Summary
В статье описана пошаговая направленная дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в трехмерные цельные органоиды легких, содержащие как проксимальные, так и дистальные эпителиальные клетки легких вместе с мезенхимой.
Abstract
Развитие и заболевания легких человека было трудно изучать из-за отсутствия биологически значимых модельных систем in vitro . Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) могут быть дифференцированы поэтапно в 3D-многоклеточные органоиды легких, состоящие как из эпителиальных, так и из мезенхимальных клеточных популяций. Мы резюмируем эмбриональные сигналы развития, временно вводя различные факторы роста и небольшие молекулы для эффективной генерации окончательной энтодермы, передней передней энтодермы передней части и впоследствии клеток-предшественников легких. Эти клетки затем внедряются в матричную среду с пониженным фактором роста (СКФ), что позволяет им спонтанно развиваться в 3D-органоиды легких в ответ на внешние факторы роста. Эти целые легкие органоиды (WLO) проходят ранние стадии развития легких, включая ветвящийся морфогенез и созревание после воздействия дексаметазона, циклического AMP и изобутилксантина. VLO обладают эпителиальными клетками дыхательных путей, экспрессирующими маркеры KRT5 (базальный), SCGB3A2 (клубный) и MUC5AC (кубок), а также альвеолярными эпителиальными клетками, экспрессирующими HOPX (альвеолярный тип I) и SP-C (альвеолярный тип II). Мезенхимальные клетки также присутствуют, включая актин гладких мышц (СМА) и рецептор фактора роста А,, полученный из тромбоцитов (PDGFRα). Полученные из iPSC VLO могут поддерживаться в условиях 3D-культуры в течение многих месяцев и могут быть отсортированы для поверхностных маркеров для очистки определенной клеточной популяции. Полученные из iPSC WLO также могут быть использованы для изучения развития легких человека, включая передачу сигналов между эпителием легких и мезенхимой, для моделирования генетических мутаций функции и развития клеток легких человека и для определения цитотоксичности инфекционных агентов.
Introduction
Легкое является сложным, гетерогенным, динамическим органом, который развивается в шесть различных стадий - эмбриональное, псевдогландулярное, канальцевое, мешковидное, альвеолярное и микрососудистое созревание1,2. Последние две фазы происходят до и послеродово в развитии человека, в то время как первые четыре стадии происходят исключительно во время развития плода, если не происходят преждевременные роды3. Эмбриональная фаза начинается в эндодермальном зародышевом слое и завершается бутонизацией трахеи и почек легких. Развитие легких происходит частично через передачу сигналов между эпителиальными и мезенхимальными клетками4. Эти взаимодействия приводят к ветвлению легких, пролиферации, определению клеточной судьбы и клеточной дифференцировке развивающегося легкого. Легкое делится на проводящие зоны (трахея к терминальным бронхиолам) и дыхательные зоны (дыхательные бронхиолы к альвеолам). Каждая зона содержит уникальные типы эпителиальных клеток; включая базальные, секреторные, реснитчатые, щеточные, нейроэндокринные и ионоцитарные клетки в проводящих дыхательных путях5, за которыми следуют альвеолярные клетки I и II типа в респираторном эпителии6. Многое до сих пор неизвестно о развитии и реакции на повреждение различных типов клеток. Производные от iPSC модели органоидов легких позволяют изучать механизмы, которые управляют развитием легких человека, влияние генетических мутаций на легочную функцию и реакцию эпителия и мезенхимы на инфекционные агенты без необходимости первичной легочной ткани человека.
Маркеры, соответствующие различным стадиям эмбриональной дифференцировки, включают CXCR4, cKit, FOXA2 и SOX17 для окончательной энтодермы (DE)7, FOXA2, TBX1 и SOX2 для передней эндодермы передней части (AFE)8 и NKX2-1 для ранних клеток-предшественников легких9. При эмбриональном развитии легких передняя кишка делится на дорсальный пищевод и вентральную трахею. Почки правого и левого легких выглядят как два независимых выхода вокруг почка трахеи10. Во время ветвящегося морфогенеза мезенхима, окружающая эпителий, производит эластичную ткань, гладкую мускулатуру, хрящи и сосудистую систему11. Взаимодействие между эпителием и мезенхимой имеет важное значение для нормального развития легких. Это включает в себя секрецию FGF1012 мезенхимой и SHH13 , производимую эпителием.
Здесь мы описываем протокол направленной дифференциации hiPSCs в трехмерные (3D) целые органоиды легких (WLO). Хотя существуют аналогичные подходы, которые включают выделение клеток-предшественников легких путем сортировки на стадии LPC для получения альвеолярных органоидов14,15 (дистальных) органоидов или органоидов дыхательных путей16 (проксимальных) или генерируют вентрально-передние сфероиды передней скаты, чтобы сделать органоиды легких человека, экспрессирующие альвеолярные клетки и мезенхимальные маркеры и органоиды предшественников почек17 , сила этого метода заключается в включении как эпителиальных, так и мезенхимальных типов клеток легких для моделирования и оркестрации морфогенеза, созревания и расширения легких in vitro.
Этот протокол использует малые молекулы и факторы роста для направления дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток через окончательную энтодерму, переднюю эндодерму передней части и клетки-предшественники легких. Эти клетки затем индуцируются в 3D-органоиды целых легких через важные этапы развития, включая ветвление и созревание. Резюме протокола дифференцировки показано на рисунке 1а с репрезентативными изображениями яркого поля эндодермальной и органоидной дифференцировки, показанными на рисунке 1b. На рисунке 1c,d показаны детали экспрессии генов эндодермальной дифференцировки, а также экспрессия генов как проксимальной, так и дистальной популяций эпителиальных клеток легких после завершения дифференцировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол исследования был одобрен Советом по институциональному обзору Программы защиты исследований человека UCSD (181180).
1. Окончательная индукция энтодермы из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (День 1 - 3)
- Медленно оттаивайте матричную среду с пониженным фактором роста (СКФ)-базальной мембраной (БМ) на льду за 30 минут до использования. В холодной смеси DMEM/F12 разбавляют матричную среду СКФ BM 1:1 таким образом, чтобы она составляла 50% этой среды. Поместите наконечники пипеток P1000 в морозильную камеру для охлаждения перед использованием.
- Покрыть каждую скважину 12-луночной пластины 500 мкл 50% ГКФ-базальной мембранной матричной среды, приготовленной в ледяном DMEM/F12. После того, как нужное количество лунок покрыто, удалите любую избыточную смесь среды и/или пузырьки из скважин и поместите пластину на лед или холодильник при 4 °C в течение 20 мин для установки. Затем переместите пластину в инкубатор при 37 °C на ночь, чтобы гелеобразную и высушенную.
- Как только hiPSCs достигнут 70-90% слияния, добавьте 10 мкМ ингибитора Rho-ассоциированной киназы (ROCK) Y-27632 за час до диссоциации. Аспирировать со среды и промыть один раз фосфатным буферизованным физиологическим раствором (PBS). Диссоциируют hiPSCs путем добавления среды отсоединения клеток (0,5 мл / лунка 12-луночной пластины) и инкубируют в течение 20 мин при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе.
- Извлеките пластины из инкубатора и добавьте в лунки 0,5 мл/12 лунки среды для пропускания стволовых клеток (табл. 1); осторожно тритурировать клетки с помощью наконечника P1000 для получения одноэлементной суспензии. Перенос диссоциированных клеток в коническую центрифужную трубку объемом 15 мл; центрифуга в течение 5 мин при 300 х г.
- Аспирировать со среды и повторно суспендировать клеточную гранулу 1 мл среды mTeSR Plus, дополненной ингибитором ROCK 10 мкМ (Y-27632). Выполните подсчет ячеек. Добавьте 2,0 x 105 hiPSCs в 1 мл mTeSR, дополненного ингибитором ROCK Y-27632 на лунку 12-луночной пластины со средним покрытием СКФ-базальной мембраны. Инкубировать при 37 °C в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Число посева ячеек должно быть оптимизировано для каждой строки ячейки. Через 24 ч после нанесения покрытия скважины должны быть на 50%-70% сливающимися. - На 1-й день аспирировать из mTeSR Plus и добавить индукционную среду Definitive Endoderm (DE) (таблица 1), дополненную 100 нг/мл человеческого активина A и 5 мкМ ингибитора GSK3β/активатора Wnt CHIR99021.
ПРИМЕЧАНИЕ: DE-среда с ингибитором GSK3β/активатором Wnt CHIR99021 должна быть удалена в течение 20-24 ч индукции DE 1-го дня для успешной дифференцировки. - На 2-й и 3-й день переведите на индукционную среду DE, дополненную 100 нг/мл только активина А.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференциация DE не должна превышать в общей сложности 72 ч, иначе эффективность снизится. На 4 день, если наблюдается отмирание крупных клеток, уменьшают общее время воздействия среды DE на 6-12 ч. - Для анализа эффективности DE подтвердите более 90% экспрессии CXCR4 и/или cKit с помощью проточной цитометрии или иммунофлуоресцентного анализа FOXA2 и/или SOX17 (рисунок 2a).
2. Индукция передней эндодермы передней передней кости (AFE) (День 4 - 6)
- На 4-й день замените среду на бессывороточную базальную среду (SFBM) (таблица 1), дополненную 10 мкМ SB431542 и 2 мкМ дорсоморфина для индукции АФЭ. Меняйте носитель AFE ежедневно в течение 3 дней (день 4, день 5 и день 6).
- Чтобы проанализировать эффективность AFE, подтвердите надежную экспрессию SOX2, TBX1 и FOXA2 с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания (рисунок 2b).
3. Дифференцировка клеток-предшественников легких (LPC) (день 7 - 16)
- На 7 день разморозьте СКФ-базальную мембранную матричную среду на льду. Аспирируйте от носителя AFE и хорошо промойте 1x PBS. Добавить 1 мл раствора для отсоединения клеток и инкубировать в течение 10 мин при 37 °C.
- Добавьте 1 мл закалочной среды (2% FBS в DMEM/F12) в скважины, содержащие раствор для отсоединения клеток. Храните ячейки в виде агрегатов, мягко испешивая вверх и вниз. Убедитесь, что все клетки смещены и перенесены в коническую центрифужную трубку объемом 15 мл. Центрифуга в течение 5 мин при 300 х г.
- Удаляют супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу в закалочной среде, дополненной 10 нг/мл человеческого рекомбинантного костного морфогенного белка-4 (BMP4), 0,1 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты (РА), 3 мкМ ингибитора GSK3β/активатора Wnt CHIR99021 и 10 мкМ ингибитора горных пород Y-27632.
- Выполните подсчет ячеек. Добавьте 2,5 х 105 клеток к 100 мкл холодной матричной среды ГКФ-базальной мембраны, хорошо перемешайте и поместите каплю в лунку из 12-луночной пластины. Инкубируют пластину при 37 °C в течение 30-60 мин, чтобы дать среде полимеризоваться. Добавьте 1 мл среды LPC, дополненной 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632 на лунку, гарантируя, что капля среды полностью погружена и инкубируется при 37 °C в течение ночи.
- На 8-й день, через 24 ч после индукции LPC, измените среду LPC для удаления ингибитора ROCK Y-27632. Меняйте среду LPC через день в общей сложности 9-11 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если среда становится желтой в течение 24 часов, меняйте среду каждый день. - Для анализа эффективности LPC подтвердите надежную экспрессию внутриклеточного транскрипционного фактора NKX2-1 или выполните проточную цитометрию поверхностных маркеров CD47hi/CD26low15 или CPM18 (рисунок 2c). Грубо говоря, сфероиды LPC должны быть круглыми и прозрачными (рисунок 2c).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует продолжать дифференциацию органоидов легких, если эффективность NKX2-1 ниже 30%.
4.3D индукция органоидов легких (День 16 - 22)
- На 17 день разморозить на льду СКФ-базальную мембранную матричную среду. Аспирируйте индукционную среду LPC. Затем добавьте в скважину 2 мкг/мл диспазы (1 мл) и повторно суспендируйте смесь среды/диспазы пипеткой P1000. Инкубировать при 37 °C в течение 15 мин. Снова тритурировать смесь и инкубировать при 37 °C еще 15 мин.
- Перенесите диспазу и клетки в коническую центрифужную трубку объемом 15 мл. Используйте охлажденный PBS (2-3 мл) для промывки скважины и повторного суспендирования смеси диспазы и клеток. Центрифуга в течение 5 мин при 400 х г. Вручную удалите супернатант, стараясь не засыпать слой гранул среды/клетки. Повторите охлажденную промывку PBS и центрифугируйте коническую центрифужную трубку еще на 5 минут при 400 х г.
- Вручную удалите супернатант, а затем добавьте 2 мл диссоциационного раствора на основе трипсина в трубку конической центрифуги. Инкубировать при 37 °C в течение 12 мин.
- После инкубации повторно суспендируйте клетки с помощью наконечника пипетки P1000. Затем добавьте равный объем закалочной среды в трубку конической центрифуги и открутите вниз при 400 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки в закалочной среде + 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная индукция органоидов легких происходит, когда клетки встроены в виде агрегатов, а не отдельных клеток, соответствующим образом корректируют пипетирование. - Выполните подсчет ячеек. Рассчитайте объем, необходимый для получения 5,0-8,0 х 104 ячеек на скважину. Ячейка Aliquot LPC объединяется в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл и центрифугу в течение 5 мин при 400 х г. Удалите избыток супернатанта, стараясь не перемешивать ячейку гранулы. Оставьте только 10 мкл остаточной среды.
- Повторно суспендировать клеточную гранулу в 200 мкл холодной матричной среды СКФ-базальной мембраны и добавить к мембранным вставкам клеточной культуры (диаметр 6,5 мм, пора 0,4 мкм, полиэфирная мембрана). Инкубировать пластину при 37 °C в течение 30-60 мин, чтобы дать возможность полимеризации матричной среды СКФ-базальной мембраны.
- Добавьте 1 мл 3D органоидной индукционной среды (таблица 1), дополненную фактором роста фибробластов-7 (FGF7) (10 нг/мл), FGF10 (10 нг/мл), ингибитором GSK3β/активатором Wnt CHIR (3 мкМ), эпидермальным фактором роста (EGF) (10 нг/мл) и 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632 в базолатеральную камеру мембранной вставки. Меняйте среду через день в течение 6 дней.
5.3D Ветвление органоидов легких (День 23 - 28)
- На 23 день переход на 3D-ветвящуюся среду (таблица 1), дополненную FGF7 (10 нг/мл), FGF10 (10 нг/мл), ингибитором GSK3β/активатором Wnt CHIR99021 (3 мкМ), РА (0,1 мкМ), EGF (10 нг/мл) и фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) / плацентарным фактором роста (PlGF) (10 нг/мл). Меняйте среду через день в течение 6 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: На 6-й день дифференциации ветвления 3D должно быть несколько ветвящихся органоидов (рисунок 2).
6.3D созревание органоидов легких (29 - 34 день)
- На 29-й день переходят на 3D-среду созревания (таблица 1), которая такая же, как 3D-среда ветвления, но с добавлением дексаметазона (50 нМ), цАМФ (100 мкМ) и 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX), ингибитора фосфодиэстеразы, также называемого изобутилксантином (100 мкМ). Меняйте среду через день в течение 6 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 24 ч после созревания 3D ветвящиеся органоиды должны расширяться и превращаться в прозрачные сферы.
7.3D Иммуноцитохимия органоидов легких
- Для 3D-анализа органоидов всего легкого зафиксируйте матричную среду СКФ-базальной мембраны в мембранных вставках с 4% параформальдегидом (PFA) в течение 1 ч при 4 °C. Встраивается в парафиновый воск и монтируется на слайды в соответствии со стандартными опубликованными протоколами.
- Выполните извлечение антигена перед окрашиванием. Маркеры дыхательных путей включают KRT5, MUC5AC и SCGB3A2. Альвеолярные маркеры включают SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 и HOPX (рисунок 3).
8. Удаление целых органоидов легких из матричной среды СКФ-базальной мембраны для прохождения, FACS или криоконсервации
- Чтобы диссоциировать органоиды из матричной среды СКФ-базальной мембраны, удаляют среду из базальной камеры и добавляют 2 мкг/мл диспазы (1 мл) в апикальную камеру.
- Аккуратно тритурировать смесь среды/диспазы пипеткой P1000 и поместить в инкубатор на 15 мин. Осторожно снова протрите смесь и инкубируйте еще 15 минут.
- Добавьте 1 мл охлажденного PBS (4 °C) и перенесите органоиды с матричной средой в коническую центрифужную трубку объемом 15 мл. Отжим при 400 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант осторожно, чтобы не нарушить клетку гранулы.
- Промыть еще раз 1 мл охлажденного PBS и открутить при 400 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант осторожно, чтобы не нарушить смесь среды и клеток.
- Добавьте 1 мл раствора клеточной отслоения к конической центрифужной трубке, аккуратно тритурат повторно суспендируйте матричную среду/ячейку СКФ-базальной мембраны. Поместите в инкубатор на 12 мин для пассирования клеток в виде агрегатов или для криоконсервации) или на 20 мин для одноклеточной суспензии.
- Добавьте равный объем закалочной среды и открутите при 400 х г в течение 5 мин. Повторное суспендирование в закалочной среде + 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе в трубке не должно быть видно остаточной среды базальной мембраны. Если остаточная среда остается, повторите шаги 8.5 и 8.6. - Выполните подсчет ячеек. Рассчитайте объем, необходимый для последующих приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Через 24 часа после нанесения покрытия, день 1, иПСК должны быть на 50%-90% сливающимися. На 2 день ДЭ должен быть 90%-95% сливающимся. Во время индукции DE обычно наблюдается значительная гибель клеток на 4-й день, но прикрепленные клетки сохраняют компактную морфологию булыжника (рисунок 2b). Прекратить дифференцировку, если большинство адгезивных клеток отделяются, и рассмотреть возможность сокращения воздействия DE-среды активином А на 6-12 ч. Во время индукции AFE гибель клеток минимальна, и клетки остаются адгезионными, но будут казаться меньшими и более неоднородными. Прохождение клеток на 7-й день должно быть выполнено только в том случае, если выход двойных положительных SOX2 и FOXA2 составляет >80%. После перехода в базальную мембранную матрицу для индукции 3D LPC сначала появятся небольшие сфероиды, затем вырастут, а некоторые могут начать ветвиться. Профили экспрессии генов для успешной эндодермальной дифференцировки включают увеличение SOX17 при DE, увеличение FOXA2 и SOX2 с уменьшением SOX17 и первым появлением NKX2-1 и увеличение NKX2-1, наряду с присутствием SOX2 и FOXA2. В соответствии с ранним эмбриональным развитием, вентрализация AFE происходит для развития почек легких (NKX2-1+), а дорсализация AFE происходит для развития желудочно-кишечного тракта (SOX2+). Культуры в LPC будут иметь смесь как легочных, так и желудочных предшественников.
Индукция органоидов легких из LPC была выполнена с использованием различных методов. Некоторые группы сортируют клетки, используя флуоресцентные репортеры NKX2-1 или прокси поверхностного антигена (CPM, CD26lowCD47high). Но эти леговидные органоиды содержат альвеолярные клетки типа II, подобные клеткам, без альвеолярных клеток типа I или мезенхимы. Другие группы собрали клеточные сгустки, которые выходят из монослоя AFE / LPC и встраивают их в матрицу базальной мембраны. Эти органоиды содержат смешанную популяцию эпителиальных и мезенхимальных клеток легких, но для культивирования требуются месяцы19. Наш протокол включает в себя как наличие эпителиальных, так и мезенхимальных клеток. WLOs экспрессируют проксимальные эпителиальные клеточные маркеры p63 и KRT5 (базальные клетки) и SCGB3A2 (клубные клетки), а также дистальные эпителиальные клеточные маркеры HOPX (ATI) и proSPC, SPB и NKX2-1 (ATII). Они также экспрессируют мезенхимальный маркер Виментина на стадии LPC, а также во всех органоидах легких. PDGFRα является маркером фибробластов, которые имеют важную функцию в легких во время саккуляции и альвеоляризации20 и экспрессируется совместно с фактором транскрипции, важным для дифференцировки дистальных клеток, SOX9 (рисунок 3).
Наш метод эффективно генерирует NKX2-1-экспрессирующие LPC 3D-культуры с использованием сигнальных молекул, которые происходят в развитии легких плода с образованием ранних органоидов легких. При прохождении LPC в матричную среду СКФ-базальной мембраны для индукции органоидов легких крайне важно не чрезмерно диссоциировать в одноклеточную суспензию, а вместо этого удерживать небольшие скопления клеток (10 клеток / сгусток). Подсчет клеток не будет полностью точным, но все же необходимо избегать чрезмерного слияния во время 3-недельной дифференцировки органоидов легких.
Индукция органоидов легких должна давать небольшие, ветвящиеся органоиды к 6-му дню индукции (23-й день дифференцировки). Они должны продолжать расти во время стадии ветвления органоида и стадии созревания. Через двадцать четыре часа после введения дексаметазона, цАМФ и IBMX ветви должны расширяться в прозрачные сферы. Анализ органоидов целых легких может быть выполнен в конце дифференцировки, или VLO могут проходить в свежую базальную мембранную матрицу с СКФ или криоконсервироваться путем замораживания в 10% DMSO.
Рисунок 1: Общая схема дифференциации целых органоидов легких (WLO) от hiPSCs и репрезентативных данных. (a) Схема дифференциации WLO от hiPSCs. Круги представляют тип эндодермальных клеток с идентифицирующими маркерами. Временная шкала дифференциации обозначена черными полосами. Факторы роста и/или малые молекулы для индукции эндодермальных и легочных органоидных популяций. Таким образом, стволовые клетки дифференцируются в окончательную энтодерму, переднюю энтодерму передней части и в клетки-предшественники легких примерно через 16 дней. Эти клетки затем проходят в матричную среду СКФ-базальной мембраны, содержащую средние вставки, и подвергаются индукции, разветвлению и созреванию органоидов легких. Общая дифференциация занимает примерно 35 дней. b) репрезентативные фазовые контрастные изображения клеток на основных эндодермальных стадиях и 3D-изображения целых органоидов легких. Масштабируйте размер полосы, как указано на панели. (c) qRT-PCR анализ маркеров развития легких во время эндодермы и (d) дифференцировки органоидов всего легкого проксимальных и дистальных клеточных маркеров. Все данные представляют собой в среднем 3-5 биологических реплик. Полосы погрешностей представляют собой стандартную погрешность среднего значения и нормализуются до актина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Характеристика дифференцировки эндодермы методом проточной цитометрии и иммуноцитохимии. (а) Проточная цитометрия окончательного маркера энтодермы CXCR4. Левая панель показывает затвор против незапятнанного населения, в то время как средняя панель показывает положительную популяцию CXCR4. На правой панели показано иммуноцитохимическое изображение SOX17 (красный), наложенное ядрами (синий). b) иммуноцитохимическое изображение маркеров AFE FOXA2 и SOX2, наложенных ядрами (синий). (c) Эндогенная экспрессия NKX2-1-GFP в репортерной клеточной линии в 3D LPC. Изображения, взятые из культуры живых клеток в Brightfield и GFP. Проточная цитометрия внутриклеточного маркера предшественника легкого NKX2-1 после фиксации и пермеабилизации. Размер шкалы = 50 мкМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристика 3D целых органоидов легких после 3-недельной дифференцировки иммуноцитохимией. (а) Проксимальные маркеры легких. На левой панели показаны SOX2 (белый) и SOX9 (красный), наложенные ядрами (синий). Эти маркеры важны в разветвленном морфогенезе и представляют проксимальные и дистальные эпителиальные популяции. На средних панелях показаны P63 (красный) и KRT5 (красный), оба маркера базальных клеток. На правой панели показан SCGB3A2, маркер клубных ячеек. b) дистальные маркеры легких. На левой панели изображены про-SPC (PSPC), (зеленый) и HOPX (красный), маркеры альвеолярных клеток типа II и I, соответственно, наложенные ядрами (синий). На средней панели показаны про-SPC (PSPC) (зеленый) и SPB (красный), маркеры альвеолярных клеток II типа, наложенные ядрами (синий). На правой панели показаны NKX2-1 (красный) и ZO1 (зеленый), наложенные ядрами (синий). с) маркеры мезенхимы легких. На левой панели показаны PDGFRA (красный) и SOX9 (белый), представляющие дистальный мезенхим. На правой панели показан виментин (красный), который рассеивается по всему легкому. Размер шкалы = 50 мкМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| РЕАГЕНТЫ И РЕШЕНИЯ - Для названий компаний, пожалуйста, смотрите Таблицу материалов Список |
| 3D органоидная индукционная среда (день 17-22) |
| Безымянная базальная среда (см. рецепт) дополнена: |
| FGF7 (10 нг/мл) |
| FGF10 (10 нг/мл) |
| CHIR99021 (3 мкМ) |
| EGF (10 нг/мл) |
| 3D органоидная ветвящаяся среда (день 23-28) |
| Безымянная базальная среда (см. рецепт) дополнена: |
| FGF7 (10 нг/мл) |
| FGF10 (10 нг/мл) |
| CHIR99021 (3 мкМ) |
| Полностью транс-ретиноевая кислота (0,1 мкМ) |
| EGF (10 нг/мл) |
| VEGF/PIGF (10 нг/мл) |
| 3D органоидная среда созревания (день 29-34) |
| Безымянная базальная среда (см. рецепт) дополнена: |
| Дексаметазон (50 нМ) |
| Br-цАМФ (100 мкМ) |
| IBMX (100 мкМ) |
| Индукционная среда AFE (день 4-6) |
| Безымянная базальная среда (см. рецепт) дополнена: |
| SB431542 (10 мкМ) |
| Дорсоморфин (2 мкМ) |
| Среда индукции DE (день 1-3) |
| 48.5 мл RPMI1640 + Глутамакс |
| 1 мл B27 без ретиноевой кислоты |
| 500 мкл HEPES (1%) |
| 500 мкл ручка/стрептококк |
| Активин человека А (100 нг/мл) |
| CHIR99021 (5 мкМ) - только в первые 24 часа |
| Индукционная среда LPC (день 7-16) |
| Безымянная базальная среда (см. рецепт) дополнена: |
| БМП4 (10 нг/мл) |
| Полностью транс-ретиноевая кислота (РА) (0,1 мкМ) |
| CHIR99021 (3 мкМ) |
| Закалочная среда |
| 49 мл DMEM/F12 |
| 1 мл FBS |
| Базальная среда без сыворотки (SFBM) |
| 375 мл Модифицированная среда Дульбекко (IMDM) Искова + Глутамакс |
| 125 мл Ham's F12 |
| 5 мл B27 без ретиноевой кислоты |
| 2,5 мл N2 |
| 500 мкл аскорбиновой кислоты, 50 мг/мл |
| 13 мкл монотиоглицерина/1 мл IMDM" используют 300мл 0,4мМ монотиоглицерина на 100 мл свободной среды сыворотки |
| 3,75 мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) фракция V, 7,5% раствор |
| 500 мкл ручка/стрептококк |
| Среда пропускания стволовых клеток (день 0) |
| 500 мл DMEM/F12 |
| 129 мл Нокаутирующая сыворотка замена (KSR) |
| 6,5 мл Глутамакс |
| 6,5 мл NEAA |
| 1,3 мл 2-меркаптоэтанола |
| 6,5 мл ручки/стрептококка |
Таблица 1: Таблица носителей.
| Проблема | Решение |
| Дифференциация DE неэффективна | Через 24 часа после нанесения покрытия в среду стволовых клеток клетки должны быть на 50-70% слиты |
| Ингибитор GSK3β/активатор Wnt CHIR99021 следует удалить в течение 20-24 часов индукции DE 1 дня | |
| Дифференциация DE не должна превышать в общей сложности 72 часа | |
| Дифференциация AFE неэффективна | Убедитесь, что дифференцировка DE была успешной, и клетки экспрессируют > 80% CXCR4 |
| Обеспечьте ежедневное добавление свежих факторов роста / малых молекул в среду | |
| Дифференциация LPC неэффективна | Убедитесь, что дифференцировка AFE была успешной, и клетки экспрессируют > 80% FOXA2 / SOX2 |
| Убедитесь, что ячейки AFE проходят в виде агрегатов из 4-10 клеток, а не в виде одной ячейки. | |
| 3D леговидные органоиды, не растущие и не дифференцирующиеся | Убедитесь, что дифференциация LPC была успешной, и клетки экспрессируют > 30% NKX2-1 |
| Убедитесь, что LPC были пройдены как агрегаты из 4-10 клеток, а не одноклеточные | |
| Убедитесь, что во время пассирования нет остаточного матригеля из LPC | |
| Добавление ингибитора ROCK Y-27632 при каждом изменении среды | |
| Убедитесь, что среда меняется вовремя и добавляются свежие факторы роста / малые молекулы | |
| Обеспечьте правильную концентрацию факторов роста/малых молекул |
Таблица 2: Устранение неполадок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успешная дифференциация 3D-органоидов целых легких (WLO) опирается на многоступенчатый 6-недельный протокол с вниманием к деталям, включая время воздействия факторов роста и малых молекул, клеточную плотность после прохождения и качество hiPSCs. Сведения об устранении неполадок см. в таблице 2. hiPSCs должны быть примерно на 70%-80% сливающимися, с менее чем 5% спонтанной дифференциацией до диссоциации. Этот протокол требует среды "mTeSR plus"; однако простая среда "mTeSR" также использовалась с сопоставимыми результатами и является менее дорогостоящей. Для внеклеточного матрикса мы используем матричную среду базальной мембраны СКФ. Мы проходим hiPSC с помощью ReLesR (см. Таблицу материалов), чтобы уменьшить дифференциацию.
Во время дифференцировки энтодермы клетки должны быть визуализированы ежедневно до и после изменений среды. Указанные факторы роста/малые молекулы следует ежедневно добавлять свежими в базовую среду, чтобы предотвратить преждевременную деградацию. Гибель клеток в окончательной энтодерме (DE) распространена, но должна быть ограничена во время индукции передней передней эндодермы (AFE) и клетки-предшественника легких (LPC). Если на третий день ДЭ (4 день) наблюдается большое отмирание, уменьшите общее время ДЭ на 6-12 ч. Новые клеточные линии iPSC, возможно, потребуется оптимизировать для успешной дифференцировки энтодермы. Выполните проточную цитометрию в DE для CXCR4 для подтверждения успешной индукции (>85% клеток CXCR4 +). Клетки должны быть относительно стабильными в AFE и будут изменяться морфологически с небольшим отмиранием.
Переход в LPC — это еще один процесс, который должен быть оптимизирован для типа ячейки. Повторное покрытие клеток при слишком низкой плотности (<50%) приведет к неэффективной дифференцировке. Подтвердите успешную индукцию LPC иммуноцитохимией для NKX2-1 или проточной цитометрией для CPM18 или CD26low/CD47high15. Успешная индукция LPC должна иметь >40% NKX2-1, иначе органоиды будут иметь большее изобилие дорсальных AFE. Для индукции LPC факторы роста должны добавляться к базовым средам при каждом изменении среды. Если медиа становится желтым позже после индукции LPC, рассмотрите возможность увеличения объема свежих носителей или меняйте медиа каждый день. Во время 3D-индукции органоидов целых легких количество покрытий и поддержание клеточных кластеров являются ключом к успешному росту органоидов. Матричная среда СКФ-базальной мембраны сложна в обращении и очень чувствительна к температуре, поэтому всегда держите ее на льду. Если матричная среда GFR-базальной мембраны гели слишком рано, то клетки LPC не будут интегрироваться в нее. Рекомендуется размораживать 1 мл аликвоты матричной среды СКФ-базальной мембраны на льду за 30 мин до прохождения. После того, как ячейки / кластеры были подсчитаны и сделаны соответствующие аликвоты, поместите гранулу ячейки на лед. Мы предлагаем подготовить пластины, маркировку и добавление мембранных вставок клеточной культуры перед обработкой матричной среды GFR-базальной мембраны.
Используйте наконечники пипетки, чтобы добавить правильный объем жидкой среды СКФ-базальной мембранной матричной среды сразу же в ячейку гранулы, удерживая на льду. Пипетка вверх и вниз быстро, но осторожно (тонкое обращение), чтобы не вводить пузырьки, затем поместите трубку обратно на лед. Добавляют смесь клеточной и ГКФ-базальной мембранной матричной среды к апикальной части трансвелла в подготовленных пластинах. Смесь должна намазаться и покрыть весь трансвелл; осторожно наклоните пластину, чтобы обеспечить покрытие. После желирования в инкубаторе в течение 30-60 мин в среде матрицы СКФ-базальной мембраны должны быть видны кластеры клеток. Добавьте соответствующие индукционные среды легких в базальную камеру, дополненную ингибитором ROCK Y-27632 10 мкМ, и контролируйте рост органоидов через день.
Будущие применения органоидов, генерируемых этим протоколом, включают изучение молекулярных путей, которые контролируют раннюю приверженность линии легких и спецификацию клеточной судьбы21,22,23. Взаимодействие между эпителием и мезенхимой может быть определено с помощью моделей нокаута генов24. Органоиды также могут быть совместно культивированы с эндотелиальными клетками, чтобы определить важность тканеспецифической ко-паттернной передачи сигналов между эпителием легких, мезенхимой и эндотелием25. Развитие легких происходит параллельно с развитием сосудов, и эта связь может вызвать важные молекулярные механизмы, необходимые для правильного развития легких. Мы также показали, что эти целые органоиды легких функционируют с помощью анализов секреции поверхностно-активных веществ после удаления матриксной среды мембраны СКФ с последующим кратковременным культивированием в скважинах со сверхнизким прикреплением26. Другие стратегии включают сортировку клеток по маркерам клеточной поверхности, таким как NGFR (базальные клетки)27 и HTII-280 (клетки ATII)28 и замену их в качестве однородных органоидов или монослоя в условиях межфазной культуры жидкости воздуха. Цельные, проксимальные и дистальные органоиды легких также использовались для изучения клеточных мишеней и патофизиологии вирусной инфекции SARS-CoV-2, чтобы лучше понять и проверить лекарства, которые могут бороться с COVID-19.
Этот протокол является надежным и воспроизводимым, но многие проблемы все еще существуют. Было протестировано много различных линий iPSC и ESC (>20 линий), но протокол должен быть оптимизирован для каждой клеточной линии. Несмотря на надежную индукцию DE и AFE, индукцию LPC может быть трудно достичь >40% ячеек NKX2-1 +. Другие протоколы включают этап сортировки поверхностных маркеров клеток NKX2-15,18, но они дают только альвеолярные тип II, как органоиды без мезенхимы, и все еще содержат популяции желудочных и печеночных клеток, несмотря на очистку популяции предшественников легких29. Мы также отметили небольшое количество желудочных и печеночных клеток как в LPC, так и в целых легких органоидах, возможно, из-за наличия дорсальных передних клеток передней передней кишки, загрязняющих LPC. Таким образом, дифференцировка чистых легочных органоидов еще не достигнута, и необходимо завершить дополнительные исследования по развитию клеток-предшественников легких в тканях человека. Последующие анализы должны быть энергично сопоставлены с экспрессией генов и белков из первичной легочной ткани человека. В то время как на сегодняшний день наиболее плодотворным было использование легочных органоидов в моделировании заболеваний и скрининге лекарств in vitro, трансплантация легочных органоидов hiPSC пациентам для регенеративной медицины рассматривалась в качестве будущей терапии для ряда состояний. Однако, прежде чем рассматривать такие вмешательства, необходимо значительно усовершенствовать контроль качества, включая идентификацию и удаление загрязняющих, нежелательных, потенциально опухолевых производных hiPSC. Кроме того, необходимо разработать более совершенные функциональные анализы in vitro и лучшие животные модели легочных заболеваний.
В частности, функциональность и безопасность клеток, полученных из hiPSC, должны быть подтверждены. Недифференцированные клетки должны быть исключены, поскольку они обладают способностью генерировать тератомы. Одним из методов определения недифференцированных стволовых клеток в окончательной энтодерме является сортировка клеток с использованием маркера плюрипотентности SSEA4. Гены-маркеры для недифференцированных hiPSCs были недавно обнаружены с использованием секвенирования одноклеточной РНК30. ESRG, CNMD и SFRP2 могут использоваться для проверки недифференцированных клеток на любом этапе дифференцировки. Как только чистота подтверждена, преимущество аутологичной терапии, полученной из iPSC, заключается в способности трансплантированных клеток избегать отторжения, поскольку они поступают из собственных клеток пациента. Недостатки включают время, необходимое для полной дифференцировки клеток, прохождения строгого клинического тестирования и трансплантации клеток пациенту с острой травмой (респираторный дистресс-синдром, инфаркт миокарда или травма позвоночника). Альтернативой является использование аллогенных клеток, полученных из iPSC31. Они могут храниться и легко доступны для пациентов с донорами, соответствующими лейкоцитарному антигену человека (HLA), и они пройдут тщательное тестирование на загрязнение. Самым большим недостатком является возможность иммунного отторжения. Иммуносупрессия может быть необходима при аллогенной трансплантации клеток, которая является текущей реальностью аллогенных трансплантаций цельной ткани. Разрабатываются стратегии, позволяющие аллогенным клеткам, полученным из iPSC, уклоняться от иммунного ответа, чтобы безопасно пересадить их пациентам32.
В конце концов, цельные органоиды легких, полученные из iPSC, будут использоваться для изучения моделей заболеваний, специфичных для пациента, адаптации терапевтических средств и улучшения регенеративных медицинских исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Калифорнийским институтом регенеративной медицины (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A.
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X.
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C.
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
