Summary
Macropinocytosis هي عملية داخل الخلايا محفوظة للغاية تبدأ من خلال تشكيل إسقاطات غشائية غنية بالصفائح F-actin ، والمعروفة أيضا باسم كشكشة الغشاء. وقد تورط معدل زيادة الاستيعاب المذاب macropinocytotic في مختلف الظروف المرضية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لقياس تكوين كشكشة الغشاء في المختبر باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.
Abstract
كشكشة الغشاء هي تكوين نتوءات غشاء البلازما المتحركة التي تحتوي على شبكة من خيوط الأكتين المبلمرة حديثا. قد تتشكل الكشكشة الغشائية تلقائيا أو استجابة لعوامل النمو والسيتوكينات الالتهابية واسترات الفوربول. قد يعاد تنظيم بعض نتوءات الغشاء في كشكشة غشائية دائرية تندمج في هوامشها البعيدة وتشكل أكوابا تغلق وتنفصل في السيتوبلازم على شكل فجوات كبيرة غير متجانسة تسمى macropinosomes. أثناء هذه العملية ، تحبس الكشكشة السائل خارج الخلية والمذابات التي تستوعب داخل macropinosomes. المجهر الإلكتروني الماسح عالي الدقة (SEM) هو تقنية تصوير شائعة الاستخدام لتصور وقياس تكوين كشكشة الغشاء ، والنتوءات الدائرية ، وأكواب المحببات الكبيرة المغلقة على سطح الخلية. يصف البروتوكول التالي ظروف زراعة الخلايا ، وتحفيز تكوين كشكشة الغشاء في المختبر ، وكيفية إصلاح الخلايا وتجفيفها وإعدادها للتصوير باستخدام SEM. كما يتم وصف القياس الكمي لكشكش الغشاء ، وتطبيع البيانات ، والمحفزات والمثبطات لتشكيل كشكشة الغشاء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول دور ندرة الخلايا الكبيرة في العمليات الفسيولوجية والمرضية ، والتحقيق في الأهداف الجديدة التي تنظم تكوين كشكشة الغشاء ، وتحديد المحفزات الفسيولوجية غير المميزة حتى الآن بالإضافة إلى مثبطات دوائية جديدة ل macropinocytosis.
Introduction
Macropinocytosis هي عملية endocytic مسؤولة عن استيعاب كمية كبيرة من السائل خارج الخلية ومحتواه عن طريق تشكيل نتوءات غشاء البلازما الديناميكية والمدفوعة بالأكتين والتي تسمى كشكشة الغشاء1. تشكل العديد من هذه الكشكشة الغشائية أكوابا تغلق وتندمج مرة أخرى على الخلية وتنفصل عن غشاء البلازما كإيدوسومات كبيرة غير متجانسة داخل الخلايا تعرف أيضا باسم macropinosomes1. على الرغم من أن ندرة الخلايا الكبيرة تسببها عوامل النمو مثل عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) وعامل نمو البشرة (EGF) في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، فقد لوحظت أيضا عملية إضافية فريدة تعتمد على الكالسيوم تعرف باسم macropinocytosis التأسيسي في الخلايا المناعية الفطرية2،3،4،5،6،7،8.
وقد ثبت أن قدرة الخلايا على استيعاب المواد خارج الخلية عن طريق زيادة عدد الخلايا الكبيرة تلعب دورا مهما في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية التي تتراوح من امتصاص المغذيات إلى التقاط مسببات الأمراض وتقديم المستضد9،10،11. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه العملية غير انتقائية وقابلة للحث ، فقد تورطت أيضا في عدد من الحالات المرضية. في الواقع ، أشارت الدراسات السابقة إلى أن ندرة الخلايا الكبيرة تلعب دورا مهما في مرض الزهايمر ومرض باركنسون والسرطان وتحصي الكلية وتصلب الشرايين12،13،14،15،16. علاوة على ذلك ، أظهرت بعض البكتيريا والفيروسات أنها تستخدم ندرة الخلايا الكبيرة للدخول إلى الخلايا المضيفة والحث على العدوى17,18. ومن المثير للاهتمام ، يمكن أيضا استغلال تحفيز ندرة الخلايا الكبيرة للتسليم المستهدف للعوامل العلاجية في مختلف الظروف المرضية19,20.
وقد استكشفت الدراسات السابقة ندرة الخلايا الكبيرة عن طريق تحديد علامات الطور السائل الداخلية الموسومة بالفلورسنت في غياب ووجود عوامل دوائية تمنع ندرة الخلايا الكبيرة باستخدام قياس التدفق الخلوي والتصوير البؤري21,22. تقتصر الأدوات الدوائية المتاحة حاليا التي تمنع ندرة الخلايا الكبيرة على 1) مثبطات بلمرة الأكتين (cytochalasin D و latrunculins) ، 2) حاصرات PI3K (LY-290042 و wortmannin) و 3) مثبطات مبادلات هيدروجين الصوديوم (NHE) (أميلوريد و EIPA) 5،14،15،23،24،25 . ومع ذلك ، نظرا لأن هذه المثبطات لها تأثيرات مستقلة على كثرة الخلايا الداخلية ، فمن الصعب تحديد مساهمة زيادة عدد الخلايا الكبيرة بشكل انتقائي في امتصاص المذاب والتسبب في المرض خاصة في الجسم الحي21.
المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) هو نوع من المجهر الإلكتروني الذي ينتج صورا فائقة الدقة للخلايا باستخدام حزمة مركزة من الإلكترونات26. في أبحاث زيادة الوجهين ، يعتبر تصوير SEM تقنية قياسية ذهبية لتصور الخصائص الطبوغرافية والمورفولوجية لغشاء البلازما ، وتحديد تكوين كشكشة الغشاء ، والتحقيق في تقدمها نحو استيعاب macropinosome. وعلاوة على ذلك، فإن المجهر الإلكتروني الماسح جنبا إلى جنب مع التحديد الكمي لامتصاص المذاب، في وجود وغياب حاصرات كثرة الخلايا الكبيرة، يوفر استراتيجية موثوقة لفحص الاستيعاب المذاب في المختبر. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا حول كيفية تحضير الخلايا ل SEM ، وتصور سطح الخلية ، وتحديد تكوين الكشكشة ، وفحص تقدمها نحو إغلاق الكوب واستيعاب macropinosome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: فيما يلي بروتوكول عام يستخدم لقياس تكوين كشكشة الغشاء في البلاعم RAW 264.7 باستخدام الفحص المجهري SEM. قد يكون التحسين مطلوبا لأنواع الخلايا المختلفة.
1. خط الخلية وزراعة الخلايا
- تنمو البلاعم RAW 264.7 في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ (vol / vol) مصل البقر الجنيني المعطل حراريا (FBS) ، و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استبدال وسائط النمو كل يومين.
- عندما تصبح الخلايا ملتقية بنسبة 80٪ ، اغسل اللوحة مرتين باستخدام PBS المعقمة.
- افصل الخلايا عن طريق إضافة 1000 ميكرولتر من 0.5٪ من التربسين-EDTA واحتضن لوحة زراعة الخلايا لمدة 3-5 دقائق في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية.
- افحص الصفيحة تحت المجهر الضوئي لتأكيد تفكك الخلية. أضف 10 مل من وسائط النمو التي تحتوي على 10٪ FBS لتعطيل التربسين.
- اجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا بلطف في وسط زراعة الخلايا الكامل وحدد عدد الخلايا وقابليتها للحياة باستخدام تلطيخ Trypan Blue (0.4٪).
ملاحظة: الحد الأدنى الموصى به لصلاحية الخلية لهذه التجربة هو >90٪. - ضع أغطية زجاجية معقمة في آبار صفيحة مكونة من 24 بئرا باستخدام ملقط معقم. خلايا البذور على أغطية بكثافة 1 × 106 خلايا / مل وتحتضن اللوحة بين عشية وضحاها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- تغيير وسائط كل بئر باستخدام وسائط كاملة جديدة 500 ميكرولتر قبل العلاج. المعالجة المسبقة للبلاعم باستخدام مركبة (DMSO أو مذيبات أخرى تستخدم لإذابة EIPA) أو مثبط ندرة الخلايا الكبيرة 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride (EIPA ، 25 μM21) لمدة 30 دقيقة.
- عالج الخلايا باستخدام المركبات والمحفزات من ندرة الخلايا الكبيرة لتعزيز كشكش الغشاء: phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA ، 1 μM ، 30 min21) وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF ، 100 نانوغرام / مل ، 30 دقيقة3).
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام مثبطات بديلة [على سبيل المثال ، لاترونكولين A (1 ميكرومتر ، 30 دقيقة) أو سيتوشالاسين D (1 ميكرومتر ، 30 دقيقة)] والمحفزات [على سبيل المثال ، عامل نمو البشرة (EGF ، 100 نانوغرام / مل ، 10 دقائق) أو عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF ، 100 نانوغرام / مل ، 15 دقيقة)] من macropinocytosis لتوصيف macropinocytosis في البلاعم وأنواع الخلايا الأخرى16,27 ، 28,29. قد تتطلب الخلايا تجويع المصل بين عشية وضحاها قبل العلاج بالمحفزات الفسيولوجية لندرة الخلايا الكبيرة. من المهم ملاحظة أنه يجب تحديد التركيزات وأوقات الحضانة الأكثر فعالية لتحفيز ندرة الخلايا الكبيرة في أنواع الخلايا الأخرى.
2. تثبيت SEM
- بعد العلاج ، قم بشفط الوسائط من الآبار واغسل الأغطية باستخدام PBS البارد مرتين مرتين.
- إصلاح الخلايا (4٪ بارافورمالديهايد و 2٪ غلوتارالدهيد في 0.1 مليون كاكوديلات الصوديوم) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها حضانة بين عشية وضحاها في المثبت عند 4 درجات مئوية.
- اغسل بلطف واحتضن الأغطية باستخدام 500 ميكرولتر من الكواشف التالية دون إزعاج الطبقة الأحادية للخلية.
- يغسل مرة واحدة في 0.1 M كاكوديلات الصوديوم ويحضن لمدة 15 دقيقة.
- يغسل مرتين مع dH2O مع حضانة لمدة 10 دقائق في كل غسلة.
- يغسل مرتين مع 25٪ من الإيثانول مع حضانة لمدة 10 دقائق في كل غسلة.
- يغسل مرتين مع 50٪ من الإيثانول مع حضانة لمدة 10 دقائق في كل غسلة.
- يغسل مرتين مع 75٪ من الإيثانول مع حضانة لمدة 10 دقائق في كل غسلة.
- يغسل مرتين مع 80٪ من الإيثانول مع حضانة لمدة 10 دقائق في كل غسلة.
- يغسل مرتين مع 95٪ من الإيثانول مع حضانة لمدة 10 دقائق في كل غسلة.
- يغسل مرتين مع الإيثانول 100٪. أداء 10 دقائق من الحضانة في كل غسلة.
ملاحظة: يجب أن يتم تغيير / استبدال الكواشف بسرعة لمنع تجفيف الهواء للخلايا. يمكن ترك Coverslips في الإيثانول 100 ٪ لعدة أيام في 4 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل ، أضف إيثانول إضافي بنسبة 100٪ وقم بتغطية الآبار بالبارافيلم لمنع تجفيف الهواء للعينة.
3. تجفيف النقاط الحرجة
- ضع الأغطية في مجفف النقطة الحرجة وقم بتغطيتها بالإيثانول بنسبة 100٪. اضغط على زر الطاقة وافتح خزان CO2 .
- اضغط على الزر تبريد لمدة 30 ثانية تقريبا حتى تنخفض درجة الحرارة إلى 0 درجة مئوية. اضغط على الزر تعبئة حتى تظهر فقاعة في نافذة الغرفة.
- اضغط على زر التطهير حتى تختفي رائحة الإيثانول من عادم التطهير. اضغط على الزر تبريد مرة أخرى حتى تنخفض درجة الحرارة إلى 0 درجة مئوية.
- قم بالضغط على زري التعبئة والتطهير لإيقاف تشغيلهما وإغلاق خزان CO2. اضغط على زر التبريد لإيقاف تشغيله واضغط على زر الحرارة.
- اضبط درجة الحرارة على 42 درجة مئوية والضغط على 1200 رطل لكل بوصة مربعة. بمجرد استقرار الضغط ودرجة الحرارة، اضغط على زر التسييل للسماح للضغط بالانخفاض ببطء.
- بمجرد أن يصل ضغط الغرفة إلى 150 رطل لكل بوصة مربعة ، اضغط على زر Vent وانتظر حتى ينخفض الضغط إلى 0 رطل لكل بوصة مربعة. أوقف تشغيل مجفف النقاط الحرجة وأزل أغطية الأغطية.
- يتم تركيب الأغطية على حوامل عينات الألمنيوم SEM باستخدام علامات تبويب لاصقة للكربون وتخضع لطلاء الرذاذ باستخدام الذهب / البلاديوم في طبقة لاصقة.
- قم بتشغيل زر الطاقة وانتظر حتى يصل الفراغ إلى 30 mTorr. اغسل الغرفة لإزالة الرطوبة والهواء عن طريق إيقاف تشغيل مفتاح الغاز وتشغيل صمام الغاز Fine عكس اتجاه عقارب الساعة.
- بمجرد زيادة الفراغ إلى 200 mTorr ، قم بإيقاف تشغيل مفتاح الغاز وانتظر حتى يصل الفراغ إلى 30 mTorr. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
- اضغط على زر المؤقت واضبط مقبض الجهد حتى يقرأ المقياس 10 مللي أمبير. قم بإزالة الأغطية المطلية من الغرفة.
ملاحظة: اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإجراء تجفيف النقاط الحرجة وطلاء الرذاذ للعينة.
4. التصوير والقياس الكمي
- أدخل أغطية العينات في حجرة المجهر الإلكتروني الماسح. أغلق الباب واضغط على زر Evac .
- افتح برنامج تشغيل SEM. اضبط الجهد المتسارع على 15 كيلو فولت ومسافة العمل على 10 مم.
- اضغط على زر الإحداثيات وتحرك حول وحدة التحكم حتى تظهر الخلايا في وسط شاشة الملاحظة. اضبط التكبير على 3500x وصور العينة بالنقر فوق الزر صورة.
ملاحظة: استخدم مستوى أعلى من التكبير (8500x إلى 16,000x) لإظهار غشاء البلازما بمزيد من التفاصيل. - التقط صورا من 10 مواقع عشوائية على الأقل على الأغطية ، مع التأكد من أن كل حقل مجهري يحتوي على خلايا متعددة. احفظ الصور كملفات .tif.
- من الصور ، حدد موقع كشكشة الغشاء ، التي تعرف بأنها طيات بارزة تشبه البطانية من غشاء البلازما ، بحجم أكبر من 500 نانومتر (الشكل 1). احسب عدد الكشكشة لكل خلية.
ملاحظة: تم تحديد الكشكشة على شكل حرف C على أنها نتوءات غشائية منحنية لم تندمج على نهاياتها الجانبية [(الشكل 1 (علاج M-CSF) والشكل 2B]. تم تحديد الكشكشة الغشائية الدائرية المنصهرة ، قبل إغلاقها ، على أنها أكواب كبيرة (الشكل 2C). - تطبيع عدد الكشكشة الغشائية إلى العدد الإجمالي للخلايا في المجال المجهري الذي تم تقييمه. كرر هذا التحليل للعينات من كل مجموعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا ، نصف النتائج من التقنية المقدمة. توضح صور SEM التمثيلية الموضحة في الشكل 1 تكوين كشكشة الغشاء في البلاعم RAW 264.7 بعد العلاج باستخدام PMA و M-CSF. تم التقاط الصور لأول مرة بتكبير 3,500x لأغراض القياس الكمي ثم عند مستويات أعلى من التكبير (8,500x إلى 16,000x) لإظهار غشاء البلازما بمزيد من التفاصيل. المعالجة المسبقة للبلاعم مع مثبط ندرة الخلايا الكبيرة EIPA تشكيل كشكشة الغشاء الموهن (الشكل 1). يمكن تقسيم أنشطة غشاء البلازما المرتبط بكثرة الخلايا الماكروبينية إلى خمس خطوات متتالية: 1) بدء كشكش الغشاء ، 2) التدوير ، 3) تكوين الكوب ، 4) إغلاق الكوب ، و 5) استيعاب السائل خارج الخلية والمذابات المرتبطة به عن طريق تكوين macropinosome. ويبين الشكل 2 صورا تمثيلية لهذه الأنشطة المتميزة مورفولوجيا للغشاء البلازمي بعد التحفيز M-CSF. تم التقاط الكشكشة الكبيرة الشبيهة بالصفائح (الشكل 2A) ، والكشكشة الدائرية على شكل C (الشكل 2B) ، والأكواب الكبيرة (الشكل 2C) عند تكبير من 6000x إلى 7000x. يمكن استخدام المجهر الإلكتروني الماسح لتوفير صور عالية الدقة لسطح الخلية ولكن لا يمكن استخدامه لتصور الماكروبينوسومات الداخلية. يوضح الشكل 3 تحديد كمية الكشكشة الغشائية بعد علاج PMA و M-CSF. يمكن تأكيد تكوين Macropinosome بواسطة تقنيات التصوير البديلة ، بما في ذلك المجهر البؤري ، كما هو موضح في الشكل 4. وأخيرا، ينبغي أن يستكمل القياس الكمي ل SEM لكشكش الغشاء بالقياس الكمي للتدفق الخلوي لعلامة طور السائل الفلورسنت (على سبيل المثال، FITC- أو Texas red-dextran) لتأكيد تحفيز ندرة الخلايا الكبيرة (الشكل 5).
الشكل 1: مسح صور المجهر الإلكتروني للبلاعم RAW 264.7. تمت معالجة البلاعم RAW 264.7 مسبقا باستخدام السيارة (التحكم في DMSO) أو EIPA (25 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة وتم احتضانها باستخدام PMA (1 ميكرومتر ، 30 دقيقة) أو M-CSF (100 نانوغرام / مل ، 30 دقيقة) لتحفيز كشكشة الغشاء. تظهر الصور الموجودة على اليمين تكبيرا أعلى لسطح الخلية. الأسهم الحمراء: كشكش الغشاء. السهم الأخضر: كشكش على شكل حرف C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المراحل المورفولوجية لندرة الخلايا الكبيرة التي تم التقاطها بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح. تمت معالجة البلاعم RAW 264.7 باستخدام M-CSF (100 نانوغرام / مل) لمدة 30 دقيقة وتمت معالجة الخلايا لتصوير SEM. (أ ) نتوء غشاء يشبه الورقة ، ( ب ) كشكشة غشاء على شكل حرف C ، و (ج) كوب كبير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: القياس الكمي لتشكيل كشكشة الغشاء. تمت معالجة البلاعم RAW 264.7 مسبقا باستخدام السيارة (التحكم في DMSO) أو EIPA (25 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة وتم احتضانها باستخدام PMA (1 ميكرومتر ، 30 دقيقة) أو M-CSF (100 نانوغرام / مل ، 30 دقيقة) لتحفيز كشكشة الغشاء. يوضح الرسم البياني الشريطي عدد الكشكشة الغشائية التي تم تطبيعها إلى إجمالي عدد الخلايا (n = 3). تمثل البيانات متوسط ± SEM. أنوفا أحادية الاتجاه ؛ * p < 0.05 مقابل السيارة ، #p < 0.05 مقابل PMA أو علاج M-CSF. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تشكيل ماكروبينوسوم. تمت معالجة الخلايا مسبقا باستخدام PMA لمدة 30 دقيقة وتم احتضانها باستخدام تكساس ريد ديكستران (25 ميكروغرام / مل ، أحمر) و FM4-64 (5 ميكروغرام / مل ، أخضر) لمدة 10 دقائق. تم إجراء التصوير باستخدام المجهر البؤري. الأسهم الزرقاء: كشكش الغشاء ، الأسهم الصفراء: الماكروبينوسوم الذي يحتوي على تكساس الأحمر ديكستران ، الأسهم الخضراء: الماكروبينوسومات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: القياس الكمي لندرة الخلايا الكبيرة. تمت معالجة البلاعم RAW 264.7 مسبقا باستخدام مركبة (التحكم في DMSO) أو EIPA (25 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة وتم احتضانها باستخدام PMA (1 ميكرومتر) و FITC-dextran (100 ميكروغرام / مل ؛ 70000 ميجاوات) لمدة 2 ساعة. يوضح الرسم البياني الشريطي متوسط تغير شدة التألق (MFI) في الطي الذي تم تطبيعه إلى معالجة السيارة (n = 3 ، يتم إجراؤه في ثلاثة أضعاف). تمثل البيانات متوسط ± SEM. أنوفا أحادية الاتجاه ؛ *< 0.05 مقابل سيارة، #p < 0.05 مقابل PMA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر بروتوكول التصوير SEM الحالي أداة لتصور وقياس تكوين كشكشة الغشاء ، والنتوءات الدائرية ، والأكواب ذات الخلايا الكبيرة على سطح الخلية في المختبر. على الرغم من أن البروتوكول الحالي يركز على البلاعم ، فقد أظهرت الدراسات أن تكوين كشكشة الغشاء يحدث أيضا على أنواع مختلفة من الخلايا الأخرى بما في ذلك الخلايا المتغصنة والخلايا الليفية والخلايا العصبية والخلايا السرطانية 11،12،14،21،30. بالنظر إلى ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى تحسين ظروف زراعة الخلايا واستخدام محفزات أو ظروف علاج مختلفة لتصور الكشكشة الغشائية في أنواع الخلايا الأخرى.
على الرغم من وجود بعض الفسحة لإعداد العينات ، إلا أنه يجب اتباع خطوات تجفيف الجفاف والنقطة الحرجة بالضبط للحفاظ على بنية سطح الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن وجود الماء أو المذيبات الأخرى مثل الإيثانول من شأنه أن يزعج الفراغ ، وهو أمر ضروري لتصوير SEM ، وبالتالي ، يجب إزالته بطريقة خاضعة للرقابة للحفاظ على مورفولوجيا العينة سليمة14.
تستخدم المجاهر الإلكترونية حزمة من الإلكترونات المتسارعة كمصدر للإضاءة. تم تطوير المجاهر الإلكترونية الأولى عندما أصبح الطول الموجي هو العامل المحدد في المجاهر الضوئية31. الإلكترونات لها أطوال موجية أقصر بكثير وبالتالي فإن المجاهر الإلكترونية لديها قدرة حل أعلى من المجاهر الضوئية ويمكن استخدامها لتوفير صور عالية الدقة والتحقيق في البنية الفائقة لمجموعة واسعة من العينات البيولوجية. هناك قيود رئيسية لهذه الطريقة تدور حول حقيقة أن SEM لا يوفر سوى لقطة من مورفولوجيا غشاء البلازما ، على عكس تصوير الخلايا الحية الفلورية ، والتي من شأنها أن تسمح بتصور الكشكشة الغشائية ، وانتقالها إلى أكواب macropinocytic ، وتشكيل macropinosomes. يمكن استخدام تصوير الخلايا الحية ، والمجهر الإلكتروني الناقل (TEM) ، واختبارات امتصاص الدكستران الفلورية للتحقيق في استيعاب المذابات الفلورية عبر macropinocytosis ، ونقل macropinosome ونضجه ، وآليات الإشارات داخل الخلايا التي تنظم macropinocytosis. نظرا لأن SEM يتطلب التثبيت على أغطية ، يمكن تصور الجانب الظهري والمنطقة الطرفية للخلية فقط ، وهو قيد آخر على هذه التقنية.
نود أن نضيف أنه في بعض الأحيان يكون من الصعب التمييز بين التكوين المستقل عن ندرة الخلايا الكبيرة للنتوءات الغشائية وكشكش الغشاء ذو الخلايا الكبيرة. قمنا بتوحيد القياس الكمي لدينا من خلال تحديد الكشكشة الغشائية مع مسافة لا تقل عن 0.5 ميكرومتر بين أي نقطتين على حافة النتوء. عدد الكشكشة الغشائية لكل خلية متغير للغاية ويعتمد على العديد من العوامل بما في ذلك المنشط وتركيزه ووقت الحضانة ونوع الخلية32. مع PMA و M-CSF ، رأينا خلايا ذات كشكش غشائي متعدد ولكننا اخترنا صورا تمثيلية تمثل بياناتنا الكمية بشكل أفضل (1-2 كشكشة لكل خلية). يبقى SEM التقنية القياسية الذهبية لتقييم الخصائص الطبوغرافية والمورفولوجية لغشاء البلازما في المختبر. يوفر الجمع بين هذه الطريقة جنبا إلى جنب مع تصوير الخلايا الحية وتحليل قياس التدفق الخلوي للاستيعاب المذاب استراتيجية موثوقة لتحليل ندرة الخلايا الكبيرة في أنواع الخلايا المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون ليبي بيري (جامعة أوغوستا) على مساعدتها في إعداد عينة SEM. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [R01HL139562 (G.C.) و K99HL146954 (B.S.)] وجمعية القلب الأمريكية [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope |
References
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
- Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
- Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
- Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
- Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
- Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
- Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
- Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
- Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
- Mercer, J., Helenius, A.
- Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
- Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
- Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
- Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
- Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- Fischer, E. R., et al.
- Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
- Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
- Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
- Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).
