Summary
La macropinocitosis es un proceso endocítico altamente conservado iniciado por la formación de proyecciones de membrana en forma de lámina rica en F-actina, también conocidas como volantes de membrana. El aumento de la tasa de internalización de solutos macropinocitóticos se ha implicado en diversas condiciones patológicas. Este protocolo presenta un método para cuantificar la formación de volantes de membrana in vitro utilizando microscopía electrónica de barrido.
Abstract
El rufilo de membrana es la formación de protuberancias de membrana plasmática móvil que contienen una malla de filamentos de actina recién polimerizados. Los volantes de membrana pueden formarse espontáneamente o en respuesta a factores de crecimiento, citoquinas inflamatorias y ésteres de forbol. Algunas de las protuberancias de la membrana pueden reorganizarse en volantes circulares de membrana que se fusionan en sus márgenes distales y forman copas que se cierran y separan en el citoplasma como vacuolas grandes y heterogéneas llamadas macropinosomas. Durante el proceso, los volantes atrapan el líquido extracelular y los solutos que se internalizan dentro de los macropinosomas. La microscopía electrónica de barrido (SEM) de alta resolución es una técnica de imagen comúnmente utilizada para visualizar y cuantificar la formación de volantes de membrana, protuberancias circulares y copas macropinocíticas cerradas en la superficie celular. El siguiente protocolo describe las condiciones de cultivo celular, la estimulación de la formación de volantes de membrana in vitro y cómo fijar, deshidratar y preparar células para imágenes utilizando SEM. También se describe la cuantificación del ruflejo de la membrana, la normalización de datos y los estimuladores e inhibidores de la formación de volantes de membrana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel de la macropinocitosis en los procesos fisiológicos y patológicos, investigar nuevos objetivos que regulan la formación de volantes de membrana e identificar estimuladores fisiológicos aún no caracterizados, así como nuevos inhibidores farmacológicos de la macropinocitosis.
Introduction
La macropinocitosis es un proceso endocítico responsable de internalizar una gran cantidad de líquido extracelular y su contenido a través de la formación de protuberancias dinámicas y de membrana plasmática impulsadas por actina llamadas volantes de membrana1. Muchos de estos volantes de membrana forman copas que se cierran y se fusionan de nuevo en la célula y se separan de la membrana plasmática como endosomas intracelulares grandes y heterogéneos también conocidos como macropinosomas1. Aunque la macropinocitosis es inducida por factores de crecimiento como el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) en una amplia gama de tipos de células, también se ha observado un proceso adicional único y dependiente del calcio conocido como macropinocitosis constitutiva en células inmunes innatas 2,3,4,5,6,7,8.
Se ha demostrado que la capacidad de las células para internalizar material extracelular a través de la macropinocitosis desempeña un papel importante en una variedad de procesos fisiológicos que van desde la absorción de nutrientes hasta la captura de patógenos yla presentación de antígenos 9,10,11. Sin embargo, debido a que este proceso no es selectivo e inducible, también se ha implicado en una serie de condiciones patológicas. De hecho, estudios previos sugirieron que la macropinocitosis juega un papel importante en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, el cáncer, la nefrolitiasis y la aterosclerosis 12,13,14,15,16. Además, ciertas bacterias y virus han demostrado utilizar la macropinocitosis para entrar en las células huésped e inducir la infección17,18. Curiosamente, la estimulación de la macropinocitosis también puede ser explotada para la administración dirigida de agentes terapéuticos en diversas condiciones de enfermedad19,20.
Estudios previos han explorado la macropinocitosis mediante la cuantificación de marcadores de fase fluida marcados fluorescentemente internalizados en ausencia y presencia de agentes farmacológicos que inhiben la macropinocitosis mediante citometría de flujo e imágenes confocales21,22. Las herramientas farmacológicas actualmente disponibles que inhiben la macropinocitosis se limitan y comprenden 1) inhibidores de la polimerización de actina (citochalasina D y latrunculinas), 2) bloqueadores PI3K (LY-290042 y wortmannin) y 3) inhibidores de intercambiadores de hidrógeno de sodio (NHE) (amilorida y EIPA)5,14,15,23,24,25 . Sin embargo, debido a que estos inhibidores tienen efectos independientes de la endocitosis, es difícil determinar selectivamente la contribución de la macropinocitosis a la absorción de solutos y la patogénesis de la enfermedad, especialmente in vivo21.
La microscopía electrónica de barrido (SEM) es un tipo de microscopio electrónico que produce imágenes de ultra alta resolución de células utilizando un haz enfocado de electrones26. En la investigación de la macropinocitosis, las imágenes SEM se consideran la técnica estándar de oro para visualizar las características topográficas y morfológicas de la membrana plasmática, cuantificar la formación de volantes de membrana e investigar su progresión hacia la internalización de macropinosomas. Además, la microscopía electrónica de barrido combinada con la cuantificación de la absorción de solutos, en presencia y ausencia de bloqueadores de macropinocitosis, proporciona una estrategia confiable para examinar la internalización de solutos macropinocitóticos in vitro. Este documento proporciona un protocolo detallado sobre cómo preparar las células para SEM, visualizar la superficie celular, cuantificar la formación de volantes y examinar su progreso hacia el cierre de la copa y la internalización del macropinosoma.
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Protocol
NOTA: El siguiente es un protocolo general utilizado para cuantificar la formación de volantes de membrana en macrófagos RAW 264.7 utilizando microscopía SEM. La optimización puede ser necesaria para diferentes tipos de células.
1. Línea celular y cultivo celular
- Cultive macrófagos RAW 264.7 en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% (vol/vol) de Suero Fetal Bovino Inactivado térmicamente (FBS), 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2. Reemplace los medios de crecimiento cada dos días.
- Cuando las células se vuelvan 80% confluentes, lave la placa dos veces con PBS estéril.
- Separe las células añadiendo 1.000 μL de tripsina-EDTA al 0,5% e incube la placa de cultivo celular durante 3-5 min en una incubadora humidificada a 37 °C.
- Examine la placa bajo un microscopio de luz para confirmar la disociación celular. Agregue 10 ml de medios de crecimiento que contengan 10% de FBS para inactivar la tripsina.
- Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender suavemente las células en el medio de cultivo celular completo y determinar el recuento celular y la viabilidad utilizando la tinción de Trypan Blue (0,4%).
NOTA: La viabilidad celular mínima recomendada para este experimento es de >90%. - Coloque cubiertas de vidrio estériles en los pocillos de una placa de 24 pocillos utilizando pinzas en autoclave. Sembrar células en hojas de cubierta a una densidad de 1 x 106 células/ml e incubar la placa durante la noche en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
- Cambie los medios de cada pozo con medios completos frescos de 500 μL antes del tratamiento. Pretratar macrófagos con vehículo (DMSO u otros disolventes utilizados para disolver EIPA) o el inhibidor de la macropinocitosis 5-(N-etil-N-isopropil)-amilorida (EIPA, 25 μM21) durante 30 min.
- Tratar las células con vehículo y estimuladores de macropinocitosis para promover el erizado de la membrana: forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, 1 μM, 30 min21) y factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, 100 ng/mL, 30 min3).
NOTA: Los inhibidores alternativos [por ejemplo, latrunculina A (1 μM, 30 min) o citocalasina D (1 μM, 30 min)] y estimuladores [por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF, 100 ng/mL, 10 min) o factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] de macropinocitosis también se pueden usar para caracterizar la macropinocitosis en macrófagos y otros tipos de células16,27, 28,29. Las células pueden requerir inanición sérica durante la noche antes del tratamiento con estimuladores fisiológicos de la macropinocitosis. Es importante tener en cuenta que las concentraciones y los tiempos de incubación más efectivos deberán determinarse para estimular la macropinocitosis en otros tipos de células.
2. Fijación SEM
- Después del tratamiento, aspire los medios de los pozos y lave las fundas con PBS helado dos veces.
- Fijar células (4% de paraformaldehído y 2% de glutaraldehído en 0,1 M de cacodilato de sodio) durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de incubación durante la noche en el fijador a 4 °C.
- Lave e incube suavemente los cubrehojas con 500 μL de reactivos siguientes sin perturbar la monocapa celular.
- Lavar una vez en 0,1 M de cacodilato de sodio e incubar durante 15 min.
- Lavar dos veces con dH2O con 10 min de incubación en cada lavado.
- Lavar dos veces con etanol al 25% con 10 min de incubación en cada lavado.
- Lavar dos veces con etanol al 50% con 10 min de incubación en cada lavado.
- Lavar dos veces con etanol al 75% con 10 min de incubación en cada lavado.
- Lavar dos veces con etanol al 80% con 10 min de incubación en cada lavado.
- Lavar dos veces con etanol al 95% con 10 min de incubación en cada lavado.
- Lavar dos veces con etanol al 100%. Realizar 10 min de incubación en cada lavado.
NOTA: El cambio / reemplazo de reactivos debe hacerse rápidamente para evitar el secado al aire de las células. Los coverslips se pueden dejar en etanol al 100% durante varios días a 4 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, agregue etanol 100% adicional y cubra los pozos con parafilm para evitar el secado al aire de la muestra.
3. Secado en puntos críticos
- Coloque las fundas en un secador de puntos críticos y cúbralas con etanol al 100%. Presione el botón de Encendido y abra el tanque de CO2 .
- Pulse el botón Cool durante aproximadamente 30 s hasta que la temperatura disminuya a 0 °C. Pulse el botón Rellenar hasta que aparezca una burbuja en la ventana de la cámara.
- Presione el botón Purga hasta que desaparezca el olor a etanol del escape de purga. Pulse de nuevo el botón Cool hasta que la temperatura disminuya a 0 °C.
- Vuelva a presionar los botones De llenado y Purga para apagarlos y cerrar el tanque de CO2 . Vuelva a presionar el botón Cool para apagarlo y presione el botón Heat .
- Ajuste la temperatura a 42 °C y la presión a 1.200 psi. Una vez que la presión y la temperatura se estabilicen, presione el botón Sangrado para permitir que la presión disminuya lentamente.
- Una vez que la presión de la cámara alcance los 150 psi, presione el botón vent y espere hasta que la presión disminuya a 0 psi. Apague el secador de puntos críticos y retire las fundas.
- Monte los trozos de cubierta en los soportes de muestras de aluminio SEM utilizando pestañas adhesivas de carbono y sujetos a recubrimiento de pulverización con oro / paladio en un recubridor de pulverización.
- Encienda el botón de encendido y espere hasta que el vacío alcance los 30 mTorr. Enjuague la cámara para eliminar la humedad y el aire apagando el interruptor de gas y girando la válvula de gas fino en sentido contrario a las agujas del reloj.
- Una vez que el vacío aumente a 200 mTorr, apague el interruptor de gas y espere hasta que el vacío alcance los 30 mTorr. Repita este paso 3 veces.
- Presione el botón temporizador y ajuste la perilla de voltaje hasta que el medidor lea 10 mA. Retire las fundas recubiertas de la cámara.
NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para realizar el secado de puntos críticos y el recubrimiento de pulverización de la muestra.
4. Imagen y cuantificación
- Inserte las hojas de cubierta de la muestra en la cámara de un microscopio electrónico de barrido. Cierre la puerta y pulse el botón Evac .
- Abra el software de operación SEM. Ajuste el voltaje de aceleración a 15 kv y la distancia de trabajo a 10 mm.
- Pulse el botón Coordenadas y desplácese por el mando hasta que aparezcan las celdas en el centro de la pantalla de observación. Establezca la ampliación en 3.500x e imagine la muestra haciendo clic en el botón Foto.
NOTA: Use un nivel más alto de aumento (8,500x a 16,000x) para mostrar la membrana plasmática con mayor detalle. - Tome imágenes de al menos 10 ubicaciones aleatorias en los cobertores, asegurándose de que cada campo microscópico contenga múltiples células. Guarde las imágenes como archivos .tif.
- A partir de las imágenes, localice los volantes de membrana, definidos como pliegues sobresalientes en forma de manta de la membrana plasmática, con un tamaño superior a 500 nm (Figura 1). Cuente el número de volantes por celda.
NOTA: Los volantes en forma de C se identificaron como protuberancias curvas de membrana que no se fusionaron en sus extremos laterales [(Figura 1 (tratamiento M-CSF) y Figura 2B]. Los volantes de membrana circular fusionada, antes de su cierre, se identificaron como copas macropinocitóticas (Figura 2C). - Normalizar el número de volantes de membrana al número total de células en el campo microscópico evaluado. Repita este análisis para las muestras de cada grupo.
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Representative Results
Aquí, describimos los resultados de la técnica presentada. Las imágenes REPRESENTATIVAS de SEM que se muestran en la Figura 1 demuestran la formación de volantes de membrana en macrófagos RAW 264.7 después del tratamiento con PMA y M-CSF. Las imágenes se capturaron primero a un aumento de 3.500x para fines de cuantificación y luego a niveles más altos de aumento (8.500x a 16.000x) para mostrar la membrana plasmática con mayores detalles. Pretratamiento de macrófagos con el inhibidor de la macropinocitosis EIPA atenuado de la formación de volantes de membrana (Figura 1). Las actividades de la membrana plasmática asociadas a la macropinocitosis se pueden dividir en cinco pasos consecutivos: 1) inicio del erizado de la membrana, 2) circularización, 3) formación de copas, 4) cierre de copas y 5) internalización del líquido extracelular y sus solutos asociados a través de la formación de macropinosomas. La Figura 2 muestra imágenes representativas de estas actividades morfológicamente distintas de la membrana plasmática después de la estimulación del M-CSF. Se capturaron volantes grandes en forma de lámina (Figura 2A), volantes circularizados en forma de C (Figura 2B) y copas macropinocíticas (Figura 2C) con un aumento de 6,000x a 7,000x. La microscopía electrónica de barrido se puede utilizar para proporcionar imágenes de alta resolución de la superficie celular, pero no se puede utilizar para visualizar macropinosomas internalizados. La cuantificación de los volantes de membrana después del tratamiento con PMA y M-CSF se muestra en la Figura 3. La formación de macropinosomas se puede confirmar mediante técnicas de imagen alternativas, incluida la microscopía confocal, como se muestra en la Figura 4. Finalmente, la cuantificación SEM del rufilo de la membrana debe complementarse con la cuantificación por citometría de flujo de un marcador fluorescente de fase fluida (por ejemplo, FITC o rojo dextrano de Texas) para confirmar la estimulación de la macropinocitosis (Figura 5).
Figura 1: Imágenes de microscopía electrónica de barrido de macrófagos RAW 264.7. Los macrófagos RAW 264.7 fueron pretratados con vehículo (control DMSO) o EIPA (25 μM) durante 30 min e incubados con PMA (1 μM, 30 min) o M-CSF (100 ng/mL, 30 min) para estimular el aleteo de la membrana. Las imágenes de la derecha muestran un aumento más alto de la superficie celular. Flechas rojas: volantes de membrana. Flecha verde: volante en forma de c. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estadios morfológicos de la macropinocitosis capturados por microscopía electrónica de barrido. Los macrófagos RAW 264.7 se trataron con M-CSF (100 ng/mL) durante 30 min y las células se procesaron para imágenes SEM. (A) protuberancia de membrana en forma de lámina, (B) volante de membrana en forma de C y (C) copa macropinocítica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación de la formación de volantes de membrana. Los macrófagos RAW 264.7 fueron pretratados con vehículo (control DMSO) o EIPA (25 μM) durante 30 min e incubados con PMA (1 μM, 30 min) o M-CSF (100 ng/mL, 30 min) para estimular el aleteo de la membrana. El gráfico de barras muestra el número de volantes de membrana normalizados al número total de células (n = 3). Los datos representan la media ± SEM. ANOVA unidireccional; *p < 0.05 vs. vehículo, #p < 0.05 vs. PMA o tratamiento M-CSF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Formación de macropinosomas. Las células fueron pretratadas con PMA durante 30 min e incubadas con Texas red-dextran (25 μg/mL, rojo) y FM4-64 (5 μg/mL, verde) durante 10 min. Las imágenes se realizaron utilizando un microscopio confocal. Flechas azules: volantes de membrana, flechas amarillas: macropinosoma que contiene rojo-dextrano de Texas, flechas verdes: macropinosomas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cuantificación de la macropinocitosis. Los macrófagos RAW 264,7 fueron pretratados con vehículo (control DMSO) o EIPA (25 μM) durante 30 min e incubados con PMA (1 μM) y FITC-dextrano (100 μg/mL; 70.000 MW) durante 2 h. El gráfico de barras muestra el cambio de pliegue de la intensidad media de fluorescencia (IMF) normalizado al tratamiento del vehículo (n = 3, realizado por triplicado). Los datos representan la media ± SEM. ANOVA unidireccional; *p < 0.05 vs. vehículo, #p < 0.05 vs. PMA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El presente protocolo de imágenes SEM proporciona una herramienta para visualizar y cuantificar la formación de volantes de membrana, protuberancias circulares y copas macropinocíticas en la superficie celular in vitro. Aunque el protocolo actual se centra en los macrófagos, los estudios han demostrado que la formación de volantes de membrana también ocurre en varios otros tipos de células, incluidas las células dendríticas, los fibroblastos, las neuronas y las células cancerosas 11,12,14,21,30. Dado esto, la optimización de las condiciones de cultivo celular y el uso de diferentes estimuladores o condiciones de tratamiento pueden ser necesarios para la visualización de los volantes de membrana en otros tipos de células.
Aunque existe cierto margen de maniobra para la preparación de la muestra, los pasos de deshidratación y secado de puntos críticos deben seguirse exactamente para preservar la arquitectura de la superficie celular. Además, la presencia de agua u otros disolventes como el etanol perturbaría el vacío, lo cual es esencial para la imagen SEM y, por lo tanto, debe eliminarse de manera controlada para mantener intacta la morfología del espécimen14.
Los microscopios electrónicos utilizan un haz de electrones acelerados como fuente de iluminación. Los primeros microscopios electrónicos se desarrollaron cuando la longitud de onda se convirtió en el factor limitante en los microscopiosde luz 31. Los electrones tienen longitudes de onda mucho más cortas, por lo que los microscopios electrónicos tienen un mayor poder de resolución que los microscopios de luz y se pueden usar para proporcionar imágenes de alta resolución e investigar la ultraestructura de una amplia gama de especímenes biológicos. Una limitación importante de este método gira en torno al hecho de que SEM proporciona solo una instantánea de la morfología de la membrana plasmática, a diferencia de las imágenes fluorescentes de células vivas, lo que permitiría la visualización de los volantes de membrana, su transición a copas macropinocíticas y la formación de macropinosomas. Las imágenes de células vivas, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y los ensayos de captación de dextrano fluorescente se pueden utilizar para investigar la internalización de solutos fluorescentes a través de la macropinocitosis, la translocación y maduración de macropinosomas y los mecanismos de señalización intracelular que regulan la macropinocitosis. Debido a que SEM requiere fijación en los pliegues, solo se puede visualizar el lado dorsal y la región periférica de la célula, que es otra limitación de esta técnica.
Nos gustaría agregar que a veces es difícil distinguir entre la formación independiente de macropinocitosis de protuberancias de membrana y el erizado de membrana macropinocítica. Estandarizamos nuestra cuantificación identificando volantes de membrana con al menos 0,5 μm de distancia mínima entre dos puntos cualesquiera en el borde de la protuberancia. El número de volantes de membrana por célula es muy variable y depende de numerosos factores, incluido el estimulante, su concentración, el tiempo de incubación y el tipo de célula32. Con PMA y M-CSF, vimos células con múltiples volantes de membrana, pero elegimos imágenes representativas que representan mejor nuestros datos cuantificados (1-2 volantes por célula). SEM sigue siendo la técnica estándar de oro para evaluar las características topográficas y morfológicas de la membrana plasmática in vitro. La combinación de este método junto con imágenes de células vivas y análisis de citometría de flujo de internalización de solutos proporciona una estrategia confiable para analizar la macropinocitosis en varios tipos de células.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Libby Perry (Universidad de Augusta) por su ayuda con la preparación de la muestra SEM. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [R01HL139562 (G.C.) y K99HL146954 (B.S.)] y la Asociación Americana del Corazón [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope |
References
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
- Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
- Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
- Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
- Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
- Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
- Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
- Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
- Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
- Mercer, J., Helenius, A.
- Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
- Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
- Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
- Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
- Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- Fischer, E. R., et al.
- Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
- Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
- Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
- Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).
