Control de la geometría celular a través de micropatterning asistido por láser infrarrojo
Summary
El protocolo presentado aquí permite la fabricación automatizada de micropatrones que estandariza la forma celular para estudiar las estructuras citoesqueléticos dentro de las células de mamíferos. Esta técnica fácil de usar se puede configurar con sistemas de imágenes disponibles en el comercio y no requiere equipos especializados inaccesibles a los laboratorios de biología celular estándar.
Abstract
Micropatterning es una técnica establecida en la comunidad de la biología celular usada para estudiar las conexiones entre la morfología y la función de compartimientos celulares mientras que evita las complicaciones que se presentan de variaciones naturales de la célula-a-célula. Para estandarizar la forma de las células, las células se confinan en moldes 3D o se controlan para la geometría adhesiva a través de islas adhesivas. Sin embargo, las técnicas tradicionales de micropatterning basadas en la fotolitografía y el grabado UV profundo dependen en gran medida de salas limpias o equipos especializados. Aquí presentamos una técnica de micropatterning asistida por láser infrarrojo (microphotopatterning) modificada de Doyle et al. En este protocolo, utilizamos un sistema de imágenes Nikon A1R MP + para generar micropatrones con precisión de micras a través de un láser infrarrojo (IR) que ablaciona regiones preestablecidas en cubiertas recubiertas de alcohol poli-vinílico. Empleamos un script personalizado para permitir la fabricación automatizada de patrones con alta eficiencia y precisión en sistemas no equipados con un enfoque automático de hardware. Mostramos que este ir láser asistido micropatterning (microphotopatterning) protocolos de protocolo da como resultado patrones definidos a los que las células se unen exclusivamente y tomar la forma deseada. Además, los datos de un gran número de celdas se pueden promediar debido a la estandarización de la forma de la celda. Los patrones generados con este protocolo, combinados con imágenes de alta resolución y análisis cuantitativo, se pueden utilizar para pantallas de rendimiento relativamente alto para identificar reproductores moleculares que median el vínculo entre la forma y la función.
Introduction
La forma celular es un determinante clave de procesos biológicos fundamentales como la morfogénesis tisular1,la migración celular2,la proliferación celular3y la expresióngénica 4. Los cambios en la forma celular son impulsados por un intrincado equilibrio entre los reordenamientos dinámicos del citoesqueleto que deforma la membrana plasmática y factores extrínsecos como las fuerzas externas ejercidas sobre la célula y la geometría de las adherencias célula-célula y célula-matriz5. La migración de células mesenquimales, por ejemplo, polimeriza una densa red de actina en el borde de ataque que empuja la membrana plasmática hacia adelante y crea una amplia lamellipodia6,mientras que la contractilidad de actomiosina retrae el estrecho borde final de la célula para separar la célula de su posición actual7,8. La interrupción de los eventos de señalización que dan lugar a tales estructuras citoesqueletas especializadas perturba la forma y la polaridad y ralentiza la migración celular9. Además, la flexión de la lámina epitelial durante la gastrulación requiere una constricción apical basada en actomiosina que hace que las células y sus vecinos se conviertan en forma de cuña10. Aunque estos estudios destacan la importancia de la forma celular, la heterogeneidad inherente en la forma celular ha obstaculizado los esfuerzos para identificar mecanismos que conectan la morfología con la función.
Con este fin, en las últimas tres décadas se han desarrollado numerosos enfoques para manipular la forma celular. Estos enfoques logran su objetivo, ya sea mediante la restricción de la célula con un molde tridimensional o el control de la geometría de adhesión celular a través de la deposición modelada de proteínas de la matriz extracelular (ECM) en una superficie antiincrusta, una técnica denominada micropatterning11. Aquí vamos a revisar una serie de técnicas que han ganado popularidad a lo largo de los años.
Originalmente pionera como un enfoque para aplicaciones microelectrónicas, la impresión de microcontacto basada en litografía suave se ha convertido inequívocamente en una de las favoritas de culto12. Una oblea maestra se fabrica primero exponiendo selectivamente áreas de un sustrato de silicio recubierto de fotorresistencia a la fotorradiación, dejando atrás una superficie estampada13. Un elastómero, como pdms, se vierte entonces sobre la oblea maestra para generar un “sello” suave que transfiere las proteínas ECM a un sustrato deseado11,14. Una vez fabricada, una oblea maestra puede ser utilizada para fundar muchos sellos PDMS que dan lugar a micropatrones altamente reproducibles12. Sin embargo, los patrones no se pueden ajustar fácilmente debido al largo proceso de fotolitografía. Este proceso también requiere equipos altamente especializados y salas blancas que normalmente no están disponibles en los departamentos de Biología.
Más recientemente, la impresión directa usando UV profundo se ha divulgado para eludir las limitaciones planteadas por acercamientos litografía-basados tradicionales. La luz UV profunda se dirige a través de una fotomáscara a áreas selectivas de una cubierta de vidrio recubierta con poli-L-lisina-injertado-polietilenglicol. Los grupos químicos expuestos a los rayos UV profundos son fotoconvertidos sin el uso de enlazantes fotosensibles para permitir la unión de proteínas ECM15. La falta de enlazadores fotosensibles permite que las cubiertas estampadas permanezcan estables a temperatura ambiente durante más de sietemeses 15. Este método evita el uso de salas blancas y equipos de fotolitografía y requiere una capacitación menos especializada. Sin embargo, el requisito de fotomáscaras todavía plantea un obstáculo sustancial para los experimentos que requieren cambios fácilmente disponibles en los patrones.
Además de los métodos que manipulan la geometría celular a través de la deposición controlada de proteínas ECM en una superficie 2D, otros buscan controlar la forma de la célula mediante la confinación de las células en microestructuras 3D. Muchos estudios han adaptado el enfoque basado en litografía blanda descrito anteriormente para generar cámaras PDMS 3D, en lugar de 2D, para investigar procesos biológicos dependientes de la forma en embriones, bacterias, levaduras y plantas16,17,18,19. La polimerización de dos fotones (2PP) también ha tomado la delantera como una técnica de microfabricación que puede crear complejos andamios de hidrogel 3D con resolución nanométrica20. 2PP se basa en los principios de la adsorción de dos fotones, donde dos fotones entregados en pulsos de femtosegundo son absorbidos simultáneamente por una molécula – fotoiniciador en este caso – que permite la polimerización local de fotopolímeros21. Esta técnica ha sido muy empleada para imprimir andamios 3D que imitan las estructuras nativas de ECM del tejido humano y se ha demostrado que induce un bajo daño fotoquímico a las células22.
El debut del microfotopatterning hace 10 años dio a los investigadores la oportunidad de fabricar micropatrones evitando equipos inaccesibles y especializados. Microphotopatterning crea patrones en la escala de micras mediante la eliminación térmica de regiones selectivas de alcohol poli-vinílico (PVA) recubierto en superficies de vidrio activadas utilizando un láser infrarrojo23,24. Las proteínas ECM que se unen solo a la superficie de vidrio subyacente y no a PVA sirven como señales bioquímicas para permitir la dinámica de propagación controlada y la forma celular. Este método también ofrece una flexibilidad superior, ya que los patrones se pueden cambiar fácilmente en tiempo real. Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso de microfotopatterning mediante el uso de un sistema comercial de imágenes multi-fotón. El protocolo descrito está diseñado para la fabricación rápida y automatizada de patrones grandes. Hemos demostrado que estos patrones controlan eficientemente la forma de la célula mediante la restricción de la geometría de las adherencias célula-ECM. Finalmente, se demuestra que la técnica de patroneo descrita modula la organización y dinámica del citoesqueleto de actina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los resultados anteriores demuestran que el protocolo descrito de micropatterning asistido por láser IR (microphotopatterning) proporciona patrones adherentes reproducibles de varias formas que permite la manipulación de la forma celular y la arquitectura citoesquelético. Aunque se han desarrollado numerosos métodos de micropatterning tanto antes como después del debut del microfotopatterning, este método posee varias ventajas. En primer lugar, no requiere equipos especializados y salas blancas que generalmente sol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Premio al Nuevo Investigador del Fondo Connaught a S.P., la Fundación Canadiense para la Innovación, el Programa de Subvenciones Discovery de NSERC (subvenciones RGPIN-2015-05114 y RGPIN-2020-05881), el Fondo conjunto de investigación de la Universidad de Manchester y la Universidad de Toronto, y el Programa XSeed de la Universidad de Toronto. C.T. recibió el apoyo de la beca NSERC USRA.
Materials
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
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