化されるべきである。特定の成長因子/小分子は、早期劣化を防ぐために、毎日新鮮なベース培地に添加する必要があります。決定的な内胚葉(DE)における細胞死は一般的であるが、前腸前腸内胚葉(AFE)および肺前駆細胞(LPC)誘導中に制限されるべきである。DE(4日目)の3日目に大きなダイオフがある場合は、DEの合計時間を6〜12時間短縮します。新しいiPSC細胞株は、正常な内胚分化のために最適化する必要があるかもしれません。CXCR4のフローサイトメトリーを実行して、誘導成功を確認します(>85%CXCR4+セル)。細胞はAFEで比較的安定している必要があり、ほとんど死ぬことなく形態学的に変化する。
LPC への合格は、セル型に最適化する必要があるもう 1 つのプロセスです。密度が低すぎる(<50%)で細胞を再めっきすると、非効率的な分化が起こる。NKX2-1またはCPM18またはCD26low/CD47high15のフローサイトメトリーに対する免疫細胞化学によるLPC誘導の成功を確認します。成功したLPC誘導は、>40%NKX2-1を有する必要があり、そうでなければオルガノイドは、より多くのドーサルAFEを有するであろう。LPC誘導では、メディアの変化ごとに成長因子をベースメディアに追加する必要があります。後でLPC誘導にメディアが黄色になった場合は、新鮮なメディアの量を増やすことを検討するか、毎日メディアを交換してください。3D全肺オルガノイド誘導の間、メッキ数と細胞クラスターの維持はオルガノイドの成長を成功させるための鍵です。GFR基膜マトリックス媒体は取り扱いにくく、温度が高いので、常に氷の上に保管してください。GFR基膜マトリックス培地が早すぎると、LPC細胞はその中に統合されません。合格の30分前に氷の上にGFR基質膜マトリックス培地の1mLアリコートを解凍することをお勧めします。細胞/クラスターがカウントされ、適切なアリコートが作られたら、細胞ペレットを氷の上に置きます。GFR基膜マトリックス媒体処理の前に、プレート、標識、細胞培養膜挿入物の添加を準備することをお勧めします。
ピペットチップを使用して、液体GFR基底膜マトリックス媒体の正しい体積をすぐに細胞ペレットに加え、氷の上に保管します。ピペットは素早く上下に(ニュアンスのハンドリング)、泡を導入しないようにし、チューブを氷の上に戻します。細胞およびGFR基膜マトリックス培地混合物を、調製したプレートのトランスウェルの補助部分に加えます。混合物は広がり、トランスウェル全体をコーティングする必要があります。プレートを軽く傾けてコーティングを確保します。インキュベーターで30〜60分間ゲル化した後、GFR基膜マトリックス培地に可視細胞クラスターが存在するはずです。10 μM ROCK 阻害剤 Y-27632 を補った基底室に適切な肺誘導培地を加え、オルガノイドの成長を隔日で監視します。
このプロトコルによって生成されるオルガノイドの将来の用途には、初期の肺系分けコミットメントおよび細胞運命仕様21,22,23を制御する分子経路の研究が含まれる。上皮と間質の相互作用は、遺伝子ノックアウトモデル24を利用することによって決定することができる。オルガノイドは、内皮細胞と共培養して、肺上皮、間質、および内皮25との間の組織特異的な共パターンシグナル伝達の重要性を決定することもできる。肺の発達は血管の発達と並行して起こり、その関係は適切な肺の発達に必要な重要な分子メカニズムを引き出すかもしれない。また、これらの全肺オルガノイドは、超低結合ウェルでの短期培養を続けてGFR基膜マトリックス培地を除去した後の界面活性剤分泌アッセイを通じて機能することを示した。その他の戦略としては、NGFR(基底細胞)27およびHTII-280(ATII細胞)28のような細胞表面マーカーの細胞を選別し、それらを均質なオルガノイドまたは空気液間相培養条件で単層として置き換えることがある。COVID-19と戦う可能性のある薬物をよりよく理解し、スクリーニングするために、SARS-CoV-2ウイルス感染の細胞標的および病態生理学を研究するために、全体、近位、および遠位肺オルガノイドも使用されてきた。
このプロトコルは堅牢で再現可能ですが、まだ多くの課題が存在します。多くの異なる iPSC および ESC 行がテストされています (>20 行) が、プロトコルは各セル行に対して最適化する必要があります。堅牢なDEおよびAFE誘導にもかかわらず、LPC誘導はNKX2-1+細胞の>40%を達成することは困難である可能性がある。他のプロトコルには、NKX2-1 cells15,18の表面マーカーの選別ステップが含まれますが、それらは、メチムのないオルガノイドのような肺胞型II型のみを生み出し、肺前駆物質集団29を浄化しているにもかかわらず胃および肝細胞集団を含んでいます。我々はまた、LPCおよび肺オルガノイド全体の両方で少量の胃細胞および肝細胞を指摘している。したがって、純粋な肺オルガノイドの分化はまだ達成されていないので、ヒト組織における肺前駆細胞の開発に関するより多くの研究を完了しなければならない。下流アッセイは、ヒト初原肺組織からの遺伝子およびタンパク質発現を精力的にベンチマークする必要がある。これまで、肺オルガノイドの最も実りある使用は、疾患のモデリングやインビトロでの薬物スクリーニングにおいて行われてきたが、hiPSC由来の肺オルガノイドを再生医療のための患者に移植することは、様々な条件の将来の治療法として考えられてきた。しかし、そのような介入を検討する前に、汚染の同定および除去を含む多くの品質管理を完成させなければならない、望ましくない、潜在的に腫瘍性のhiPSC誘導体。さらに、肺疾患のより良い機能アッセイおよびより良い動物モデルは、まだ開発する必要があります。
具体的には、hiPSC由来細胞の機能性と安全性を確認する必要があります。未分化細胞は、奇形腫を生成する能力を持っているので、除外する必要があります。決定的な内胚葉で未分化幹細胞を決定する方法の1つは、多能性マーカーSSEA4を用いて細胞を選別することです。未分化ハイポシスのマーカー遺伝子は、最近、単一細胞RNAシーケンシング30を用いて検出された。ESRG、CNMD、およびSFRP2は、任意の分化ステップで未分化細胞を検証するために使用することができます。一度純度が確認されると、自家iPSC由来の治療法の利点は、移植された細胞が患者自身の細胞から来ているので拒絶反応を避ける能力です。欠点は、細胞を完全に分化し、厳密な臨床グレードの検査を受け、急性傷害(呼吸窮迫症候群、心筋梗塞、または脊髄損傷)を有する患者に細胞を移植するのにかかる時間を含む。代替は、バンクされた同種iPSC由来のセル31を利用する。これらは、ヒト白血球抗原(HLA)が一致したドナーを有する患者のために貯蔵され、容易に入手可能であり、汚染の徹底的な検査を受けているであろう。最大の欠点は、免疫拒絶反応の可能性です。同種細胞移植では免疫抑制が必要であり、これは同種全組織移植の現在の現実である。同種iPSC由来の細胞が免疫応答を回避して安全に患者32に移植できるように戦略が考案されている。
最終的には、iPSC由来の全肺オルガノイドは、患者固有の疾患モデルの研究、治療の調整、再生医療研究の強化に利用される。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、カリフォルニア再生医療研究所(CIRM)(DISC2-COVID19-12022)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
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