Summary
Makalede, indüklenen pluripotent kök hücrelerin mezenkim ile birlikte hem proksimal hem de distal epitel akciğer hücrelerini içeren üç boyutlu tüm akciğer organoidlerine yönlendirilmiş adım bilgeliği açıklanmaktadır.
Abstract
Biyolojik olarak ilgili in vitro model sistemlerin eksikliği nedeniyle insan akciğer gelişimi ve hastalığının incelenmesi zor olmuştur. İnsan indüklenen pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) adım adım hem epitel hem de mezenkimal hücre popülasyonlarından oluşan 3D çok hücreli akciğer organoidlerine ayırt edilebilir. Embriyonik gelişimsel ipuçlarını, kesin endoderm, ön ön endoderm ve daha sonra akciğer progenitör hücreleri verimli bir şekilde üretmek için çeşitli büyüme faktörleri ve küçük moleküller sunarak yeniden kapsülleriz. Bu hücreler daha sonra büyüme faktörü azaltılmış (GFR)-bodrum membran matris ortamına gömülür ve dış büyüme faktörlerine yanıt olarak kendiliğinden 3D akciğer organoidlerine dönüşmelerini sağlar. Tüm bu akciğer organoidleri (WLO) deksametazon, siklik AMP ve izobutilksantin maruziyeti sonrası dallanma morfogenez ve olgunlaşma dahil olmak üzere erken akciğer gelişim evrelerinden geçer. WLO'lar KRT5 (bazal), SCGB3A2 (club) ve MUC5AC (goblet) belirteçlerini ifade eden hava yolu epitel hücrelerinin yanı sıra HOPX (alveolar tip I) ve SP-C'yi (alveolar tip II) ifade eden alveolar epitel hücrelerine sahiptir. Düz kas aksin (SMA) ve trombosit türevi büyüme faktörü reseptörü A (PDGFRα) dahil olmak üzere mezenkimal hücreler de mevcuttur. iPSC türevi WLO'lar aylarca 3D kültür koşullarında tutulabilir ve belirli bir hücre popülasyonunun saflaştırılması için yüzey belirteçleri için sıralanabilir. iPSC türevi WLO'lar, akciğer epitel ve mezenkim arasındaki sinyaller de dahil olmak üzere insan akciğer gelişimini incelemek, insan akciğer hücresi fonksiyonu ve gelişimi üzerinde genetik mutasyonları modellemek ve enfektif ajanların sitotoksikliğini belirlemek için de kullanılabilir.
Introduction
Akciğer, embriyonik, psödooglandular, kanaliküler, sakküler, alveolar ve mikrovasküler olgunlaşma1,2 olmak üzere altı farklı aşamada gelişen karmaşık, heterojen, dinamik bir organdır. İkinci iki evre insan gelişiminde prenatal olarak gerçekleşirken, ilk dört aşama sadece fetal gelişim sırasında meydana gelir, tabii preterm doğum gerçekleşmediği sürece3. Embriyonik faz endodermal mikrop tabakasında başlar ve trakea ve akciğer tomurcuklarının tomurcuklanmasıyla sonuçlanır. Akciğer gelişimi kısmen epitel ve mezenkimal hücreler arasında sinyal yoluyla gerçekleşir4. Bu etkileşimler akciğer dallanması, çoğalması, hücresel kader tespiti ve gelişmekte olan akciğerin hücresel farklılaşması ile sonuçlanır. Akciğer iletken bölgelere (terminal bronşiollere trakea) ve solunum bölgelerine (alveollere solunum bronşiolleri) ayrılmıştır. Her bölge benzersiz epitel hücre tipleri içerir; hava yolunda bazal, salgı, siliated, fırça, nöroendokrin ve iyonosit hücreleri5, ardından solunum epitelinde alveolar tip I ve II hücreleri dahil olmak üzere6. Çeşitli hücre tiplerinin gelişimi ve yaralanmasına yanıt hakkında hala çok şey bilinmemektedir. iPSC türevi akciğer organoid modelleri, insan akciğer gelişimini yönlendiren mekanizmaların incelenmesini, genetik mutasyonların pulmoner fonksiyon üzerindeki etkilerini ve hem epitel hem de mezenkimlerin primer insan akciğer dokusuna ihtiyaç duymadan enfeksiyöz ajanlara yanıtlanmasını sağlar.
Embriyonik farklılaşmanın çeşitli aşamalarına karşılık gelen belirteçler arasında kesin endoderm (DE)7 için CXCR4, cKit, FOXA2 ve SOX17, ön ön endoderm (AFE)8 için FOXA2, TBX1 ve erken akciğer progenitor hücreleri için NKX2-1 bulunur9. Embriyonik akciğer gelişiminde, foregut dorsal yemek borusu ve ventral trakeaya bölünür. Sağ ve sol akciğerlerin tomurcukları, trakeal tomurcuk10 etrafında iki bağımsız çıkıntı olarak görünür. Dallanma morfogenez sırasında, epitel çevreleyen mezenkim elastik doku, düz kas, kıkırdak ve vaskülür üretir11. Epitel ve mezenkim arasındaki etkileşim normal akciğer gelişimi için gereklidir. Bu, FGF1012'nin epitel tarafından üretilen mezenkim ve SHH13 tarafından salgılanmasıdır.
Burada, hiPSC'lerin üç boyutlu (3D) tüm akciğer organoidlerine (WLO) yönlendirilmiş farklılaşması için bir protokol açıklıyoruz. Alveolar benzeri 14,15 (distal) organoid veya hava yolu16 (proksimal) organoid yapmak için LPC aşamasında tasnif yoluyla akciğer progenitör hücrelerinin izolasyonunu içeren benzer yaklaşımlar olsa da, veya insan akciğer organoidlerini alveolar hücre ve mezenkimal belirteçleri ve tomurcuk ucu progenitor organoidlerini ifade eden hale getirmek için ventral-ön sferoidler üretin17 , bu yöntemin gücü, akciğer dallanma morfogenez, olgunlaşma ve genişleme in vitro için hem akciğer epitel hem de mezenkimal hücre tiplerinin örüntülenmesi ve düzenlenmesidir.
Bu protokol, pluripotent kök hücrelerin ayırt ediciliğini kesin endoderm, ön ön ön endoderm ve akciğer progenitör hücreleri yoluyla yönlendirmek için küçük moleküller ve büyüme faktörleri kullanır. Bu hücreler daha sonra dallanma ve olgunlaşma da dahil olmak üzere önemli gelişimsel adımlarla 3D tüm akciğer organoidlerine indüklenir. Farklılaşma protokolünün özeti Şekil 1a'da, Şekil 1b'de gösterilen endodermal ve organoid farklılaşmanın temsili parlak alan görüntüleriyle gösterilmiştir. Şekil 1c, endodermal farklılaşmanın gen ekspresyon detaylarının yanı sıra farklılaşmayı tamamladıktan sonra akciğer epitel hücrelerinin hem proksimal hem de distal popülasyonlarının gen ekspresyonunu gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma protokolü UCSD İnsan Araştırma Koruma Programı Kurumsal İnceleme Kurulu (181180) tarafından onaylanmıştır.
1. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden kesin endoderm indüksiyonu (Gün 1 - 3)
- Büyüme faktörünü yavaşça çözün (GFR)-bodrum membran (BM) matris ortamı kullanılmadan 30 dakika önce buz üzerinde. Soğuk DMEM/F12'de, GFR BM matris ortamını bu ortamın% 50'sini oluşturacak şekilde seyreltin. P1000 pipet uçlarını kullanmadan önce soğuması için dondurucuya yerleştirin.
- Buz gibi DMEM/F12'de hazırlanan 500 μL%50 GFR-bodrum membran matris ortamı ile 12 kuyulu bir plakanın her kuyusunu kapla. İstenilen kuyu sayısı kaplandıktan sonra, kuyulardan fazla orta karışımı ve/veya kabarcıkları çıkarın ve plakayı ayarlamak için 20 dakika boyunca 4 °C'de buz veya buzdolabına yerleştirin. Daha sonra, tabağı jelleşmek ve kurumak için gece boyunca 37 ° C'de inkübatöre taşıyın.
- HiPSC'ler% 70-90 izdiah süresine ulaştığında, ayrışmadan bir saat önce 10 μM Rho ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 ekleyin. Ortamı aspire edin ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın. Hücre ayırma ortamı (0,5 mL / 12 kuyu plakası kuyusu) ekleyerek hiPSC'leri ayırın ve % 5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
- Plakaları inkübatörden çıkarın ve kuyulara 0,5 mL/12 kuyu kök hücre geçirme ortamı (Tablo 1) ekleyin; tek hücreli süspansiyon elde etmek için P1000 ucu kullanarak hücreleri hafifçe üçe katlayın. Ayrışmış hücreleri 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın; 300 x g'da 5 dakika santrifüj.
- Ortamı epire edin ve hücre peletini 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiş 1 mL mTeSR Plus ortamla yeniden canlandırın. Hücre sayısı gerçekleştirin. 12 kuyulu GFR bodrum membranlı orta kaplamalı plakanın kuyusu başına ROCK inhibitörü Y-27632 ile desteklenmiş 1 mL mTeSR'ye 2,0 x 105 hiPSC ekleyin. Gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır.
NOT: Hücre tohumlama numarası hücre çizgisi başına en iyi duruma getirilmelidir. Kaplamadan 24 saat sonra, kuyular% 50-% 70 bir arada olmalıdır. - 1. günde, mTeSR Plus'ı epire edin ve 100 ng/mL insan aktivin A ve 5 μM GSK3 inhibitörü/Wnt aktivatör CHIR99021 ile desteklenmiş Kesin Endoderm (DE) indüksiyon ortamı (Tablo 1) ekleyin.
NOT: Başarılı farklılaşma için GSK3β inhibitörü/Wnt aktivatör CHIR99021 ile DE ortamı 1. - 2. gün ve 3.
NOT: DE farklılaşması toplam 72 saati geçmemelidir, aksi taktirde etkinlik azalacaktır. 4. günde, büyük hücreli ölüm gözlenirse, toplam DE ortam maruz kalma süresini 6-12 saat azaltın. - DE verimliliğini analiz etmek için, FOXA2 ve/veya SOX17'nin akış sitometrisi veya immünopluoresans analizi yoluyla %90'dan fazla CXCR4 ve/veya cKit ekspresyonunun doğrulanmış olması (Şekil 2a).
2. Ön ön ön endoderm (AFE) indüksiyonu (Gün 4 - 6)
- 4. günde, medyayı AFE indüksiyonu için 10 μM SB431542 ve 2 μM Dorsomorphin ile desteklenmiş serumsuz bazal ortama (SFBM) (Tablo 1) değiştirin. AFE medyayı 3 gün boyunca günlük olarak değiştirin (4. gün, 5. gün ve 6. gün).
- AFE verimliliğini analiz etmek için, immünofluoresans boyama yoluyla SOX2, TBX1 ve FOXA2'nin sağlam ifadesini onaylayın (Şekil 2b).
3. Akciğer progenitör hücre (LPC) farklılaşması (Gün 7 - 16)
- 7. günde, GFR-bodrum membran matris ortamını buz üzerinde çözün. AFE medyasını epire edin ve 1x PBS ile iyice yıkayın. 1 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hücre müfrezesi çözeltisi içeren kuyulara 1 mL söndürme ortamı (DMEM/F12'de %2 FBS) ekleyin. Hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyarak agrega olarak tutun. Tüm hücrelerin yerinden çıkıp 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarıldığından emin olun. 300 x g'da 5 dakika santrifüj.
- Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 10 ng/mL insan rekombinant kemik morfojenik protein-4 (BMP4), 0,1 μM all-trans retinoik asit (RA), 3 μM GSK3β inhibitörü/Wnt aktivatör CHIR99021 ile desteklenmiş söndürme ortamında yeniden canlandırın, ve 10 μM Kaya inhibitörü Y-27632.
- Hücre sayısı gerçekleştirin. 100 μL soğuk GFR-bodrum membran matris ortamına 2,5 x 105 hücre ekleyin, iyice karıştırın ve damlacıkları 12 kuyulu bir tabağa yerleştirin. Ortanın polimerize olmasını sağlamak için plakayı 37 °C'de 30-60 dakika kuluçkaya bırakın. Orta damlanın tamamen batırılmasını ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatmasını sağlamak için kuyu başına 10 μM KAYA inhibitörü Y-27632 ile desteklenmiş 1 mL LPC ortam ekleyin.
- LPC indüksiyonu sonrası 8, 24 saat sonra, ROCK inhibitörü Y-27632'yi çıkarmak için LPC ortamını değiştirin. Toplam 9-11 gün boyunca LPC ortamını her gün değiştirin.
NOT: Ortam 24 saat içinde sararırsa, her gün ortayı değiştirin. - LPC verimliliğini analiz etmek için hücre içi transkripsiyon faktörü NKX2-1'in sağlam ekspresyonunu onaylayın veya CD47hi/CD26low15 veya CPM18 yüzey belirteçleri için akış sitometrisi gerçekleştirin (Şekil 2c). Brüt olarak, LPC küreselleri yuvarlak ve şeffaf olmalıdır (Şekil 2c).
NOT: NKX2-1'in verimliliği %30'un altındaysa akciğer organoid farklılaşmasına devam etmeyin.
4.3D akciğer organoid indüksiyonu (Gün 16 - 22)
- 17. günde, GFR-bodrum membran matrisi ortamını buz üzerinde çözün. LPC indüksiyon ortamını aspire edin. Daha sonra kuyuya 2 μg/mL dispaz (1 mL) ekleyin ve orta/dispaz karışımını bir P1000 pipetle yeniden biriktirin. 15 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın. Karışımı tekrar üçe ayırın ve 37 °C'de 15 dakika daha kuluçkaya yatırın.
- Dispaz ve hücreleri 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. Kuyuyu yıkamak ve dispaz/hücre karışımını yeniden kullanmak için soğutulmuş PBS (2-3 mL) kullanın. 400 x g'da 5 dakika santrifüj. Orta / hücre pelet tabakasını dağıtmamaya dikkat derek, üst düğmeyi manuel olarak çıkarın. Soğutulmuş PBS yıkamayı tekrarlayın ve konik santrifüj tüpünü 400 x g'da 5 dakika daha santrifüjleyin.
- Süpernatantı manuel olarak çıkarın ve ardından konik santrifüj tüpüne 2 mL tripsin bazlı ayrışma çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 12 dakika kuluçkaya yaslanın.
- İnkübasyondan sonra, hücreleri P1000 pipet ucuyla yeniden biriktirin. Ardından konik santrifüj tüpüne eşit miktarda söndürme ortamı ekleyin ve 5 dakika boyunca 400 x g'da aşağı doğru döndürün. Süpernatant ve resuspend hücreleri söndürme ortamı + 10 μM ROCK inhibitörü Y-27632'de epire edin.
NOT: Başarılı akciğer organoid indüksiyonu, hücreler tek hücre olarak değil, agrega olarak gömildiğinde, pipetleti buna göre ayarladığında ortaya çıkar. - Hücre sayısı gerçekleştirin. Kuyu başına 5,0-8,0 x 104 hücre elde etmek için gereken hacmi hesaplayın. LPC hücresinin 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve santrifüjler halinde 400 x g'da 5 dakika boyunca bir araya toplanır. Hücre peletini çalkalatmamaya dikkat derek fazla üstnatantı çıkarın. Sadece 10 μL artık ortam bırakın.
- Hücre peletini 200 μL soğuk GFR-bodrum membran matris ortamında yeniden askıya alın ve hücre kültürü membran kesici uçlarına ekleyin (6,5 mm çapında, 0,4 μm gözenek, polyester membran). GFR-bodrum membran matrisi ortamının polimerize olmasını sağlamak için plakayı 37 °C'de 30-60 dakika kuluçkaya bırakın.
- Fibroblast büyüme faktörü-7 (FGF7) (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), GSK3β inhibitörü ile desteklenmiş 1 mL 3D organoid indüksiyon ortamı (Tablo 1) ekleyin /Wnt aktivatör CHIR (3 μM), epidermal büyüme faktörü (EGF) (10 ng/mL) ve 10 μM ROCK inhibitörü Y-27632 membran kesici ucun bazolateral odasına. Ortamı 6 gün boyunca iki günde bir değiştirin.
5.3D Akciğer organoid dallanma (Gün 23 - 28)
- 23. günde FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), GSK3β inhibitörü/Wnt aktivatör CHIR9902 ile birlikte 3D dallanma ortamına (Tablo 1) yapılan değişiklik 1 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng/mL) ve vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) / plasental büyüme faktörü (PlGF) (10 ng/mL). Ortamı 6 gün boyunca iki günde bir değiştirin.
NOT: 3D dallanma farklılaşması 6. günde birden fazla dallanma organoidi olmalıdır (Şekil 2).
6.3D akciğer organoid olgunlaşması (Gün 29 - 34)
- 29. günde, 3D olgunlaşma ortamına (Tablo 1) değiştirin, bu da 3D dallanma ortamıyla aynıdır, ancak deksametazon (50 nM), cAMP (100 μM) ilavesiyle ve 3-izobütil-1-metiloksinatin (IBMX), fosfodizeraz inhibitörü de izobutilksantin (100 μM) olarak adlandırıldı. Ortamı 6 gün boyunca iki günde bir değiştirin.
NOT: 3D olgunlaşmadan sonra 24 saat içinde, dallanan organoidler genişlemeli ve şeffaf kürelere dönüşmelidir.
7.3D Akciğer organoid immünosikokimyası
- 3D tüm akciğer organoid analizi için, 4 °C'de 1 saat boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile membran uçlarındaki GFR-bodrum membran matris ortamını sabitleyin. Parafin balmumuna gömün ve yayınlanan standart protokollere göre slaytlara monte edin.
- Boyamadan önce antijen alımını gerçekleştirin. Hava yolu belirteçleri arasında KRT5, MUC5AC ve SCGB3A2 bulunur. Alveolar belirteçler SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 ve HOPX'u içerir (Şekil 3).
8. Tüm akciğer organoidlerinin geçiş, FACS veya kriyoprezervasyon için GFR-bodrum membran matris ortamından çıkarılması
- Organoidleri GFR-bodrum membran matris ortamından ayrıştırmak için bazal hazneden medyayı çıkarın ve apikal hazneye 2 μg/mL dispaz (1 mL) ekleyin.
- Orta / dispaz karışımı bir P1000 pipetle hafifçe üçe katlayın ve 15 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Karışımı tekrar hafifçe üçe ayırın ve 15 dakika daha kuluçkaya yatırın.
- 1 mL soğutulmuş PBS (4 °C) ekleyin ve matris ortamına sahip organoidleri 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün. Hücre peletini rahatsız etmemek için üstnatant dikkatlice çıkarın.
- 1 mL soğutulmuş PBS ile bir kez daha yıkayın ve 5 dakika boyunca 400 x g'da aşağı doğru döndürün. Orta/ hücre karışımını rahatsız etmemek için üstnatant dikkatlice çıkarın.
- Konik santrifüj tüpüne 1 mL hücre dekarakment çözeltisi ekleyin, GFR-Basement membran matrisi orta / hücre karışımını hafifçe yeniden kullanın. Hücreleri agrega olarak geçirmek veya kriyoprezervasyon için 12 dakika veya tek hücreli süspansiyon için 20 dakika inkübatöre yerleştirin.
- Eşit miktarda söndürme ortamı ekleyin ve 5 dakika boyunca 400 x g'da aşağı çevirin. Söndürme ortamı + 10 μM KAYA inhibitörü Y-27632'de yeniden kullanılabilir.
NOT: Bu adımda tüpte artık bodrum membran ortamı görülmemelidir. Kalan ortam kalırsa, 8.5 ve 8.6 adımlarını yineleyin. - Hücre sayısı gerçekleştirin. Aşağı akış uygulamaları için gereken birimi hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kaplamadan 24 saat sonra, 1. 2. günde DE%90-%95 bir arada olmalıdır. DE indüksiyonu sırasında, 4. günde önemli hücre ölümünü gözlemlemek yaygındır, ancak bağlı hücreler kompakt bir parke taşı morfolojisini koruyacaktır (Şekil 2b). Yapışık hücrelerin çoğunluğu ayrılırsa farklılaşmayı durdurun ve ACTIVIN A ile DE ortamına maruz kalmayı 6-12 saat kısaltmayı düşünün. AFE indüksiyonu sırasında hücre ölümü minimumdur ve hücreler yapışmada kalır, ancak daha küçük ve daha heterojen görünecektir. Hücrelerin 7. günde geçmesi ancak çift pozitif SOX2 ve FOXA2 verimi %80> ise yapılmalıdır. 3D LPC indüksiyonu için bodrum membran matrisine geçtikten sonra, küçük sferoidler önce ortaya çıkar, sonra büyür ve bazıları dallanmaya başlayabilir. Başarılı endodermal farklılaşma için gen ekspresyon profilleri arasında DE'de artan SOX17, azalan SOX17 ile artan FOXA2 ve SOX2 ve NKX2-1'in ilk görünümü ve SOX2 ve FOXA2 varlığı ile birlikte NKX2-1'in artması sayılabilir. Erken embriyonik gelişim ile uyumlu olarak, akciğer tomurcuk gelişimi (NKX2-1+) için AFE'nin ventralizasyonu ve gastrointestinal gelişim (SOX2+) için AFE'nin dorsalizasyonu meydana gelir. LPC'deki kültürler hem akciğer hem de mide atalarının bir karışımına sahip olacak.
LPC'den akciğer organoid indüksiyonu çeşitli yöntemler kullanılarak gerçeklenmiştir. Bazı gruplar hücreleri NKX2-1 floresan muhabirleri veya bir yüzey antijen proxy'si (CPM, CD26lowCD47high) kullanarak sıralar. Ancak bu akciğer organoidleri alveolar tip I hücreleri veya mezenkim içermeyen hücreler gibi alveolar tip II içerir. Diğer gruplar, AFE/LPC monolayer'dan tomurcuklanan hücre kümelerini topladılar ve bodrum membran matrisine gömdler. Bu organoidler akciğer epitel ve mezenkimal hücrelerin karışık popülasyonu içerir, ancak kültüre aylar sürer19. Protokolümüz hem epitel hem de mezenkimal hücrelerin varlığını içerir. WLO'lar proksimal epitel hücre belirteçlerini p63 ve KRT5 (bazal hücreler) ve SCGB3A2 (kulüp hücreleri) ile distal epitel hücre belirteçlerini HOPX (ATI) ve proSPC, SPB ve NKX2-1 (ATII) ile ifade eder. Ayrıca LPC aşamasında ve tüm akciğer organoidlerinde mezenkimal belirteç Vimentin'i ifade ederler. PDGFRα, keskülasyon ve alveolarizasyon sırasında akciğerde önemli bir işleve sahip fibroblastlar için bir belirteçtir20 ve distal hücre farklılaşmasında önemli olan transkripsiyon faktörü ile birlikte ifade edilir, SOX9 (Şekil 3).
Yöntemimiz, erken akciğer organoidlerini oluşturmak için fetal akciğer gelişiminde meydana gelen sinyal moleküllerini kullanarak NKX2-1 eksprese edici LPC 3D kültürlerini verimli bir şekilde üretir. LPC'leri akciğer organoid indüksiyonu için GFR-bodrum membran matris ortamına geçirirken, tek bir hücre süspansiyonuna aşırı ayrışmamak, bunun yerine küçük hücre kümelerini (10 hücre/küme) tutmak zorunludur. Hücre sayımı tamamen doğru olmayacaktır, ancak 3 haftalık akciğer organoid farklılaşması sırasında aşırı izdihamdan kaçınmak için yine de gereklidir.
Akciğer organoid indüksiyonu, indüksiyonun 6. gününe (farklılaşmanın 23. günü) kadar küçük, dallanarak organoidler vermelidir. Bunlar organoid dallanma adımı ve olgunlaşma adımı sırasında büyümeye devam etmelidir. Deksametazon, cAMP ve IBMX'in piyasaya sürülmesinden yirmi dört saat sonra, şubeler şeffaf kürelere genişlemelidir. Tüm akciğer organoid analizi farklılaşmanın sonunda yapılabilir veya WLO'lar GFR ile taze bodrum membran matrisine geçiş yapabilir veya% 10 DMSO'da dondurularak kriyoprezerserved olabilir.
Şekil 1: Tüm akciğer organoidinin (WLO) hiPSC'lerden ve temsili verilerden farklılaşma şeması. (a) HiPSC'lerden WLO farklılaşma şeması. Daireler, tanımlayıcı işaretleyicilerle endodermal hücre tipini temsil eder. Farklılaşmanın zaman çizelgesi siyah çubuklarda gösterilir. Endodermal ve akciğer organoid popülasyonlarının indüksiyonu için büyüme faktörleri ve/veya küçük moleküller. Özetle kök hücreler yaklaşık 16 gün içinde kesin endoderm, ön ön ön endoderm ve akciğer progenitör hücrelerine ayırıcı hale gelir. Bu hücreler daha sonra orta uçlar içeren GFR-bodrum membran matris ortamına geçer ve akciğer organoid indüksiyonu, dallanma ve olgunlaşma geçirir. Toplam farklılaşma yaklaşık 35 gün sürer. (b) Majör endodermal evrelerde hücrelerin temsili faz kontrast görüntüleri ve tüm akciğer organoidlerinin 3D görüntüleri. Panelde belirtildiği gibi ölçek çubuğu boyutu. (c) endoderm sırasında akciğer gelişim belirteçlerinin qRT-PCR analizi ve (d) proksimal ve distal hücre belirteçlerinin tüm akciğer organoid farklılaşması. Tüm veriler ortalama 3-5 biyolojik kopyayı temsil eder. Hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil eder ve harekete geçmek için normalleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Endoderm farklılaşmasının akış sitometrisi ve immünositokimya ile karakterizasyonu. (a) Kesin endoderm belirteci CXCR4'ün akış sitometrisi. Sol panel, orta panel CXCR4 pozitif popülasyonu gösterirken, fark edilmeyen popülasyona karşı gating gösterir. Sağ panel, ÇEKIRDEK (mavi) ile kaplanmış SOX17'nin (kırmızı) immünositoksimya görüntüsünü gösterir. (b) AFE işaretleyicileri FOXA2 ve SOX2'nin nüklei (mavi) ile kaplanmış immünositoksimya görüntüsü. (c) 3D LPC'deki bir muhabir hücre hattında NKX2-1-GFP'nin endojen ekspresyonu. Brightfield ve GFP'deki canlı hücre kültüründen alınan görüntüler. Fiksasyon ve permeabilizasyondan sonra akciğer progenitör hücre içi belirteci NKX2-1'in akış sitometrisi. Ölçek çubuğu boyutu = 50 μM. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İmmünositokimya ile 3 haftalık farklılaşmadan sonra 3D tüm akciğer organoidlerinin karakterizasyonu. (a) Proksimal akciğer belirteçleri. Sol panelde çekirdek (mavi) ile kaplanan SOX2 (beyaz) ve SOX9 (kırmızı) gösterilir. Bu belirteçler morfogenez dallanmada önemlidir ve proksimal ve distal epitel popülasyonlarını temsil eder. Orta paneller, bazal hücrelerin her ikisi de işaretleyici olan P63 (kırmızı) ve KRT5'i (kırmızı) gösterir. Sağ panelde kulüp hücrelerinin bir işareti olan SCGB3A2 gösterilir. (b) Distal akciğer belirteçleri. Sol panelde sırasıyla alveolar tip II reklam I hücrelerinin çekirdek (mavi) ile kaplanmıştır. Orta panel, çekirdek (mavi) ile kaplanan alveolar tip II hücrelerinin işaretleyicileri olan pro-SPC (PSPC) (yeşil) ve SPB'yi (kırmızı) gösterir. Sağ panelde çekirdek (mavi) ile kaplanan NKX2-1 (kırmızı) ve ZO1 (yeşil) gösterilir. (c) Akciğer mezenkiminin belirteçleri. Sol panel pdgfra (kırmızı) ve SOX9 (beyaz), distal mezenkim temsil eder gösterir. Sağ panel, akciğer boyunca dağılmış vimentin (kırmızı) gösterir. Ölçek çubuğu boyutu = 50 μM. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| REAKTIFLER VE ÇÖZÜMLER - Şirket adları için lütfen Malzeme Listesi Tablosu'na bakın |
| 3D organoid indüksiyon ortamı (gün 17-22) |
| Serumsuz bazal ortam (tarife bakınız) ile desteklenmiştir: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| EGF (10 ng/mL) |
| 3D organoid dallanma ortamı (gün 23-28) |
| Serumsuz bazal ortam (tarife bakınız) ile desteklenmiştir: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Tamamen trans retinoik asit (0,1 μM) |
| EGF (10 ng/mL) |
| VEGF/PIGF (10 ng/mL) |
| 3D organoid olgunlaşma ortamı (gün 29-34) |
| Serumsuz bazal ortam (tarife bakınız) ile desteklenmiştir: |
| Deksametazon (50 nM) |
| Br-cAMP (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| AFE indüksiyon ortamı (gün 4-6) |
| Serumsuz bazal ortam (tarife bakınız) ile desteklenmiştir: |
| SB431542 (10 μM) |
| Dorsomorfin (2 μM) |
| DE indüksiyon ortamı (gün 1-3) |
| 48,5 mL RPMI1640 + Glutamax |
| Retinoik asitsiz 1 mL B27 |
| 500 μl HEPES (%1) |
| 500 μl kalem/strep |
| İnsan aktivin A (100 ng/mL) |
| CHIR99021 (5 μM) - sadece ilk 24 saat içinde |
| LPC indüksiyon ortamı (gün 7-16) |
| Serumsuz bazal ortam (tarife bakınız) ile desteklenmiştir: |
| BMP4 (10 ng/mL) |
| Tamamen trans retinoik asit (RA) (0,1 μM) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| Söndürme ortamı |
| 49 mL DMEM/F12 |
| 1 mL FBS |
| Serumsuz bazal ortam (SFBM) |
| 375 mL Iscove Modifiye Dulbecco Orta (IMDM) + Glutamax |
| 125 mL Ham'ın F12'leri |
| Retinoik asitsiz 5 mL B27 |
| 2,5 mL N2 |
| 500 μl askorbik asit, 50 mg/mL |
| 13 μl monothioglycerol/1ml IMDM" serumsuz medya başına 0.4m monothioglycerol 300ul kullanın |
| 3.75 mL sığır serum albümin (BSA) Fraksiyon V, 7.5% çözüm |
| 500 μl kalem/strep |
| Kök hücre geçirme ortamı (gün 0) |
| 500 mL DMEM/F12 |
| 129 mL Nakavt serum replasmanı (KSR) |
| 6,5 mL Glutamax |
| 6,5 mL NEAA |
| 1.3 mL 2-mercaptoethanol |
| 6,5 mL kalem/strep |
Tablo 1: Ortam tablosu.
| Sorun | Çözüm |
| DE farklılaşması verimli değil | Kök hücre ortamında kaplamadan 24 saat sonra hücreler %50-70 bir arada olmalıdır. |
| GSK3β inhibitörü/Wnt aktivatör CHIR99021 1 DE indüksiyon gününden sonraki 20-24 saat içinde çıkarılmalıdır | |
| DE farklılaşması toplam 72 saati geçmemelidir | |
| AFE farklılaşması verimli değil | DE farklılaşması başarılı olduğundan ve hücrelerin %80 CXCR4 > sağladığından emin olun |
| Her gün medyaya taze büyüme faktörlerinin/küçük moleküllerin eklendiğini sağlayın | |
| LPC farklılaşması verimli değil | AFE farklılaşması başarılı olduğundan ve hücrelerin %80 FOXA2/SOX2 > ifade ederek |
| AFE hücrelerinin tek hücreli değil, 4-10 hücrenin toplamları olarak geçirildiklerinden emin olun | |
| 3D akciğer organoidleri büyüymeyen veya farklılaşmayan | LPC farklılaşması başarılı olduğundan ve hücrelerin %30 NKX2-1'> ifade getirdiğine emin olun |
| LPC'lerin tek hücreli değil, 4-10 hücrenin toplamları olarak geçirildiklerinden emin olun | |
| Geçiş sırasında LPC'lerden artık matrigel olmadığından emin olun | |
| Her ortam değişikliğiyle ROCK inhibitörü Y-27632 ekleyin | |
| Ortamın zamanında değiştirildiğinden ve taze büyüme faktörlerinin/küçük moleküllerin ekildiğinden emin olun | |
| Büyüme faktörlerinin/küçük moleküllerin konsantrasyonunun doğru olduğundan emin olun |
Tablo 2: Sorun giderme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D tüm akciğer organoidlerinin (WLO) başarılı farklılaşması, büyüme faktörlerine ve küçük moleküllere maruz kalma süresi, geçtikten sonra hücresel yoğunluk ve hiPSC'lerin kalitesi de dahil olmak üzere detaylara dikkat edilen çok adımlı, 6 haftalık bir protokole dayanır. Sorun giderme için tablo 2'ye bakın. hiPSC'ler yaklaşık%70-%80 bir arada olmalı, ayrışma öncesinde %5'ten az spontan farklılaşma olmalıdır. Bu protokol "mTeSR artı" ortamını gerektirir; ancak, düz "mTeSR" ortamı da karşılaştırılabilir sonuçlarla kullanılmıştır ve daha ucuzdur. Hücre dışı matris için GFR bodrum membran matrisi ortamı kullanıyoruz. Farklılaşmayı azaltmak için HiPSC'leri ReLesR (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak aktarıyoruz.
Endoderm farklılaşması sırasında, hücreler ortam değişikliklerinden önce ve sonra günlük olarak görselleştirilmelidir. Erken bozulmayı önlemek için baz ortama günlük taze büyüme faktörleri/küçük moleküller eklenmelidir. Kesin endoderm (DE) hücre ölümü yaygındır, ancak ön ön ön endoderm (AFE) ve akciğer progenitör hücre (LPC) indüksiyonu sırasında sınırlanmalıdır. DE'nin üçüncü gününde (4. gün) büyük bir kalıp varsa, DE'nin toplam süresini 6-12 saat azaltın. Başarılı endoderm farklılaşması için yeni iPSC hücre hatlarının optimize edilmesi gerekebilir. Başarılı indüksiyonu onaylamak için CXCR4 için DE'de akış sitometrisi gerçekleştirin (%>85 CXCR4 + hücreler). Hücreler AFE'de nispeten stabil olmalıdır ve çok az kalıpla morfolojik olarak değişecektir.
LPC'ye geçirme, hücre türü için en iyi duruma getirilmesi gereken başka bir işlemdir. Hücrelerin çok düşük yoğunlukta (%<50) yeniden sıçraması verimsiz farklılaşmaya neden olur. NKX2-1 için immünositokimya veya CPM18 veya CD26low/CD47high15 için akış sitometrisi ile başarılı LPC indüksiyonunu onaylayın. Başarılı LPC indüksiyonu % 40 NKX2-1 > olmalıdır, aksi takdirde organoidler daha fazla dorsal AFE bolluğuna sahip olacaktır. LPC indüksiyonu için, her ortam değişikliğiyle temel ortama büyüme faktörleri eklenmelidir. Ortam daha sonra LPC indüksiyonuna sarıya dönüşürse, taze ortamın sesini artırmayı düşünün veya medyayı her gün değiştirin. 3D tüm akciğer organoid indüksiyonu sırasında, kaplama sayısı ve hücre kümelerinin korunması başarılı organoid büyümesinin anahtarıdır. GFR-bodrum membran matris ortamının kullanımı zordur ve yüksek sıcaklığa duyarlıdır, bu nedenle her zaman buzda tutun. GFR-bodrum membran matrisi orta jelleri çok erkense, LPC hücreleri içinde entegre olmaz. GFR-bodrum membran matris ortamının 1 mL'lik aliquots'u geçmeden 30 dakika önce buz üzerinde çözmenizi öneririz. Hücreler/kümeler sayıldıktan ve uygun aliquots yapıldıktan sonra, hücre peletini buza yerleştirin. GFR-bodrum membran matrisi orta işlemeden önce plakaların hazırlanmasını, etiketlenmeyi ve hücre kültürü membran uçlarının eklenmesini öneririz.
Doğru hacimli sıvı GFR-bodrum membran matris ortamını hemen hücre peletine eklemek için pipet uçlarını kullanın, buz üzerinde tutun. Pipet kabarcıkları tanıtmamak için hızlı ama hafifçe (nüanslı kullanım) yukarı ve aşağı, sonra tüpü tekrar buza yerleştirin. Hücre ve GFR-bodrum membran matrisi orta karışımını hazırlanan plakalarda transwell'in apikal kısmına ekleyin. Karışım tüm transwell'i yaymalı ve kaplamalıdır; kaplamayı sağlamak için plakayı hafifçe eğin. 30-60 dk boyunca inkübatörde jelleştikten sonra, GFR-bodrum membran matrisi ortamında görünür hücre kümeleri olmalıdır. 10 μM ROCK inhibitörü Y-27632 ile desteklenmiş bazal odaya uygun akciğer indüksiyon ortamı ekleyin ve her gün organoid büyümesini izleyin.
Bu protokol tarafından oluşturulan organoidlerin gelecekteki uygulamaları arasında erken akciğer soyu taahhüdünü ve hücre kader spesifikasyonunu kontrol eden moleküler yolların incelenmesi yer almaktadır21,22,23. Epitel ve mezenkim arasındaki etkileşim gen nakavt modelleri kullanılarak belirlenebilir24. Organoidler ayrıca akciğer epitel, mezenkim ve endotel25 arasında dokuya özgü ko-desen sinyalinin önemini belirlemek için endotel hücreleri ile birlikte kültürlenebilir. Akciğer gelişimi vasküler gelişime paralel olarak ortaya çıkar ve bu ilişki uygun akciğer gelişimi için gerekli önemli moleküler mekanizmaları ortaya çıkarabilir. Ayrıca, GFR-bodrum membran matriks ortamı çıkarıldıktan sonra tüm bu akciğer organoidlerinin yüzey aktif madde salgı tahlilleri yoluyla işlevsel olduğunu ve ardından ultra düşük bağlanma kuyularında kısa süreli kültürün olduğunu gösterdik26. Diğer stratejiler arasında NGFR (bazal hücreler)27 ve HTII-280 (ATII hücreleri)28 gibi hücre yüzey belirteçleri için hücrelerin sıralanması ve bunların homojen organoidler veya hava sıvısı interfaz kültürü koşullarında bir monolayer olarak değiştirilmesi yer almaktadır. Bütün, proksimal ve distal akciğer organoidleri, COVID-19 ile mücadele edebilecek ilaçları daha iyi anlamak ve taramak için SARS-CoV-2 viral enfeksiyonunun hücresel hedeflerini ve patofizyolojisini incelemek için de kullanılmıştır.
Bu protokol sağlam ve tekrarlanabilir, ancak birçok zorluk hala mevcut. Birçok farklı iPSC ve ESC hattı test edilmiştir (>20 satır) ancak protokol her hücre satırı için en iyi duruma getirilmelidir. Sağlam DE ve AFE indüksiyonlarına rağmen, LPC indüksiyonunun NKX2-1 + hücrelerinin % 40'> elde edilmesi zor olabilir. Diğer protokoller NKX2-1 hücrelerinin yüzey belirteçleri için bir sıralama adımı15,18 içerir, ancak bunlar sadece mezenkimsiz organoidler gibi alveolar tip II verir ve akciğer progenitör popülasyonu29'u arındırmalarına rağmen hala mide ve hepatik hücre popülasyonları içerir. Ayrıca, muhtemelen LPC'leri kirleten dorsal ön ön hücrelerin varlığı nedeniyle hem LPC'de hem de tüm akciğer organoidlerinde az miktarda mide ve hepatik hücreye dikkat çektik. Bu nedenle, saf akciğer organoidlerinin farklılaşması henüz sağlanmamıştır ve insan dokusundaki akciğer progenitör hücrelerinin gelişimi hakkında daha fazla araştırma tamamlanmalıdır. Aşağı akış tahlilleri, birincil insan akciğer dokusundan gelen gen ve protein ekspresyolü ile güçlü bir şekilde kıyaslanmalıdır. Bugüne kadar akciğer organoidlerinin en verimli kullanımı hastalıkların modellanması ve ilaçların tüp bebek taramasında iken, hiPSC türevi akciğer organoidlerinin rejeneratif tıp için hastalara nakli bir dizi durum için gelecekteki bir tedavi olarak düşünülmektedir. Bununla birlikte, bu tür müdahaleleri düşünmeden önce, kontamine edici, istenmeyen, potansiyel olarak tümörojenik hiPSC türevlerinin tanımlanması ve çıkarılması da dahil olmak üzere iyi bir kalite kontrolü mükemmelleştirilmelidir. Ayrıca, pulmoner hastalığın in vitro ve daha iyi hayvan modellerinin daha iyi fonksiyonel tahlillerinin geliştirilmesi gerekmektedir.
Özellikle, hiPSC türevi hücrelerin işlevselliği ve güvenliği onaylanmalıdır. Farklılaşmamış hücrelerin teratom üretme kapasitesine sahip oldukları için dışlanmaları gerekir. Kesin endodermde farklılaşmamış kök hücreleri belirlemek için bir yöntem pluripotency marker SSEA4 kullanarak hücreleri sıralamaktır. Farklılaşmamış hiPSC'ler için marker genleri yakın zamanda tek hücreli RNA dizilimi30 kullanılarak tespit edildi. ESRG, CNMD ve SFRP2, farklılaşmamış hücreleri herhangi bir farklılaşma adımında doğrulamak için kullanılabilir. Saflık doğrulandıktan sonra, otolog iPSC türevi tedavilerin yararı, nakledilen hücrelerin hastanın kendi hücrelerinden geldikleri için reddedilmeyi önleme yeteneğidir. Dezavantajları, hücreleri tamamen ayırt etmek, sıkı klinik sınıf testinden geçmek ve hücreleri akut yaralanması olan bir hastaya (solunum sıkıntısı sendromu, miyokard enfarktüsü veya omurga yaralanması) nakletmek için gereken süreyi içerir. Alternatif, bankalı allojenik iPSC türevi hücreleri kullanmaktır31. Bunlar, insan lökosit antijeni (HLA) ile eşleşen donörleri olan hastalar için saklanabilir ve kolayca kullanılabilir ve kontaminasyon için kapsamlı testlerden geçmiş olacaktır. En büyük dezavantajı bağışıklık reddi olasılığıdır. Allojenik tüm doku nakillerinin güncel gerçeği olan allojenik hücre transplantasyonunda immünsüpresyon gerekebilir. Allojenik iPSC türevi hücrelerin bağışıklık tepkilerinden kaçarak hastalara güvenli bir şekilde nakledilmesine izin vermek için stratejiler tasarlanmıştır32.
Sonunda, iPSC türetilmiş tüm akciğer organoidleri, hastaya özgü hastalık modellerini incelemek, terapötikleri uyarlamak ve rejeneratif tıbbi araştırmaları geliştirmek için kullanılacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Kaliforniya Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) (DISC2-COVID19-12022) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A.
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X.
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C.
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
