Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर झिल्ली रफल गठन visualizing

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/62658
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia at Augusta University, 2Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical College of Georgia at Augusta University

Summary

मैक्रोपिनोसाइटोसिस एक अत्यधिक संरक्षित एंडोसाइटिक प्रक्रिया है जो एफ-एक्टिन-समृद्ध शीट-जैसे झिल्ली अनुमानों के गठन से शुरू होती है, जिसे झिल्ली रफल्स के रूप में भी जाना जाता है। मैक्रोपिनोसाइटोटिक विलेय आंतरिककरण की बढ़ी हुई दर को विभिन्न रोग स्थितियों में फंसाया गया है। यह प्रोटोकॉल स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विट्रो में झिल्ली रफल गठन को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।

Abstract

झिल्ली रफलिंग गतिशील प्लाज्मा झिल्ली प्रोट्रूशियंस का गठन है जिसमें नए पॉलिमराइज्ड एक्टिन फिलामेंट्स का एक जालवर्क होता है। झिल्ली रफल्स अनायास या विकास कारकों, भड़काऊ साइटोकिन्स और फोरबोल एस्टर के जवाब में बन सकते हैं। कुछ झिल्ली प्रोट्रूशन परिपत्र झिल्ली रफल्स में पुनर्गठित हो सकते हैं जो उनके डिस्टल मार्जिन पर फ्यूज होते हैं और ऐसे कप बनाते हैं जो साइटोप्लाज्म में बड़े, विषम रिक्तिकाओं के रूप में बंद और अलग होते हैं जिन्हें मैक्रोपिनोसोम कहा जाता है। प्रक्रिया के दौरान, रफल्स एक्स्ट्रासेल्युलर तरल पदार्थ और विलेय को फंसाते हैं जो मैक्रोपिनोसोम के भीतर आंतरिक होते हैं। उच्च रिज़ॉल्यूशन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) एक आमतौर पर उपयोग की जाने वाली इमेजिंग तकनीक है जो कोशिका की सतह पर झिल्ली रफल गठन, परिपत्र प्रोट्रूशियंस और बंद मैक्रोपिनोसाइटिक कप की कल्पना और मात्रा निर्धारित करती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल सेल संस्कृति की स्थिति, विट्रो में झिल्ली रफल गठन की उत्तेजना, और SEM का उपयोग करके इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को कैसे ठीक करें, निर्जलित करें, और तैयार करें। झिल्ली रफलिंग, डेटा सामान्यीकरण, और उत्तेजक और झिल्ली रफल गठन के अवरोधकों का परिमाणीकरण भी वर्णित है। यह विधि शारीरिक और रोग संबंधी प्रक्रियाओं में मैक्रोपिनोसाइटोसिस की भूमिका के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है, नए लक्ष्यों की जांच कर सकती है जो झिल्ली रफल गठन को विनियमित करते हैं, और अभी तक अज्ञात शारीरिक उत्तेजकों के साथ-साथ मैक्रोपिनोसाइटोसिस के उपन्यास औषधीय अवरोधकों की पहचान करते हैं।

Introduction

Macropinocytosis एक एंडोसाइटिक प्रक्रिया है जो गतिशील और एक्टिन-संचालित प्लाज्मा झिल्ली प्रोट्रूशियंस के गठन के माध्यम से बड़ी मात्रा में बाह्य कोशिकीय तरल पदार्थ और इसकी सामग्री को आंतरिक बनाने के लिए जिम्मेदार है जिसे झिल्ली रफल्स1 कहा जाता है। इनमें से कई झिल्ली रफल्स कप बनाते हैं जो सेल पर वापस बंद और फ्यूज करते हैं और प्लाज्मा झिल्ली से बड़े, विषम इंट्रासेल्युलर एंडोसोम के रूप में अलग होते हैं जिन्हें मैक्रोपिनोसोम1 के रूप में भी जाना जाता है। यद्यपि मैक्रोपिनोसाइटोसिस कोशिका प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) जैसे विकास कारकों से प्रेरित होता है, एक अतिरिक्त अद्वितीय, कैल्शियम-निर्भर प्रक्रिया जिसे संरचनात्मक मैक्रोपिनोसाइटोसिस के रूप में जाना जाता है, को जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं 2,3,4,5,6,7,8 में भी देखा गया है।

मैक्रोपिनोसाइटोसिस के माध्यम से बाह्य कोशिकीय सामग्री को आंतरिक बनाने के लिए कोशिकाओं की क्षमता को विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है, जिसमें पोषक तत्वों के उत्थान से लेकर रोगज़नक़ कैप्चर और एंटीजन प्रस्तुति 9,10,11 तक शामिल हैं। हालांकि, क्योंकि यह प्रक्रिया गैर-चयनात्मक और अपरिवर्तनीय है, इसलिए इसे कई रोग स्थितियों में भी फंसाया गया है। दरअसल, पिछले अध्ययनों ने सुझाव दिया कि मैक्रोपिनोसाइटोसिस अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, कैंसर, नेफ्रोलिथियासिस और एथेरोस्क्लेरोसिस 12,13,14,15,16 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अलावा, कुछ बैक्टीरिया और वायरस ने मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश करने और संक्रमण को प्रेरित करने के लिए मैक्रोपिनोसाइटोसिस का उपयोग करने और17,18 संक्रमण को प्रेरित करने के लिए दिखाया है। दिलचस्प बात यह है कि मैक्रोपिनोसाइटोसिस की उत्तेजना का भी विभिन्न रोग स्थितियों में चिकित्सीय एजेंटों के लक्षित वितरण के लिए शोषण किया जा सकताहै 19,20।

पिछले अध्ययनों ने फार्माकोलॉजिकल एजेंटों की अनुपस्थिति और उपस्थिति में आंतरिक फ्लोरोसेंट-टैग किए गए द्रव-चरण मार्करों को परिमाणित करके मैक्रोपिनोसाइटोसिस का पता लगाया है जो प्रवाह साइटोमेट्री और कॉन्फोकल इमेजिंग21,22 का उपयोग करके मैक्रोपिनोसाइटोसिस को रोकते हैं। वर्तमान में उपलब्ध औषधीय उपकरण जो मैक्रोपिनोसाइटोसिस को रोकते हैं, वे सीमित हैं और इसमें 1) एक्टिन पोलीमराइजेशन इनहिबिटर (साइटोकैलासिन डी और लैट्रुनक्यूलिन), 2) पीआई3के ब्लॉकर्स (एलवाई -290042 और वोर्टमैनिन) और 3) सोडियम हाइड्रोजन एक्सचेंजर्स (एनएचई) (एमिलोराइड और ईआईपीए) के अवरोधक 5,14,15,23,24,25 शामिल हैं। . हालांकि, क्योंकि इन अवरोधकों में एंडोसाइटोसिस स्वतंत्र प्रभाव होते हैं, इसलिए विशेष रूप से विवो21 में विलेय अपटेक और रोग रोगजनन के लिए मैक्रोपिनोसाइटोसिस के योगदान को चुनिंदा रूप से निर्धारित करना मुश्किल है।

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) एक प्रकार का इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप है जो इलेक्ट्रॉनों के केंद्रित बीम का उपयोग करके कोशिकाओं की अल्ट्रा-उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का उत्पादन करताहै। मैक्रोपिनोसाइटोसिस अनुसंधान में, एसईएम इमेजिंग को प्लाज्मा झिल्ली की स्थलाकृतिक और रूपात्मक विशेषताओं की कल्पना करने, झिल्ली रफल गठन को मापने और मैक्रोपिनोसोम आंतरिककरण की ओर उनकी प्रगति की जांच करने के लिए सोने की मानक तकनीक के रूप में माना जाता है। इसके अलावा, मैक्रोपिनोसाइटोसिस ब्लॉकर्स की उपस्थिति और अनुपस्थिति में विलेय अपटेक के परिमाणीकरण के साथ संयुक्त स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, विट्रो में मैक्रोपिनोसाइटोटिक विलेय आंतरिककरण की जांच करने के लिए एक विश्वसनीय रणनीति प्रदान करती है। यह पेपर SEM के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के तरीके पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, सेल की सतह की कल्पना करता है, रफल गठन को मापता है, और कप बंद करने और मैक्रोपिनोसोम आंतरिककरण की दिशा में उनकी प्रगति की जांच करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: निम्नलिखित एक सामान्य प्रोटोकॉल है जिसका उपयोग SEM माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके RAW 264.7 मैक्रोफेज में झिल्ली रफल गठन को मापने के लिए किया जाता है। विभिन्न सेल प्रकारों के लिए ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता हो सकती है.

1. सेल लाइन और सेल संस्कृति

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में रॉ 264.7 मैक्रोफेज 10% (vol / vol) गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन के 100 IU / mL और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक humidified इनक्यूबेटर में बढ़ो। हर दूसरे दिन विकास मीडिया को बदलें।
  2. जब कोशिकाएं 80% confluent हो जाती हैं, तो बाँझ पीबीएस का उपयोग करके प्लेट को दो बार धोएं।
  3. 0.5% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 1,000 μL को जोड़कर कोशिकाओं को अलग करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 3-5 मिनट के लिए सेल संस्कृति प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  4. सेल पृथक्करण की पुष्टि करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत प्लेट की जांच करें। ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए 10% FBS युक्त 10 mL विकास मीडिया जोड़ें।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर एक 50 mL शंक्वाकार ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में सेल निलंबन ले लीजिए। धीरे से पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और ट्रिपैन ब्लू (0.4%) स्टेनिंग का उपयोग करके सेल की गिनती और व्यवहार्यता निर्धारित करें।
    नोट:: इस प्रयोग के लिए अनुशंसित न्यूनतम सेल व्यवहार्यता >90% है।
  6. ऑटोक्लेव्ड संदंश का उपयोग करके 24-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में बाँझ कांच के कवरलिप्स रखें। 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर कवरलिप्स पर बीज कोशिकाएं और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रातभर प्लेट को इनक्यूबेट करतीहैं।
  7. उपचार से पहले ताजा 500 μL पूर्ण मीडिया के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया बदलें। वाहन (डीएमएसओ या ईआईपीए को भंग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य सॉल्वैंट्स) या मैक्रोपिनोसाइटोसिस इनहिबिटर 5-(एन-एथिल-एन-आइसोप्रोपाइल)-एमिलोराइड (ईआईपीए, 25 μM21) के साथ मैक्रोफेज को 30 मिनट के लिए प्रीट्रीट करें।
  8. झिल्ली ruffling को बढ़ावा देने के लिए macropinocytosis के वाहन और उत्तेजक के साथ कोशिकाओं का इलाज करें: phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (PMA, 1 μM, 30 मिनट21) और मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (M-CSF, 100 ng / mL, 30 मिनट3)।
    नोट: वैकल्पिक अवरोधक [उदाहरण के लिए, लैट्रनकुलिन ए (1 μM, 30 मिनट) या साइटोकैलासिन डी (1 μM, 30 मिनट)] और उत्तेजक [उदाहरण के लिए, एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (EGF, 100 ng / mL, 10 मिनट) या प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक (PDGF, 100 ng / mL, 15 मिनट)] मैक्रोपिनोसाइटोसिस केअन्य प्रकारों को चिह्नित करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। 28,29. मैक्रोपिनोसाइटोसिस के शारीरिक उत्तेजकों के साथ उपचार से पहले कोशिकाओं को रात भर सीरम भुखमरी की आवश्यकता हो सकती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सबसे प्रभावी सांद्रता और इनक्यूबेशन बार को अन्य सेल प्रकारों में मैक्रोपिनोसाइटोसिस को उत्तेजित करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।

2. SEM निर्धारण

  1. उपचार के बाद, कुओं से मीडिया को एस्पिरेट करें और दो बार बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ कवरलिप्स को धोएं।
  2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं (4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड और 0.1 एम सोडियम कैकोडिलेट में 2% ग्लूटाराल्डिहाइड) को ठीक करें, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर फिक्सेटिव में रात भर इनक्यूबेशन।
  3. धीरे से धोने और सेल monolayer परेशान किए बिना निम्नलिखित अभिकर्मकों के 500 μL के साथ coverslips incubate.
    1. 0.1 एम सोडियम cacodylate में एक बार धोएं और 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. प्रत्येक धोने में 10 मिनट इनक्यूबेशन के साथ dH2O के साथ दो बार धोएं।
    3. प्रत्येक धोने में 10 मिनट इनक्यूबेशन के साथ 25% इथेनॉल के साथ दो बार धोएं।
    4. प्रत्येक धोने में 10 मिनट इनक्यूबेशन के साथ 50% इथेनॉल के साथ दो बार धोएं।
    5. प्रत्येक धोने में 10 मिनट इनक्यूबेशन के साथ 75% इथेनॉल के साथ दो बार धोएं।
    6. प्रत्येक धोने में 10 मिनट इनक्यूबेशन के साथ 80% इथेनॉल के साथ दो बार धोएं।
    7. प्रत्येक धोने में 10 मिनट इनक्यूबेशन के साथ 95% इथेनॉल के साथ दो बार धोएं।
    8. 100% इथेनॉल के साथ दो बार धोएं। प्रत्येक धोने में इनक्यूबेशन के 10 मिनट का प्रदर्शन करें।
      नोट: अभिकर्मकों को बदलने / बदलने के लिए कोशिकाओं की हवा सूखने को रोकने के लिए तेजी से किया जाना चाहिए। कवरलिप्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों के लिए 100% इथेनॉल में छोड़ा जा सकता है। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, अतिरिक्त 100% इथेनॉल जोड़ें और नमूने की हवा सुखाने को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ कुओं को कवर करें।

3. महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने

  1. एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर में कवरलिप्स रखें और 100% इथेनॉल के साथ कवर करें। पावर बटन दबाएं और CO2 टैंक खोलें।
  2. लगभग 30 सेकंड के लिए कूल बटन दबाएं जब तक कि तापमान 0 डिग्री सेल्सियस तक कम न हो जाए। कक्ष विंडो में एक बुलबुला प्रकट होने तक भरण बटन दबाएँ.
  3. पर्ज बटन दबाएं जब तक कि पर्ज निकास से इथेनॉल की गंध गायब न हो जाए। कूल बटन को फिर से दबाएं जब तक कि तापमान 0 डिग्री सेल्सियस तक कम न हो जाए।
  4. भरण और पर्ज बटन को दबाएं ताकि उन्हें बंद किया जा सके और सीओ2 टैंक को बंद किया जा सके। इसे बंद करने के लिए कूल बटन को दबाएं और हीट बटन दबाएं।
  5. तापमान को 42 डिग्री सेल्सियस पर और दबाव को 1,200 साई पर सेट करें। एक बार जब दबाव और तापमान स्थिर हो जाता है, तो दबाव को धीरे-धीरे कम करने की अनुमति देने के लिए ब्लीड बटन दबाएं।
  6. एक बार जब कक्ष का दबाव 150 साई तक पहुंच जाता है, तो वेंट बटन दबाएं और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि दबाव 0 साई तक कम न हो जाए। महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर बंद करें और coverslips को हटा दें।
  7. माउंट SEM एल्यूमीनियम नमूना कार्बन चिपकने वाला टैब का उपयोग कर mounts पर coverslips और एक sputter coater में सोने का उपयोग कर sputter कोटिंग के अधीन /
  8. पावर बटन को चालू करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि वैक्यूम 30 mTorr तक नहीं पहुंच जाता। गैस स्विच को बंद करने और ठीक गैस वाल्व वामावर्त मोड़ द्वारा आर्द्रता और हवा को हटाने के लिए कक्ष फ्लश करें।
  9. एक बार वैक्यूम 200 mTorr तक बढ़ जाता है, तो गैस स्विच को बंद कर दें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि वैक्यूम 30 mTorr तक नहीं पहुंच जाता। इस चरण को 3 बार दोहराएं।
  10. टाइमर बटन पुश और वोल्टेज घुंडी समायोजित जब तक गेज 10 mA पढ़ता है. कक्ष से लेपित coverslips निकालें.
    नोट: महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने और नमूने के sputter कोटिंग करने के लिए निर्माता के निर्देश का पालन करें।

4. इमेजिंग और परिमाणीकरण

  1. एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के कक्ष में नमूना coverslips सम्मिलित करें। दरवाजा बंद करें और Evac बटन दबाएँ।
  2. SEM कार्रवाई सॉफ़्टवेयर खोलें। त्वरित वोल्टेज को 15 केवी और काम की दूरी को 10 मिमी पर सेट करें।
  3. निर्देशांक बटन दबाएँ और नियंत्रक के चारों ओर ले जाएँ जब तक कि कक्ष अवलोकन स्क्रीन के केंद्र में दिखाई न दें. आवर्धन को 3,500x पर सेट करें और फोटो बटन पर क्लिक करके नमूने की छवि बनाएं।
    नोट:: अधिक से अधिक विवरण पर प्लाज्मा झिल्ली दिखाने के लिए आवर्धन (8,500x से 16,000x) के एक उच्च स्तर का उपयोग करें।
  4. कवरस्लिप पर कम से कम 10 यादृच्छिक स्थानों से छवियां लें, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक माइक्रोस्कोपिक फ़ील्ड में कई कोशिकाएं हैं। छवियों को .tif फ़ाइलों के रूप में सहेजें.
  5. छवियों से, झिल्ली रफल्स का पता लगाएं, जिसे प्लाज्मा झिल्ली के उभरे हुए कंबल जैसी सिलवटों के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसका आकार 500 एनएम (चित्रा 1) से अधिक है। प्रति सेल रफल्स की संख्या की गणना करें।
    नोट: सी-आकार के रफल्स को घुमावदार झिल्ली प्रोट्रूशियंस के रूप में पहचाना गया था जो उनके पार्श्व सिरों पर फ्यूज नहीं करते थे [(चित्रा 1 (एम-सीएसएफ उपचार) और चित्रा 2 बी]। फ्यूज्ड परिपत्र झिल्ली रफल्स, उनके बंद होने से पहले, मैक्रोपिनोसाइटोटिक कप (चित्रा 2 सी) के रूप में पहचाने गए थे।
  6. मूल्यांकन किए गए सूक्ष्म क्षेत्र में कोशिकाओं की कुल संख्या के लिए झिल्ली रफल्स की संख्या को सामान्य करें। प्रत्येक समूह के नमूनों के लिए इस विश्लेषण को दोहराएँ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहां, हम प्रस्तुत तकनीक के परिणामों का वर्णन करते हैं। चित्रा 1 में दिखाए गए प्रतिनिधि SEM छवियां पीएमए और एम-सीएसएफ के साथ उपचार के बाद रॉ 264.7 मैक्रोफेज में झिल्ली रफल गठन का प्रदर्शन करती हैं। छवियों को पहले परिमाणीकरण उद्देश्यों के लिए 3,500x के आवर्धन पर कब्जा कर लिया गया था और फिर प्लाज्मा झिल्ली को अधिक से अधिक विवरण पर दिखाने के लिए आवर्धन (8,500x से 16,000x) के उच्च स्तर पर। macropinocytosis अवरोधक EIPA क्षीण झिल्ली रफल गठन के साथ मैक्रोफेज के pretreatment (चित्रा 1). मैक्रोपिनोसाइटोसिस से जुड़ी प्लाज्मा झिल्ली गतिविधियों को लगातार पांच चरणों में विभाजित किया जा सकता है: 1) झिल्ली की शुरुआत, 2) परिपत्रीकरण, 3) कप गठन, 4) कप बंद, और 5) मैक्रोपिनोसोम गठन के माध्यम से बाह्य कोशिकीय तरल पदार्थ और इसके संबंधित विलेय का आंतरिककरण। चित्रा 2 एम-सीएसएफ उत्तेजना के बाद इन रूपात्मक रूप से अलग प्लाज्मा झिल्ली गतिविधियों की प्रतिनिधि छवियों को दर्शाता है। बड़ी शीट की तरह रफल्स (चित्रा 2 ए), परिपत्रित सी-आकार के रफल्स (चित्रा 2 बी), और मैक्रोपिनोसाइटिक कप (चित्रा 2 सी) को 6,000x से 7,000x के आवर्धन पर कब्जा कर लिया गया था। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग सेल सतह की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्रदान करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन आंतरिक मैक्रोपिनोसोम की कल्पना करने के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है। पीएमए और एम-सीएसएफ उपचार के बाद झिल्ली रफल्स का परिमाणीकरण चित्र 3 में दिखाया गया है। मैक्रोपिनोसोम गठन की पुष्टि वैकल्पिक इमेजिंग तकनीकों द्वारा की जा सकती है, जिसमें कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी भी शामिल है, जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। अंत में, झिल्ली ruffling के SEM परिमाणीकरण को एक फ्लोरोसेंट द्रव-चरण मार्कर (उदाहरण के लिए, FITC- या टेक्सास रेड-डेक्सट्रान) के प्रवाह साइटोमेट्री परिमाणीकरण द्वारा पूरक किया जाना चाहिए ताकि मैक्रोपिनोसाइटोसिस (चित्रा 5) की उत्तेजना की पुष्टि की जा सके।

Figure 1
चित्रा 1: रॉ 264.7 मैक्रोफेज की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों को स्कैन करना। रॉ 264.7 मैक्रोफेज को 30 मिनट के लिए वाहन (डीएमएसओ नियंत्रण) या ईआईपीए (25 μM) के साथ पूर्व-इलाज किया गया था और पीएमए (1 μM, 30 मिनट) या एम-सीएसएफ (100 एनजी / एमएल, 30 मिनट) के साथ इनक्यूबेट किया गया था ताकि झिल्ली को उत्तेजित किया जा सके। दाईं ओर की छवियां सेल की सतह का उच्च आवर्धन दिखाती हैं। लाल तीर: झिल्ली ruffles. हरा तीर: सी के आकार का रफल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मैक्रोपिनोसाइटोसिस के रूपात्मक चरण ों को स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा कैप्चर किया गया। रॉ 264.7 मैक्रोफेज को 30 मिनट के लिए एम-सीएसएफ (100 एनजी / एमएल) के साथ इलाज किया गया था और कोशिकाओं को एसईएम इमेजिंग के लिए संसाधित किया गया था। (ए) शीट की तरह झिल्ली फलाव, (बी) सी के आकार की झिल्ली रफल, और (सी) मैक्रोपिनोसाइटिक कप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: झिल्ली रफल गठन का परिमाणीकरण। रॉ 264.7 मैक्रोफेज को 30 मिनट के लिए वाहन (डीएमएसओ नियंत्रण) या ईआईपीए (25 μM) के साथ पूर्व-इलाज किया गया था और पीएमए (1 μM, 30 मिनट) या एम-सीएसएफ (100 एनजी / एमएल, 30 मिनट) के साथ इनक्यूबेट किया गया था ताकि झिल्ली को उत्तेजित किया जा सके। बार ग्राफ कुल सेल संख्या (एन = 3) के लिए सामान्यीकृत झिल्ली रफल्स की संख्या दिखाता है। डेटा SEM के माध्य ± प्रतिनिधित्व करता है। एक तरफ़ा एनोवा; * पी < 0.05 बनाम वाहन, # पी < 0.05 बनाम पीएमए या एम-सीएसएफ उपचार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मैक्रोपिनोसोम गठन। कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए पीएमए के साथ पूर्व-इलाज किया गया था और टेक्सास रेड-डेक्सट्रान (25 μg / mL, लाल) और FM4-64 (5 μg / mL, हरा) के साथ 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था। इमेजिंग एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. नीले तीर: झिल्ली ruffling, पीले तीर: टेक्सास लाल dextran, हरे तीर युक्त macropinosome: macropinosomes. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: मैक्रोपिनोसाइटोसिस का परिमाणीकरण। रॉ 264.7 मैक्रोफेज को 30 मिनट के लिए वाहन (डीएमएसओ नियंत्रण) या ईआईपीए (25 μM) के साथ पूर्व-उपचारित किया गया था और पीएमए (1 μM) और FITC-dextran (100 μg / mL; 70,000 MW) के साथ 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। बार ग्राफ से पता चलता है कि माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) गुना परिवर्तन वाहन उपचार के लिए सामान्यीकृत है (एन = 3, तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया जाता है)। डेटा SEM के माध्य ± प्रतिनिधित्व करता है। एक तरफ़ा एनोवा; * पी < 0.05 बनाम वाहन, # पी < 0.05 बनाम पीएमए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वर्तमान SEM इमेजिंग प्रोटोकॉल विट्रो में सेल सतह पर झिल्ली रफल गठन, परिपत्र प्रोट्रूशन, और मैक्रोपिनोसाइटिक कप की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। यद्यपि वर्तमान प्रोटोकॉल मैक्रोफेज पर केंद्रित है, अध्ययनों से पता चला है कि झिल्ली रफल गठन डेंड्राइटिक कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स, न्यूरॉन्स और कैंसर कोशिकाओं 11,12,14,21,30 सहित विभिन्न अन्य सेल प्रकारों पर भी होता है। इसे देखते हुए, सेल संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन और अन्य सेल प्रकारों में झिल्ली रफल्स के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए विभिन्न उत्तेजकों या उपचार स्थितियों के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है।

हालांकि नमूना तैयारी के लिए कुछ छूट मौजूद है, सेल सतह वास्तुकला को संरक्षित करने के लिए निर्जलीकरण और महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने के चरणों का बिल्कुल पालन किया जाना चाहिए। इसके अलावा, इथेनॉल जैसे पानी या अन्य सॉल्वैंट्स की उपस्थिति वैक्यूम को परेशान करेगी, जो एसईएम इमेजिंग के लिए आवश्यक है और इसलिए, नमूना आकृति विज्ञानको बरकरार रखने के लिए इसे नियंत्रित तरीके से हटा दिया जाना चाहिए।

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप रोशनी के स्रोत के रूप में त्वरित इलेक्ट्रॉनों की एक किरण का उपयोग करते हैं। पहले इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप विकसित किए गए थे जब तरंग दैर्ध्य प्रकाश माइक्रोस्कोप31 में सीमित कारक बन गया था। इलेक्ट्रॉनों में बहुत कम तरंग दैर्ध्य होते हैं इस प्रकार इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में प्रकाश माइक्रोस्कोप की तुलना में एक उच्च समाधान शक्ति होती है और इसका उपयोग उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्रदान करने और जैविक नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला की अल्ट्रास्ट्रक्चर की जांच करने के लिए किया जा सकता है। इस विधि की एक प्रमुख सीमा इस तथ्य के चारों ओर घूमती है कि एसईएम प्लाज्मा झिल्ली आकृति विज्ञान का केवल एक स्नैपशॉट प्रदान करता है, जैसा कि फ्लोरोसेंट लाइव सेल इमेजिंग के विपरीत है, जो झिल्ली रफल्स के विज़ुअलाइज़ेशन, मैक्रोपिनोसाइटिक कप में उनके संक्रमण और मैक्रोपिनोसोम के गठन की अनुमति देगा। लाइव सेल इमेजिंग, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम), और फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान अपटेक एसेस का उपयोग मैक्रोपिनोसाइटोसिस, मैक्रोपिनोसोम ट्रांसलोकेशन और परिपक्वता, और मैक्रोपिनोसाइटोसिस को विनियमित करने वाले इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग तंत्र के माध्यम से फ्लोरोसेंट विलेय के आंतरिककरण की जांच करने के लिए किया जा सकता है। क्योंकि SEM को कवरलिप पर निर्धारण की आवश्यकता होती है, केवल पृष्ठीय पक्ष और सेल के परिधीय क्षेत्र की कल्पना की जा सकती है, जो इस तकनीक की एक और सीमा है।

हम यह जोड़ना चाहते हैं कि कभी-कभी झिल्ली प्रोट्रूशियंस के मैक्रोपिनोसाइटोसिस-स्वतंत्र गठन और मैक्रोपिनोसाइटिक झिल्ली रफलिंग के बीच अंतर करना मुश्किल होता है। हमने फलाव के किनारे पर किसी भी दो बिंदुओं के बीच कम से कम 0.5 μm न्यूनतम दूरी के साथ झिल्ली रफल्स की पहचान करके अपने परिमाणीकरण को मानकीकृत किया। प्रति कोशिका झिल्ली रफल्स की संख्या अत्यधिक परिवर्तनशील है और उत्तेजक, इसकी एकाग्रता, इनक्यूबेशन समय और सेल प्रकार32 सहित कई कारकों पर निर्भर करती है। पीएमए और एम-सीएसएफ के साथ, हमने कई झिल्ली रफल्स वाली कोशिकाओं को देखा, लेकिन प्रतिनिधि छवियों को चुना जो हमारे मात्रात्मक डेटा (प्रति सेल 1-2 रफल्स) का बेहतर प्रतिनिधित्व करते हैं। एसईएम विट्रो में प्लाज्मा झिल्ली की स्थलाकृतिक और रूपात्मक विशेषताओं का आकलन करने के लिए सोने की मानक तकनीक बनी हुई है। विलेय आंतरिककरण के लाइव सेल इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के साथ इस विधि का संयोजन विभिन्न सेल प्रकारों में मैक्रोपिनोसाइटोसिस का विश्लेषण करने के लिए एक विश्वसनीय रणनीति प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखकों ने लिब्बी पेरी (ऑगस्टा विश्वविद्यालय) को SEM नमूना तैयारी के साथ उसकी मदद के लिए धन्यवाद दिया। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [R01HL139562 (G.C.) और K99HL146954 (B.S.)] और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन [17POST33661254 (B.S.)] द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA Gibco 15400-054
2% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
4% Paraformaldehyde Santa Cruz Biotechnology 281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride Sigma Life Science A3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive Tabs Electron Microscopy Sciences 77825-09
Dimethyl Sulfoxide Corning 25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium Cytiva Life Sciences SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Falcon 353047
Fetal Bovine Serum Gemini Bio 900-108
FitC-dextran Thermo Fisher Scientific D1823
FM 4-64 Thermo Fisher Scientific T13320
HERAcell 150i CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater Anatech USA 58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover Glass Thermo Fisher Scientific 12-545-82
Pen Strep Gibco 15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetate Millipore Sigma 524400
RAW 264.7 macrophage ATCC ATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSF Peprotech 300-25
Samdri-790 Critical Point Dryer Tousimis Research Corporation 8778B
SEM Aluminum Specimen Mounts Electron Microscopy Sciences 75220
Sodium Cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300
Texas red-dextra Thermo Fisher Scientific D1864
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific 15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  2. Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
  3. Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
  4. Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
  5. Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
  6. Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
  7. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
  8. Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  10. Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
  11. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
  12. Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
  13. Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
  14. Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
  15. Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
  16. Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
  17. Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
  18. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).
  19. Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
  21. Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
  22. Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
  23. Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
  24. Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
  25. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  26. Fischer, E. R., et al. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).
  27. Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
  28. Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
  29. Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
  30. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts. Bio- Protocols. 9 (10), (2019).
  31. Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
  32. Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).

Tags

चिकित्सा अंक 171
स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर झिल्ली रफल गठन visualizing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahn, W., Singla, B., Marshall, B.,… More

Ahn, W., Singla, B., Marshall, B., Csányi, G. Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (171), e62658, doi:10.3791/62658 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter