Summary
이 기사는 근접성 및 말단 상피 폐 세포를 메센키메와 함께 포함하는 3차원 전체 폐 오르가노이드로 유도된 다능성 줄기 세포의 단계 현명한 분화를 설명합니다.
Abstract
인간 폐 발달 및 질병은 생물학적으로 관련된 체외 모델 시스템의 부족으로 인해 연구하기가 어려웠습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC)는 상피 및 중간 엽 세포 집단으로 만든 3D 다세포 폐 오르가노이드로 단계적으로 분화 될 수 있습니다. 우리는 다양한 성장 인자와 작은 분자를 효율적으로 생성하여 배아 발달 신호를 재구성하여 최종 엔도름, 전방 전방 전구 장부, 그리고 그 이후에 폐 선조 세포를 생성합니다. 이 세포는 그 때 감소된 성장 인자 감소 (GFR)-지하 막 매트릭스 매체에 내장되어, 그(것)들이 외부 성장 인자에 응하여 3D 폐 오르가노이드로 자발적으로 발전할 수 있게 합니다. 이 전체 폐 오르가노이드 (WLO)는 덱사메타손, 순환 앰프 및 이소부틸산틴에 노출 된 후 형성 형성 및 성숙을 포함한 초기 폐 발달 단계를 겪습니다. WlOs는 마커 KRT5 (기저), SCGB3A2 (클럽) 및 MUC5AC (잔)뿐만 아니라 HOPX (alveolar 타입 I) 및 SP-C (alveolar type II)를 표현하는 폐포 상피 세포를 발현하는 기도 상피 세포를 보유하고 있습니다. 중간엽 세포는 또한 평활근 액틴(SMA) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 A(PDGFRα)를 포함하는 존재한다. iPSC 유래 WlOs는 몇 달 동안 3D 배양 조건에서 유지될 수 있으며 특정 세포 집단을 정화하기 위해 표면 마커를 위해 정렬될 수 있다. iPSC 유래 WlOs는 또한 폐 상피와 관혈 사이의 신호를 포함하여 인간의 폐 발달을 연구하고, 인간 폐 세포 기능 및 발달에 대한 유전 적 돌연변이를 모델링하고, 감염제의 세포 독성을 결정하는 데 활용될 수 있다.
Introduction
폐는 배아, 의사, 캐날리큘러, 충류, 및 미세 혈관 성숙1,2 - 6 개의 별개의 단계에서 발전하는 복잡하고 이질적이며 역동적 인 기관입니다. 후자의 두 단계는 조산이 발생하지 않는 한 태아 발달 중에 독점적으로 발생하는 반면, 인간 발달에서 산후적으로 발생합니다3. 배아 단계는 내피 세균 층에서 시작하여 기관및 폐 싹의 신진으로 끝납니다. 폐 발달은 상피 세포와 중간엽 세포 4 사이의 신호를 통해 부분적으로 발생합니다. 이러한 상호 작용은 폐 분지, 증식, 세포 운명 결정 및 발전 폐의 세포 분화를 초래합니다. 폐는 전도 영역(말기 기관으로의 기관) 및 호흡기 영역(폐포에 대한 호흡기 기관지)으로 나뉩니다. 각 영역은 독특한 상피 세포 유형을 포함; 기저, 분비, 모양, 브러시, 신경 내분비 및 이오노세포 세포를 실시하는 기도55, 호흡 상피에서 폐포형 I 및 II 세포가 뒤따른다. 많은 개발 및 다양 한 세포 유형의 부상에 대 한 응답에 대 한 아직 알 수 없습니다. iPSC 유래 폐 오르가노이드 모델은 인간의 폐 발달을 유도하는 메커니즘, 폐 기능에 대한 유전 적 돌연변이의 효과 및 1 차적인 인간 폐 조직에 대한 필요없이 전염성 요원에 대한 상피 및 메센키메 의 반응을 가능하게합니다.
배아 분화의 다양한 단계에 대응하는 마커는 CXCR4, cKit, FOXA2 및 SOX17을 위한 최종 엔도드름(DE)7, FOXA2, TBX1 및 SOX2를 위한 전방 전방 배구 내분방(AFE)8, 및 초기 폐선세포에 대한 NKX2-1을 포함한다. 배아 폐 발달에서, 전장은 등쪽 식도와 복부 기관으로 분할합니다. 오른쪽과 왼쪽 폐의 싹은 기관 bud10 주위에 두 개의 독립적 인 외설로 나타납니다. 형태 발생을 분기하는 동안 상피를 둘러싼 중간 근막은 탄성 조직, 부드러운 근육, 연골 및 혈관11을 생성합니다. 상피와 메센키메 사이의 상호 작용은 정상적인 폐 발달에 필수적입니다. 여기에는 FGF1012의 분비성 및 상피에 의해 생성된 SHH13이 포함됩니다.
여기서, 우리는 hiPSC의 지시된 분화에 대한 프로토콜을 3차원(3D) 전체 폐 오르가노이드(WLO)로 기술한다. LPC 단계에서 분류를 통해 폐 전구 세포의 절연을 통합하여 폐포-유사 14,15(distal) 오르가노이드 또는 기도를 만드는 유사한 접근법이 있지만, 16(근접) 오르가노이드, 또는 폐포 세포와 중간엽 마커 및 버드 팁 선조 오르가노이드를 발현하는 인간 폐 오르가노이드를 만들기 위해 복부 전방 전구 스페로이드를 생성합니다17 , 이 방법의 강도는 폐 상피 및 중간엽 세포 유형을 패턴화하여 체외에서 폐 분지, 성숙 및 확장을 조율하는 것이다.
이 프로토콜은 작은 분자와 성장 인자를 사용하여 최종 엔데름, 전방 전방 배구 내분 및 폐 선조 세포를 통해 다능성 줄기 세포의 분화를 지시합니다. 이 세포는 그 때 분기및 성숙을 포함하여 중요한 발달 단계를 통해 3D 전체 폐 오르가노이드로 유도됩니다. 분화 프로토콜의 요약은 도 1b 에 도시된 내분피 및 오르가노이드 분화의 대표적인 브라이트필드 이미지와 함께 도 1a에 도시된다. 도 1c,d 는 분화를 완료한 후 폐 상피 세포의 근위 및 탈모 집단의 유전자 발현뿐만 아니라 내피 분화의 유전자 발현 세부 사항을 보여준다.
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Protocol
이 연구 프로토콜은 UCSD의 인간 연구 보호 프로그램 (181180)의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 유도 만능 줄기 세포에서 최종 엔도드름 유도 (1 일 - 3)
- 천천히 해동 성장 인자 감소 (GFR)-지하 막 (BM) 매트릭스 배지 얼음에 30 분 전에 사용하기 전에. 감기 DMEM/F12에서, 혼합물은, GFR BM 매트릭스 배지를 희석시켜 이 매체의 50%를 구성한다. P1000 파이펫 팁을 냉동실에 놓아 사용하기 전에 식힙니다.
- 얼음 차가운 DMEM/F12로 제조된 500 μL의 500 μL의 500 μL로 12웰 플레이트의 각 웰을 코팅합니다. 원하는 수의 우물이 코팅되면, 우물에서 여분의 중간 혼합물 및 /또는 거품을 제거하고 20 분 동안 얼음이나 냉장고에 접시를 놓습니다. 그런 다음, 접시를 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이터로 이동하여 겔화하고 건조시합니다.
- hiPSC가 70-90%의 연결성에 도달하면 해리 전에 10 μM의 Rho 관련 키나아제(ROCK) 억제제 Y-27632를 추가합니다. 매체를 흡기하고 인산염 완충식식염(PBS)으로 한 번 씻으세요. 세포 분리 배지(0.5mL/12웰 플레이트의 우물)를 첨가하여 hiPSC를 해리하고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 20분 동안 배양한다.
- 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 우물에 줄기 세포 패세이징 배지(표 1)의 0.5mL/12웰을 추가합니다. P1000 팁을 사용하여 세포를 부드럽게 세분하여 단일 셀 서스펜션을 얻습니다. 15 mL 원심분리기 튜브로 해리된 세포를 전송; 원심 분리기는 300 x g에서 5 분 동안.
- 10 μM ROCK 억제제(Y-27632)로 보충된 mTeSR Plus 배지의 1mL로 세포 펠릿을 흡인하고 재중단한다. 셀 수를 수행합니다. 12웰 GFR 지하 막 중간 코팅 플레이트의 웰 당 ROCK 억제제 Y-27632로 보충된 mTeSR 1mL에 2.0 x 105 hiPSC를 추가합니다. 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.
참고: 셀 파싱 번호는 셀라인당 최적화되어야 합니다. 도금 후 24 시간, 우물은 50 %-70 % 컨할 수 있어야합니다. - 1일째에는 mTeSR 플러스를 흡권하고 인간 활성제 A의 100 ng/mL과 GSK3β 억제제/Wnt 활성제 CHIR99021의 5 μM으로 보충된 최종 엔도드름(DE) 유도 매체(표 1)를 첨가한다.
참고: GSK3β 억제제/Wnt 활성제 CHIR99021을 가진 DE 매체는 성공적인 분화를 위해 1DE 유도의 20-24 시간 이내에 제거되어야 합니다. - 2일과 3일째, 100 ng/mL의 활성제 A로 보충된 DE 유도 매체로변경합니다.
참고: DE 분화는 총 72h를 초과해서는 안되며 효능이 감소합니다. 4일째, 대형 세포 다이오프가 관찰되면 총 DE 미디어 노출 시간을 6-12h감소시. - DE 효율을 분석하기 위해 FOXA2 및/또는 SOX17의 유동 세포측정 또는 면역 형광 분석을 통해 90% 이상의 CXCR4 및/또는 cKit 발현을 확인합니다(그림 2a).
2. 전방 전구 배분 (AFE) 유도 (4 일 - 6)
- 4일째에는 AFE 유도용 10μM SB431542 및 2μM 도르소모핀으로 보충된 무분유 기저형(SFBM)(표 1)으로 배지를 변경합니다. 매일 AFE 미디어를 3일(일4일, 5일, 6일)에 변경합니다.
- AFE 효율을 분석하려면 면역 형광 염색 (도 2b)을 통해 SOX2, TBX1 및 FOXA2의 강력한 발현을 확인합니다.
3. 폐 전구 세포 (LPC) 분화 (7 일 - 16)
- 7일째, 얼음 에 GFR 지하 막 매트릭스 배지를 해동. AFE 미디어를 흡입하고 1배 PBS로 잘 씻으세요. 세포 분리 용액 1mL을 추가하고 37 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 담금질 매체 1mL(DMEM/F12의 2% FBS)를 세포 분리 용액을 함유하는 우물에 추가합니다. 셀을 위아래로 부드럽게 배관하여 응집체로 유지합니다. 모든 세포가 15mL 원심분리기 튜브로 분리되어 전달되는지 확인하십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상체를 제거하고 인간 재조합 골 형태 호르몬-4(BMP4), 0.1 μM 의 모든 트랜스 망막산(RA), GSK3β 억제제/Wnt 활성제 CHIR99021, 및 10μM의 10μm-암분억제제로 보충된 담금질 매체에서 세포 펠릿을 재중단한다.
- 셀 수를 수행합니다. 2.5 x 105 셀을 차가운 GFR 지하 막 매트릭스 배지의 100 μL에 넣고 잘 섞고 물방울을 12웰 플레이트의 우물에 놓습니다. 배지가 중합할 수 있도록 37°C에서 30-60분 동안 플레이트를 배양한다. 1mL의 LPC 미디어를 추가하여 10 μM의 ROCK 억제제 Y-27632를 잘 추가하여 중간 낙하가 완전히 침수되고 하룻밤 사이에 37°C에서 배양할 수 있도록 합니다.
- LPC 유도 후 8, 24 시간, ROCK 억제제 Y-27632를 제거하기 위해 LPC 매체를 변경합니다. 총 9-11일 동안 LPC 배지를 격일로 변경합니다.
참고: 매체가 24시간 이내에 노란색이 되면 매일 매체를 변경합니다. - LPC 효율을 분석하기 위해 세포내 전사 인자 NKX2-1의 견고한 발현을 확인하거나 표면 마커 CD47hi/CD26low15 또는 CPM18(도 2c)에 대한 유동 세포측정을 수행한다. 심하게, LPC 스페로이드는 둥글고 투명해야한다 (그림 2c).
참고: NKX2-1의 효율이 30% 미만인 경우 폐 오르간노이드 분화를 진행하지 마십시오.
4.3D 폐 오르간성 유도 (16일 - 22일)
- 17일째, 얼음 위에 GFR 지하 막 매트릭스 배지를 해동합니다. LPC 유도 매체를 흡인합니다. 그런 다음 2 μg/mL의 디스파제(1mL)를 우물에 넣고 P1000 파이펫으로 중간/디스파제 혼합물을 다시 분리한다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 혼합물을 다시 트리튜트하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 디스파제와 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기다. 차가운 PBS (2-3 mL)를 사용하여 우물을 씻고 디스파스 / 셀 혼합물을 다시 중단하십시오. 원심 분리기는 400 x g에서 5 분 동안. 수동으로 중간 /세포 펠릿 층을 분리하지 않도록주의하여 상체를 제거하십시오. 차가운 PBS 세척을 반복하고 원심 분리기 튜브를 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
- 상체를 수동으로 제거한 다음 원추형 원심분리기 튜브에 트립신 기반 해리 솔루션 2mL을 추가합니다. 37°C에서 12분 동안 배양합니다.
- 인큐베이션 후 P1000 파이펫 끝으로 셀을 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 원물 원심 분리기 튜브에 동일한 양의 담금질 미디어를 추가하고 5 분 동안 400 x g 로 회전합니다. 슈퍼칸트와 암석 억제제 Y-27632의 담금질 배지 + 10 μM에서 세포를 재흡입한다.
참고: 성공적인 폐 오르가노이드 유도는 세포가 단일 세포가 아닌 응집체로 내장될 때 발생하며, 그에 따라 파이펫팅을 조정합니다. - 셀 수를 수행합니다. 우물당 5.0-8.0 x 104 셀을 얻는 데 필요한 부피를 계산합니다. AliquotLPC 세포는 400 x g에서 5 분 동안 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브및 원심 분리기로 집계 됩니다. 세포 펠릿을 동요하지 않도록 주의하면서 과도한 상신제제거합니다. 잔류 용지의 10 μL만 둡니다.
- 감기 GFR-지하 막 매트릭스 배지의 200 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 세포 배양 막 인서츠(직경 6.5mm, 0.4 μm 모공, 폴리에스테르 멤브레인)에 첨가한다. GFR-지하 멤브레인 매트릭스 배지가 중합할 수 있도록 37°C에서 30-60분 동안 플레이트를 배양한다.
- 섬유아세포 성장 인자-7(FGF7) 7(10 ng/mL), FGF10(10 ng/mL), GSK3β 억제제/Wn으로 보충된 3D 오르간성 유도 매체(표 1)의 1mL추가 CHIR(3 μM), 표피 성장 인자(EGF) (10 ng/mL), 및 멤브레인 삽입의 바칼탈 챔버에 대한 ROCK 억제제 Y-27632의 10 μM. 6일 동안 격일로 배지를 변경합니다.
5.3D 폐 오르가노이드 분기 (23 일 - 28 일)
- FGF7(10 ng/mL), FGF10(10 ng/mL), GSK3β 억제제/Wnt 액티비티어 CHIR9902로 보충된 3D 분기 매체(표 1)로 의 변경 11 (3 μM), RA (0.1 μM), EGF (10 ng/mL), 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) / 태반 성장 인자 (PlGF) (10 ng/mL). 6일 동안 격일로 배지를 변경합니다.
참고: 3D 분기 분화 분화의 6일째에는 여러 분기 오르가노이드가 있어야 합니다(그림 2).
6.3D 폐 오르간성 성숙 (29 일 - 34 일)
- 29일째에는 3D 분기 매체와 동일하지만 덱사메타손(50nM), cAMP(100 μM), 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX), 인포디세라이제 억제제(IBMX) 및 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX) 및 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX) 및 3-이소비제세라이체 억제제(Ibutylxthin)의 첨가와 동일하여 3D 성숙 배지(표 1)로 변경한다. 6일 동안 격일로 배지를 변경합니다.
참고: 3D 성숙 후 24시간 이내에 분기 오르가노이드가 투명 구체로 확장되고 변경되어야 합니다.
7.3D 폐 오르간성 면역 세포 화학
- 3D 전체 폐 오르가노이드 분석을 위해, 4°C에서 1h에 대한 4% 파라포름알데히드(PFA)로 멤브레인 삽입물에서 GFR-지하 막 매트릭스 배지를 수정한다. 파라핀 왁스에 포함되고 표준 게시된 프로토콜당 슬라이드에 장착합니다.
- 염색하기 전에 항원 검색을 수행합니다. 기도 마커는 KRT5, MUC5AC 및 SCGB3A2를 포함한다. 폐포 마커는 SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 및 HOPX(그림 3)를 포함한다.
8. 통로, FACS 또는 냉동 보존을 위한 GFR 지하 막 매트릭스 배지에서 전체 폐 오르가노이드 제거
- GFR-지하 멤브레인 매트릭스 배지에서 오르가노이드를 분리하려면 기저 챔버에서 미디어를 제거하고 apical 챔버에 2 μg/mL의 디스파스(1mL)를 추가한다.
- P1000 파이펫으로 중간/디스파제 혼합물을 부드럽게 세리팅하고 인큐베이터에 15분 동안 배치합니다. 혼합물을 부드럽게 세리트리트하고 15분 동안 배양합니다.
- 1mL의 차가운 PBS(4°C)를 추가하고 매트릭스 배지로 오가노이드를 15mL 원심분리기 튜브로 옮춥니다. 5 분 동안 400 x g 에서 회전합니다. 셀 펠릿을 방해하지 말고 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
- 1mL 냉장 PBS로 한 번 더 씻고 400 x g 에서 5 분 동안 회전하십시오. 중간/세포 혼합물을 방해하지 말고 주관체를 조심스럽게 제거하십시오.
- 원추형 원심분리기 튜브에 1mL의 세포 분리 용액을 추가하고 GFR-지하 막 매트릭스 배지/세포 혼합물을 부드럽게 세자리로 처리합니다. 인큐베이터에 12분 동안 세포를 응집체 또는 냉동 보존용으로 배치하거나 단일 세포 현탁액에 대해 20분 간 배치하십시오.
- 담금질 매체의 동일한 볼륨을 추가하고 5 분 동안 400 x g 에서 아래로 회전합니다. 담금질 매체 + 10 μM의 ROCK 억제제 Y-27632에서 재연한다.
참고: 이 단계에서는 남은 지하 막 배지가 튜브에서 볼 수 없습니다. 잔여 매체가 남아 있으면 8.5 및 8.6 단계를 반복하십시오. - 셀 수를 수행합니다. 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 볼륨을 계산합니다.
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Representative Results
도금 후 24시간, 1일째, iPSC는 50%-90%의 컨할 수 있어야 합니다. 2일째에 DE는 90%-95%로 응모해야 합니다. DE 유도 하는 동안, 그것은 일반적인 세포 죽음을 관찰 하는 4 4 하지만 부착 된 세포는 소형 조약 돌 형태를 유지 합니다 (도 2b). 대부분의 부착 세포가 분리되고 활성 A를 사용하여 DE 미디어에 대한 노출을 6-12 h로 단축하는 것을 고려하는 경우 분화를 중단합니다. AFE 유도 하는 동안, 세포 죽음은 최소한의, 그리고 세포는 준수 남아, 하지만 더 작고 더 이질적 나타납니다. 7일째에 세포를 전달하는 것은 이중 양성 SOX2와 FOXA2의 수율이 >80%인 경우에만 이루어져야 합니다. 3D LPC 유도를 위한 지하 막 매트릭스로 전달한 후, 작은 스페로이드가 먼저 나타나고, 성장하고 일부는 분기를 시작할 수 있습니다. 성공적인 내피 분화를 위한 유전자 발현 프로파일은 SOX2 및 FOXA2의 존재와 함께 SOX17 증가, FOXA2 및 SOX2증가, SOX17 감소및 NKX2-1의 첫 등장, NKX2-1 증가 등이 포함된다. 초기 배아 발달과 일치, 폐 싹 개발을 위한 AFE의 복부 (NKX2-1+) 및 위장 개발을 위해 AFE의 등쪽화가 발생 (SOX2+). LPC의 배양은 폐와 위 선조모두의 혼합을 가질 것입니다.
LPC로부터의 폐 오르가노이드 유도는 다양한 방법을 사용하여 수행되고 있다. 일부 그룹은 NKX2-1 형광 기자 또는 표면 항원 프록시(CPM, CD26lowCD47high)를 사용하여 세포를 정렬합니다. 그러나 그 폐 오르가노이드는 폐포 타입 I 세포 또는 mesenchyme 없이 세포 같이 폐포 형 II를 포함합니다. 다른 그룹은 AFE /LPC 단층떨어져 싹 세포 덩어리를 수집하고 지하 막 매트릭스에 내장. 그 오르가노이드는 폐 상피 및 중간 엽 세포의 혼합 된 인구를 포함하지만 culture19에 개월이 걸릴. 우리의 프로토콜은 상피 세포와 중간 엽 세포의 존재를 모두 포함합니다. WlOs는 근접 상피 세포 마커 p63 및 KRT5(기저 세포) 및 SCGB3A2(클럽 셀)뿐만 아니라 황실 상피 세포 마커 HOPX(ATI) 및 proSPC, SPB 및 NKX2-1(ATII)을 발현한다. 그(것)들은 또한 LPC 단계에서 중간엽 마커 Vimentin를, 뿐만 아니라 전체 폐 오르가노이드에서 표현합니다. PDGFRα는 세포 분화 및 폐포화 20 동안 폐에서 중요한 기능을 갖는 섬유아세포에 대한 마커이며, 탈구 세포 분화에서 중요한 전사 인자와 함께 호발화된다, SOX9 (도 3).
우리의 방법은 태아 폐 발달에서 발생하는 신호 분자를 사용하여 NKX2-1 발현 LPC 3D 배양을 효율적으로 생성하여 초기 폐 오르가노이드를 형성합니다. 폐 오르가노이드 유도를 위한 GFR-지하 막 매트릭스 배지로 LpC를 통과할 때, 단일 세포 현탁액으로 과도하게 해리하는 것이 아니라 세포의 작은 덩어리(10세포/덩어리)를 유지하는 것이 필수적입니다. 세포 계수는 완전히 정확하지 는 않지만 3 주 폐 오르가노이드 분화 중에 과잉 합류를 피해야합니다.
폐 오르가노이드 유도는 유도의 6 일째 (분화의 일 23)에 의해 작은 분기 오르가노이드를 산출한다. 이들은 오르가노이드 분기 단계 및 성숙 단계 도중 계속 성장해야 합니다. 덱사메타손, cAMP 및 IBMX가 도입된 지 24시간 후, 지점은 투명한 구체로 확장되어야 합니다. 전체 폐 오르가노이드 분석은 분화의 끝에서 수행 될 수있다, 또는 WlO는 GFR과 신선한 지하 막 매트릭스로 통과 하거나 10 % DMSO에서 동결하여 냉동 보존 될 수있다.
그림 1: 전체 폐 오르가노이드(WLO) 분화(WLO) hiPSC 및 대표 데이터로부터의 전체 회로도. (a) HPSC로부터의 WLO 분화의 회로도. 원은 식별 마커와 내피 세포 유형을 나타냅니다. 차별화 타임라인은 검은색 막대로 표시됩니다. 내분피 및 폐 오르가노이드 집단의 유도를 위한 성장 인자 및/또는 작은 분자. 요약하자면, 줄기세포는 약 16일 내에 최종 엔데름, 전방 전구균 및 폐 전구세포로 분화된다. 이 세포는 그 때 중간 삽입을 포함하는 GFR-지하실 막 매트릭스 매체로 통과하고 폐 오르가노이드 유도, 분기 및 성숙을 겪습니다. 총 분화는 약 35 일이 걸립니다. (b) 전체 폐 오르가노이드의 주요 내피 단계 및 3D 이미지에서 세포의 대표적인 위상 대조 이미지. 패널에 표시된 대로 막대 크기를 조정합니다. (c) qRT-PCR 내막 중 폐 발달 마커의 qRT-PCR 분석 및 (d) 전체 폐 오르가노이드 분화의 근위 및 말단 세포 마커. 모든 데이터는 평균 3-5개의 생물학적 복제를 나타냅니다. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타내며 actin으로 정규화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 유동 세포및 면역세포화학에 의한 내분화의 특성화. (a) 최종 내분 마커 CXCR4의 유동 세포측정. 왼쪽 패널은 중앙 패널이 CXCR4 양성 인구를 표시하는 동안 얼룩지지 않은 인구에 대한 게이팅을 보여줍니다. 오른쪽 패널은 핵(blue)으로 겹쳐진 SOX17(빨간색)의 면역세포화학 이미지를 나타낸다. (b) AFE 마커 FOXA2 및 SOX2의 면역 세포화학 이미지는 핵(blue)으로 오버레이된다. (c) 3D LPC에서 리포터 셀라인에서 NKX2-1-GFP의 내인성 발현. 밝은 필드와 GFP에서 라이브 세포 배양에서 찍은 이미지. 고정 및 투과화 후 폐 선조 내 마커 NKX2-1의 유동 세포측정. 스케일 바 크기 = 50 μM. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 3: 면역 세포화학에 의한 3주 분화 후 3D 전체 폐 오르가노이드의 특성화. (a) 근위 폐 마커. 왼쪽 패널은 핵(blue)에 의해 오버레이된 SOX2(흰색) 및 SOX9(빨간색)을 나타낸다. 이 마커는 형태 발생을 분기에 중요 하고 근위 및 말단 상피 집단을 나타냅니다. 중간 패널은 P63 (빨간색) 및 KRT5 (빨간색), 기저 세포의 두 마커를 보여줍니다. 오른쪽 패널은 클럽 셀의 마커인 SCGB3A2를 보여줍니다. (b) 탈장 폐 마커. 왼쪽 패널은 프로-SPC(PSPC), (녹색) 및 HOPX(빨간색), 폐포형 II 광고 I 세포의 마커를 각각 핵(blue)으로 오버레이한다. 중간 패널은 프로-SPC(PSPC) (녹색) 및 SPB(빨간색), 폐포형 II 세포의 마커, 핵(blue)으로 오버레이된 것을 나타낸다. 오른쪽 패널은 NKX2-1(빨간색) 및 ZO1(녹색)이 핵(파란색)으로 오버레이된 것을 보여줍니다. (c) 폐 메센키메의 마커. 왼쪽 패널은 PDGFRA(빨간색) 및 SOX9(흰색)을 나타내며, 이는 불강 적인 메센키메를 나타낸다. 오른쪽 패널은 폐 전체에 분산되는 비멘틴(빨간색)을 보여줍니다. 스케일 바 크기 = 50 μM. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
| 시약 및 솔루션 - 회사 이름은 재료 표 목록을 참조하십시오. |
| 3D 오르간노이드 유도 배지(17-22일째) |
| 세럼이 없는 기초 매체(레시피 참조)로 보충: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| EGF (10 ng/mL) |
| 3D 오르가노이드 분기 매체(23-28일) |
| 세럼이 없는 기초 매체(레시피 참조)로 보충: |
| FGF7 (10 ng/mL) |
| FGF10 (10 ng/mL) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| 전트랜스 망천산(0.1 μM) |
| EGF (10 ng/mL) |
| VEGF/PIGF (10 ng/mL) |
| 3D 오르간구성 성숙 배지(29-34일차) |
| 세럼이 없는 기초 매체(레시피 참조)로 보충: |
| 덱사메타손 (50 nM) |
| Br-cAMP (100 μM) |
| IBMX (100 μM) |
| AFE 유도 매체(4-6일차) |
| 세럼이 없는 기초 매체(레시피 참조)로 보충: |
| SB431542 (10 μM) |
| 도르소모르핀 (2 μM) |
| DE 유도 매체(1일1-3일) |
| 48.5 mL RPMI1640 + 글루타맥스 |
| 망동산 없음 1mL B27 |
| 500 μl HEPES (1%) |
| 500 μl 펜/스트렙 |
| 인간 액티비틴 A (100 ng/mL) |
| CHIR99021 (5 μM) - 처음 24 시간 만에 |
| LPC 유도 매체(7일~16일) |
| 세럼이 없는 기초 매체(레시피 참조)로 보충: |
| BMP4 (10 ng/mL) |
| 모든 트랜스 망장산 (RA) (0.1 μM) |
| CHIR99021 (3 μM) |
| 담금질 매체 |
| 49 mL DMEM/F12 |
| 1 mL FBS |
| 세럼 프리 기저형(SFBM) |
| 375 mL 이스코브의 수정된 덜벡코의 매체(IMDM) + 글루타맥스 |
| 125 mL 햄의 F12 |
| 망동산 이없는 5mL B27 |
| 2.5 mL N2 |
| 500 μl 아스코르브 산, 50 mg/mL |
| 13 μl 모노티오글리세롤/IMDM 1ml" 세럼 프리 미디어 100ml당 0.4mM 모노티오글리세롤 300ul 사용 |
| 3.75 mL 소 세럼 알부민 (BSA) 분수 V, 7.5% 용액 |
| 500 μl 펜/스트렙 |
| 줄기 세포 패세이징 배지(0일차) |
| 500 mL DMEM/F12 |
| 129 mL 녹아웃 세럼 교체 (KSR) |
| 6.5 mL 글루타맥스 |
| 6.5 mL NEAA |
| 1.3 mL 2-메르카토에탄올 |
| 6.5 mL 펜/스트렙 |
표 1: 미디어 테이블입니다.
| 문제 | 용액 |
| DE 분화 효율적이지 않음 | 줄기 세포 배지에서 도금 후 24 시간, 세포는 50-70 % 컨천이 있어야합니다 |
| GSK3β 억제제/Wnt 활성제 CHIR99021은 1DE 유도일의 20-24시간 이내에 제거되어야 합니다. | |
| DE 분화는 총 72시간을 초과해서는 안 됩니다. | |
| AFE 분화효율이 아닙니다. | DE 분화가 성공하고 세포가 > 80% CXCR4를 표현하도록 보장합니다. |
| 매일 미디어에 신선한 성장 인자/소분자가 추가되고 있는지 확인 | |
| LPC 차별화가 효율적이지 않음 | AFE 분화가 성공하고 세포가 > 80% FOXA2/SOX2를 표현하도록 보장합니다. |
| AFE 세포가 단일 셀이 아닌 4-10 세포의 응집체로 처리되었는지 확인합니다. | |
| 성장하거나 분화하지 않는 3D 폐 오르간노이드 | LPC 분화가 성공적이고 세포가 > 30% NKX2-1을 표현하도록 보장합니다. |
| 단일 셀이 아닌 4-10 셀의 집계로 CFC가 통과되었는지 확인합니다. | |
| 통과 하는 동안 LpC에서 잔여 matrigel 없는 지 확인 | |
| 각 미디어 변경과 함께 ROCK 억제제 Y-27632 추가 | |
| 미디어가 제 시간에 변경되고 신선한 성장 인자/소분자가 추가되었는지 확인합니다. | |
| 성장 인자/소분자의 농도가 올바른지 확인 |
표 2: 문제 해결.
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Discussion
3D 전체 폐 오르가노이드 (WLO)의 성공적인 분화는 성장 인자와 소분자에 노출되는 시간, 패세후 세포 밀도 및 hiPSC의 품질을 포함하여 세부 사항에주의를 기울여 다단계 6 주 프로토콜에 의존합니다. 문제 해결의 경우 표 2를 참조하십시오. hiPSC는 약 70%-80%의 컨할 수 있어야 하며, 해리 전에 5% 미만의 자발적인 분화를 해야 합니다. 이 프로토콜은 "mTeSR 플러스"매체를 요구합니다. 그러나, 일반 "mTeSR" 매체는 또한 비교 결과사용 하 고 저렴 한. 세포 외 매트릭스의 경우, 우리는 GFR 지하 막 매트릭스 배지를 사용합니다. 우리는 차별화를 줄이기 위해 ReLesR ( 재료의 표 참조)를 사용하여 hiPSC를 통과합니다.
엔도름 분화 중에 세포는 미디어 변경 전과 후에 매일 시각화되어야 합니다. 지정된 성장 인자/소분자는 조기 분해를 방지하기 위해 베이스 배지에 매일 신선하게 첨가해야 합니다. 최종 엔도름(DE)에서세포 사멸은 일반적이지만 전방 전구 내분 (AFE) 및 폐 전구 세포 (LPC) 유도 중에 제한되어야한다. DE(4일째)의 셋째 날에 큰 다이가 있는 경우 총 DE 시간을 6-12시간으로 줄입니다. 새로운 iPSC 세포주 성공적인 엔도드름 분화에 최적화해야 할 수도 있습니다. 성공적인 유도(>85% CXCR4 + 세포)를 확인하기 위해 CXCR4용 DE에서 유동 세포측정을 수행합니다. 세포는 AFE에서 상대적으로 안정되어야 하며 거의 죽지 않은 채 형태학적으로 변질됩니다.
LPC로 의지는 셀 유형에 최적화해야 하는 또 다른 프로세스입니다. 밀도가 너무 낮음(<50%)으로 세포를 투석하면 비효율적인 분화를 초래할 수 있습니다. CPM18 또는 CD26low/CD47high15용 NKX2-1 또는 유량 세포측정을 위한 면역 세포화학으로 성공적인 LPC 유도를 확인합니다. 성공적인 LPC 유도는 >40% NKX2-1이 있어야 하며, 그렇지 않으면 오르간 AFE가 더 풍부합니다. LPC 유도의 경우 각 미디어 변경과 함께 기본 미디어에 성장 요소를 추가해야 합니다. 나중에 미디어가 LPC 유도에 노란색이 되면 신선한 미디어의 볼륨을 늘리거나 매일 미디어를 변경하는 것이 좋습니다. 3D 전체 폐 오르가노이드 유도 동안 도금 수와 세포 클러스터 유지가 성공적인 오르가노이드 성장의 핵심입니다. GFR 지하 멤브레인 매트릭스 매체는 다루기 어렵고 온도가 매우 민감하므로 항상 얼음 위에 보관하십시오. GFR-지하 막 매트릭스 배지 가 너무 일찍 젤하는 경우, LPC 세포는 그 안에 통합되지 않습니다. 통과 하기 전에 얼음에 GFR 지하 막 매트릭스 매체의 1 mL 알리쿼트 를 해동 하는 것이 좋습니다. 세포/클러스터가 계산되고 적절한 알리쿼트가 만들어지면 세포 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. GFR-지하 막 매트릭스 배지 처리 전에 플레이트, 라벨링 및 세포 배양막 인서트를 추가하는 것이 좋습니다.
파이펫 팁을 사용하여 액체 GFR 지하 멤브레인 매트릭스 배지를 즉시 세포 펠릿에 추가하여 얼음을 유지합니다. 피펫은 거품을 소개하지 않고 튜브를 얼음에 다시 놓습니다. 셀 및 GFR 지하 막 매트릭스 배지 혼합물을 준비된 플레이트에서 트랜스웰의 정량 부분에 첨가한다. 혼합물은 전체 트랜스웰을 확산하고 코팅해야합니다. 부드럽게 코팅을 보장하기 위해 접시를 기울입니다. 인큐베이터에서 30-60분 동안 겔화한 후, GFR-지하 막 매트릭스 배지에 보이는 세포 클러스터가 있어야 한다. 10 μM ROCK 억제제 Y-27632로 보충된 기초 챔버에 적절한 폐 유도 매체를 추가하고 격일로 오르가노이드 성장을 모니터링합니다.
이 프로토콜에 의해 생성된 오르가노이드의 미래 응용 은 초기 폐 계보 약정 및 세포 운명 사양21,22,23을 제어하는 분자 경로를 연구하는 것을 포함한다. 상피와 메센키메 사이의 상호 작용은 모델을 노크유전자를 활용하여 결정될 수 있다24. 오르가노이드는 또한 폐 상피, 메센키메 및 내피성25 사이의 조직 특정 공동 패턴 신호의 중요성을 결정하기 위해 내피 세포와 공동 배양될 수 있다. 폐 발달은 혈관 발달과 병행하여 생기고 그 관계는 적당한 폐 발달을 위해 필요한 중요한 분자 기계장치를 이끌어 내는 수 있습니다. 또한 이러한 전체 폐 오르가노이드는 GFR-지하 막 매트릭스 배지를 제거한 후 계면활성분비 애서를 통해 기능성이 있는 것으로 나타났으며, 이어서 초저부착 유정에서 단기 배양에 이어 있다26. 그밖 전략은 NGFR (기저 세포)27 및 HTII-280 (ATII 세포)28과 같은 세포 표면 마커를 위한 세포를 분류하고 공기 액체 상 배양 조건에서 균일한 오르가노이드 또는 단층으로 대체하는 것을 포함합니다. COVID-19에 대항할 수 있는 약물을 더 잘 이해하고 선별하기 위해 SARS-CoV-2 바이러스 감염의 세포 표적 및 병리학을 연구하기 위해 전체, 근위 및 탈탈 폐 오르가노이드가 사용되었습니다.
이 프로토콜은 강력하고 재현 가능하지만 여전히 많은 문제가 있습니다. 많은 다른 iPSC 및 ESC 라인이 테스트되었지만 (>20 라인) 프로토콜은 각 세포줄에 최적화되어야합니다. 강력한 DE 및 AFE 유도에도 불구하고 LPC 유도는 NKX2-1 + 세포의 >40%를 달성하기 어려울 수 있습니다. 그밖 프로토콜은 NKX2-1 세포의 표면 마커를 위한 선별 단계를 포함합니다15,18, 그러나 그만 폐구없이 오르가노이드 같이 폐포 타입 II를 산출하고 폐 선조 인구를 정화에도 불구하고 여전히 위 및 간 세포 집단을 포함29. 우리는 또한 LPC와 전체 폐 오르가노이드 둘 다에 있는 위 및 간 세포의 소량을 주의했습니다, 아마도 LFC를 오염시키는 등쪽 전방 전주 세포의 존재 때문일 수 있습니다. 따라서 순수한 폐 오르가노이드의 분화는 아직 달성되지 않았으며, 인간 조직에서 폐 전구 세포의 개발에 대한 더 많은 연구가 완료되어야 합니다. 다운스트림 어약은 1차 인간 폐 조직에서 유전자 및 단백질 발현으로 적극적으로 벤치마킹되어야 합니다. 현재까지 폐 오르가노이드의 가장 유익한 사용은 시험관내 약물의 약물 모델링 및 검진에 있었지만, 회생 의학을 위한 환자로 hiPSC 유래 폐 오르가노이드를 이식하는 것은 다양한 조건에 대한 미래 치료법으로 고려되고 있다. 그러나, 이러한 개입을 고려하기 전에, 오염의 식별 및 제거를 포함하여 품질 관리의 좋은 거래를 완성해야합니다, 바람직하지 않은, 잠재적으로 종양성 hiPSC 유도체. 게다가, 체외에서 더 나은 기능적인 assays 및 폐 질병의 더 나은 동물 모형은 아직도 개발될 필요가 있습니다.
특히, hiPSC 유래 세포의 기능및 안전성을 확인해야 한다. 미분화 세포는 기종절을 생성할 수 있는 능력을 가지고 있기 때문에 배제될 필요가 있습니다. 최종 내분증 줄기 세포를 결정하는 한 가지 방법은 Pluripotency 마커 SSEA4를 사용하여 세포를 분류하는 것입니다. 미분화 hiPSC에 대한 마커 유전자는 최근 단세포 RNA 시퀀싱30을 사용하여 검출되었다. ESRG, CNMD 및 SFRP2를 사용하여 임의의 분화 단계에서 미분화 세포를 검증할 수 있습니다. 순도가 확인되면, 자가 iPSC 파생 치료법의 이점은 이식된 세포가 환자의 세포에서 왔기 때문에 거부를 피할 수 있는 능력입니다. 단점은 세포를 완전히 분화하고, 엄격한 임상 등급 검사를 받고, 급성 상해를 가진 환자로 세포를 이식하는 데 걸리는 시간을 포함합니다 (호흡 곤란 증후군, 심근 경색 또는 척추 부상). 대안은 뱅크된 동종 iPSC 유래 세포를 활용하는 것입니다31. 이들은 저장되고 인간 백혈구 항원 (HLA) 일치하는 기증자를 가진 환자를 위해 쉽게 유효할 수 있고 오염을 위한 철저한 시험을 겪게 될 것입니다. 가장 큰 단점은 면역 거부의 가능성입니다. 동종 세포 이식에 면역 억제가 필요할 수 있으며, 이는 동종 전체 조직 이식의 현재 현실이다. 동종 iPSC 유래 세포가 환자로 안전하게 이식하여 면역 반응을 회피할 수 있도록 전략이 고안되고 있다32.
결국, iPSC 유래 전체 폐 오르가노이드는 환자 특정 질병 모델을 연구하고, 치료법을 조정하고, 재생 의학 연구를 향상시키기 위해 활용될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 재생 의학에 대 한 캘리포니아 연구소에 의해 지원 되었다 (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A.
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X.
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C.
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
