Summary
L'articolo descrive la differenziazione diretta graduale delle cellule staminali pluripotenti indotte in organoidi polmonari interi tridimensionali contenenti cellule polmonari epiteliali sia prossimali che distali insieme a mesenchima.
Abstract
Lo sviluppo e la malattia polmonare umana sono stati difficili da studiare a causa della mancanza di sistemi modello in vitro biologicamente rilevanti. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) possono essere differenziate gradualmente in organoidi polmonari multicellulari 3D, costituiti da popolazioni di cellule epiteliali e mesenchimali. Ricapitoliamo i segnali di sviluppo embrionale introducendo temporalmente una varietà di fattori di crescita e piccole molecole per generare in modo efficiente l'endoderma definitivo, l'endoderma dell'intestino anteriore e successivamente le cellule progenitrici polmonari. Queste cellule vengono quindi incorporate nel mezzo della matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto (GFR), consentendo loro di svilupparsi spontaneamente in organoidi polmonari 3D in risposta a fattori di crescita esterni. Questi organoidi polmonari interi (WLO) subiscono fasi iniziali di sviluppo polmonare tra cui morfogenesi ramificata e maturazione dopo l'esposizione a desametasone, AMP ciclico e isobutilxantina. I WLO possiedono cellule epiteliali delle vie aeree che esprimono i marcatori KRT5 (basale), SCGB3A2 (club) e MUC5AC (calice) e cellule epiteliali alveolari che esprimono HOPX (tipo alveolare I) e SP-C (tipo alveolare II). Sono presenti anche cellule mesenchimali, tra cui l'actina della muscolatura liscia (SMA) e il recettore A del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα). I WLO derivati da iPSC possono essere mantenuti in condizioni di coltura 3D per molti mesi e possono essere ordinati per i marcatori di superficie per purificare una specifica popolazione cellulare. I LLO derivati da iPSC possono anche essere utilizzati per studiare lo sviluppo polmonare umano, compresa la segnalazione tra l'epitelio polmonare e il mesenchima, per modellare mutazioni genetiche sulla funzione e lo sviluppo delle cellule polmonari umane e per determinare la citotossicità degli agenti infettivi.
Introduction
Il polmone è un organo complicato, eterogeneo e dinamico che si sviluppa in sei fasi distinte: maturazione embrionale, pseudoghiandolare, canalicolare, sacculare, alveolare e microvascolare1,2. Le ultime due fasi si verificano prima e dopo la nascita nello sviluppo umano, mentre le prime quattro fasi si verificano esclusivamente durante lo sviluppo fetale, a meno che non si verifichi la nascita pretermine3. La fase embrionale inizia nello strato germinale endodermico e si conclude con il germogliamento della trachea e delle gemme polmonari. Lo sviluppo polmonare avviene in parte attraverso la segnalazione tra le cellule epiteliali e mesenchimali4. Queste interazioni provocano la ramificazione polmonare, la proliferazione, la determinazione del destino cellulare e la differenziazione cellulare del polmone in via di sviluppo. Il polmone è diviso in zone conduttrici (trachea ai bronchioli terminali) e zone respiratorie (bronchioli respiratori agli alveoli). Ogni zona contiene tipi di cellule epiteliali uniche; comprese le cellule basali, secretorie, ciliate, a pennello, neuroendocrine e ionocitarie nelle vie aeree conduttrici5, seguite da cellule alveolari di tipo I e II nell'epitelio respiratorio6. Molto è ancora sconosciuto sullo sviluppo e la risposta alle lesioni dei vari tipi di cellule. I modelli di organoidi polmonari derivati da iPSC consentono lo studio dei meccanismi che guidano lo sviluppo del polmone umano, gli effetti delle mutazioni genetiche sulla funzione polmonare e la risposta sia dell'epitelio che del mesenchima agli agenti infettivi senza la necessità di tessuto polmonare umano primario.
I marcatori corrispondenti ai vari stadi della differenziazione embrionale includono CXCR4, cKit, FOXA2 e SOX17 per l'endoderma definitivo (DE)7, FOXA2, TBX1 e SOX2 per l'endoderma anteriore dell'intestino anteriore (AFE)8 e NKX2-1 per le prime cellule progenitrici polmonari9. Nello sviluppo polmonare embrionale, l'intestino anteriore si divide nell'esofago dorsale e nella trachea ventrale. Le gemme dei polmoni destro e sinistro appaiono come due outpouching indipendenti attorno al germoglio tracheale10. Durante la morfogenesi ramificata, il mesenchima che circonda l'epitelio produce tessuto elastico, muscolatura liscia, cartilagine e vascolarizzazione11. L'interazione tra l'epitelio e il mesenchima è essenziale per il normale sviluppo polmonare. Ciò include la secrezione di FGF1012 da parte del mesenchima e SHH13 prodotto dall'epitelio.
Qui, descriviamo un protocollo per la differenziazione diretta delle hiPSC in organoidi polmonari interi tridimensionali (3D) (WLO). Mentre ci sono approcci simili che incorporano l'isolamento delle cellule progenitrici polmonari tramite smistamento allo stadio LPC per produrre organoidi alveolari14,15 (distali) o organoidi delle vie aeree16 (prossimali), o generare sferoidi ventrali-anteriori del foregut per produrre organoidi polmonari umani che esprimono marcatori alveolari e mesenchimali e organoidi progenitori della punta delle gemme17 , il punto di forza di questo metodo è l'inclusione di entrambi i tipi di cellule epiteliali e mesenchimali polmonari per modellare e orchestrare la morfogenesi, la maturazione e l'espansione della ramificazione polmonare in vitro.
Questo protocollo utilizza piccole molecole e fattori di crescita per dirigere la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti attraverso l'endoderma definitivo, l'endoderma dell'intestino anteriore e le cellule progenitrici polmonari. Queste cellule vengono quindi indotte in organoidi polmonari interi 3D attraverso importanti fasi di sviluppo, tra cui la ramificazione e la maturazione. Il riassunto del protocollo di differenziazione è mostrato nella Figura 1a con immagini rappresentative in campo luminoso della differenziazione endodermica e organoide mostrata nella Figura 1b. La Figura 1c,d mostra i dettagli dell'espressione genica della differenziazione endodermica e l'espressione genica di entrambe le popolazioni prossimali e distali delle cellule epiteliali polmonari dopo aver completato la differenziazione.
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Protocol
Questo protocollo di studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del programma di protezione della ricerca umana dell'UCSD (181180).
1. Induzione definitiva dell'endoderma da cellule staminali pluripotenti indotte (Giorno 1 - 3)
- Scongelare lentamente il fattore di crescita ridotto (GFR) -membrana basale (BM) mezzo di matrice su ghiaccio 30 minuti prima dell'uso. In miscela DMEM/F12 a freddo, diluire il mezzo della matrice GFR BM 1:1 in modo tale che costituisca il 50% di questo mezzo. Posizionare le punte della pipetta P1000 nel congelatore per raffreddare prima dell'uso.
- Rivestire ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con 500 μL di mezzo matrice a membrana basale GFR al 50% preparato in DMEM/F12 ghiacciato. Una volta rivestito il numero desiderato di pozzetti, rimuovere qualsiasi miscela media in eccesso e/o bolle dai pozzetti e posizionare la piastra su ghiaccio o frigorifero a 4 °C per 20 minuti per fissare. Quindi, spostare la piastra nell'incubatore a 37 °C durante la notte per gelificare e asciugare.
- Una volta che le hiPSC raggiungono il 70-90% di confluenza, aggiungere 10 μM di inibitore della chinasi associata a Rho (ROCK) Y-27632 un'ora prima della dissociazione. Aspirare il fluido e lavare una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Dissociare gli hiPSC aggiungendo un mezzo di distacco cellulare (0,5 ml / pozzetto di una piastra a 12 pozzetti) e incubare per 20 minuti a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5%.
- Rimuovere le piastre dall'incubatore e aggiungere 0,5 ml/12 pozzetti di mezzo di passaggio delle cellule staminali (Tabella 1) ai pozzetti; triturare delicatamente le cellule utilizzando una punta P1000 per ottenere una sospensione a singola cellula. Trasferire cellule dissociate in un tubo centrifugo conico da 15 ml; centrifuga per 5 min a 300 x g.
- Aspirare il mezzo e risospesciare il pellet cellulare con 1 mL di mTeSR Plus media integrato con 10 μM di inibitore ROCK (Y-27632). Eseguire un conteggio delle celle. Aggiungere 2,0 x 105 hiPSC in 1 mL di mTeSR integrato con l'inibitore ROCK Y-27632 per pozzetto di una piastra a membrana basale GFR a 12 pozzetti. Incubare a 37 °C durante la notte.
NOTA: il numero di seeding delle celle deve essere ottimizzato per ogni riga di cella. 24 ore dopo la placcatura, i pozzetti dovrebbero essere confluenti al 50% -70%. - Il giorno 1, aspirare il mTeSR Plus e aggiungere il mezzo di induzione Definitive Endoderm (DE) (Tabella 1) integrato con 100 ng/mL di activina A umana e 5 μM di inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR99021.
NOTA: I media DE con inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR99021 devono essere rimossi entro 20-24 ore dall'induzione de del giorno 1 per una differenziazione di successo. - Il giorno 2 e il giorno 3, il passaggio al supporto di induzione DE integrato con 100 ng / mL di activina A solo.
NOTA: la differenziazione de non deve superare un totale di 72 ore, o l'efficacia diminuirà. Il giorno 4, se si osserva una moria di grandi cellule, ridurre il tempo totale di esposizione ai media DE di 6-12 ore. - Per analizzare l'efficienza de, confermare un'espressione superiore al 90% di CXCR4 e/o cKit tramite citometria a flusso o analisi di immunofluorescenza di FOXA2 e/o SOX17 (Figura 2a).
2. Induzione dell'endoderma anteriore dell'intestino anteriore (AFE) (Giorno 4 - 6)
- Il giorno 4, cambiare il mezzo in mezzo basale privo di siero (SFBM) (Tabella 1) integrato con 10 μM SB431542 e 2 μM dorsomorfina per l'induzione afE. Cambia i supporti AFE ogni giorno per 3 giorni (giorno 4, giorno 5 e giorno 6).
- Per analizzare l'efficienza AFE, confermare la robusta espressione di SOX2, TBX1 e FOXA2 tramite colorazione a immunofluorescenza (Figura 2b).
3. Differenziazione delle cellule progenitrici polmonari (LPC) (Giorno 7 - 16)
- Il giorno 7, scongelare il mezzo della matrice della membrana GFR-basale sul ghiaccio. Aspirare il supporto AFE e lavare bene con 1x PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare e incubare per 10 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 1 mL di mezzo di tempra (2% FBS in DMEM/F12) ai pozzetti contenenti la soluzione di distacco cellulare. Mantenere le cellule come aggregati pipettando su e giù delicatamente. Assicurarsi che tutte le cellule siano spostate e trasferite in un tubo centrifugo conico da 15 ml. Centrifuga per 5 min a 300 x g.
- Rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare in mezzo di tempra integrato con 10 ng/mL di proteina morfogenica ossea ricombinante umana-4 (BMP4), 0,1 μM di acido retinoico all-trans (RA), 3 μM di inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR99021 e 10 μM di rock inibitore Y-27632.
- Eseguire un conteggio delle celle. Aggiungere 2,5 x 105 celle a 100 μL di mezzo a matrice di membrana fredda GFR-basement, mescolare bene e posizionare la goccia in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Incubare la piastra a 37 °C per 30-60 min per permettere al mezzo di polimerizzare. Aggiungere 1 mL di supporto LPC integrato con 10 μM di inibitore ROCK Y-27632 per pozzetto assicurando che la goccia media sia completamente sommersa e incubata a 37 °C durante la notte.
- Il giorno 8, 24 ore dopo l'induzione di LPC, cambiare il mezzo LPC per rimuovere l'inibitore ROCK Y-27632. Cambia il mezzo LPC a giorni alterni per un totale di 9-11 giorni.
NOTA: Se il mezzo diventa giallo entro 24 ore, cambiare mezzo ogni giorno. - Per analizzare l'efficienza LPC, confermare una robusta espressione del fattore di trascrizione intracellulare NKX2-1 o eseguire la citometria a flusso per i marcatori di superficie CD47hi/CD26low15 o CPM18 (Figura 2c). Grossolanamente, gli sferoidi LPC dovrebbero essere rotondi e trasparenti (Figura 2c).
NOTA: Non procedere con la differenziazione degli organoidi polmonari se l'efficienza di NKX2-1 è inferiore al 30%.
4.3D induzione di organoidi polmonari (Giorno 16 - 22)
- Il giorno 17, scongelare il mezzo della matrice della membrana GFR-basale sul ghiaccio. Aspirare il mezzo di induzione LPC. Aggiungere quindi 2 μg/mL di dispasi (1 mL) al pozzo e risospescere la miscela media/dispase con una pipetta P1000. Incubare a 37 °C per 15 min. Triturare nuovamente la miscela e incubare a 37 °C per altri 15 minuti.
- Trasferire la dispacciatura e le celle in un tubo centrifugo conico da 15 ml. Utilizzare PBS refrigerato (2-3 ml) per lavare il pozzetto e risospesso la miscela dispase/cell. Centrifuga per 5 min a 400 x g. Rimuovere manualmente il surnatante, facendo attenzione a non distubare lo strato di pellet medio/cellulare. Ripetere il lavaggio PBS refrigerato e centrifugare il tubo della centrifuga conica per altri 5 minuti a 400 x g.
- Rimuovere manualmente il surnatante e quindi aggiungere 2 ml di soluzione di dissociazione a base di tripsina al tubo conico della centrifuga. Incubare a 37 °C per 12 min.
- Dopo l'incubazione, risospese le cellule con una punta della pipetta P1000. Quindi aggiungere un volume uguale di mezzi di tempra al tubo conico della centrifuga e girare verso il basso a 400 x g per 5 minuti. Aspirare le cellule surnatante e risospese in mezzo di tempra + 10 μM di inibitore ROCK Y-27632.
NOTA: l'induzione di organoidi polmonari di successo si verifica quando le cellule sono incorporate come aggregati, non singole cellule, regolare il pipettaggio di conseguenza. - Eseguire un conteggio delle celle. Calcola il volume necessario per ottenere 5,0-8,0 x 104 celle per pozzetto. Aliquotare gli aggregati di cellule LPC in tubi microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 5 minuti a 400 x g. Rimuovere il surnatante in eccesso, facendo attenzione a non agitare il pellet cellulare. Lasciare solo 10 μL di mezzo residuo.
- Sospendere nuovamente il pellet cellulare in 200 μL di mezzo a matrice di membrana fredda GFR-basamento e aggiungere agli inserti della membrana di coltura cellulare (diametro 6,5 mm, poro 0,4 μm, membrana in poliestere). Incubare la piastra a 37 °C per 30-60 minuti per consentire la polimerizzazione del mezzo a matrice di membrana GFR-basement.
- Aggiungere 1 mL di mezzo di induzione organoide 3D (Tabella 1) integrato con fattore di crescita dei fibroblasti-7 (FGF7) (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR (3 μM), fattore di crescita epidermico (EGF) (10 ng/mL) e 10 μM di inibitore ROCK Y-27632 alla camera basolaterale dell'inserto di membrana. Cambia il mezzo a giorni alterni per 6 giorni.
5.3D Ramificazione organoide polmonare (Giorno 23 - 28)
- Il giorno 23 passa al mezzo ramificato 3D (Tabella 1) integrato con FGF7 (10 ng / mL), FGF10 (10 ng / mL), inibitore GSK3β / attivatore Wnt CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng / mL) e fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) / fattore di crescita placentare (PlGF) (10 ng / mL). Cambia il mezzo a giorni alterni per 6 giorni.
NOTA: Al giorno 6 della differenziazione ramificata 3D, dovrebbero esserci più organoidi ramificati (Figura 2).
6.3D maturazione organoide polmonare (Giorno 29 - 34)
- Il giorno 29, passare al mezzo di maturazione 3D (Tabella 1), che è lo stesso del mezzo di ramificazione 3D ma con l'aggiunta di desametasone (50 nM), cAMP (100 μM) e 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), un inibitore della fosfodiesterasi chiamato anche isobutilxantina (100 μM). Cambia il mezzo a giorni alterni per 6 giorni.
NOTA: Entro 24 ore dalla maturazione 3D, gli organoidi ramificati dovrebbero espandersi e trasformarsi in sfere trasparenti.
7.3D Immunocitochimica organoide polmonare
- Per l'analisi organoide polmonare intera 3D, fissare il mezzo della matrice della membrana basale GFR negli inserti di membrana con paraformaldeide (PFA) al 4% per 1 ora a 4 °C. Incorporare la cera di paraffina e montarla su diapositive secondo i protocolli standard pubblicati.
- Eseguire il recupero dell'antigene prima della colorazione. I marcatori delle vie aeree includono KRT5, MUC5AC e SCGB3A2. I marcatori alveolari includono SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 e HOPX (Figura 3).
8. Rimozione di organoidi polmonari interi dal mezzo della matrice della membrana GFR-basale per il passaggio, FACS o crioconservazione
- Per dissociare gli organoidi dal mezzo della matrice della membrana basale GFR, rimuovere i mezzi dalla camera basale e aggiungere 2 μg/mL di dispasi (1 mL) nella camera apicale.
- Triturare delicatamente la miscela media/dispasa con una pipetta P1000 e metterla nell'incubatrice per 15 min. Triturare delicatamente la miscela di nuovo e incubare per altri 15 minuti.
- Aggiungere 1 mL di PBS refrigerato (4 °C) e trasferire gli organoidi con il mezzo della matrice in un tubo centrifugo conico da 15 mL. Girare a 400 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante con attenzione, per non disturbare il pellet cellulare.
- Lavare ancora una volta con 1 mL di PBS refrigerato e girare a 400 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante con attenzione, per non disturbare la miscela medio/cellulare.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare al tubo conico della centrifuga, triturare delicatamente la miscela media/cellulare della matrice di membrana GFR-Basement. Mettere nell'incubatrice per 12 minuti per il passaggio di cellule come aggregati o per la crioconservazione) o 20 minuti per la sospensione a singola cellula.
- Aggiungere lo stesso volume di mezzi di tempra e girare verso il basso a 400 x g per 5 minuti. Risospeso in mezzo di tempra + 10 μM di ROCK Inibitore Y-27632.
NOTA: In questa fase, nel tubo non si deve vedere alcun mezzo residuo della membrana basale. Se il mezzo residuo rimane, ripetere i passaggi 8.5 e 8.6. - Eseguire un conteggio delle celle. Calcolare il volume necessario per le applicazioni a valle.
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Representative Results
24 ore dopo la placcatura, giorno 1, le iPSC dovrebbero essere confluenti al 50% -90%. Il giorno 2, DE dovrebbe essere confluente al 90% -95%. Durante l'induzione de, è comune osservare una significativa morte cellulare il giorno 4, ma le cellule attaccate manterranno una morfologia compatta di ciottoli (Figura 2b). Interrompere la differenziazione se la maggior parte delle cellule aderenti si stacca e considera di abbreviare l'esposizione ai mezzi DE con activina A di 6-12 ore. Durante l'induzione dell'AFE, la morte cellulare è minima e le cellule rimangono aderenti, ma appariranno più piccole ed eterogenee. Il passaggio delle cellule il giorno 7 deve essere fatto solo se la resa di SOX2 e FOXA2 doppi positivi è >80%. Dopo il passaggio nella matrice della membrana basale per l'induzione 3D LPC, piccoli sferoidi appariranno per la prima volta, poi cresceranno e alcuni potrebbero iniziare a ramificarsi. I profili di espressione genica per una differenziazione endodermica di successo includono l'aumento di SOX17 a DE, l'aumento di FOXA2 e SOX2 con la diminuzione di SOX17 e la prima comparsa di NKX2-1 e l'aumento di NKX2-1, insieme alla presenza di SOX2 e FOXA2. Coerentemente con lo sviluppo embrionale precoce, la ventralizzazione dell'AFE si verifica per lo sviluppo delle gemme polmonari (NKX2-1+) e la dorsalizzazione dell'AFE avviene per lo sviluppo gastrointestinale (SOX2+). Le colture di LPC avranno un mix di progenitori sia polmonari che gastrici.
L'induzione di organoidi polmonari da LPC è stata eseguita utilizzando vari metodi. Alcuni gruppi ordinano le cellule utilizzando reporter fluorescenti NKX2-1 o un proxy dell'antigene di superficie (CPM, CD26lowCD47high). Ma quegli organoidi polmonari contengono cellule alveolari di tipo II senza cellule alveolari di tipo I o mesenchima. Altri gruppi hanno raccolto grumi cellulari che germogliano dal monostrato AFE / LPC e li hanno incorporati nella matrice della membrana basale. Questi organoidi contengono una popolazione mista di cellule epiteliali e mesenchimali polmonari, ma richiedono mesi per la coltura19. Il nostro protocollo prevede sia la presenza di cellule epiteliali che mesenchimali. I WLO esprimono marcatori di cellule epiteliali prossimali p63 e KRT5 (cellule basali) e SCGB3A2 (cellule club) e marcatori di cellule epiteliali distali HOPX (ATI) e proSPC, SPB e NKX2-1 (ATII). Esprimono anche il marcatore mesenchimale Vimentina allo stadio LPC, così come nell'intero organoide polmonare. PDGFRα è un marker per i fibroblasti che hanno un'importante funzione nel polmone durante la sacculazione e l'alveolarizzazione20 ed è co-espresso con il fattore di trascrizione importante nel differenziamento cellulare distale, SOX9 (Figura 3).
Il nostro metodo genera in modo efficiente colture LPC 3D che esprimono NKX2-1 utilizzando molecole di segnalazione che si verificano nello sviluppo polmonare fetale per formare organoidi polmonari precoci. Quando si passano le LPC nel mezzo della matrice della membrana basale GFR per l'induzione dell'organoide polmonare, è imperativo non dissociarsi eccessivamente in una sospensione a singola cellula, ma invece di trattenere piccoli grumi di cellule (10 cellule / grumo). Il conteggio delle cellule non sarà completamente accurato, ma comunque necessario per evitare la confluenza eccessiva durante la differenziazione organoide polmonare di 3 settimane.
L'induzione degli organoidi polmonari dovrebbe produrre piccoli organoidi ramificati entro il giorno 6 dell'induzione (giorno 23 della differenziazione). Questi dovrebbero continuare a crescere durante la fase di ramificazione organoide e la fase di maturazione. Ventiquattro ore dopo l'introduzione del desametasone, del cAMP e dell'IBMX, i rami dovrebbero espandersi in sfere trasparenti. L'analisi organoide polmonare intera può essere eseguita alla fine della differenziazione, oppure i WLO possono essere passati nella matrice della membrana basale fresca con GFR o crioconservati congelando nel 10% di DMSO.
Figura 1: Schema complessivo della differenziazione degli organoidi polmonari interi (WLO) dalle hiPSC e dati rappresentativi. (a) Schema della differenziazione WLO dalle hiPSC. I cerchi rappresentano il tipo di cellula endodermica con marcatori identificativi. La linea temporale della differenziazione è indicata in barre nere. Fattori di crescita e/o piccole molecole per l'induzione di popolazioni organoidi endodermiche e polmonari. In sintesi, le cellule staminali vengono differenziate in endoderma definitivo, endoderma anteriore dell'intestino anteriore e in cellule progenitrici polmonari in circa 16 giorni. Queste cellule vengono quindi passate nel mezzo della matrice di membrana basale GFR contenente inserti medi e subiscono induzione organoide polmonare, ramificazione e maturazione. La differenziazione totale richiede circa 35 giorni. (b) Immagini rappresentative di contrasto di fase delle cellule nei principali stadi endodermici e immagini 3D di organoidi polmonari interi. Scalare le dimensioni della barra come indicato nel pannello. c) analisi qRT-PCR dei marcatori di sviluppo polmonare durante l'endoderma e (d) differenziazione organoide polmonare intera dei marcatori cellulari prossimali e distali. Tutti i dati rappresentano una media di 3-5 repliche biologiche. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media e sono normalizzate in actina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Caratterizzazione del differenziamento dell'endoderma mediante citometria a flusso e immunocitochimica. (a) Citometria a flusso del marcatore endoderma definitivo CXCR4. Il pannello di sinistra mostra il gating contro la popolazione non macchiata mentre il pannello centrale mostra la popolazione positiva CXCR4. Il pannello di destra mostra l'immagine immunocitochimica di SOX17 (rosso) sovrapposto a nuclei (blu). (b) Immagine immunocitochimica dei marcatori AFE FOXA2 e SOX2 sovrapposti a nuclei (blu). (c) Espressione endogena di NKX2-1-GFP in una linea cellulare reporter in LPC 3D. Immagini tratte da colture cellulari vive in campo luminoso e GFP. Citometria a flusso del marcatore intracellulare progenitore polmonare NKX2-1 dopo fissazione e permeabilizzazione. Dimensione barra scala = 50 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Caratterizzazione di organoidi polmonari interi 3D dopo differenziazione di 3 settimane mediante immunocitochimica. (a) Marcatori polmonari prossimali. Il pannello di sinistra mostra SOX2 (bianco) e SOX9 (rosso) sovrapposti da nuclei (blu). Questi marcatori sono importanti nella morfogenesi ramificata e rappresentano le popolazioni epiteliali prossimali e distali. I pannelli centrali mostrano P63 (rosso) e KRT5 (rosso), entrambi marcatori di cellule basali. Il pannello di destra mostra SCGB3A2, un marcatore di celle di club. b) Marcatori polmonari distali. Il pannello di sinistra raffigura pro-SPC (PSPC), (verde) e HOPX (rosso), marcatori di cellule alveolari di tipo II ad I, rispettivamente, sovrapposte a nuclei (blu). Il pannello centrale mostra pro-SPC (PSPC) (verde) e SPB (rosso), marcatori di cellule alveolari di tipo II, sovrapposte a nuclei (blu). Il pannello di destra mostra NKX2-1 (rosso) e ZO1 (verde) sovrapposti a nuclei (blu). c) Marcatori di mesenchima polmonare. Il pannello di sinistra mostra PDGFRA (rosso) e SOX9 (bianco), che rappresentano il mesenchima distale. Il pannello di destra mostra Vimentin (rosso), che è disperso in tutto il polmone. Dimensione barra scala = 50 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| REAGENTI E SOLUZIONI - Per le denominazioni delle aziende si rimanda alla Tabella dei Materiali |
| Mezzo di induzione organoide 3D (giorno 17-22) |
| Mezzo basale senza siero (vedi ricetta) integrato con: |
| FGF7 (10 ng/ml) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| FEG (10 ng/ml) |
| Mezzo di ramificazione organoide 3D (giorno 23-28) |
| Mezzo basale senza siero (vedi ricetta) integrato con: |
| FGF7 (10 ng/ml) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Acido retinoico all-trans (0,1 μM) |
| FEG (10 ng/ml) |
| VEGF/PIGF (10 ng/mL) |
| Mezzo di maturazione organoide 3D (giorno 29-34) |
| Mezzo basale senza siero (vedi ricetta) integrato con: |
| Desametasone (50 nM) |
| Br-cAMP (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| Mezzo di induzione AFE (giorno 4-6) |
| Mezzo basale senza siero (vedi ricetta) integrato con: |
| SB431542 (10 μM) |
| Dorsomorfina (2 μM) |
| Mezzo di induzione DE (giorno 1-3) |
| 48,5 ml RPMI1640 + Glutamax |
| 1 mL B27 senza acido retinoico |
| 500 μl HEPES (1%) |
| Penna/streptococco da 500 μl |
| Activina umana A (100 ng/mL) |
| CHIR99021 (5 μM) - solo nelle prime 24 ore |
| Mezzo di induzione LPC (giorno 7-16) |
| Mezzo basale senza siero (vedi ricetta) integrato con: |
| BMP4 (10 ng/mL) |
| Acido retinoico trans (RA) (0,1 μM) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Mezzo di tempra |
| 49 ml DMEM/F12 |
| 1 ml FBS |
| Mezzo basale privo di siero (SFBM) |
| 375 mL Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) + Glutamax |
| 125 ml di F12 di prosciutto |
| 5 ml di B27 senza acido retinoico |
| 2,5 ml N2 |
| 500 μl di acido ascorbico, 50 mg/mL |
| 13 μl di monotioglicerolo/1ml di IMDM" 300ul di 0,4mM di monotioglicerolo per 100ml di siero free media |
| 3,75 mL di albumina sierica bovina (BSA) Frazione V, soluzione al 7,5% |
| Penna/streptococco da 500 μl |
| Mezzo di passaggio delle cellule staminali (giorno 0) |
| 500 ml DMEM/F12 |
| 129 mL Sostituzione del siero knockout (KSR) |
| 6,5 ml di Glutamax |
| 6,5 ml di NEAA |
| 1,3 ml di 2-mercaptoetanolo |
| 6,5 ml di penna/streptococco |
Tabella 1: Tabella dei media.
| Problema | Soluzione |
| Differenziazione DE non efficiente | 24 ore dopo la placcatura in mezzo di cellule staminali, le cellule dovrebbero essere confluenti al 50-70% |
| L'inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR99021 deve essere rimosso entro 20-24 ore dal giorno 1 induzione DE | |
| La differenziazione DE non deve superare un totale di 72 ore | |
| Differenziazione AFE non efficiente | Assicurarsi che la differenziazione DE abbia avuto successo e che le cellule esprimano >'80% CXCR4 |
| Assicurarsi che nuovi fattori di crescita / piccole molecole vengano aggiunti quotidianamente ai media | |
| Differenziazione LPC non efficiente | Assicurarsi che la differenziazione AFE abbia avuto successo e che le cellule esprimano > 80% FOXA2 / SOX2 |
| Assicurarsi che le celle AFE siano passate come aggregati di 4-10 celle e non a cella singola | |
| Organoidi polmonari 3D non crescono o si differenziano | Assicurarsi che la differenziazione LPC abbia avuto successo e che le cellule esprimano > 30% NKX2-1 |
| Assicurarsi che gli LPC siano stati passati come aggregati di 4-10 celle e non a cella singola | |
| Assicurarsi che non vi sia alcun matrigel residuo dalle LPC durante il passaggio | |
| Aggiungi l'inibitore ROCK Y-27632 ad ogni cambio di supporto | |
| Assicurarsi che il fluido venga modificato in tempo e che vengano aggiunti nuovi fattori di crescita / piccole molecole | |
| Assicurarsi che la concentrazione di fattori di crescita/piccole molecole sia corretta |
Tabella 2: Risoluzione dei problemi.
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Discussion
Il successo della differenziazione degli organoidi polmonari interi 3D (WLO) si basa su un protocollo multi-step di 6 settimane con attenzione ai dettagli, incluso il tempo di esposizione a fattori di crescita e piccole molecole, la densità cellulare dopo il passaggio e la qualità delle hiPSC. Per la risoluzione dei problemi, vedere la Tabella 2. Le hiPSC dovrebbero essere confluenti per circa il 70%-80%, con meno del 5% di differenziazione spontanea prima della dissociazione. Questo protocollo richiede il supporto "mTeSR plus"; tuttavia, il semplice mezzo "mTeSR" è stato utilizzato anche con risultati comparabili ed è meno costoso. Per la matrice extracellulare, utilizziamo il mezzo della matrice della membrana basale GFR. Passiamo gli hiPSC usando ReLesR (vedi Tabella dei materiali) per ridurre la differenziazione.
Durante la differenziazione dell'endoderma, le cellule devono essere visualizzate quotidianamente prima e dopo i cambiamenti dei media. I fattori di crescita specificati/piccole molecole devono essere aggiunti freschi ogni giorno al mezzo di base per prevenire la degradazione prematura. La morte cellulare nell'endoderma definitivo (DE) è comune, ma deve essere limitata durante l'induzione dell'endoderma anteriore dell'intestino anteriore (AFE) e della cellula progenitrice polmonare (LPC). Se c'è una grande morte il terzo giorno di DE (giorno 4), ridurre il tempo totale di DE di 6-12 ore. Potrebbe essere necessario ottimizzare nuove linee cellulari iPSC per una differenziazione efficace dell'endoderma. Eseguire la citometria a flusso presso DE per CXCR4 per confermare il successo dell'induzione (>85% cellule CXCR4 +). Le cellule dovrebbero essere relativamente stabili all'AFE e cambieranno morfologicamente con poca moria.
Il passaggio in LPC è un altro processo che deve essere ottimizzato per il tipo di cella. La ripiassatura delle celle a densità troppo bassa (<50%) comporterà una differenziazione inefficiente. Confermare con successo l'induzione LPC con immunocitochimica per NKX2-1 o citometria a flusso per CPM18 o CD26low/CD47high15. L'induzione LPC di successo deve avere >40% NKX2-1, altrimenti gli organoidi avranno una maggiore abbondanza di AFE dorsale. Per l'induzione LPC, i fattori di crescita devono essere aggiunti ai supporti di base ad ogni modifica del supporto. Se il supporto diventa giallo più tardi nell'induzione LPC, considera di aumentare il volume di nuovi supporti o cambia il supporto ogni giorno. Durante l'induzione dell'organoide polmonare intero 3D, il numero di placcatura e il mantenimento dei cluster cellulari sono la chiave per una crescita organoide di successo. Il mezzo a matrice di membrana basale GFR è difficile da maneggiare e altamente sensibile alla temperatura, quindi tienilo sempre sul ghiaccio. Se la matrice della membrana GFR-basale gela troppo presto, le cellule LPC non si integreranno al suo interno. Si consiglia di scongelare 1 mL aliquote di GFR-membrana basale media su ghiaccio 30 minuti prima del passaggio. Una volta che le cellule/grappoli sono stati contati e le aliquote appropriate sono state fatte, posizionare il pellet cellulare sul ghiaccio. Suggeriamo la preparazione di piastre, l'etichettatura e l'aggiunta di inserti di membrana di coltura cellulare prima della manipolazione del mezzo della matrice della membrana basale GFR.
Utilizzare le punte delle pipette per aggiungere immediatamente il volume corretto del mezzo della matrice di membrana GFR-basement liquido al pellet cellulare, mantenendosi sul ghiaccio. Pipettare su e giù rapidamente ma delicatamente (manipolazione sfumata) per non introdurre bolle, quindi riposizionare il tubo sul ghiaccio. Aggiungere la miscela di mezzo della matrice della membrana cellulare e della membrana GFR-basale alla porzione apicale del fulfato in piastre preparate. La miscela dovrebbe diffondersi e rivestire l'intero transwell; inclinare delicatamente la piastra per garantire il rivestimento. Dopo la gelificazione nell'incubatore per 30-60 minuti, dovrebbero esserci cluster cellulari visibili nel mezzo della matrice della membrana GFR-basale. Aggiungere un mezzo di induzione polmonare appropriato alla camera basale integrato con 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 e monitorare la crescita degli organoidi a giorni alterni.
Le applicazioni future degli organoidi generati da questo protocollo includono lo studio dei percorsi molecolari che controllano l'impegno del lignaggio polmonare precoce e la specifica del destino cellulare21,22,23. L'interazione tra l'epitelio e il mesenchima può essere determinata utilizzando modelli di knock out genico24. Gli organoidi potrebbero anche essere co-coltivati con cellule endoteliali per determinare l'importanza della segnalazione del co-pattern specifico del tessuto tra l'epitelio polmonare, il mesenchima e l'endotelio25. Lo sviluppo polmonare avviene in parallelo con lo sviluppo vascolare e tale relazione può suscitare importanti meccanismi molecolari necessari per un corretto sviluppo polmonare. Abbiamo anche dimostrato che questi organoidi polmonari interi sono funzionali attraverso saggi di secrezione di tensioattivi dopo che il mezzo della matrice della membrana basale GFR è stato rimosso seguito da una coltura a breve termine in pozzetti di attacco ultra-bassi26. Altre strategie includono l'ordinamento delle cellule per marcatori di superficie cellulare come NGFR (cellule basali)27 e HTII-280 (cellule ATII)28 e la loro sostituzione come organoidi omogenei o monostrato in condizioni di coltura interfase liquida d'aria. Gli organoidi polmonari interi, prossimali e distali sono stati utilizzati anche per studiare i bersagli cellulari e la fisiopatologia dell'infezione virale da SARS-CoV-2 al fine di comprendere e selezionare meglio i farmaci che potrebbero combattere COVID-19.
Questo protocollo è robusto e riproducibile, ma esistono ancora molte sfide. Sono state testate molte diverse linee iPSC ed ESC (>20 linee) ma il protocollo deve essere ottimizzato per ogni linea cellulare. Nonostante la robusta induzione DE e AFE, l'induzione LPC può essere difficile da raggiungere >40% delle celle NKX2-1 +. Altri protocolli includono una fase di ordinamento per i marcatori di superficie delle cellule NKX2-115,18, ma quelli producono solo organoidi alveolari di tipo II senza mesenchima e contengono ancora popolazioni di cellule gastriche ed epatiche nonostante purifichino la popolazione progenitrice polmonare29. Abbiamo anche notato una piccola quantità di cellule gastriche ed epatiche sia nell'LPC che negli organoidi polmonari interi, probabilmente a causa della presenza di cellule dorsali del foregut anteriore che contaminano le LPC. Pertanto, la differenziazione degli organoidi polmonari puri deve ancora essere raggiunta e devono essere completate ulteriori ricerche sullo sviluppo delle cellule progenitrici polmonari nel tessuto umano. I saggi a valle devono essere sottoposti a un rigoroso benchmark con l'espressione genica e proteica dal tessuto polmonare umano primario. Mentre, fino ad oggi, l'uso più fruttuoso degli organoidi polmonari è stato nella modellazione delle malattie e nello screening per i farmaci in vitro, il trapianto di organoidi polmonari derivati da hiPSC in pazienti per la medicina rigenerativa è stato contemplato come una terapia futura per una serie di condizioni. Tuttavia, prima di prendere in considerazione tali interventi, è necessario perfezionare una buona dose di controllo di qualità, compresa l'identificazione e la rimozione di derivati hiPSC contaminanti, indesiderati e potenzialmente tumorigenici. Inoltre, è ancora necessario sviluppare migliori saggi funzionali in vitro e migliori modelli animali di malattie polmonari.
In particolare, devono essere confermate la funzionalità e la sicurezza delle cellule derivate da hiPSC. Le cellule indifferenziate devono essere escluse poiché hanno la capacità di generare teratomi. Un metodo per determinare le cellule staminali indifferenziate nell'endoderma definitivo è quello di ordinare le cellule usando il marcatore di pluripotenza SSEA4. I geni marcatori per hiPSC indifferenziati sono stati recentemente rilevati utilizzando il sequenziamento dell'RNA a singola cellula30. ESRG, CNMD e SFRP2 possono essere utilizzati per convalidare le cellule indifferenziate in qualsiasi fase di differenziazione. Una volta confermata la purezza, il beneficio delle terapie autologhe derivate da iPSC è la capacità delle cellule trapiantate di evitare il rigetto poiché provengono dalle cellule del paziente. Gli svantaggi includono il tempo necessario per differenziare completamente le cellule, sottoporsi a rigorosi test di grado clinico e trapiantare le cellule in un paziente con una lesione acuta (sindrome da distress respiratorio, infarto miocardico o lesione spinale). L'alternativa è quella di utilizzare cellule allogeniche derivate da iPSC bancate31. Questi possono essere conservati e prontamente disponibili per i pazienti con donatori abbinati all'antigene leucocitario umano (HLA) e saranno stati sottoposti a test approfonditi per la contaminazione. Il più grande svantaggio è la possibilità di rigetto immunitario. L'immunosoppressione può essere necessaria nel trapianto di cellule allogeniche, che è la realtà attuale dei trapianti di tessuto intero allogenico. Sono in fase di elaborazione strategie per consentire alle cellule allogeniche derivate da iPSC di eludere la risposta immunitaria per trapiantarle in modo sicuro nei pazienti32.
Alla fine, gli organoidi polmonari interi derivati dall'iPSC saranno utilizzati per studiare modelli di malattia specifici del paziente, personalizzare le terapie e migliorare la ricerca medica rigenerativa.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
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