Summary
Makropinocytose er en stærkt bevaret endocytisk proces initieret ved dannelsen af F-actinrige arklignende membranfremspring, også kendt som membranflæser. Øget hastighed af makropinocytotisk solind internalisering har været impliceret i forskellige patologiske tilstande. Denne protokol præsenterer en metode til at kvantificere membranflæsedannelse in vitro ved hjælp af scanningselektronmikroskopi.
Abstract
Membranruffling er dannelsen af bevægelige plasmamembranfremspring indeholdende et meshwork af nyligt polymeriserede actinfilamenter. Membranflæser kan dannes spontant eller som reaktion på vækstfaktorer, inflammatoriske cytokiner og phorbolestere. Nogle af membranfremspringene kan omorganisere sig i cirkulære membranflæser, der smelter sammen ved deres distale margener og danner kopper, der lukker og adskiller sig i cytoplasmaet som store, heterogene vakuoler kaldet makropinosomer. Under processen fælder flæser ekstracellulær væske og opløste stoffer, der internaliserer i makropinosomer. Højopløselig scanningselektronmikroskopi (SEM) er en almindeligt anvendt billeddannelsesteknik til at visualisere og kvantificere membranflæsedannelse, cirkulære fremspring og lukkede makropinocytiske kopper på celleoverfladen. Følgende protokol beskriver cellekulturbetingelserne, stimulering af membranflæsedannelsen in vitro, og hvordan man fikserer, dehydrerer og forbereder celler til billeddannelse ved hjælp af SEM. Kvantificering af membranruffling, datanormalisering og stimulatorer og hæmmere af membranflæsedannelse er også beskrevet. Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om makropinocytoseens rolle i fysiologiske og patologiske processer, undersøge nye mål, der regulerer dannelsen af membranflæser, og identificere endnu ukarakteriserede fysiologiske stimulatorer samt nye farmakologiske hæmmere af makropinocytose.
Introduction
Makropinocytose er en endocytisk proces, der er ansvarlig for internalisering af en stor mængde ekstracellulær væske og dens indhold via dannelsen af dynamiske og aktindrevne plasmamembranfremspring kaldet membranflæser1. Mange af disse membranflæser danner kopper, der lukker og smelter tilbage på cellen og adskilles fra plasmamembranen som store, heterogene intracellulære endosomer, også kendt som makropinosomer1. Selvom makropinocytose induceres af vækstfaktorer som makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og epidermal vækstfaktor (EGF) i en lang række celletyper, er der også observeret en yderligere unik, calciumafhængig proces kendt som konstitutiv makropinocytose i medfødte immunceller 2,3,4,5,6,7,8.
Cellernes evne til at internalisere ekstracellulært materiale via makropinocytose har vist sig at spille en vigtig rolle i en række fysiologiske processer, der spænder fra næringsoptagelse til patogenfangst og antigenpræsentation 9,10,11. Men fordi denne proces er ikke-selektiv og inducerbar, har den også været impliceret i en række patologiske tilstande. Faktisk foreslog tidligere undersøgelser, at makropinocytose spiller en vigtig rolle i Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, kræft, nefrolitose og aterosklerose 12,13,14,15,16. Desuden har visse bakterier og vira vist sig at udnytte makropinocytose til at få adgang til værtsceller og fremkalde infektion 17,18. Interessant nok kan stimulering af makropinocytose også udnyttes til målrettet levering af terapeutiske midler under forskellige sygdomstilstande 19,20.
Tidligere undersøgelser har undersøgt makropinocytose ved at kvantificere internaliserede fluorescerende mærkede væskefasemarkører i fravær og tilstedeværelse af farmakologiske midler, der hæmmer makropinocytose ved hjælp af flowcytometri og konfokal billeddannelse21,22. Aktuelt tilgængelige farmakologiske værktøjer, der hæmmer makropinocytose, er begrænset til og består af 1) actinpolymerisationshæmmere (cytochalasin D og latrunculiner), 2) PI3K-blokkere (LY-290042 og wortmannin) og 3) hæmmere af natriumhydrogenbyttere (NHE) (amilocid og EIPA)5,14,15,23,24,25 . Men fordi disse hæmmere har endocytose uafhængige virkninger, er det vanskeligt selektivt at bestemme makropinocytose bidrag til opløst optagelse og sygdomspatogenese, især in vivo21.
Scanning elektronmikroskopi (SEM) er en type elektronmikroskop, der producerer ultrahøjopløselige billeder af celler ved hjælp af en fokuseret stråle af elektroner26. I makropinocytoseforskning betragtes SEM-billeddannelse som guldstandardteknikken til at visualisere topografiske og morfologiske egenskaber ved plasmamembranen, kvantificere membranflæsedannelse og undersøge deres progression mod makropinosominternalisering. Desuden giver scanningselektronmikroskopi kombineret med kvantificering af opløst stofoptagelse i nærvær og fravær af makropinocytoseblokkere en pålidelig strategi til undersøgelse af makropinocytotisk solintualisering in vitro. Dette papir giver en detaljeret protokol om, hvordan man forbereder celler til SEM, visualiserer celleoverfladen, kvantificerer flæsedannelse og undersøger deres fremskridt mod koplukning og makropinosominternalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Følgende er en generel protokol, der bruges til at kvantificere membranflæsedannelse i RAW 264.7 makrofager ved hjælp af SEM-mikroskopi. Optimering kan være påkrævet for forskellige celletyper.
1. Cellelinje og cellekultur
- Dyrk RAW 264,7 makrofager i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% (vol/vol) varmeinaktiveret føtal bovin serum (FBS), 100 IE/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2. Udskift vækstmedier hver anden dag.
- Når celler bliver 80% sammenflydende, vaskes pladen to gange ved hjælp af steril PBS.
- Fjern celler ved at tilsætte 1.000 μL 0,5% trypsin-EDTA og inkuber cellekulturpladen i 3-5 minutter i en befugtet inkubator ved 37 ° C.
- Undersøg pladen under et lysmikroskop for at bekræfte celledissociation. Tilføj 10 ml vækstmedier indeholdende 10% FBS for at inaktivere trypsin.
- Opsaml cellesuspensionen i et 50 ml konisk rør og centrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Resuspend celler forsigtigt i det komplette cellekulturmedium og bestem celletal og levedygtighed ved hjælp af Trypan Blue (0,4%) farvning.
BEMÆRK: Den anbefalede mindste cellelevedygtighed for dette eksperiment er >90%. - Anbring sterile glasdæksler i brønde på en 24-brønds plade ved hjælp af autoklavede tang. Frøceller på dæksler med en densitet på 1 x 106 celler/ml og inkuberer pladen natten over i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Skift medier for hver brønd med friske 500 μL komplette medier før behandling. Forbehandle makrofager med køretøj (DMSO eller andre opløsningsmidler, der anvendes til opløsning af EIPA) eller makropinocytosehæmmeren 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amilocid (EIPA, 25 μM21) i 30 minutter.
- Behandl celler med køretøj og stimulatorer af makropinocytose for at fremme membran ruffling: phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA, 1 μM, 30 min21) og makrofag kolonistimulerende faktor (M-CSF, 100 ng / ml, 30 min3).
BEMÆRK: Alternative hæmmere [f.eks. latrunculin A (1 μM, 30 min) eller cytochalasin D (1 μM, 30 min)] og stimulatorer [f.eks. epidermal vækstfaktor (EGF, 100 ng/ml, 10 min) eller blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF, 100 ng/ml, 15 min)] af makropinocytose kan også anvendes til at karakterisere makropinocytose i makrofager og andre celletyper16,27, 28,29. Celler kan kræve serumsult natten over før behandling med fysiologiske stimulatorer af makropinocytose. Det er vigtigt at bemærke, at de mest effektive koncentrationer og inkubationstider skal bestemmes for at stimulere makropinocytose i andre celletyper.
2. SEM-fiksering
- Efter behandlingen aspirerer medierne fra brønde og vasker dæksler med iskold PBS to gange.
- Fastgør celler (4 % paraformaldehyd og 2 % glutaraldehyd i 0,1 M natriumkacodylat) i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af inkubation natten over i fikseringsmidlet ved 4 °C.
- Vask og inkuber forsigtigt dæksedler med 500 μL følgende reagenser uden at forstyrre cellemonolaget.
- Vask en gang i 0,1 M natriumkacodylat og inkuber i 15 minutter.
- Vask to gange med dH2O med 10 minutters inkubation i hver vask.
- Vask to gange med 25% ethanol med 10 minutters inkubation i hver vask.
- Vask to gange med 50% ethanol med 10 minutters inkubation i hver vask.
- Vask to gange med 75% ethanol med 10 minutters inkubation i hver vask.
- Vask to gange med 80% ethanol med 10 minutters inkubation i hver vask.
- Vask to gange med 95% ethanol med 10 minutters inkubation i hver vask.
- Vask to gange med 100% ethanol. Udfør 10 minutters inkubation i hver vask.
BEMÆRK: Ændring/udskiftning af reagenser skal ske hurtigt for at forhindre lufttørring af celler. Coverslips kan efterlades i 100% ethanol i flere dage ved 4 °C. Ved langtidsopbevaring tilsættes yderligere 100 % ethanol og dækkes brønde med parafilm for at forhindre lufttørring af prøven.
3. Tørring af kritisk punkt
- Læg dæksler i en Critical Point Dryer og dæk med 100% ethanol. Tryk på tænd / sluk-knappen , og åbn CO2 - tanken.
- Tryk på knappen Cool i ca. 30 s, indtil temperaturen falder til 0 °C. Tryk på knappen Fyld, indtil der vises en boble i kammervinduet.
- Tryk på knappen Udrensning, indtil lugten af ethanol fra udrensningsudstødningen forsvinder. Tryk på knappen Cool igen, indtil temperaturen falder til 0 °C.
- Tryk på knapperne Fyld og Rens for at slukke for dem, og luk CO2 - tanken. Tryk på knappen Cool igen for at slukke for den, og tryk på knappen Varme .
- Indstil temperaturen til 42 °C og trykket til 1.200 psi. Når trykket og temperaturen er stabiliseret, skal du trykke på knappen Udluftning for at lade trykket falde langsomt.
- Når kammertrykket når 150 psi, skal du trykke på udluftningsknappen og vente, indtil trykket falder til 0 psi. Sluk for tørretumbleren med kritisk punkt, og fjern dækslipsene.
- Monter dæksler på SEM aluminiumsprøvebeslag ved hjælp af carbonklæbende faner og underlagt sputterbelægning ved hjælp af guld / palladium i en sputtercoater.
- Tænd for tænd / sluk-knappen , og vent, indtil vakuumet når 30 mTorr. Skyl kammeret for at fjerne fugt og luft ved at slukke for gaskontakten og dreje Fine gasventilen mod uret.
- Når vakuumet stiger til 200 mTorr, skal du slukke for gasafbryderen og vente, indtil vakuumet når 30 mTorr. Gentag dette trin 3 gange.
- Tryk på timerknappen , og juster spændingsknappen , indtil måleren læser 10 mA. Fjern belagte dæksler fra kammeret.
BEMÆRK: Følg producentens instruktion for at udføre kritisk punkttørring og sputterbelægning af prøven.
4. Billeddannelse og kvantificering
- Indsæt prøvedæksler i kammeret i et scanningselektronmikroskop. Luk døren, og tryk på Evac-knappen .
- Åbn SEM-driftssoftwaren. Indstil accelerationsspændingen til 15 kv og arbejdsafstanden til 10 mm.
- Tryk på knappen Koordinater , og flyt rundt på controlleren, indtil cellerne vises i midten af observationsskærmen. Indstil forstørrelsen til 3.500x, og aftryk eksemplet ved at klikke på knappen Foto.
BEMÆRK: Brug et højere forstørrelsesniveau (8.500x til 16.000x) for at vise plasmamembranen ved større detaljer. - Tag billeder fra mindst 10 tilfældige steder på dæksedlerne, og sørg for, at hvert mikroskopisk felt indeholder flere celler. Gem billeder som .tif filer.
- Fra billederne skal du finde membranflæser, defineret som fremspringende tæppelignende folder af plasmamembranen, med en størrelse større end 500 nm (figur 1). Tæl antallet af flæser pr. Celle.
BEMÆRK: C-formede flæser blev identificeret som buede membranfremspring, der ikke smeltede sammen på deres laterale ender [(Figur 1 (M-CSF-behandling) og figur 2B]. Smeltede cirkulære membranflæser blev før deres lukning identificeret som makropinocytotiske kopper (figur 2C). - Normaliser antallet af membranflæser til det samlede antal celler i det mikroskopiske felt, der evalueres. Gentag denne analyse for prøverne fra hver gruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi resultaterne fra den præsenterede teknik. Repræsentative SEM-billeder vist i figur 1 viser dannelse af membranflæser i RAW 264.7 makrofager efter behandling med PMA og M-CSF. Billeder blev først taget ved en forstørrelse på 3.500x til kvantificeringsformål og derefter ved højere forstørrelsesniveauer (8.500x til 16.000x) for at vise plasmamembranen ved større detaljer. Forbehandling af makrofager med makropinocytosehæmmeren EIPA-svækket membranflæsedannelse (figur 1). Makropinocytose-associerede plasmamembranaktiviteter kan opdeles i fem på hinanden følgende trin: 1) initiering af membranruffling, 2) cirkularisering, 3) kopdannelse, 4) koplukning og 5) internalisering af ekstracellulær væske og dets tilhørende opløste stoffer via makropinosomdannelse. Figur 2 viser repræsentative billeder af disse morfologisk adskilte plasmamembranaktiviteter efter M-CSF-stimulering. Store arklignende flæser (figur 2A), cirkulære C-formede flæser (figur 2B) og makropinocytiske kopper (figur 2C) blev fanget ved en forstørrelse på 6.000x til 7.000x. Scanningselektronmikroskopi kan bruges til at levere billeder i høj opløsning af celleoverfladen, men kan ikke bruges til at visualisere internaliserede makropinosomer. Kvantificering af membranflæser efter PMA- og M-CSF-behandling er vist i figur 3. Makropinosomdannelse kan bekræftes ved hjælp af alternative billeddannelsesteknikker, herunder konfokal mikroskopi, som vist i figur 4. Endelig bør SEM-kvantificering af membranruffling suppleres med flowcytometrikvantificering af en fluorescerende væskefasemarkør (f.eks. FITC- eller Texas red-dextran) for at bekræfte stimulering af makropinocytose (figur 5).
Figur 1: Scanning af elektronmikroskopibilleder af RAW 264.7 makrofager. RAW 264,7 makrofager blev forbehandlet med køretøj (DMSO-kontrol) eller EIPA (25 μM) i 30 minutter og inkuberet med PMA (1 μM, 30 min) eller M-CSF (100 ng/ml, 30 min) for at stimulere membranruffling. Billeder til højre viser højere forstørrelse af celleoverfladen. Røde pile: membranflæser. Grøn pil: c-formet flæse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Morfologiske stadier af makropinocytose fanget ved scanning af elektronmikroskopi. RAW 264,7 makrofager blev behandlet med M-CSF (100 ng/ml) i 30 minutter, og celler blev behandlet til SEM-billeddannelse. (A) arklignende membranfremspring, (B) C-formet membranflæser og (C) makropinocytisk kop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvantificering af dannelse af membranflæser. RAW 264,7 makrofager blev forbehandlet med køretøj (DMSO-kontrol) eller EIPA (25 μM) i 30 minutter og inkuberet med PMA (1 μM, 30 min) eller M-CSF (100 ng/ml, 30 min) for at stimulere membranruffling. Søjlegraf viser antallet af membranflæser normaliseret til det samlede celletal (n = 3). Data repræsenterer middelværdien ± SEM. *p < 0,05 vs. køretøj, #p < 0,05 vs. PMA eller M-CSF behandling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Makropinosomdannelse. Cellerne blev forbehandlet med PMA i 30 minutter og inkuberet med Texas rød-dextran (25 μg/ml, rød) og FM4-64 (5 μg/ml, grøn) i 10 min. Billeddannelse blev udført ved hjælp af et konfokalmikroskop. Blå pile: membran ruffling, gule pile: makropinosom indeholdende Texas rød-dextran, grønne pile: makropinosomer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kvantificering af makropinocytose. RAW 264,7 makrofager blev forbehandlet med køretøj (DMSO-kontrol) eller EIPA (25 μM) i 30 minutter og inkuberet med PMA (1 μM) og FITC-dextran (100 μg/ml; 70.000 MW) i 2 timer. Søjlediagram viser den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) foldændring normaliseret til køretøjsbehandling (n = 3, udført i triplikater). Data repræsenterer middelværdien ± SEM. *p < 0,05 vs. køretøj, #p < 0,05 vs. PMA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende SEM-billeddannelsesprotokol giver et værktøj til at visualisere og kvantificere membranflæsedannelse, cirkulære fremspring og makropinocytiske kopper på celleoverfladen in vitro. Selvom den nuværende protokol fokuserer på makrofager, har undersøgelser vist, at membranflæsedannelse også forekommer på forskellige andre celletyper, herunder dendritiske celler, fibroblaster, neuroner og kræftceller 11,12,14,21,30. I betragtning af dette kan optimering af cellekulturbetingelser og anvendelse af forskellige stimulatorer eller behandlingsbetingelser være nødvendig for visualisering af membranflæser i andre celletyper.
Selvom der er et vist spillerum for prøveforberedelse, skal dehydrerings- og kritiske punkttørringstrin følges nøjagtigt for at bevare celleoverfladearkitekturen. Derudover vil tilstedeværelsen af vand eller andre opløsningsmidler såsom ethanol forstyrre vakuummet, hvilket er afgørende for SEM-billeddannelse, og det skal derfor fjernes på en kontrolleret måde for at holde prøvemorfologien intakt14.
Elektronmikroskoper bruger en stråle af accelererede elektroner som en kilde til belysning. De første elektronmikroskoper blev udviklet, da bølgelængden blev den begrænsende faktor i lysmikroskoper31. Elektroner har meget kortere bølgelængder, så elektronmikroskoper har en højere opløsningsevne end lysmikroskoper og kan bruges til at levere billeder i høj opløsning og undersøge ultrastrukturen af en lang række biologiske prøver. En væsentlig begrænsning af denne metode drejer sig om det faktum, at SEM kun giver et øjebliksbillede af plasmamembranmorfologien i modsætning til den fluorescerende levende cellebilleddannelse, som ville muliggøre visualisering af membranflæser, deres overgang til makropinocytiske kopper og dannelse af makropinosomer. Levende cellebilleddannelse, transmissionselektronmikroskopi (TEM) og fluorescerende dextranoptagelsesassays kan bruges til at undersøge internaliseringen af fluorescerende opløste stoffer via makropinocytose, makropinosomtranslokation og modning og intracellulære signalmekanismer, der regulerer makropinocytose. Fordi SEM kræver fiksering på dæksedler, kan kun den dorsale side og den perifere region af cellen visualiseres, hvilket er en anden begrænsning for denne teknik.
Vi vil gerne tilføje, at det nogle gange er svært at skelne mellem makropinocytoseuafhængig dannelse af membranfremspring og makropinocytisk membranruffling. Vi standardiserede vores kvantificering ved at identificere membranflæser med mindst 0,5 μm minimumsafstand mellem to punkter i kanten af fremspringet. Antallet af membranflæser pr. celle er meget variabelt og afhænger af mange faktorer, herunder stimulansen, dens koncentration, inkubationstid og celletype32. Med PMA og M-CSF så vi celler med flere membranflæser, men valgte repræsentative billeder, der bedre repræsenterer vores kvantificerede data (1-2 flæser pr. Celle). SEM forbliver guldstandardteknikken til vurdering af topografiske og morfologiske egenskaber ved plasmamembranen in vitro. Kombinationen af denne metode sammen med levende cellebilleddannelse og flowcytometrianalyse af internalisering af opløst stof giver en pålidelig strategi til analyse af makropinocytose i forskellige celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker Libby Perry (Augusta University) for hendes hjælp med SEM-prøveforberedelsen. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) og K99HL146954 (BS)] og American Heart Association [17POST33661254 (BS)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope |
References
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
- Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
- Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
- Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
- Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
- Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
- Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
- Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
- Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
- Mercer, J., Helenius, A.
- Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
- Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
- Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
- Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
- Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- Fischer, E. R., et al.
- Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
- Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
- Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
- Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).
