Summary
O artigo descreve a diferenciação direcionada de células-tronco pluripotentes induzidas a organoides pulmonares inteiros tridimensionais contendo células pulmonares epiteliais proximais e disais, juntamente com mesenchyme.
Abstract
O desenvolvimento pulmonar humano e a doença têm sido difíceis de estudar devido à falta de sistemas de modelos in vitro biologicamente relevantes. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) podem ser diferenciadas em organoides pulmonares multicelulares 3D, feitos de populações epiteliais e células mesenquimais. Recapitulamos pistas de desenvolvimento embrionário introduzindo temporalmente uma variedade de fatores de crescimento e pequenas moléculas para gerar eficientemente o endoderme definitivo, o endoderme anterior e, posteriormente, as células progenitoras pulmonares. Essas células são então incorporadas no meio de matriz de membrana de fator de crescimento (GFR)-porão, permitindo que elas se desenvolvam espontaneamente em organoides pulmonares 3D em resposta a fatores de crescimento externos. Estes organoides pulmonares inteiros (WLO) passam por estágios iniciais de desenvolvimento pulmonar, incluindo morfogênese ramificada e maturação após exposição à dexametasona, AMP cíclico e isobutylxanthine. Os WLOs possuem células epiteliais das vias aéreas expressando os marcadores KRT5 (basal), SCGB3A2 (clube) e MUC5AC (cálice), bem como células epiteliais alveolares expressando HOPX (tipo alveolar I) e SP-C (alveolar tipo II). Células mesenquimais também estão presentes, incluindo actina muscular lisa (SMA), e receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas A (PDGFRα). Os WLOs derivados do iPSC podem ser mantidos em condições de cultura 3D por muitos meses e podem ser classificados para marcadores de superfície para purificar uma população celular específica. Os WLOs derivados do iPSC também podem ser utilizados para estudar o desenvolvimento pulmonar humano, incluindo a sinalização entre o epitélio pulmonar e o mesenquimme, para modelar mutações genéticas na função e desenvolvimento das células pulmonares humanas, e para determinar a citotoxicidade dos agentes infecciosos.
Introduction
O pulmão é um órgão complicado, heterogêneo e dinâmico que se desenvolve em seis estágios distintos - embrionário, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar e maturação microvascular1,2. As duas últimas fases ocorrem pré e pós-natal no desenvolvimento humano, enquanto os quatro primeiros estágios ocorrem exclusivamente durante o desenvolvimento fetal, a menos que ocorram nascimentos prematuros3. A fase embrionária começa na camada de germes endodérmicos e termina com o brotamento da traqueia e dos botões pulmonares. O desenvolvimento pulmonar ocorre em parte através da sinalização entre as células epiteliais e mesenquimais4. Essas interações resultam em ramificação pulmonar, proliferação, determinação do destino celular e diferenciação celular do pulmão em desenvolvimento. O pulmão é dividido em zonas de condução (traqueia para os brônquios terminais) e zonas respiratórias (brônquios respiratórios aos alvéolos). Cada região contém tipos únicos de células epiteliais; incluindo células basais, secretas, ciliadas, escovas, neuroendócrinas e ionócitos nas vias aéreas condutoras5, seguidas por células alveolares tipo I e II no epitélio respiratório6. Ainda não se sabe muito sobre o desenvolvimento e a resposta à lesão dos vários tipos de células. Modelos organoides fundidas derivadas do iPSC permitem o estudo de mecanismos que impulsionam o desenvolvimento pulmonar humano, os efeitos das mutações genéticas na função pulmonar e a resposta tanto do epitélio quanto do mesenquime a agentes infecciosos sem a necessidade de tecido pulmonar humano primário.
Os marcadores correspondentes aos vários estágios de diferenciação embrionária incluem CXCR4, cKit, FOXA2 e SOX17 para endoderme definitivo (DE)7, FOXA2, TBX1 e SOX2 para endoderme anterior (AFE)8, e NKX2-1 para células progenitoras pulmonares precoces9. No desenvolvimento pulmonar embrionário, o foregut se divide no esôfago dorsal e na traqueia ventral. Os botões dos pulmões direito e esquerdo aparecem como dois outpouchings independentes ao redor do broto traqueal10. Durante a morfogênese ramificada, o mesenquima em torno do epitélio produz tecido elástico, músculo liso, cartilagem e vasculatura11. A interação entre o epitélio e o mesenquime é essencial para o desenvolvimento pulmonar normal. Isso inclui a secreção de FGF1012 pelo mesenchyme e SHH13 produzidos pelo epitélio.
Aqui, descrevemos um protocolo para a diferenciação direcionada de hiPSCs em organoides pulmonares tridimensionais (3D) inteiros (WLO). Embora existam abordagens semelhantes que incorporem o isolamento de células progenitoras pulmonares através da triagem no estágio LPC para fazer organoides allveolares 14,15 (distal) ou organoides das vias aéreas16 (proximal), ou gerar esferoides ventral-anteriores para fazer organoides pulmonares humanos expressando marcadores alveolares e mesenquimais e organoides progenitores de bud , a força deste método é a inclusão de ambos os tipos de células epiteliais pulmonares e mesenquimais para padronizar e orquestrar morfogênese de ramificação pulmonar, maturação e expansão in vitro.
Este protocolo utiliza pequenas moléculas e fatores de crescimento para direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes através de endoderme definitivo, endoderme anterior de foregut e células progenitoras pulmonares. Essas células são então induzidas em organoides pulmonares 3D inteiros através de importantes etapas de desenvolvimento, incluindo ramificação e maturação. O resumo do protocolo de diferenciação é mostrado na Figura 1a com imagens representativas de brightfield de diferenciação endodérmica e organoide mostrada na Figura 1b. A Figura 1c,d mostra os detalhes da expressão genética da diferenciação endodérmica, bem como a expressão genética das populações proximais e distais das células epiteliais pulmonares após completar a diferenciação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Programa de Proteção à Pesquisa Humana da UCSD (181180).
1. Indução definitiva de endóderme de células-tronco pluripotentes induzidas (Dia 1 - 3)
- Degelo lento fator de crescimento reduzido (GFR)-membrana de porão (BM) meio de matriz no gelo 30 minutos antes do uso. No DMEM/F12 frio, misture, dilui o meio de matriz BM GFR 1:1 de tal forma que constitua 50% deste meio. Coloque as pontas de pipeta P1000 no congelador para esfriar antes de usar.
- Cubra cada poço de uma placa de 12 poços com 500 μL de matriz de membrana de 50% GFR-porão preparada em DMEM/F12 gelado. Uma vez revestido o número desejado de poços, remova qualquer mistura média e/ou bolhas em excesso de poços e coloque a placa no gelo ou geladeira a 4 °C por 20 minutos para definir. Em seguida, mova a placa para a incubadora a 37 °C durante a noite para gelar e secar.
- Uma vez que os hiPSCs atinjam 70-90% de confluência, adicione 10 μM de Inibidor de Quinase (ROCK) associado a Rho Y-27632 uma hora antes da dissociação. Aspire fora da mídia e lave uma vez com salina tamponada fosfato (PBS). Dissociar hiPSCs adicionando meio de descolamento celular (0,5 mL/ poço de uma placa de 12 poços) e incubar por 20 min a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%.
- Remova as placas da incubadora e adicione 0,5 mL/12-well de meio de passagem de células-tronco (Tabela 1) aos poços; células suavemente triturada usando uma ponta P1000 para obter suspensão unicelular. Transferir células dissociadas em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL; centrífuga por 5 min a 300 x g.
- Aspire fora do médio e resuspenda a pelota celular com 1 mL de mTeSR Plus de mídia suplementada com inibidor rock de 10 μM (Y-27632). Faça uma contagem de células. Adicione 2,0 x 105 hiPSCs em 1 mL de mTeSR complementado com inibidor de ROCHA Y-27632 por poço de uma placa revestida de membrana de 12 poços de GFR-porão. Incubar a 37 °C durante a noite.
NOTA: O número de semeadura celular deve ser otimizado por linha celular. 24 h após o revestimento, os poços devem ser 50%-70% confluentes. - No dia 1, aspire fora do mTeSR Plus e adicione mídia de indução Definitiva Endoderm (DE) (Tabela 1) complementada com 100 ng/mL de ativação humana A e 5 μM de inibidor GSK3β/Ativador Wnt CHIR99021.
NOTA: A mídia DE com o inibidor GSK3β/ativador Wnt CHIR99021 deve ser removida dentro de 20-24 h do dia 1 Indução DE para diferenciação bem sucedida. - No dia 2 e dia 3, mude para mídia de indução DE complementada com 100 ng/mL apenas de ativação A.
NOTA: A diferenciação DE não deve exceder um total de 72 h, ou a eficácia diminuirá. No dia 4, se for observado o die-off de células grandes, diminua o tempo total de exposição da mídia DE em 6-12 h. - Para analisar a eficiência de DE, confirme maior que 90% de expressão CXCR4 e/ou cKit através da citometria de fluxo ou análise de imunofluorescência de FOXA2 e/ou SOX17 (Figura 2a).
2. Indução anterior de endodermia de foregut (AFE) (Dia 4 - 6)
- No dia 4, mude a mídia para meio basal livre de soro (SFBM) (Tabela 1) complementada com 10 μM SB431542 e 2 μM Dorsomorphin para indução AFE. Mude a mídia AFE diariamente por 3 dias (dia 4, dia 5 e dia 6).
- Para analisar a eficiência da AFE, confirme a expressão robusta de SOX2, TBX1 e FOXA2 através de coloração de imunofluorescência (Figura 2b).
3. Diferenciação de célula progenitora pulmonar (LPC) (Dia 7 - 16)
- No dia 7, descongele a matriz de membrana GFR-porão no gelo. Aspire a mídia AFE e lave bem com 1x PBS. Adicione 1 mL de solução de descolamento celular e incubar por 10 min a 37 °C.
- Adicione 1 mL de meio de saciamento (2% FBS em DMEM/F12) aos poços que contêm solução de descolamento celular. Mantenha as células como agregados, encanar suavemente para cima e para baixo. Certifique-se de que todas as células sejam desalojadas e transferidas para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL. Centrifugar por 5 min a 300 x g.
- Remova o supernascimento e resuspenque a pelota celular em meio de saciamento suplementado com 10 ng/mL de proteína morfogênica ósseo recombinante humano-4 (BMP4), 0,1 μM de ácido retinóico totalmente trans (RA), 3 μM de inibidor GSK3β/Ativador Wnt CHIR99021, e 10 μM de Inibidor de Rocha Y-27632.
- Faça uma contagem de células. Adicione 2,5 x 105 células a 100 μL de meio de matriz de membrana GFR-porão frio, misture bem e coloque gotícula em um poço de uma placa de 12 poços. Incubar a placa a 37 °C por 30-60 min para permitir que o médio polimerize. Adicione 1 mL de mídia LPC suplementada com 10 μM de Inibidor de ROCHA Y-27632 por poço garantindo que a gota média esteja totalmente submersa e incubada a 37 °C durante a noite.
- No dia 8, 24 h após a indução do LPC, altere o meio LPC para remover o Inibidor de ROCHA Y-27632. Troque o meio LPC a cada dois dias por um total de 9-11 dias.
NOTA: Se o meio ficar amarelo dentro de 24h, troque de meio todos os dias. - Para analisar a eficiência do LPC, confirme a expressão robusta do fator de transcrição intracelular NKX2-1 ou realize a citometria de fluxo para marcadores de superfície CD47hi/CD26low15 ou CPM18 (Figura 2c). Grosseiramente, os esferoides LPC devem ser redondos e transparentes (Figura 2c).
NOTA: Não proceda com a diferenciação organoide pulmonar se a eficiência do NKX2-1 estiver abaixo de 30%.
Indução organoide pulmonar 4.3D (Dia 16 - 22)
- No dia 17, descongele a matriz de membrana GFR-porão no gelo. Aspire o meio de indução LPC. Em seguida, adicione 2 μg/mL de dispase (1 mL) ao poço e resuspenque a mistura média/dispase com uma pipeta P1000. Incubar a 37 °C por 15 min. Triturar a mistura novamente e incubar a 37 °C por mais 15 min.
- Transfira o dispase e as células para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL. Use PBS refrigerado (2-3 mL) para lavar o poço e resuspensar a mistura dispase/célula. Centrífuga por 5 min a 400 x g. Remova manualmente o supernatante, tomando cuidado para não distub a camada de pelota média/célula. Repita a lavagem pbs gelada e centrífugue o tubo de centrífuga cônica por mais 5 min a 400 x g.
- Remova manualmente o supernante e, em seguida, adicione 2 mL de solução de dissociação baseada em trippsina ao tubo de centrífuga cônica. Incubar a 37 °C por 12 min.
- Após a incubação, resuspend células com uma ponta de pipeta P1000. Em seguida, adicione um volume igual de mídia saciante ao tubo de centrífuga cônica e gire para baixo a 400 x g por 5 min. Aspire as células supernascidas e resuspend em meio de saciamento + 10 μM de Inibidor de ROCHA Y-27632.
NOTA: A indução de organoide pulmonar bem-sucedida ocorre quando as células são incorporadas como agregados, não células únicas, ajustam a pipetação de acordo. - Faça uma contagem de células. Calcule o volume necessário para obter 5,0-8,0 x 104 células por poço. Alíquota a célula LPC agrega em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL e centrífuga por 5 min a 400 x g. Remova o excesso de supernanato, tomando cuidado para não agitar a pelota celular. Deixe apenas 10 μL de mídia residual.
- Suspenda a pelota celular em 200 μL de meio de matriz de membrana gfr-porão frio e adicione às pastilhas de membrana de cultura celular (6,5 mm de diâmetro, poros de 0,4 μm, membrana de poliéster). Incubar a placa a 37 °C por 30-60 min para permitir que a matriz de membrana GFR-porão seja polimerizar.
- Adicionar 1 mL de meio de indução organoide 3D (Tabela 1) complementado com fator de crescimento do fibroblasto-7 (FGF7) (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inibidor GSK3β/Ativador Wnt CHIR (3 μM), fator de crescimento epidérmico (EGF) (10 ng/mL) e 10 μM de Inibidor de ROCHA Y-27632 para a câmara basolateral da pastilha da membrana. Troque o meio dia não por 6 dias.
Ramificação organoide pulmonar 5.3D (Dia 23 - 28)
- No dia 23, mude para meio de ramificação 3D (Tabela 1) complementado com FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inibidor GSK3β/Ativador Wnt CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng/mL) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) / fator de crescimento placentário (PlGF) (10 ng/mL). Troque o meio dia não por 6 dias.
NOTA: No dia 6 de diferenciação de ramificações 3D, deve haver organoides de ramificação múltiplos (Figura 2).
Maturação organoide .3D pulmão 6.3D (Dia 29 - 34)
- No dia 29, mudar para meio de maturação 3D (Tabela 1), que é o mesmo que meio de ramificação 3D, mas com a adição de dexametasona (50 nM), cAMP (100 μM) e 3-isobutil-1-metilxanthine (IBMX), um inibidor de fosfodiester também chamado isobutylxanthine (100 M). Troque o meio dia não por 6 dias.
NOTA: Dentro de 24 horas após o amadurecimento 3D, os organoides ramificados devem expandir e se transformar em esferas transparentes.
Imunocitoquímica organoide pulmonar 7.3D
- Para análise organoide pulmonar inteira 3D, fixar o meio de matriz de membrana GFR-porão nas pastilhas de membrana com 4% de paraformaldeído (PFA) por 1h a 4 °C. Incorporar em cera de parafina e montar em slides por protocolos publicados padrão.
- Realize a recuperação de antígenos antes da coloração. Os marcadores das vias aéreas incluem KRT5, MUC5AC e SCGB3A2. Os marcadores alveolares incluem SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 e HOPX (Figura 3).
8. Remoção de organoides pulmonares inteiros do meio de matriz de membrana GFR-porão para passagem, FACS ou criopreservação
- Para dissociar os organoides do meio de matriz de membrana GFR-porão, remova a mídia da câmara basal e adicione 2 μg/mL de dispase (1 mL) na câmara apical.
- Triturar suavemente a mistura média/dispase com uma pipeta P1000 e coloque na incubadora por 15 minutos. Triturar suavemente a mistura novamente e incubar por mais 15 minutos.
- Adicione 1 mL de PBS refrigerado (4 °C) e transfira organoides com o meio de matriz em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL. Gire a 400 x g por 5 min. Remova o supernatante cuidadosamente, para não perturbar a pelota celular.
- Lave mais uma vez com PBS refrigerado de 1 mL e gire a 400 x g por 5 min. Remova o supernatante cuidadosamente, para não perturbar a mistura média/celular.
- Adicione 1 mL de solução de descolamento celular ao tubo cônico centrífuga, levemente triturado resuspend a mistura de membrana GFR-Porão média/célula. Coloque na incubadora por 12 minutos para células passantes como agregados ou para criopreservação), ou 20 min para suspensão de célula única.
- Adicione o volume igual de mídia saciante e gire para baixo em 400 x g por 5 min. Resuspend em meio de saciamento + 10 μM de Inibidor de ROCHA Y-27632.
NOTA: Nesta etapa, nenhum meio de membrana residual do porão deve ser visto no tubo. Se o meio residual permanecer, repita as etapas 8.5 e 8.6. - Faça uma contagem de células. Calcule o volume necessário para aplicações a jusante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
24 horas após o revestimento, dia 1, os iPSCs devem ser 50%-90% confluentes. No dia 2, o DE deve ser 90%-95% confluente. Durante a indução de DE, é comum observar morte celular significativa no dia 4, mas as células anexadas manterão uma morfologia compacta de paralelepípedo (Figura 2b). Descontinua a diferenciação se a maioria das células aderentes se desprender e considerar reduzir a exposição à mídia DE com ativação A por 6-12 h. Durante a indução da AFE, a morte celular é mínima, e as células permanecem aderentes, mas parecerão menores e mais heterogêneas. A passagem das células no dia 7 só deve ser feita se o rendimento do SOX2 positivo duplo e FOXA2 for >80%. Depois de passar para a matriz de membrana do porão para indução 3D LPC, pequenos esferoides aparecerão primeiro, depois crescerão e alguns podem começar a ramificar-se. Os perfis de expressão genética para diferenciação endodérmica bem-sucedida incluem aumento sox17 no DE, aumento foxa2 e SOX2 com diminuição sox17 e a primeira aparição de NKX2-1, e aumento NKX2-1, juntamente com a presença de SOX2 e FOXA2. Consistente com o desenvolvimento embrionário precoce, ocorre a ventralização da AFE para o desenvolvimento de brotos pulmonares (NKX2-1+) e a dorsalização da AFE para o desenvolvimento gastrointestinal (SOX2+). As culturas do LPC terão uma mistura de progenitores pulmonares e gástricos.
A indução organoide pulmonar do LPC tem sido realizada utilizando vários métodos. Alguns grupos classificam as células usando repórteres fluorescentes NKX2-1 ou um proxy de antígeno de superfície (CPM, CD26lowCD47high). Mas esses organoides pulmonares contêm alveolares tipo II como células sem células alveolares tipo I ou mesenchyme. Outros grupos coletaram aglomerados de células que brotam da monocamada AFE/LPC e as incorporaram na matriz de membrana do porão. Esses organoides contêm uma população mista de epiteliais pulmonares e células mesenquimais, mas levam meses para a cultura19. Nosso protocolo inclui a presença de células epiteliais e mesenquimais. Os WLOs expressam marcadores proximais de células epiteliais p63 e KRT5 (células basais) e SCGB3A2 (células do clube), bem como marcadores de células epiteliais distal HOPX (ATI) e proSPC, SPB e NKX2-1 (ATII). Eles também expressam o marcador mesenquimal Vimentin na fase LPC, bem como em todos os organoides pulmonares. PDGFRα é um marcador para fibroblastos que têm uma função importante no pulmão durante a sacolarização e alveolarização20 e é co-expresso com o fator de transcrição importante na diferenciação de células distais, SOX9 (Figura 3).
Nosso método gera eficientemente culturas LPC 3D expressas NKX2-1 usando moléculas de sinalização que ocorrem no desenvolvimento pulmonar fetal para formar organoides pulmonares precoces. Ao passar LPCs para o meio de matriz de membrana GFR-porão para indução organoide pulmonar, é imperativo não se dissociar demais em uma única suspensão celular, mas para reter pequenas moitas de células (10 células/aglomerados). A contagem de células não será completamente precisa, mas ainda é necessária para evitar excesso de confluência durante a diferenciação organoide pulmonar de 3 semanas.
A indução organoide pulmonar deve produzir organoides pequenos e ramificados até o dia 6 de indução (dia 23 de diferenciação). Estes devem continuar a crescer durante a etapa de ramificação organoide e etapa de maturação. Vinte e quatro horas após a introdução da dexametasona, cAMP e IBMX, as filiais devem expandir-se para esferas transparentes. A análise organoide pulmonar inteira pode ser realizada no final da diferenciação, ou os WLOs podem ser passagem para a matriz de membrana de porão fresco com GFR ou criopreservado congelando em 10% DMSO.
Figura 1: Esquema global de diferenciação organoide pulmonar total (WLO) de hiPSCs e dados representativos. (a) Esquemático da diferenciação da WLO dos hiPSCs. Círculos representam tipo de célula endodérmica com marcadores de identificação. A linha do tempo de diferenciação é indicada em barras pretas. Fatores de crescimento e/ou pequenas moléculas para indução de populações organoides endodérmicas e pulmonares. Em resumo, as células-tronco são diferenciadas em endoderme definitivo, endoderme anterior de foregut e em células progenitoras pulmonares em aproximadamente 16 dias. Essas células são então passagee para o meio de matriz de membrana GFR-porão contendo inserções médias e submetidas à indução organoide pulmonar, ramificação e maturação. A diferenciação total leva aproximadamente 35 dias. b Imagens de contraste de fase representativas das células em estágios endodérmicos principais e imagens 3D de organoides pulmonares inteiros. Dimensione o tamanho da barra conforme indicado no painel. c Análise qRT-PCR dos marcadores de desenvolvimento pulmonar durante o endoderme e (d) diferenciação organoide pulmonar total de marcadores proximais e células distais. Todos os dados representam uma média de 3-5 réplicas biológicas. As barras de erro representam erro padrão da média e são normalizadas para atuar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização da diferenciação do endoderme por citometria de fluxo e imunocytoquímica. (a) Citometria de fluxo do marcador de endoderme definitivo CXCR4. O painel esquerdo mostra a gating contra a população não manchada, enquanto o painel médio mostra a população positiva CXCR4. O painel direito mostra imagens imunocitoquímicas de SOX17 (vermelho) sobrepostos com núcleos (azuis). b Imagem imunocytoquímica dos marcadores AFE FOXA2 e SOX2 sobrepostos com núcleos (azul). c Expressão endógena de NKX2-1-GFP em uma linha celular repórter em LPC 3D. Imagens tiradas da cultura celular ao vivo em Brightfield e GFP. Citometria de fluxo do progenitor pulmonar marcador intracelular NKX2-1 após fixação e permeabilização. Dimensione o tamanho da barra = 50 μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização de organoides pulmonares 3D inteiros após 3 semanas de diferenciação por imunocitoquímica. (a) Marcadores pulmonares proximais. O painel esquerdo mostra SOX2 (branco) e SOX9 (vermelho) sobrepostos por núcleos (azul). Esses marcadores são importantes na morfogênese ramificada e representam as populações epiteliais proximais e distal. Os painéis médios mostram P63 (vermelho) e KRT5 (vermelho), ambos marcadores de células basais. O painel direito mostra SCGB3A2, um marcador de células do clube. b Marcadores pulmonares distais. O painel esquerdo retrata pro-SPC (PSPC), (verde) e HOPX (vermelho), marcadores de células alveolar tipo II ad I, respectivamente, sobrepostas com núcleos (azul). O painel médio mostra pró-SPC (PSPC) (verde) e SPB (vermelho), marcadores de células alveolares tipo II, sobrepostos com núcleos (azul). O painel direito mostra NKX2-1 (vermelho) e ZO1 (verde) sobrepostos com núcleos (azul). (c) Marcadores de mesenquime pulmonar. O painel esquerdo mostra PDGFRA (vermelho) e SOX9 (branco), representando mesenquime distal. O painel direito mostra Vimentin (vermelho), que está disperso por todo o pulmão. Dimensione o tamanho da barra = 50 μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| REAGENTES E SOLUÇÕES - Para nomes da empresa, consulte a Lista de Tabela de Materiais |
| Meio de indução organoide 3D (dia 17-22) |
| Meio basal sem soro (ver receita) complementado com: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| EGF (10 ng/mL) |
| Meio de ramificação organoide 3D (dia 23-28) |
| Meio basal sem soro (ver receita) complementado com: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Ácido retinóico totalmente trans (0,1 μM) |
| EGF (10 ng/mL) |
| VEGF/PIGF (10 ng/mL) |
| Meio de maturação organoide 3D (dia 29-34) |
| Meio basal sem soro (ver receita) complementado com: |
| Dexametasona (50 nM) |
| BR-cAMP (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| Meio de indução aFE (dia 4-6) |
| Meio basal sem soro (ver receita) complementado com: |
| SB431542 (10 μM) |
| Dorsomorphin (2 μM) |
| Meio de indução DE (dia 1-3) |
| 48,5 mL RPMI1640 + Glutamax |
| 1 mL B27 sem ácido retinóico |
| 500 μl HEPES (1%) |
| Caneta/estreptococos de 500 μl |
| Ativação humana A (100 ng/mL) |
| CHIR99021 (5 μM) - somente nas primeiras 24 horas |
| Meio de indução lPC (dia 7-16) |
| Meio basal sem soro (ver receita) complementado com: |
| BMP4 (10 ng/mL) |
| Ácido retinóico totalmente trans (RA) (0,1 μM) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Meio saciante |
| 49 mL DMEM/F12 |
| 1 mL FBS |
| Meio basal sem soro (SFBM) |
| 375 mL Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) + Glutamax |
| F12 de 125 mL Ham |
| 5 mL B27 sem ácido retinóico |
| 2,5 mL N2 |
| 500 μl ácido ascórbico, 50 mg/mL |
| 13 μl monothioglycerol/1ml de IMDM" use 300ul de 0,4mM monothioglicerol por 100ml de mídia livre de soro |
| 3,75 mL de gânbio bovino (BSA) Fração V, solução de 7,5% |
| Caneta/estreptococos de 500 μl |
| Meio de passagem de células-tronco (dia 0) |
| 500 mL DMEM/F12 |
| Substituição de soro knockout de 129 mL (KSR) |
| 6,5 mL Glutamax |
| 6,5 mL NEAA |
| 1,3 mL 2-mercaptoetanol |
| Caneta/estreptococos de 6,5 mL |
Tabela 1: Tabela de mídia.
| Problema | Solução |
| Diferenciação DE não eficiente | 24 horas após o revestimento em células-tronco média, as células devem ser 50-70% confluentes |
| Inibidor GSK3β/Ativador Wnt CHIR99021 deve ser removido dentro de 20-24 horas após o dia 1 Indução DE | |
| A diferenciação DE não deve exceder um total de 72 horas | |
| Diferenciação AFE não eficiente | Certifique-se de que a diferenciação DE foi bem sucedida e as células expressam > 80% CXCR4 |
| Garantir que novos fatores de crescimento/pequenas moléculas estejam sendo adicionados à mídia diariamente | |
| Diferenciação de LPC não eficiente | Certifique-se de que a diferenciação da AFE foi bem sucedida e as células expressam > 80% FOXA2/SOX2 |
| Certifique-se de que as células AFE sejam passagemdas como agregados de 4-10 células e não unicelulares | |
| Organoides pulmonares 3D não crescendo ou diferenciando | Certifique-se de que a diferenciação do LPC foi bem sucedida e as células expressam > 30% NKX2-1 |
| Certifique-se de que os LPCs foram aprovados como agregados de 4-10 células e não unicelulares | |
| Certifique-se de que não há matrigel residual dos LPCs durante a passagem | |
| Adicione o Inibidor rock Y-27632 a cada mudança de mídia | |
| Certifique-se de que a mídia seja alterada a tempo e novos fatores de crescimento/pequenas moléculas são adicionados | |
| Garantir que a concentração de fatores de crescimento/pequenas moléculas esteja correta |
Tabela 2: Solução de problemas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A diferenciação bem sucedida de organoides pulmonares inteiros 3D (WLO) conta com um protocolo de várias etapas e seis semanas com atenção aos detalhes, incluindo tempo de exposição a fatores de crescimento e pequenas moléculas, densidade celular após a passagem e a qualidade dos hiPSCs. Para solucionar problemas, consulte tabela 2. hiPSCs devem ser aproximadamente 70%-80% confluentes, com menos de 5% de diferenciação espontânea antes da dissociação. Este protocolo exige o meio "mTeSR plus"; no entanto, o meio "mTeSR" simples também tem sido usado com resultados comparáveis e é menos caro. Para a matriz extracelular, usamos meio de matriz de membrana de porão GFR. Passamos os hiPSCs usando ReLesR (ver Tabela de Materiais) para reduzir a diferenciação.
Durante a diferenciação do endoderme, as células devem ser visualizadas diariamente antes e depois das alterações na mídia. Fatores de crescimento especificados/pequenas moléculas devem ser adicionados diariamente ao meio base para evitar a degradação prematura. A morte celular em endoderme definitivo (DE) é comum, mas deve ser limitada durante a indução anterior de células progenitoras (AFE) e célula progenitora pulmonar (LPC). Se houver um grande die off no terceiro dia de DE (dia 4), diminua o tempo total de DE em 6-12 h. Novas linhas de células iPSC podem precisar ser otimizadas para uma diferenciação de endoderme bem sucedida. Realize a citometria de fluxo no DE para CXCR4 para confirmar a indução bem sucedida (>85% CXCR4 + células). As células devem ser relativamente estáveis na AFE e mudarão morfologicamente com pouco die off.
A passagem para LPC é outro processo que deve ser otimizado para o tipo celular. Replando células com densidade muito baixa (<50%) resultará em diferenciação ineficiente. Confirme a indução lpc bem sucedida com imunocytoquímica para NKX2-1 ou citometria de fluxo para CPM18 ou CD26low/CD47high15. A indução de LPC bem sucedida deve ter >40% NKX2-1, caso contrário os organoides terão maior abundância de AFE dorsal. Para a indução do LPC, os fatores de crescimento devem ser adicionados à mídia base a cada mudança de mídia. Se a mídia se tornar amarela mais tarde na indução do LPC, considere aumentar o volume de mídia fresca ou mude a mídia todos os dias. Durante a indução organoide pulmonar 3D, o número de revestimento e a manutenção de aglomerados celulares são fundamentais para o crescimento organoide bem sucedido. O meio de matriz de membrana GFR-porão é difícil de manusear e altamente sensível à temperatura, por isso mantenha-o sempre no gelo. Se a matriz de membrana GFR-porão for muito cedo, então as células LPC não se integrarão dentro dela. Recomendamos descongelar 1 mL de alíquotas de matriz de membrana GFR-porão no gelo 30 min antes da passagem. Uma vez que as células/aglomerados tenham sido contadas e alíquotas apropriadas feitas, coloque a pelota de célula no gelo. Sugerimos a preparação de placas, rotulagem e adição de pastilhas de membrana de cultura celular antes do manuseio médio da matriz de membrana GFR-porão.
Use dicas de pipeta para adicionar o volume correto do meio de matriz de membrana GFR-porão líquido imediatamente à pelota celular, mantendo-se no gelo. Pipeta para cima e para baixo rapidamente, mas suavemente (manuseio nuances) para não introduzir bolhas, em seguida, coloque o tubo de volta no gelo. Adicione a mistura média da matriz de membrana de célula e GFR-porão à porção apical do transwell em placas preparadas. A mistura deve se espalhar e revestir toda a transwell; incline suavemente a placa para garantir o revestimento. Depois de gelar na incubadora por 30-60 min, deve haver aglomerados de células visíveis no meio da matriz de membrana GFR-porão. Adicione mídia de indução pulmonar apropriada à câmara basal suplementada com 10 μM de inibidor de ROCHA Y-27632 e monitore o crescimento organoide a cada dois dias.
As aplicações futuras dos organoides geradas por este protocolo incluem o estudo das vias moleculares que controlam o compromisso de linhagem pulmonar precoce e a especificação do destino celular21,22,23. A interação entre o epitélio e o mesenquime pode ser determinada utilizando modelos de nocaute genético24. Os organoides também poderiam ser co-cultivados com células endoteliais para determinar a importância da sinalização de co-padrão específico do tecido entre o epitélio pulmonar, mesenquime e o endotélio25. O desenvolvimento pulmonar ocorre em paralelo com o desenvolvimento vascular e essa relação pode provocar importantes mecanismos moleculares necessários para o desenvolvimento adequado do pulmão. Também mostramos que esses organoides pulmonares inteiros são funcionais através de ensaios de secreção surfactante depois que o meio da matriz de membrana GFR-porão foi removido seguido pela cultura de curto prazo em poços de apego ultra-baixo26. Outras estratégias incluem a classificação das células para marcadores de superfície celular, como NGFR (células basais)27 e HTII-280 (células ATII)28 e substituindo-as como organoides homogêneas ou monocamadas em condições de cultura interfase líquida. Organoides pulmonares inteiros, proximais e distais também têm sido usados para estudar os alvos celulares e a fisiopatologia da infecção viral SARS-CoV-2, a fim de entender melhor e testar drogas que possam combater o COVID-19.
Este protocolo é robusto e reprodutível, mas muitos desafios ainda existem. Muitas linhas diferentes de iPSC e ESC foram testadas (>20 linhas), mas o protocolo deve ser otimizado para cada linha celular. Apesar da indução robusta de DE e AFE, a indução de LPC pode ser difícil de alcançar >40% das células NKX2-1 + . Outros protocolos incluem um passo de triagem para marcadores superficiais de células NKX2-115,18, mas esses só produzem alveolar tipo II como organoides sem mesenquime e ainda contêm populações de células gástricas e hepáticas, apesar de purificar a população progenitora pulmonar29. Também notamos uma pequena quantidade de células gástricas e hepáticas tanto no LPC quanto em organoides pulmonares inteiros, possivelmente devido à presença de células foregut anteriores dorsais contaminando os LPCs. Portanto, a diferenciação de organoides pulmonares puros ainda está para ser alcançada, e mais pesquisas sobre o desenvolvimento das células progenitoras pulmonares no tecido humano devem ser concluídas. Os ensaios a jusante devem ser vigorosamente referenciados com expressão genética e proteica do tecido pulmonar humano primário. Embora, até o momento, o uso mais frutífero de organoides pulmonares tenha sido na modelagem de doenças e no rastreamento de medicamentos in vitro, o transplante de organoides pulmonares derivados do hiPSC em pacientes para medicina regenerativa tem sido contemplado como uma futura terapia para uma série de condições. No entanto, antes de considerar tais intervenções, uma boa dose de controle de qualidade deve ser aperfeiçoada, incluindo a identificação e remoção de derivados hiPSC contaminantes, indesejáveis e potencialmente tumorigênicos. Além disso, melhores ensaios funcionais in vitro e melhores modelos animais de doença pulmonar ainda precisam ser desenvolvidos.
Especificamente, a funcionalidade e a segurança das células derivadas do hiPSC devem ser confirmadas. Células indiferenciadas precisam ser excluídas, pois têm a capacidade de gerar teratomas. Um método para determinar células-tronco indiferenciadas em endoderme definitivo é classificar as células usando o marcador de pluripotência SSEA4. Genes marcadores para hiPSCs não diferentes foram recentemente detectados usando sequenciamento de RNA de célula única30. ESRG, CNMD e SFRP2 podem ser usados para validar células indiferenciadas em qualquer etapa de diferenciação. Uma vez confirmada a pureza, o benefício das terapias derivadas do iPSC autólogos é a capacidade das células transplantadas evitarem a rejeição, uma vez que vêm das próprias células do paciente. As desvantagens incluem o tempo que leva para diferenciar totalmente as células, submeter-se a rigorosos testes de grau clínico e transplantar as células em um paciente com uma lesão aguda (síndrome do problema respiratório, infarto do miocárdio ou lesão espinhal). A alternativa é utilizar células derivadas do iPSC alergênicos bancários31. Estes podem ser armazenados e prontamente disponíveis para pacientes com antígeno leucócito humano (HLA) combinados doadores e eles terão sido submetidos a testes minuciosos para contaminação. A maior desvantagem é a possibilidade de rejeição imunológica. A imunossupressão pode ser necessária no transplante de células aogênicas, que é a realidade atual dos transplantes de tecido integral alergênicos. Estratégias estão sendo elaboradas para permitir que as células derivadas do iPSC alergênicos evitem a resposta imune para transplantá-las com segurança em pacientes32.
Eventualmente, os organoides pulmonares inteiros derivados do iPSC serão utilizados para estudar modelos de doenças específicas do paciente, adaptar terapêuticas e melhorar a pesquisa médica regenerativa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A.
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X.
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C.
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
